Cycle de Krebs PDF

Métabolisme 3ECTS (21h cours/9h TD) Jean MARY Lionel CLADIERE Maître de conférences, SU Maître de conférences, SU UMR 7144 – Adaptation et Diversité UMR 8227 – Laboratoire de biologie en Milieu Marin...

Métabolisme 3ECTS (21h cours/9h TD) Jean MARY Lionel CLADIERE Maître de conférences, SU Maître de conférences, SU UMR 7144 – Adaptation et Diversité UMR 8227 – Laboratoire de biologie en Milieu Marin intégrative des modèles marins Equipe DYDIV Equipe Glycobiologie marine [email protected] [email protected]  Programme * Introduction au métabolisme (JM) * Transports des sucres; glycolyse; gluconéogénèse; métabolisme du glycogène; voie des pentoses phosphates (LC) * Cycle de Krebs, Voie du glyoxylate (LC) * Acide gras: dégradation, biosynthèse (JM) * Corps cétoniques. (JM) * Phosphorylations oxydatives (JM) * Navettes métaboliques (JM) * Métabolisme de l’azote: acides aminés (dégradation, biosynthèse) transaminations; (LC) * Cycle de l’urée (LC) Biochemistry Voet & Voet 4ème édition 2011 Wiley Lehninger Principles of Biochemistry Nelson & Cox 6ème édition 2013 MacMillan Learning Carte des voies métaboliques majeures d’une cellule Métabolisme biochimique Catabolisme du glucose Fig: 2.2 La glycolyse Toutes les étapes de la glycolyse sont à connaitre dans les détails: substrats et produits (structure incluses) , co-facteurs, enzyme, régulations, … La glycolyse se déroule entièrement dans le cytoplasme et peut se décomposer en 2 phases : a) PHASE PREPARATOIRE, CONSOMMATRICE D'ENERGIE b) PHASE PRODUCTRICE D'ENERGIE Vue d'ensemble : 1° PHASE PREPARATOIRE IMPORTANT: tous les intermédiaires glycolytiques entre glucose et pyruvate sont phosphorylés. La phosphorylation a 3 fonctions : 1° Elle piège ces intermédiaires dans la cellule (pas de transporteurs permettant la sortie des phospho-sucres) 2° L'énergie métabolique est conservée dans les liaisons phosphates, et servira à la biosynthèse de l'ATP 3° Les enzymes glycolytiques fixent leurs substrats en se liant en particulier aux groupements phosphates -> accroissement de la spécificité et abaissement de l'énergie d'activation  1° PHASE PREPARATOIRE : réactions 1-5 1 – Transfert de groupe L'hexokinase est une enzyme allostérique, activée par le glucose et inhibée par un excès du produit Glc6P. (a) (b) ajustement induit par le glucose Biochemistry, Voet and Voet 4 – Clivage 5 – Isomérisation  Bilan de la Phase 1: NB : à l'issue de la phase 1,les 6 carbones du glucose se distribuent dans 2 molécules de glycéraldéhyde 3-phosphate (GAP). -> Lors de la phase 2 à partir du GAP, les bilans doivent donc être multipliés par 2. 2° PHASE PRODUCTRICE D'ENERGIE :réactions 6-10 6 – Formation d’un anhydride mixte Liaison à haut énergie libre standard ΔG’° d’hydrolyse = -49,3 kJ/mol 7 – Transfert de groupe Production d’ ATP par Phosphorylation directe 8 – Isomérisation 9 – Déshydratation Liaison à haut énergie libre standard ΔG’° d’hydrolyse = -61,9 kJ/mol  10 – Transfert de groupe Enzyme inhibée allostériquement par l’ATP Note : comme la PFK, la PK est inhibée allostériquement par l'ATP Production d’ ATP par Phosphorylation directe Bilan des Phases 1 et 2 : 1°) Glucose + 2 ATP 2 GAP + 2 ADP+2Pi 2°) 2 GAP + 4 ADP + 2 Pi + 2 NAD+ 2 PYR + 4 ATP + 2 NADH + 2 H+ Glucose + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 Pyruvate + 2 NADH + 2 H+ + 2 ATP  