Reaktivne kisikove zvrsti PDF

REAKTIVNE KISIKOVE ZVRSTI Dušan Šuput, Irina Milisav 1 Uvod Po Paulijevem izključitvenem principu niti dva elektrona ne Ž...

REAKTIVNE KISIKOVE ZVRSTI Dušan Šuput, Irina Milisav 1 Uvod Po Paulijevem izključitvenem principu niti dva elektrona ne Živimo v okolju, v katerem so prosti radikali prisotni vsepovsod. moreta imeti vseh kvantnih števil enakih, tako da ima vsaka orbi- Nastajajo tudi v našem organizmu. V tem poglavju je pregled pro- tala lahko torej le dva elektrona; enega s spinom + ½ in drugega stih radikalov, pomembnih za fiziološke in patofiziološke procese, z – ½. Poleg tega po Hundovem pravilu velja, da bo, kadar so na poudarek pa bo na reaktivnih kiskovih zvrsteh (ROS), od katerih voljo prazne orbitale z enako energijo, najprej vsaka dobila po en so nekatere prosti radikali, druge pa ne. elektron, preden se bo katerakoli dopolnila še z drugim. Zaradi teh pravil sta na enem energijskem nivoju največ dva elektrona, Pred dvema milijardama let se je na Zemlji zgodila ena najhujših ki pa morata imeti nasprotno usmerjena spina (spinska restrikci- ekoloških katastrof. Tedaj je delež kisika v ozračju dosegel okrog ja). Tudi spina dveh elektronov, ki tvorita kovalentno vez pri neki 10 %, kar je bilo pogubno za anaerobno življenje, ki je takrat pre- molekuli, morata biti nasprotno usmerjena. vladovalo na Zemlji. Kisik je reagiral z biomolekulami in jih inak- tiviral ali drugače poškodoval. Zaradi večje topnosti v lipidih kot Razumljivo je torej, da bodo atomi, ki imajo na zadnji orbitali le en v vodi je bilo največ poškodb na hidrofobnih delih evkariontskih elektron in atomi, ki imajo na zadnjih orbitalah po en nesparjen celic in bakterij. V sedanjem času je kisik najbolj razširjen element elektron, ustrezali definiciji prostega radikala. Atomi, ki imajo liho v zemeljski skorji (zastopanost v obliki njegovih spojin, zlasti sili- število elektronov, so praviloma tudi paramagnetni. Med prvimi katov, je okrog 50 %, molekularnega kisika v suhem zraku pa je osmimi elementi periodnega sistema so elementi, ki so temelj- 21 %). Raztopljeni kisik v hidrosferi, kjer ga je okrog 90 %, tudi ne sestavine biomolekul in že med njimi najdemo proste radika- prispeva k aerobnemu življenju, čeprav je molekularni kisik bolj le. Tudi številne izmed prvih 36 elementov periodnega sistema topen v organskih topilih kot v vodi, kar je pomembno za njego- pogosto obravnavamo pri biokemiji, fiziologiji in patološki fizio- ve reakcije v hidrofobnih membranskih lipidih. Na kisik odpadeta logiji kot bistvene dele številnih encimov, drugih makromolekul tudi dve tretjini mase človeškega telesa. in vitaminov. V nadaljevanju bomo obravnavali le tiste proste radikale elementov, ki pomembno vstopajo v reakcije z drugi- To ekološko katastrofo so preživela bitja, ki so lahko uporabljala mi molekulami v organizmu. Tako npr. ne bo govora o prostem kisik pri svojih normalnih presnovnih procesih. Razviti so mora- radikalu vodika, saj vodik nastopa v obliki H2, ki ni prosti radikal, la tudi mehanizme, s katerimi so kompenzirala toksične učinke oziroma v ionski obliki H+, ki tudi ni prosti radikal, saj je brez elek- kisika. Pri tem so adaptacije šle še dalje in so posegle tudi v fizi- trona. Nasprotno pa bo velik del poglavja posvečen kisikovim ološke procese. Danes so nekateri prosti radikali nujno potrebni prostim radikalom in drugim ROS, ki jim je naš organizem trajno za normalno delovanje in preživetje "sodobnih" mnogoceličar- izpostavljen. jev. Poglavje Reaktivne kisikove zvrsti obravnava pojem prostih radikalov, njihove reakcije z molekulami v organizmu in pomen 2.2 Temeljne kemične značilnosti radikalov reaktivnih kisikovih zvrsti v patofizioloških procesih. Prosti radikali hitro zapolnijo vrzel na energijskem nivoju z elek- tronom, ki mora imeti spin v nasprotni smeri kot pri elektronu 2 Fizikalnokemične osnove brez para. Prosti radikali z lihim številom elektronov so zelo reak- 2.1 Opredelitev in temeljne značilnosti radikalov tivni. Njihov razpolovni čas je pogosto med milijoninko in milijar- Prosti radikali so atomi, ioni in molekule ali njihovi deli, ki imajo dinko sekunde ali pa še krajši. Zelo reaktivni so tudi prosti radi- na vsaj enem od energijskih nivojev elektronov en sam, nespar- kali s sodim številom nesparjenih elektronov, ki imajo nasprotne jen, elektron – torej nesparjeno spinsko kvantno število. spine (npr. kisikov singlet v obliki prostega radikala). Pri pisanju njihovih kemičnih simbolov proste radikale označujemo s piko V Bohrovem preprostem enodimenzionalnem modelu atoma so desno zgoraj. Redkeje piko lahko postavimo levo, če je to nujno, elektroni locirani na orbitalah, ki so podobno kot tirnice planetov kadar želimo pokazati, na katerem atomu v molekuli ali njenem porazdeljene v različnih oddaljenostih od jedra. Edina pomem- delu je nesparjen elektron. bna dimenzija je velikost orbite, ki jo označimo s kvantnim števi- V primerjavi z reaktivnimi prostimi radikali pa kemično stabilni lom n. Že Niels Bohr se je zavedal, da rešitev ni povsem ustrezna, prosti radikali kar za nekaj velikostnih razredov počasneje reagi- a šele kvantna mehanika je omogočila napredek. Kvantna meha- rajo z drugimi molekulami, ki niso prosti radikali. Zato jih nava- nika, najpreprosteje gledano, ne obravnava elektronov le kot del- dno ne imenujemo proste radikale in pri pisanju opuščamo piko. ce, ampak tudi kot valovno funkcijo v času in prostoru. Schrödin- To so molekule, ki imajo sicer sodo število elektronov, vendar vsaj gerjeva enačba, ki je podala rešitev za atom vodika, je tudi dala dva elektrona na različnih nivojih s spinoma v isti smeri. Primera rešitev za tri od štirih kvantnih števil. stabilnih prostih radikalov sta molekularni kisik (O2) in dušikov dioksid (NO2). Stabilni prosti radikali pa zelo hitro reagirajo z reak- Vrste kvantnih števil so: glavno, stransko, magnetno in spinsko. tivnimi prostimi radikali. 