Détection des acides nucléiques PDF

Détection des acides nucléiques Marquage et suivi des acides nucléiques  Introduction La capacité de détecter des acides nucléiques tels que l’ADN ou l’ARN est un savoir-faire technique essentiel qui est souvent utilisée dans les laboratoires de recherche médicale et biologique...

Détection des acides nucléiques Marquage et suivi des acides nucléiques  Introduction La capacité de détecter des acides nucléiques tels que l’ADN ou l’ARN est un savoir-faire technique essentiel qui est souvent utilisée dans les laboratoires de recherche médicale et biologique Il existe plusieurs approches courantes pour la détection d’acides nucléiques Les techniques du marquage  Définition du marquage est principalement employé dans toutes les techniques qui utilisent une sonde C’est quoi une sonde ? Est une Séquence d'ADN ou d'ARN marquée (par un composé fluorescent, un radio-isotope, ou un enzyme) que l'on utilise pour détecter des séquences homologues  On distingue le marquage dit « chaud » utilisant des isotopes radioactifs, et les marquages « froids » qui utilisent des molécules aux propriétés fluorescentes, luminescentes. Ces dernières sont de plus en plus employées car plus pratiques.  Les types des sondes Les sondes Les sondes doubles brins radioactives Les sondes simples brins Les sondes Fluorescence Colorimétrie non Chimioluminescence radioactives  Les techniques du marquage Marquage radioactif Les sondes doubles brins Les sondes simple brins extrémités Interne ADN En 5’ Nick translation ARN En 3’ amorçage au hasard Les sondes doubles brins  Marquage par translation de coupure (Nick translation) *Est une technique de marquage utilisant les propriétés de la DNA Polymerase I (E. coli), pour obtenir des sondes radioactives. *L’ouverture d’une brèche dans la structure primaire d’un des deux brins d’un fragment d’ADN est obtenue par l’action de la désoxyribonucléase pancréatique. *La DNA polymérase synthétise un nouveau brin d’ADN à partir de l’extrémité 3’OH terminale d’un coté de la brèche ainsi crée. Simultanément l’activité 5’→3’ exonucléase de la DNA pol I hydrolyse les nucléotides du coté 5’-phosphate de la même brèche. Figure 01: Marquage des acides nucléiques par translation de coupure * Nick translation* Amorçage au hasard ou Randon Printing -*La synthèse d’un brin marqué de DNA peut aussi être faite par une DNA polymérase à partir d’amorces contenant des séquences aléatoires. *Ces amorces sont obtenues par synthèse chimique d’oligonucléotides contenant au hasard chacune des quatre bases à chaque position. On peut aussi utiliser un produit de digestion poussée d’un ADN génomique réduit en fragments aléatoires de 6 à 12 nucléotides. -*Dans les deux cas, un ou plusieurs des oligonucléotides s’hybrident avec la séquence en 5’ du fragment d’intérêt (ADN simple brin) et servent d’amorces pour la synthèse d’un deuxième brin. -*Si cette opération est réalisée en présence de nucléotides substrats fortement marqués, le marqueur sera incorporé dans le DNA synthétisé. les deux brins d’ADN de la sonde sont : séparés par chauffage suivi un refroidissement brutal. Puis + un mélange d’oligonucléotides (hexanucléotides) Figure 01: Marquage des acides nucléiques par amorçage au hasard ( Random Printing) (Denis et al, 2016)  Donc: *Ces oligonucléotides vont s’hybrider avec le sonde pour une partie d’entre eux. *Ces oligonucléotides fixés vont servir d’amorces au fragment de Klenow de l’ADN polymérase I qui va reconstituer l’intégrité des deux fragments en présence de désoxynucléosides triphosphates marqués au 32P. *Des ADN polymérases par exemple dérivée du phage T7 sont actuellement les plus utilisées. Figure 02: Marquage des acides nucléiques par Amorçage au hasard  Marquage en 5’ avec la T4 polynucléotide kinase.Marquage pour les oligonucléotides de synthèse Figure 0 3: Marquage en 5’ des acides nucléiques  Marquage en 3’ avec une ADN pol. : fragment de Klenow, T4 ADN pol., Taq pol., transscriptase reverse) *remplissage d'un site 5' sortant généré par une enzyme de restriction. *avec une exonucléase *avec une terminal transférase Figure 0 4: Marquage en 3’ des acides nucléiques.  Les sondes simples brins ADN ARN Sondes à activité spécifique Rendements d’hybridation importante (Southern, meilleurs par rapport aux Northern Blot). hybrides ADN-ADN, plus Protection contre la nucléase stables. S1, Hybridation in situ. Pour hybridation in situ  Marquage non radioactive Figure5: Révélation par système biotine-avidine  1-Fluorescence : Absorption d'énergie lumineuse par une molécule (fluorochrome). Passage à l'état de Molécule excitée. Relaxation partielle avec perte de chaleur par échange avec le milieu ambiant. Retour à l'état fondamental par émission lumineuse (de plus grande longueur d'onde que l'onde de stimulation) = spectre de fluorescence.  2-Colorimétrie : *Colorants : biotine, digoxygénine, fluoresceine Exemple : l’ADN cible est fixé sur une membrane et les sondes sont biotinylées. *La détection est réalisée par ajout d’un complexe streptavidine-HRP (HorseRadish peroxidase ou Peroxydase de Raifort), l’enzyme permettant l’oxydation d’un chromogène. La mesure du signal est réalisée par colorimétrie  3-Chimioluminescence *La chimioluminescence se produit au cours d'une réaction chimique lorsque l'excès d'énergie est libérée sous forme de lumière. *De nombreuses réactions produisent ce phénomène et chacune émet une lumière de longueur d'onde spécifique, et d'intensité proportionnelle à la quantité de molécules réactives présentes. Attention : ces sondes « froides » présentent un problème de sensibilité et leur utilisation ne fait pas toujours l'unanimité = (l’ensemble = l’union) Tableau: Les avantages et les inconvénients de marquage (Coulibaly et al, 2016) Sondes Avantages Inconvénients *Nécessité de se * Elle ne se renature pas protéger contre le Chaudes sur elle même lors l’hybridation. rayonnement émis, un emploi ou utilisation des sondes inconfortable. *Décroissance rapide du P32 d’où un besoin de marquer les sondes fréquemment. Froides *Elles sont stables et donc réutilisables. *Ces sondes présentent un *Elles sont un peu moins problème de sensibilité et puissantes que les sondes leur utilisation ne fait pas chaudes. toujours l’union.