Problème : comment régénérer le NAD+ ainsi consommé ? Fermentation Fermentation Oxydation complète  Discussion :les besoins en nutriments et leur utilisation Chez les unicellulaires eucaryotes et les bactéries, la quantité de nutriments détermine si les cellules peuvent proliférer ou si elles doivent rester quiescentes. Pour proliférer, les cellules utilisent les nutriments (ex. sucres) pour en faire des molécules complexes (augmentation de la biomasse). Pour cela, elles utilisent souvent la fermentation au lieu de la respiration, qui sera elle utilisée pour exploiter au maximum les nutriments s'ils se font rares. Cette fermentation s'accompagne de l'excrétion de grandes quantités de petites molécules (éthanol, lactate, acides organiques). Chez les Métazoaires (organismes pluricellulaires), les nutriments sont en général abondants, et c'est la présence ou l'absence de facteur de croissance qui détermine si les cellules prolifèrent ou pas. Là encore, les cellules prolifératives ont un métabolisme largement fermentatif même en présence d'oxygène (= fermentation aérobie), et font préférentiellement de la respiration à un état quiescent, différencié, en consommant de faibles quantités de nutriments. Science 2009, 324:1029 -> Les cellules tumorales ont un métabolisme de cellules en prolifération, à la nuance près qu'elles sont ainsi, même en l'absence de facteurs de croissance. BILAN FINAL DE LA FERMENTATION DU GLUCOSE GLUCOSE + 2 ADP + 2 Pi 2 LACTATE + 2 ATP ou 2 ETHANOL + 2 CO2 + 2 ATP Conclusion : L 'oxydation incomplète du glucose en lactate ou en éthanol + CO2 produit 2 moles d'ATP par mole de glucose. Rq : Son oxydation complète en C02 (en présence d'oxygène) produit environ 15 fois plus d'ATP.  Discussion : la glycolyse est-elle réversible physiologiquement ? Rappel: pour la réaction aA +bB cC +cD NB : Alors que les valeurs de ΔG'0 sont des constantes, les valeurs de ΔG varient avec les types cellulaires et les conditions physiologiques. Conclusion : la glycolyse inclut 3 étapes irréversibles in vivo : (1) GLUCOSE + ATP -> GLUCOSE-6P + ADP (3) FRUCTOSE-6P + ATP -> FRUCTOSE 1,6-P2 + ADP (10) PHOSPHOENOLPYRUVATE + ADP -> PYRUVATE + ATP Le processus global GLUCOSE -> 2 PVRUVATES via la glycolyse est donc irréversible in vivo.  REGULATIONS DE LA GLYCOLYSE :Conséquences de l'inhibition de la PFK (forte charge énergétique et/ou excès de citrate, et/ou défaut de F2,6P2) HK lsomérase PFK Glc G6P F6P F1,6P2 Conséquence : le glucose intracellu laire s'équilibre avec l'extérieur (pas Glc d'accumulation dans la cellule). Toutefois l'hépatocyte possède une enzyme supplémentaire, la glucokinase (GK). Comme la HK, la GK transforme le Glc en G6P en présence d'ATP, mais avec des paramètres cinétiques différents, et elle n'est pas inhibée par le G6P. - Lorsque [Glc] est faible, seule la HK possède une affinité suffisante pour le transformer en G6P. - Mais lorsque la HK est inhibée par un excès de G6P, la GK prend le relais. Hexokinase + excès G6P -> intérêt ? Commentaires, questions-réponses : 1° Toutes les étapes de la glycolyse sont à connaitre par coeur : substrats et produits (structures incluses), co-facteurs, enzymes, régulations, etc… 2° Questions-réponses Glycolyse = voie par laquelle une molécule de glucose est oxydée en...... molécules pyruvate, avec production nette de......molécules d'ATP