39 060 2019 Farmacija.indd 39 20.9.2019 10:48:19  R e a k tivne k isik ove z vrst i 3 Reaktivne oblike kisika in njegove spojine premočnim ultravijoličnim (UV) sevanjem. Ozon nastane s fotodi- 3.1 Reaktivne molekularne oblike kisika sociacijo molekularnega kisika. Med reaktivnimi spojinami samega kisika so najpomembnejši tri- je prosti radikali (atmosferski kisik O2 , kisikov singlet – radikal O2 in superoksidni anion O2- ) ter kisikov singlet O2 in perok­sidni ion Atomski kisik reagira z molekularnim in nastane ozon: O22-. Po reaktivnosti si slede v naslednjem zaporedju atmosfer- ski kisk O2 < singlet kisik O2 < superoksidni anion – radikal O2- < peroksidni ion O2- < singlet kisik (radikal) O2. Na prvi pogled Med najpomembnejše krivce za propad ozonske plasti spadajo so si te molekule kisika zelo podobne, vendar je velika razlika, če fluorirani ogljikovodiki, ki jih uporabljamo v hladilnih napravah in si podrobneje ogledamo zasedenost njihovih zadnjih dveh elek- v raznih razpršilcih ter dušikovi oksidi, ki visoko v ozračju nastaja- tronskih orbital (slika 1). jo predvsem pri izgorevanju v motorjih visoko letečih reaktivnih Atmosferski kisik je prosti radikal, saj ima na zadnjih dveh zasede- letal in zaradi erupcij na soncu (sončne pege). Zaradi tanjše plasti nih orbitalah po en elektron z enakim spinskim številom. Orbitali ozona skozi ozračje prodre do zemeljske površine več škodljivih lahko zapolni, ko sprejme dva elektrona, ki pa morata imeti nas- UV-žarkov, ki v koži povzročijo nastanek prostih radikalov. Po dru- protno spinsko število. To je težko dosegljivo; lažje poteka eno- gi strani pa ozon lahko nastane v človekovem okolju pod vplivom stopenjska redukcija atmosferskega kisika. Bolj reaktiven "neradi- UV-žarkov in v fotokemičnih reakci­jah ob prisotnosti dušikovih kalni" singlet kisik ima na eni orbitali dva elektrona z antiparalel- oksidov in sledov ogljikovodikov, ki jih je v izobilju v izpušnih pli- nim spinom (zato ni radikal) in z lahkoto sprejme nov elektron ali nih (in tudi cigaretnem dimu). Ozon je zelo toksičen. Čeprav sam kar elektronski par na prosto orbitalo. Kljub temu, da ni radikal, je ni radikal, lahko v reakcijah dela proste radikale. Sproži lipidno reaktivna kisikova spojina, ki lahko postane radikal, če sprejme en peroksidacijo in v vodnih raztopinah lahko dela OH. elektron, ali pa če dodamo energijo (glej elektronsko konfiguraci- jo pri singlet radikalu). Še bolj reaktiven superoksidni radikal ima Pri izgorevanju organskih snovi (polucija v mestih!) nastajajo tudi nesparjen elektron le na eni orbitali. Peroksidni ion ima zasedeni dušikovi oksidi, ki po eni strani prispevajo k nastajanju ozona, v že obe orbitali in vstopa v reakcije z drugimi spojinami kot zelo drugi vrsti reakcij pa k propadu ozonske plasti. Pouda­rimo lah- reaktiven ion. Najbolj reaktivna kisikova spojina je singlet radikal, ko npr. avtomobilske izpuhe in cigaretni dim. En sam cigaretni ki ima na zadnjih dveh orbi­talah po en nesparjen elektron z nas- "poteg" vsebuje približno 1014 prostih radikalov. Mnogi med njimi protnima spinoma, zato je manj "izbirčen" pri sprejemanju elek- so zelo obstojni in so na filtrih reaktivni še ure potem, ko so nasta- trona kot atmosferski kisik in s tem tudi bolj reaktiven. li. Pregled pomembnejših prostih radikalov in drugih reaktivnih kisikovih spojin je v razpredelnicah 1 in 2. Pri učinkih radikalov in drugih reaktivnih zvrsti (ne le kisi- kovih) velja pravilo, da imajo bolj reaktivne spojine navad- 4 Splošen pregled nastajanja radikalov v naravi no intenzivnejše učinke, vendar lokalno na kraju nastanka, Pri enostopenjski redukciji molekularnega kisika nastaja super- medtem ko imajo manj reaktivne spojine večji radij delo- oksidni anion: vanja, kar pa je seveda odvisno tudi od morebitnih difuzij- skih preprek (pomen topnosti v lipidih). V nadaljnjih reakcijah nastajajo še nove kisikove reaktivne spojine z drugimi elementi, O2- običajno zapisujemo kot O2-, iz didaktičnih namenov pa ga v navedene v razpredelnici 1. tem poglavju označujemo kot O2- , da opozorimo, da je to radikal. Vir elektrona pri enostopenjski redukciji molekularnega kisika je 3.2 Drugi radikali s kisikom in reaktivne kisikove spojine lahko endogen (npr. oksidacijska encimska reakcija) ali eksogen Biokemične poškodbe povzročajo reaktivne kisikove zvrsti. (npr. ionizirajoče sevanje ali intermediarna presnova pri presnovi To so poleg prej omenjenih še drugi prosti radikali s kisikom v ksenobiotikov). Superoksidni anion je pomemben "izhodiščni" svoji strukturi in kisikove spojine, ki niso prosti radikali, vendar pri prosti radikal pri števil­nih poškodbah celic in tkiv, npr. tudi pri svojih reakcijah lahko delajo proste radikale. miokardnem infarktu. V vodnih raztopinah je superok­sidni anion razmeroma slab oksidant in zmerno močan reducent. Večino bio- Že nekaj časa je iz ekološkega in biomedicinskega pomena v kemičnih poškodb, če ne vseh, povzročajo druge reaktivne zvrsti, porastu zanimanje za ozonsko plast v ozračju, ki nas ščiti pred ki nastajajo pri reakcijah superoksidnega anio­na. Poglavitna reak- cija O2- je dismutacijska, ki poteka v dveh stopnjah: Celotna reakcija je (sumarično): Ta reakcija poteka počasi, ker je koncentracija vodikovih ionov pri fiziološkem pH majhna. Tipične hitrostne konstante za reakcije O2- Slika 1. Ponazoritev možnih elektronskih konfiguracij v kisikovi z nekaterimi biomolekulami so 104 do 106 M-1s-1, medtem ko z lipidi, molekuli O2. Reaktivnost narašča od leve proti desni. H2O2, histidinom in nekaterimi drugimi aminokislinami praktično ne reagira, saj je hitrostna konstanta za reakcije z njimi okrog 1 M-1 s-1. 40 060 2019 Farmacija.indd 40 20.9.2019 10:48:19  R e a k ti v n e k i si k ove z v r sti Razpredelnica 1. Nekateri reaktivni kisikovi prosti radikali. ZVRST IME OH· je primarni "krivec" za škodljive učinke ionizirajočih žarkov OH· hidroksilni radikal pri posrednem nastajanju pros­tih radikalov pod njihovim vpli- vom. Če pa ionizirajoči žarki neposredno zadenejo biopolimer, O2H· hidroperoksilni radikal lahko izbijejo elektron iz njega: ROO· peroksilni radikal RO· alkoksilni radikal Druge reaktivne spojine, ki pomembno vstopajo v reakcije s ses- ArO· aroksilni radikal tavinami celic, so podane v razpredelnici 2. Biopolimerov prosti UQ· semikinonski radikal radikal ima lahko elektron brez para ne samo na kisikovem ato- mu, temveč tudi na žveplovem, dušikovem ali ogljikovem atomu (heteroradikali). Pri presnovi kse­nobiotikov, kot so npr. mnogi Razpredelnica 2. Reaktivne kisikove spojine, ki niso prosti radikali. antibiotiki, z encimskim sistemom oksigenaze z mešano funkcijo (citokrom P450) nastajajo kot intermediati prosti radikali, ki lahko ZVRST IME uhajajo v mikrookolje (razpre­delnica 3). H2O2 vodikov peroksid 5 Nastanek radikalov pri homolitični fisiji kovalentne vezi HClO hipoklorna (hipoklorova) kislina Pri kovalentni vezi si atoma "delita" skupni elektronski par. Pri raz- ROOH hidroperoksid padu kovalentne vezi, npr. pri disociaciji soli v vodi, ima navadno en atom dodaten elektron, zato je elektronegativen, drug atom ROO peroksid pa odda elektron in je zato elektropozitiven. Tak razpad imenu- jemo "heterolitična fisi­ja". Nasprotno pa pri "homolitični fisiji" LH večkrat nenasičene maščobne kisline vsak atom obdrži svoj elektron, vsaj enemu atomu zato ostane nesparjen elektron, torej je prosti radikal. Zato se O2- , ki ni močno reaktiven, lahko oddaljuje s kraja nas- splošen primer: homolitična fisija: tanka. H2O2 kot produkt redukcije molekularnega kisika z dve­ma elektronoma je eden izmed najbolj stabilnih intermediatov pri 6 Pomen kovinskih ionov pri nastanku hidroksilnega redukciji O2- v vodnih raz­topinah. Ravno tako lahko difundira s radikala OH· kraja nastanka in kot električno nevtralna zvrst lahko prehaja sko- Kovine v prvi vrsti skupine "d" v periodnem sistemu elementov zi membrane (O2- ne more, razen, če so v membranah ustrezni so prosti radikali. Razumljivo je, da so prav te kovine, med njimi anionski kanali). V Fentonovih reakcijah v stiku s kovinskimi ioni najpogosteje železo, bistveni del številnih encimov. Kovine lah- nastaja hidroksilni radikal OH. ko bistveno prispevajo k nastajanju radikalov v organizmu, kadar se čezmerno nalagajo v tkivih (hemosideroza, Wilsonova Hidroksilni radikal OH· je zelo reaktiven in lahko reagira skoraj z bolezen, hemartroza pri hemofilikih). vsako biološko molekulo. Zato ima zelo kratek razpolovni čas (tipične hitrostne konstante za reakcije z biomolekulami so 108 V laboratorijskih razmerah nastaja hidroksilni radikal kot produkt do 1011 M-1s-1), ki mu ne dovoljuje difuzije daleč od kraja nastanka. neposredne interakcije med O2- in H2O2 (Haber-Weissova reak- Hidroksilni radikali reagirajo z odvzemanjem, dodajanjem ali pre- cija), vendar se je pokazalo, da ta reakcija ne poteka v bioloških nosom elektronov. sistemih. V živem svetu poteka reakcija večstopenjsko kot kata- primer odvzemanja elektrona liza s kovinskimi ioni. Za reakcijo je bistvena udeležba kovinskih soli v sledovih; najbolj primerne kovinske soli so železove, pa tudi primer oddajanja elektrona bakrove. Z železovimi ioni katalizirane reakcije superoksidne- ga aniona in vodikovega peroksida imenujemo po Fentonu, ki primer prenosa elektrona jih je prvi opisal že pred več kot sto leti, "Fentonove reakcije". Reakcija poteka v treh stopnjah: redukcija železa s superoksidnim Pod vplivom ionizirajočih žarkov nastajajo prosti radikali posred- anionom, "regeneracija" superoksidnega aniona v reakciji Fe3+ z no ali neposredno. Posreden način je pri radiolizi vode. Voda je vodikovim peroksidom in končno nastanek hidroksilnega radika- vsesplošno topilo v živem svetu; lahko je tudi strukturno vezana v la v reakciji Fe2+ z vodikovim peroksidom. biopolimerih. Ionizirajoči žarki lizirajo vodo v dveh stopnjah: ekscitirana molekula vode homolitična fisija vode 41 060 2019 Farmacija.indd 41 20.9.2019 10:48:19  R e a k tivne k isik ove