et......molécules de NADH. Localisation intracellulaire des enzymes de glycolyse ?...... Dans la phase préparatoire, le glucose est phosphorylé grâce à 2 molécules d'ATP en un hexose bis-phosphate, le......,qui est ensuite clivé en 2 trioses-P, le...... et le...... Dans la seconde phase de la glycolyse, l'un des 2 trioses-P, le......,est oxydé en Cl, et l'énergie de la réaction d'oxydation est conservée pour la formation de...... moles de NADH et...... moles d'ATP par mole de triose-P oxydé. La régulation de la glycolyse s'effectue au niveau de 3 étapes irréversibles, contrôlées par des enzymes soumises à régulation allostériques, lesquelles ?...... L'enzyme...... contrôle l'étape cinétiquement déterminante de la glycolyse. Les 2 principales formes de stockage du glucose, le...... et I'......, sont clivées dans les cellules en un intermédiaire, le......,qui est isomérisé en glucose-6P. Le...... produit dans l'étape 6 de la glycolyse doit être recyclé en...... substrat de cette même étape. Dans les conditions aérobies, les électrons passent du...... produit dans l'étape 6 à l'accepteur final,I'...... ,grâce à la respiration mitochondriale. En anoxie ou en hypoxie, ils servent à réduire le...... en lactate ou en éthanol et en....... Ces processus sont appelés....... Effets Pasteur et Warburg Louis Pasteur a décrit, en 1876, les relations réciproques existant entre la glycolyse aérobie et les phosphorylations oxydatives (utilisation de l'énergie libérée par l'oxydation des nutriments pour une production maximale d'ATP. En absence d'oxygène (anaérobiose), le faible rendement énergétique de la glycolyse impose une forte consommation de glucose. La glycolyse ralentit seulement lorsque la production d'ATP est suffisante, et c'est le cas lorsque les phosphorylations oxydatives sont actives (i.e. en aérobiose). En présence d'oxygène, la fermentation lactique est inhibée en faveur de l'oxydation complète du Glc en CO2 via la chaîne respiratoire mitochondriale et la forte biosynthèse d'ATP qui lui est associée. L'effet Warburg est la perte de l'effet Pasteur. Otto Warburg a été le premier (1956) à découvrir que les cellules cancéreuses continuent à produire du lactate à partir du glucose, même lorsque l'oxygène est abondant. Effet Warburg = fermentation aérobie. Alors que les tissus normaux utilisent la glycolyse pour produire environ 10% de l'ATP cellulaire, les 90% restant étant produits par les mitochondries, Warburg a montré que les cellules tumorales produisent en moyenne 50% de leur ATP via la glycolyse et 50% via les mitochondries. Il en résulte une très forte consommation de glucose qui est métabolisé à des fins énergétiques et en tant que précurseur de biosynthèses indispensables à la prolifération maligne de ces cellules.  Phosphorylations oxydatives/glycolyse anaérobie/glycolyse aérobie (effet Warburg) En présence d'oxygène les tissus non-prolifératifs (différenciés) métabolisent le glucose en pyruvate qui est majoritairement oxydé en CO2 par les mitochondries grâce aux phosphorylations oxydatives avec une forte production d'ATP. La privation d'oxygène rend ces mitochondries non- fonctionnelles, et les cellules redirigent le pyruvate en lactate grâce à la fermentation cytoplasmique (= glycolyse anaérobie), au prix d'une production minimale d'ATP. Science 2009, 324:1029 Les tissus prolifératifs normaux