z vrst i Hidroksilni radikal lahko nastane tudi pri reakciji vodikovega Reaktivne kisikove zvrsti nastajajo tudi endogeno v fizioloških peroksida z bakrom: razmerah (nekateri me­diatorji in lokalni hormoni) in pri patofizi- oloških procesih. Način delovanja je odvisen od mesta nastanka, reaktivnosti in polarnosti reaktivne kisikove zvrsti. Celotna reakcija (sumarično) pa je: 8.1 Učinki radikalov v mikrookolju živih organizmov Prosti radikali so po današnjih spoznanjih vpleteni v številne patofiziološke procese od akutnih zapletov (npr. ishemija in pos- treperfuzijska poškodba) do staranja. Poleg tega v telesu stalno nastajajo "koristni prosti radikali", ki imajo funkcijo bodisi "lokal- 7 Endogeno nastajanje superoksidnega aniona nih hormonov" ali nevrotransmi­torjev v osrednjem živčevju (npr. Razpredelnica 3 kaže celične procese, pri katerih nastajajo ali iz NO) do kompleksnih vlog cikličnih endoperoksidov in levko­ katerih uhajajo superoksidni anioni. trienov. Poškodbe celic s prostimi radikali so lahko genotok- sične (posredne ali neposredne poškodbe dedne snovi, ali Razpredelnica 3. Poraba O2 in nastajanje O2– v organizmu. poškodbe struk­turnih in funkcijskih molekul celic. PROCES O2– pretvorba 0,1 % 8.2 Škodljivi učinki hidroksilnega radikala OH· Hidroksilni radikal nastane pod vplivom ionizirajočega sevanja, porabljenega O2 v O2- zaradi uhajanja e- s ultrazvoka in vitro (npr. litotripsija, ultrazvočna diagnostika!), 80 do 90 % pod vplivom ozona in pri reakcijah, kataliziranih s kovinami kisika iz poraba kisika v dihalni kompleksov I in III (Fen­tonove reakcije in reakcije z bakrom). Pomen hidroksilnega vdihanega verigi radikala je tudi pri oksidaciji etanola v mikrosomih (indukcija zraka ubikinon: majhno citokroma P450 v mikrosomih). Pomen kovin za nastanek OH je uhajanje O2- zlasti pri natančneje opisan v poglavju 6, tu ponovimo predvsem to, da zvečanem p O2 v reakcije vstopajo voda, superoksidni anion, vodikov peroksid, encimske oksidacije preostali nastajanje O2- kovine in hidroksilni radikal. Škodljivost hidroksil­nega radikala je (NADPH oksidaze – NOX) kisik iz razvidna pri kopičenju železa v tkivih (idiopatska hemokromato- fagocitoza (NOX2) nastajanje O2- za ali hemosi­deroza po pogostih transfuzijah) in pri pomanjka- vdihanega mikrosomski elektronski nastajanje in uhajanje nju ceruloplazmina, zaradi česar se v tkivih kopiči baker – razvoj zraka transport (citokrom P 450) O2- Wilsonove bolezni. Značilne motnje pri Wilsonovi bolezni (hepa- 10 do 20 % avtooksidacija substratov nastajanje O - 2 to-lentikularna degeneracija) so mentalna zaostalost, tremor, motena koordinacija gibov, okvare jeter, pridružene so lahko okvare roženice in ledvic. 8 ROS v patofizioloških procesih V prejšnjih razdelkih smo spoznali, da reaktivne kisikove zvrsti Hidroksilni radikal, ki nastane v citoplazmi, praktično ne nastajajo v okolju in v živih organizmih. Med njimi so najpomem- more biti genotok­sičen, se pravi, ne more neposredno poško- bnejši kisikovi radikali in reaktivne kisikove spojine, ki niso radi- dovati DNA, ker ima zelo kratek razpolovni čas in zato kratko difu- kali. V organizmu so pomembne tudi spojine dušika s kisikom, zijsko razdaljo. Genotoksičen je lahko le, če nastane v jedru ali predvsem dušikov oksid ( NO) in peroksinitrit (ONOO-), katere v mitohondriju. Genotoksične poškodbe mitohondrijev vodijo v imenujemo tudi reaktivne dušikove zvrsti. njihovo staranje in propadanje. Pri genotoksičnih učinkih hidrok- silnih radikalov se lahko oksidira slad­korna komponenta nuklein- Pri kajenju nastaja najprej NO, ki se lahko oksidira v prosti radi- skih kislin, se pravi deoksiriboza, ali pa baze. kal NO2, ki povzroči peroksidacijo lipidov v celičnih membranah. Primer za to je hidrok­silacija gvanilne skupine DNA z OH , ki jo Poleg tega lahko tako NO kot NO2 reagirata s H2O2 in pri tem lahko natančno zasledujemo z občutljivim postop­kom, ki omo- nastaja HO. V pljučih zmanjšata koncentracijo antioksidantov in goča odkrivanje enega hidroksiliranega gvanozina na sto tisoč encimov, ki preprečujejo oksidativne poškodbe tkiva ter inaktivi- nukleozidov. Tako je mogoče meriti oksidativno poškodbo DNA. rata α1-antitripsin, zato pride do propada elastina. Mnogi avtorji Od zmogljivosti reparacijskih sistemov je odvis­no, ali se bo poš- menijo, da je to razlog za pogost razvoj emfizema pri kadilcih. kodovano mesto odstranilo in DNA zakrpala, ali pa se bo poško- dba ohranila in uveljavila posledice. Hidroksilni radikal je zelo Ozon nas po eni strani ščiti pred nevarnim UV-sevanjem, kadar reaktivna kisikova spojina, ki takoj reagira z vsako biomolekulo, je le visoko v atmosferi (ozon­ska luknja!), sicer pa je zelo toksi- s katero pride v stik, naj bo to lipid, protein, nukleinska kislina ali čen. Čeprav sam ni radikal, lahko v reakcijah dela proste radikale. antioksidant. Sproži lipidno peroksidacijo in v vodnih raztopinah lahko tvori OH·. V pljučih, podobno kot NO2 in OH , inaktivira α1-antitripsin 8.2.1 Lipidna peroksidacija in "potroši" vitamina C in E ter glutation (GSH). V reakcije z vitami- Začetek peroksidacije fosfolipidov in nenasičenih maščobnih nom C in GSH vstopa verjetno neposredno, izguba vitamina E v kislin je odvzem atoma vodika iz npr. verige maščobnih kislin, pljučih pa je najbrž posledica peroksidacije lipidov. 