et les cellules tumorales convertissent la majeure partie du glucose qu'ils consomment en lactate, que l'oxygène soit présent ou non (= effet Warburg ou glycolyse aérobie). Leurs mitochondries restent toutefois fonctionnelles mais pratiquent une phosphorylation oxydative réduite ne produisant que peu d'ATP : ces cellules doivent alors compenser ce faible rendement énergétique par une consommation intensive de glucose (et d'autres nutriments). GLUCONÉOGENÈSE ET MÉTABOLISME DU GLYCOGÈNE Gluconéogenèse (ou néoglucogenèse) = biosynthèse de sucres à partir de précurseurs simples non-sucres Processus essentiel pour l'organisme. Besoins quotidiens en Glc du cerveau (adulte) :120 g. Rq :pour le corps entier, les besoins sont de 160 g. Disponibilité :20 g dans les fluides corporels, 190 g sous forme de stockage (glycogène). Conclusion: au delà d'un jour de jeûne, il faut obtenir le Glc d'autres sources -> c'est le but de la gluconéogenèse - Précurseurs majeurs du glucose pour la gluconéogenèse ? LACTATE (produit du métabolisme anaérobie des sucres dans le muscle squelettique et les globules rouges, et les tumeurs en hypoxie/anoxie) AMINO-ACIDES (produits de la dégradation des protéines) GLYCEROL (produit de la dégradation des triglycérides*) *NB : les acides gras ne sont pas des précurseurs du Glc (du moins chez les mammifères, voir plus loin) Localisation :foie (90%) et cortex rénal (10%).  Biosynthèse des sucres : analogies plantes-animaux Réversion partielle de la glycolyse Vue d'ensemble 7 des 10 étapes de la glycolyse sont réversibles in vivo Mais 3 d'entre elles sont irréversibles : 1° Glc -> G6P 2° F6P -> F1,6P2 et 3° PEP -> PYR Il faut donc contourner ces 3 étapes : la gluconéogenèse n'est pas l'inverse de la glycolyse. * Chez les eucaryotes, les passages G6P -> Glc et F1,6P2 -> F6P utilisent des enzymes cytoplasmiques. Le passage Pyr -> PEP utilise 2 enzymes (mitochondriale et cytoplasmique) et des navettes métaboliques entre ces 2 compartiments. * En outre, la mitochondrie participe à la gluconéogenèse à partir des aminoacides via le cycle de Krebs (CK), et le cytoplasme y contribue à partir des aminoacides et du glycérol-P. Glc (ou glycogène) Glycérol-P (triglycérides) PEP Amino Pyr Lact acides CK  Cette suite de réaction est à connaitre dans les détails 1° Passage PYR -> PEP Le pyruvate pénètre dans la mitochondrie où il est carboxylé en oxaloacétate (OAA*) grâce à la pyruvate GDP carboxylase (PC). Cette réaction consomme de l'ATP : GTP CH3-CO-COOH + CO2 HOOC-CH2CO-COOH (OAA) ATP ADP + Pi L'oxaloacétate est réduit en malate par la malate déshydrogénase (MDH) mitochondriale : HOOC-CH2CO-COOH HOOC-CH2-CHOH-COOH NADH, H+ NAD+ Après sa sortie de la mitochondrie, le malate est re- transformé en oxaloacétate grâce à la MDH cytoplasmique. ADP + Pi L'oxaloacétate est alors décarboxylé en phosphoénol ATP pyruvate grâce à la phosphoénolpyruvate carboxykinase cytoplasmique (PEPCK). Cette réaction consomme du GTP HOOC-CH2CO-COOH CH2=COP-COOH + CO2 GTP GDP *NB : la membrane interne mitochondriale est imperméable à l'OAA Bilan :utilisation d'ATP et de GTP pour transformer le GDP pyruvate en PEP : GTP PYR + ATP + GTP -> PEP + ADP + GDP + Pi Bilan énergétique: ΔG’°= + 0,8 kJ.mole-1, à comparer à celui de la glycolyse « inversée »: PYR+ ATP -> PEP + ADP ΔG’°= - 31,4 kJ.mole-1 Le PEP et le NADH cytoplasmiques