42 060 2019 Farmacija.indd 42 20.9.2019 10:48:19  R e a k ti v n e k i si k ove z v r sti najverjetneje v reakciji z OH. Nastanejo lahko heteroradikali z Peroksidacijo kakšne večkrat nenasičene kisline (LH) lahko spro- nesparjenim elektronom na C-atomu, npr.: žijo poleg radikalov OH· tudi alkoksilni radikali (LO·) in peroksilni radikali (LO2·). ali Po preureditvi atomov nastanejo konjugirani dieni in reakcija se Železo je pomembno tudi pri lipidni peroksidaciji, zlasti pri reak- ustavi, če npr. na nasprotni strani lipidnega sloja pride v stik z dru- cijah z lipidnim hidroperoksi­dom (L-OOH): gim C·-radikalom. To pa poveže molekule fosfolipidov na obeh straneh membrane, kar zmanjša fluidnost in prožnost membran. Druga možnost je reakcija z membranskimi proteini, kar tudi vpli- va na njihovo funkcijo. Najugodnejša možnost je, da se reakcija prekine v stiku z vitaminom E. V aerobnih razmerah pa so verjetnejše reak­cije radikala C z O2 in Sumarično lahko ponazorimo razpad lipidnih peroksidov v pero- nastane peroksilni radikal ROO·. Nastanek peroksilnega radika- ksilne in alkoksilne radikale v navzočnosti železovih ali bakrovih la je začetek verižne reakcije oksidacije lipidov (slika 2)! kompleksov tako: V reakciji z drugimi lipidi nastaneta lipidni hidroperoksid (=CHO2H) in nov peroksilni radikal. 8.2.2 Posledice lipidne peroksidacije Malonilaldehid nastaja v majhnih količinah v vseh tkivih, več pa Iz lipidnega hidroperoksida nastajajo ciklični peroksidi in ciklični ga nastaja med peroksidacijo v mikrosomskih frakcijah jeter. V endoperoksidi, sledi frag­mentacija do aldehidov (malonilalde- večini membran verižna reakcija peroksidacije ne bo poteka­la hid) in/ali polimerizacija v druge toksične presnovke. daleč, preden bo lipidni prosti radikal zadel na beljakovino in jo Slika 2. Verižne reakcije reaktivnih kisikov spojin lipidov (PUFA – ang. polyunsaturated fatty acids (polinenasičene maščobne kisline)). 43 060 2019 Farmacija.indd 43 20.9.2019 10:48:20  R e a k tivne k isik ove z vrst i so kompleksni polimeri oksidiranih lipidov, združeni s kovinami in beljakovinami. Velike koncentracije železa in bakra v teh pig- mentih kažejo na bistven pomen kovinskih ionov pri njihovem nastajanju. V literaturi so opisane povezave med čedalje večjim kopičenjem starostnih pigmentov na eni strani in spremenjeno funkcijo tkiva ter smrtjo tkivnih celic na drugi strani. 8.3 Nastanek in škodljivi učinki kisikovega singleta Kisikov singlet (pa tudi hidroksilni radikal) nastaja pri številnih fotodermatozah, med kateri­mi je najbolj tipična fotodermatoza pri porfiriji. Kisikov singlet – prosti radikal nastane tudi pri osve- tlitvi riboflavina in drugih flavinskih mononukleotidov ter biliru- bina (pride tudi do fotoizo­meracije). Patološke spremembe se pojavijo na osvetljenih delih kože. Slika 3. Reakcije superoksidnega aniona. Pri fotodermatozah in drugih poškodbah z ultravijolično svetlobo bi lahko omenili tudi tanjšan­je zaščitne plasti ozona in posledič- poškodoval. Beljakovine napadajo alkoksilni, nekoliko počasneje no povečano nastajanje prostih radikalov. pa tudi peroksilni radikali. V reakcije verjetno lahko vstopajo tudi ogljikovi prosti radikali, ki nastajajo v verižnih reakcijah lipidne 8.4 Pomen superoksidnega aniona v patofiziologiji peroksidacije. Malonilaldehid prizadene normalne funkcije Superoksidni anion – prosti radikal nastaja in vivo predvsem membranskih proteinov s tem, da jih prečno poveže ali pa kot stranski produkt mitohondrijske dihalne verige, proizvaja- inhibira njihove funkcionalne skupine, npr. -NH2 ali -SH2. V jo ga NADH in NADPH oksidaze (slednje imenovane NOX) ter membranah lahko nastanejo veliki agregati nefunkcionalnih pro- ksantin-oksi­daza oziroma ksantin-dehidrogenaza, ki in vivo teinov in celična membrana propada. Propad pospešijo tudi dru- prenaša elektrone od substrata na NAD+ namesto na kisik. Supe- gi produkti lipidne peroksidacije. Skozi poškodovano membrano roksidni anion nastaja tudi pri biotransformaciji nekaterih kseno- vstopajo kalcijevi ioni, iz celice pa se izgubljajo vitalne molekule biotikov. Fridovič in McCord sta leta 1968 odkrila encim superok- in kalijevi ioni, kar vodi v končni fazi v propad celice (nekroza, lah- sid-dismutazo (SOD), ki odstranjuje O2-. Neka­talizirana sponta- ko tudi apoptoza). na reakcija je počasna, zato O2- lahko oddifundira daleč od kraja nastanka. Podatki kažejo, da lahko prehaja tudi skozi nekatere Fosfolipidi, vgrajeni v strukturo mem­brane, so razmeroma odpor- anionske kanalčke. Sam superoksidni anion je slabo reaktiven v ni proti peroksidaciji, že majhna poškodba membrane pa lahko vodi. Bolj reaktiven je v hidrogenirani obliki, HO2 , ki lahko preha- sproži verižno reakcijo, v kateri nastajajo lizofosfolipidi, produkti ja membrane in povzroči peroksidacijo lipidov. Zaradi relativno peroksidacije, ki imajo deter­gentom podobno delovanje in tako majhnega redukcijskega potenciala deluje superoksidni anion poškodujejo membrane. Izgubljajo se maščobne kisline, pred- pogosto kot reducent, namesto oksidant. Kljub temu lahko supe- vsem nenasičene, ki najprej vstopajo v reakcije s prostimi radikali. roksidni anion poškoduje celice, saj oksidira železo-žveplove Holesterol ima v mem­branah pomembno vlogo v organizaciji centre števlinih encimov, npr. akonitaze (encim ciklusa trikarbok- strukture in uravnavanju fluidnosti membran. Majhne količine silnih kislin). V tovrstnih oksidacijah se sprosti železo, takojšnja holesterola pospešujejo, večje količine pa zavirajo peroksidacijo posledica je inaktivacija encima (slika 3). membranskih lipi­dov. Superoksidni anion reagira tudi z NO. Ta reakcija poteče 10-krat Že v začetnih fazah lipidne peroksidacije se z njo močno zmanj- hitreje od dismutacije superoksidnega aniona s SOD, zato v pri- ša antioksidantna zaščita celic, kar zmanjša verjetnost prekinitve sotnosti NO nastane produkt, anion peroksinitrit (ONOO-) (tudi reakcije. v prisotnosti SOD). Peroksinitrit je močan oksidant številnih za Med lipidno peroksidacijo nastajajo tudi bioaktivne spojine, celice pomembnih molekul. ki imajo lahko škodljive (npr. kancerogene snovi, radikali, ki inhibirajo funkcionalne skupine encimov) ali pa pogoj- V prisotnosti kovinskih ionov, kot je železo, lahko iz superoksida no koristne (npr. trombogene in antitrombogene) učinke. in vodikovega peroksida nastane hidroksilni radikal, ki je tudi Ciklični endoperoksidi, ki nastajajo iz ara­hidonske kisline, imajo močan oksidant. K nastanku OH lahko prispevajo tudi drugi pomembne fiziološke in patofiziološke funkcije (vnetje, hemosta- reducenti (askorbat, NADH, NADPH, tioli). Druge posredne mož- za, uravnavanje telesne temperature, žilnega tonusa itd.), prosti nosti za toksične učinke superoksidnega aniona so nastanek kisi- radikali, ki jih delajo aktivirani fagociti, pa ubijajo mikrobe. Med kovega singleta ali v drugih reakcijah hidrogenirane oblike HO 2 poškodbo nastali prosti radikali tudi vzpodbujajo novo celično in nato H2O2. rast in lahko delujejo antikancerogeno. Pomembna pa je tudi vloga prostih radikalov pri staranju. 8.5 Nastanek in učinki vodikovega peroksida Vodikov peroksid nastaja predvsem kot posledica encim- S časom se kot posledica lipidne peroksidacije nabirajo v skega odstranjevanja O2-· (dismutaza, peroksi­daza). Nepo- celicah "starostni pigmen­ti", kot sta ceroid in lipofuscin. To sredno lahko inaktivira encime s skupinami -SH. Oksidira lahko 44 060 2019 Farmacija.indd 44 20.9.2019 10:48:20  R e a k ti v n e k i si k ove z v r sti tudi nekatere ke­tokisline (npr. piruvično). Lahko prehaja celične Odkrili so prek 400 različnih (genetskih) poškodb tega encima. membrane in zaradi razmeroma majhne reak­tivnosti reagira z Odvisno od tega, koliko je zmanjšana aktivnost encima, lahko molekulami daleč od mesta nastanka. V citosolu lahko reagira z bolnik umre že v otroštvu ali pa šele v četrtem desetletju življe- žele­zovimi in bakrovimi ioni in nastaja HO. nja. Najhujše oblike so povezane z mutacijami na kromosomu X, blažje pa se dedujejo avtosomno. Preživetje ljudi 5 let po odkritju 8.6 Primeri koristnih in škodljivih učinkov radikalov pri človeku bolezni je manj kot 20 %. Ti bolniki imajo pogoste bakterijske in Prosti radikali lahko po eni strani povzročijo akutno poškod- glivične infekcije. Heterozigoti, prenašalci mutacij, ki povzročijo bo celice ali celo celično smrt, po drugi strani pa s počasnimi kronično granulomatozo, pa imajo povečano število vnetij, ki spremembami vodijo v degeneracije in staranje. Vpleteni so v niso posledica infekcij. celo vrsto patoloških procesov, poznamo pa tudi motnje, ki lahko nastanejo zaradi pomanjkanja "koristnih" prostih radikalov (npr. Halidno-mieloperoksidazni sistem (HMPO) je prav tako priza- hemoragična diateza pri pomanjkljivem nastajanju tromboksa- det predvsem z genetskimi okvarami, motnje pa so lahko tudi na). pridobljene. Potek je blažji kot pri kronični granulomatozi; neka- tere osebe so celo asimptomatske. Oksidativni izbruh je burna 8.6.1 Baktericidnost nevtrofilcev reakcija, ki lahko poškoduje tudi celice. Prosti radikali niso toksični le za človeka, ampak tudi za nižja bitja, kot so npr. virusi, bakterije in glive (glej tudi poglavje Vnetje). Spe- HMPO verjetno igra pomembno vlogo kot negativna povratna cializirane celice – makrofagi – delajo proste radikale v fagocitni zveza, saj so opazili, da pri ljudeh s pomanjkanjem HMPO oksida- vakuoli, in tako inaktivirajo mikrobe (slika 4). tivni izbruh traja dalj časa. HMPO verjetno inaktivira kemotaksine, α1-antitripsin, zavira delovanje naravnih ubijalk, trombocitov itd. Nekaj študij je pokazalo tudi zmanjšano nevarnost za trombotič- ne kardiovaskularne zaplete pri ljudeh s pomanjkanjem HMPO. Vloga HMPO v kancerogenezi in avtoimunskih obolenjih je še sla- bo poznana. Dobro pa je znana povezava po eni strani z imunsko insuficienco, po drugi strani pa tudi z avtoimunskimi obolenji. 