alimentent la suite (réductrice) de la gluconéogenèse ADP + Pi ATP  Ces 2 réactions sont à connaitre dans les détails 2° Passage Fructose 1,6-P2 -> Fructose 6-P (cytoplasme) Fru1,6P2 + H2O -> Fru6P + Pi ΔG’° = - 16.7 kJ.mole-1, spontanée in vivo. Exterieur Enzyme : Fructose 1,6 bis-phosphatase (FBPase) Voir sa régulation plus loin. 3° Passage Glucose 6-P -> Glucose (cytoplasme) Glu6P + H2O -> Glc + Pi Seules les cellules hépatiques et corticales rénales disposent d'une seconde phosphatase, la Glucose 6-phosphatase (G6Pase), qui catalyse cette réaction. Glucose-6 phosphatase ΔG’° = -13,8 kJ.mole-1, spontanée in vivo. Cette enzyme est située sur les membranes du réticulum endoplasmique Voir sa régulation plus loin. CONCLUSION : La gluconéogenèse permet la synthèse de glucose et son exportation, ou bien son stockage sous forme de glycogène à partir de précurseurs non-sucres : lactate, triglycérides, aminoacides. à partir du glycérol des triglycérides: Glc Glycogène HOCH2CHOH-CH2OH (a) Glycérol + ATP -> Glycérol-1P + ADP G6P (b) puis Glycérol-1P + NAD+ Glycérol-P -> DHAP* + NADH, H+ (triglycérides) PEP Pyr Lact à partir du lactate du Amino muscle et autres acides cellules mitochondrie CK *Rq : le glycérol des triglycérides alimente donc la gluconéogenèse et/ou la glycolyse via le DHAP A démontrer Bilan carboné, énergétique et redox de la gluconéogenèse : 2 Pyr + 4 ATP + 2 GTP + 2 NADH, H+ Glc + 4 ADP + 2 GDP + 2 NAD+ + 6 Pi ΔG’° = -37,5 kJ. mole-1  Bilan énergétique glycolyse + gluconéogenèse -83,5 -37,5 = -121 kJ.mole-1 compatible avec celui des entrées et sorties : 2 ATP + 2 GTP -> 2 ADP + 2 GDP + 4 Pi ΔG’° ≈ 4 x (-30,5) kJ.mole-1 2 ADP Glc 4 ADP + 2 Pi + 4 Pi 2 ATP 4 ATP ΔG’° = -37,5 kJ.mole-1 ΔG’° = -83,5 kJ.mole-1 2 GDP + 2 Pi 2 GTP 2 Pyr Rq : le GTP et l'ATPsont équivalents du point de vue énergétique  Le cycle de Cori illustre la coordination de la glycolyse et de la gluconéogenèse Lors d'un effort brutal mais bref, le muscle utilise la phosphocréatine pour produire l’ATP nécessaire à la contraction. ADP ATP Au repos, la créatine kinase phosphoryle CH3 CH3 réversiblement la créatine. La P-créatine sert de réservoir d'énergie utilisée H2N pour régénérer l'ATP nécessaire à la contraction. Mais ce stock a une durée de vie limitée. ATP ADP Le muscle en contraction soutenue, les érythrocytes de façon constitutive et d'autres types cellulaires (ex. tumeurs en hypoxie/anoxie), transforment le glucose en lactate qui rejoint le foie à travers la circulation sanguine (alternative pour le muscle :dégradation aérobie des acides gras, par exemple lors d'un marathon). Cycle de Cori : le foie transforme ce lactate en glucose qui peut retourner aux autres cellules (dont le muscle). Rq :alors que le muscle produit 2 ATP par glucose fermenté en lactate, le foie consomme l'équivalent de 6 ATP pour chaque molécule de glucose néoformé à partir du lactate. Glc Glc Gluconéogenèse Glycolyse 6 ATP (GTP) 2 ATP 2 Pyr sang 2 Pyr Fermentation 2 Lac 2 Lac FOIE MUSCLE  Discussion : les cycles futiles Les hépatocytes sont capables d'utiliser la glycolyse ou la gluconéogenèse en fonction des circonstances. Or l'ensemble glycolyse + gluconéogenèse constitue un CYCLE FUTILE, i.e. un cycle susceptible d'hydrolyser tout l'ATP (et/ou le GTP) cellulaire, les intermédiaires métaboliques jouant le rôle de simples catalyseurs dans ce processus. 