8.6.2 Ishemična poškodba in radikali V kaskadi že prej omenjenih dogodkov nastane H2O2 in nato še OH s posledičnimi poškodbami celičnih membran. To hipotezo Slika 4. Reaktivne kisikove spojine in nevtrofilci. podpirajo tudi podatki, da alopurinol, ki je inhibitor ksantin-oksi- daze, lahko prepreči postreperfuzijske poškodbe miokarda. V oksidativni izbruh nevtrofilcev sta vpletena vsaj dva enci- Viri reaktivnih kisikovih zvrsti pri reperfuziji so številni: nevtrofilci, ma: NADPH-oksidaza 2 (NOX2) in mieloperoksidaza. Po delo- ksantin-oksidaza, avtooksidacija kateholaminov, ciklooksigena- vanju prvega nastane superoksidni anion, po spontani ali encim- za, lipoksigenaza, pri oksidativnem stresu in/ali prisotnosti pro- ski dismutaciji pa vodikov peroksid. Mieloperoksidaza, katere stega železa pa v Fentonovih reakcijah nastane OH. katalitični center je hem z železom, nato iz vodikovega peroksida in ionov klora dela hipoklorno (hipoklorovo) kislino, ki je močan Med ishemijo upada koncentracija ATP, nastaja AMP in iz njega oksidant. Nevtrofilci (pa tudi monociti/makrofagi) fagocitirajo hipoksantin. Hkrati ksantin-dehidrogenaza začne delovati kot patogene. V fagosomih je oksidazni sistem, ki tvori superoksidni oksidaza. Vzroki za to so najverjetneje delna hidroliza encima anion, ki lahko že sam uniči mikrobe. Pomanjkanje NOX2 vodi do zaradi vdora kalcija v celico, vezava na kalpain in oksidacija sku- kronične granulomatoze. pin -SH med reperfuzijo (slika 5). Ksantin-oksidaza tako postane Slika 5. Vloga ksantin-oksidaze pri nastanku superoksidnega aniona in vodikovega peroksida ob reperfuzijski poškodbi. 45 060 2019 Farmacija.indd 45 20.9.2019 10:48:20  R e a k tivne k isik ove z vrst i pomemben vir superoksidnega aniona. Čeprav njena vloga v 8.7.1 Encimi, ki ščitijo pred radikali miokardu ni neizpodbitna, je razmeroma obilno prisotna v endo- Dve vrsti encimov sta udeleženi pri zaščiti pred prostimi radikali. teliju koronarnih arterij. Prosti radikali zmanjšajo kontraktilnost To so hidroperoksidaze (katalaza in peroksidaze) in superok- miokarda ob reperfuziji (ang. myocardial stunning) in so vzrok ire- sid-dismutaza (SOD). To so antioksidantni encimi. verzibilnih poškodb miokarda. Superoksid-dismutaza je ime za družino encimov, ki so vsi metaloproteini in katali­zirajo isto reakcijo: 8.6.3 Drugi primeri patoloških stanj, v katere so vpleteni radikali in toksični produkti lipidne peroksidacije Primeri poškodb ali bolezni, ki nastanejo in potekajo prek delo- ali preprosteje vanja prostih radikalov, so še npr. radiacijski sindrom in eritemi, povzročeni z ultravijoličnimi žarki; spodbujanje maligne rasti, ini- ciacija karcinogeneze; hiper- in hipoksija, ishemija; ateroskleroza, V glavnem sta dva tipa SOD. Pri prvem tipu sta kot kovini zastopa- staranje; poškodbe jeter pri alkoholikih, bolezen silosnih delav- na baker in cink (Cu, Zn-SOD), nahaja se v citoplazmi. Pri drugem cev; akutne in kronične jetrne bolezni, vključno virusne hepato- tipu, ki se nahaja v mitohondrijih, je kovina mangan (Mn-SOD). patije; drugi vnetni procesi. Prosti radikali so vpleteni v (skoraj) SOD tesno sodeluje z encimi, ki odstranjujejo H2O2. To sta katala- vse patofiziološke procese. za in glutation-peroksidaza. 8.7 Zaščita celic in tkiv pred radikali Katalaza razgrajuje H2O2: Brez kisika ni aerobnega življenja, s kisikom pa je življenje tudi lahko ogroženo. Zato se je med evolucijo aerobnega življenja raz- vila zaščita celic pred prostimi radikali. Glutation-peroksidaza odstranjuje H2O2 tako, da oksidira gluta- Temeljna zaščita celice je v prvi vrsti njena strukturna in funkcij- tion (GSH): ska integriteta. V tem smislu pomenijo tudi reparacijski sistemi poškodovane DNA zaščito pred prostimi radikali. Bolj speci- fična zaščita temelji na sposobnosti posameznih encimov, da Ti encimi z odstranjevanjem O2 - in H2O2 onemogočajo nastajanje odstranjujejo proste radikale in druge reaktivne kisikove radikalov OH. zvrsti in na delovanju antioksidantov, ki niso enci­mi, vendar preprečujejo, zmanjšujejo ali ustavljajo verižne oksidacije, 8.7.2 Antioksidantne snovi, ki niso encimi sprožene s pros­timi radikali. Razpredelnica 4 kaže pregled anti- Izraz antioksidant je prvotno veljal za snovi, ki pretrgajo verižni oksidantov v celici in zunaj nje. proces pri lipidni peroksidaciji. Proučevanje lipidne peroksidacije pa je največ prispevalo k spoznavanju pomena prostih radika­lov v celici in zaščiti pred njimi. Dandanes se ta izraz rabi v širšem Razpredelnica 4. Pregled in lokacija nekaterih antioksidantov. pomenu: to je poljubna snov, ki v koncentraciji, ki je majhna v pri- merjavi s koncentracijo tarčne snovi prostega radika­la, prepreči, odloži ali zavira oksidacijo tarčne snovi. Antioksidanti lahko učin- V CELICI V CELIČNI MEMBRANI ZUNAJ CELICE kujejo na raz­ličnih stopnjah oksidacijskega procesa. Pri lipidni peroksidaciji npr. lahko preprečijo sprožitev (iniciacijo) z odstra- ceruloplazmin superoksid- α-tokoferol (inaktivira Cu2+ in njevanjem prostih radikalov, kot je OH. Lahko razgradijo peroksi- dismutaze de v produkte, ki niso radikali (npr. alkoholi). Lahko odstranjujejo deloma Fe2+) intermediarne radikale (kot so peroksi- in alkoksi- radikali) in tako transferin in laktoferin, katalaza karotenoidi pretrgajo verižno reakcijo. Takšni antioksidanti so fenoli in aro- ki vežeta Fe3+ matični amini. estri askorbinske hemopeksin in glutation- kisline, ki so bolj Vitamin E (α-tokoferol) spada med fenolne antioksidante in se haptoglobin, ki vežeta peroksidaza liposolubilni kot sama hem oz. hemoglobin kot topen v maščobah kopiči v hidrofobni notranjosti membran. kislina S prispevanjem vodika peroksilnemu radikalu pre­trga verižno ekstracelularna reduciran glutation ubikinon superoksid-dismutaza reakcijo. Sam pri tem pridobi en elektron brez para. Vendar je (malo aktivna) kot prosti radikal bolj stabilen in se včasih sam razgradi ali pa ga askorbat reducira nazaj v vitamin E. ubikinon askorbinska kislina Vitamin C (askorbinska kislina) je dvorezen; lahko deluje kot α-tokoferol, raztopljen antioksidant ali prooksi­dant, odvisno od razmer v okolju. V askorbinska kislina v plazemskih lipidih navzočnosti ionov Fe3+ in Cu2+ v vodnih raztopinah je askorbat lahko prooksidant. V nižji valenčni stopnji pa ioni teh kovin (Fe2+, mukus, ki lovi OH Cu+) katalizirajo nastajanje prostih radikalov (OH ). Od razmer- ja koncentracij ionov teh kovin in askorbata je odvisno, ali bo sečna kislina askorbat deloval kot anti- ali kot prooksidant. Če je koncentracija askorbata majhna v primerjavi s koncentracijo kovinskih ionov 46 060 2019 Farmacija.indd 46 20.9.2019 10:48:20  R e a k ti v n e k i si k ove z v r sti (Fe3+), bo askorbat učinkoval kot prooksi­dant, če pa je koncentra- Francis AJ, et al. The protective effects of L-ascorbc acid and cija velika, bo učinkoval kot antioksidant. DL-α-tocopherol on cultured rat embryos, treated with xanthine/ xanthine oxidase. Mut Res 1989; 214: 137–45. Karotenoidi (npr. β-karoten) so dobri lovilci prostih radikalov Fridovich I, Freeman B. Antioxidant defenses in the lung. Ann Rev pri majhnih parcialnih tlakih kisika, kot je npr. v zdravem tkivu. Physiol 1986; 48: 693–702. Poleg tega preprečujejo uveljavljanje učinkov kisikovega singleta Halliwell B, Gutteridge JMC. Free radicals in biology and medicine, 4th (O2) in učinkujejo sinergistično s tokoferolom v lipidnem okolju, ed. Oxord University Press, 2007. kjer je askorbat brez učinka. Halliwell B, Gutteridge JMC. Oxygen radicals and the nervous system. TINS January 1985: 22–6. 9 Izpitne teme Hassan HM. Attenuation of antioxidant enzymes in response to oxi- Kaj je prosti radikal? dative stress. In: Somogyi JC, Muller HR, eds. Nutritional Impact of Kateri so kisikovi prosti radikali in druge reaktivne kisikove zvrsti, Food Processing. Bibl Nutr Dieta, Basel, Karger, 1989; 43: 278–89. ki so pomembni za delovanje organizma v normalnih in patolo- Johnson JE, et al. Free radicals, aging, and degenerative diseases. ških razmerah? New York: Alan R. Liss, Inc, 1986. Kaj je superoksidni anion in kako nastane? Koivistoinen P. Mechanisms of lipid oxidation and antioxidation. In: Kaj je hidroksilni anion in kako nastane? Kaj so "Fentonove reak- Somogyi JC, Muller HR, eds. Nutrition­al Impact of Food Proces- cije"? sing. Bibl Nutr Dieta, Basel, Karger 1989; 43: 260–5. Kaj je in kako nastane kisikov singlet? Larramendy ML, et al. Correlation between the anti-oxidant enzyme Kateri prosti radikali so pomembni pri razvoju bolezni? Kateri so activities of blood fractions and the yield of bleomycin-induced povzročitelji škode in kateri so koristni? chromosome damage. Mut Res 1989; 214: 129–36. Učinki reaktivnih kisikovih spojin so odvisni od njihove reaktiv- Li R. Free radical biomedicine: Principles, clinical correlations and nosti in topnosti v telesnih tekočinah in lipidih. Razloži zakaj? methodologies. Bentham e Books. V kakšnih razmerah nastaja hidroksilni prosti radikal v telesu? Doi 10.2174/97816080532231120101. Kakšne poškodbe povzroča? Ali deluje genotoksično ali povzro- Qu HB. Nitric oxide: a revolution of free radicals theory of aging. Med ča poškodbe strukturnih in funkcijskih molekul? Ali je to morda Hypotheses 1991; 34: 60–1. odvisno od tega, kje nastane? Če "da", zakaj tako? Schoen FJ, Cotran RS. Blood vessels. In: Cotran RS, Kumar V, Collins T, Kakšna je vloga hidroksilnega radikala pri lipidni peroksidaciji? eds. Robbins pathologic basis of disease. 1998: 493–543. Kako pride do verižne reakcije peroksidacije lipidov in kako se Werns SW, Lucchesi BR. Free radicals and ischemic tissue injury. TiPS reakcija lahko prekine? Kakšne so posledice lipidne peroksidacije? 1991; 11: 161–6. Kdaj v organizmu prekomerno nastaja kisikov singlet? Katere Weber GF. The pathophysiology of reactive oxygen intermediates in bolezni so povezane z njegovim nastankom? the central nervous system. Med Hypotheses 1994; 43: 223–30. Pomen superoksidnega aniona v patofizioloških procesih: v kak- šnih razmerah nastaja in kakšne poškodbe lahko povzroči nepo- sredno in posredno prek nastanka drugih prostih radikalov. Ali je vodikov peroksid prosti radikal? Kakšne poškodbe povzroča in zakaj je nevaren? Reaktivne kisikove spojine nastajajo v organizmu tudi v normal- nih razmerah. Prekomer­ne koncentracije nastanejo, kadar jih preveč nastaja (razlogi?) ali kadar se premalo odstranju­jejo (raz- logi?). Naštej nekaj primerov. Opiši mehanizme za odstranjevanje prostih radikalov. Razloži encimsko katalizirane reakcije in delovanje "lovilcev" prostih radikalov. Vloga prostih radikalov v obrambi organizma: opiši vlogo prostih radikalov pri nevtro­filcih, pri vnetju in pri uravnavanju žilnega tonusa. Uporabi podatke iz drugih predavanj (vnetje, hemoragič- na diateza in tromboza, ateroskleroza...)! Razloži vlogo prostih radikalov pri reperfuzijski poškodbi po ishe- miji (npr. miokarda)! 10 Viri Brieger K, et al. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Med Wkly 2012; 142: w13659. Cotran RS, Kumar V, Collins T. Robbins pathologic basis of disease. 6thed. Cellular pathology, I; II in Acute and chronic inflammation. 1998: 1–89. Cerutti P, et al. Pathophysiological mechanisms of active oxygen. Mut Res 1989; 214: 81–8. 47 060 2019 Farmacija.indd 47 20.9.2019 10:48:20