2 ADP Glc 4 ADP + 2 Pi + 4 Pi Bilan entrées/sorties : 2 ATP 4 ATP 2 ATP + 2 GTP ΔG’° = -37,5 kJ.mole-1 2 ADP + 2 GDP + 4 Pi ΔG’° = -83,5 kcal.mole-1 2 GDP ΔG’° = -121 kJ.mole-1 + 2 Pi 2 GTP 2 Pyr 1° Lorsque de telles voies "antagonistes" sont actives dans les mêmes cellules (foie ou muscle), comment les contrôler afin d'empêcher la dissipation de toute l'énergie cellulaire (essentiellement sous forme de chaleur) ? 2° La PC, la PEPCK et la FBPase sont présentes et actives même dans le muscle (mais pas la G6Pase), alors qu'elles s'opposent à la glycolyse indispensable à la contraction musculaire. Explication ?  Ce grand cycle futile peut se décomposer en 3 petits cycles futiles (en bleu gluconéogenèse, en rouge glycolyse). PC PFK ADP HK ADP CO2 ADP + Pi ATP ATP ATP PYR OAA F6P F1,6P2 Glc G6P ADPGTP PEPCK ATP GDP PK PEP CO2 Pi Pi FBPase G6Pase GTP -> GDP + Pi ATP -> ADP + Pi ATP -> ADP + Pi Bilans : ΔG’° = -30,5 kJ.mole-1 ΔG’° = -30,5 kJ.mole-1 ΔG’° = -30,5 kJ.mole-1 A l'exception de la G6Pase restreinte aux seuls hépatocytes, toutes ces enzymes sont exprimées dans les hépatocytes comme dans les cellules musculaires (ainsi que de dans plusieurs autres types cellulaires). Sans contrôle, un seul de ces 3 cycles consommerait toute l'énergie cellulaire. Ce n'est pas le cas, car toutes ces réactions sont sous contrôle cinétique. ln vivo, aucune de ces réactions ne se déroule dans les conditions standard, i.e. ce ne sont pas les ΔG’° qui comptent mais les ΔG. Le contrôle cinétique des activités enzymatiques en cause assure cette régulation. Exemple du 2ème cycle futile AMP, ADP ATP F2,6P2 Ce cycle est sous le contrôle de la PFK (appelée aussi citrate - H+ + PFK-1) et de la FBPase (appelée aussi FBPase-1). La PFK est activée : par une faible charge énergétique, via l'AMP et l'ADP par le F2,6P2 Elle est inhibée : par une forte charge énergétique via l'ATP par le citrate par H+ La FBPase est activée : par le citrate Elle est inhibée : par l'AMP (faible charge énergétique) par le F2,6P2 Remarques : 1° Ces effecteurs agissent en se fixant sur des sites distincts des sites substrats et modulent les activités de ces enzymes dites "allostériques". AMP + - 2° L'AMP, le citrate et le F2,6P2 régulent de façon F2,6P2 opposée ces 2 enzymes antagonistes citrate → Amplification des effets La PFK est inhibée par l'ATP, les H+ et le citrate: Le F2,6P2 active allostériquement la PFK hépatocytaire : (1) en augmentant son affinité pour le FRU-6P (2) en diminuant l'effet allostérique inhibiteur de l'ATP En outre, le F2,6P2 inhibe allostériquement la FBPase hépatocytaire en diminuant son affinité pour le F1,6-bisphosphate. L'insuline (hormone hypoglycémiante) sécrétée par les cellules β du pancréas, et le glucagon (hormone hyperglycémiante) sécrété par les cellules α du pancréas, régulent de façon opposée l'activité de la PFKFB: Son activité kinase (appelée parfois PFK-2*) augmente en réponse à l'insuline, entraînant une forte production de F2,6P2 et stimule la glycolyse. Son activité phosphatase (appelée parfois FBPase-2*) augmente en réponse au glucagon. via l'AMP cyclique, entraînant une forte baisse de F2,6P2 et une accélération de la gluconéogenèse. *Note : ne pas confondre cette enzyme bi-fonctionnelle avec les enzymes distinctes phosphofructokinase (PFK ou PFK-1) et Fructose 1,6-bisphosphatase (FBPase ou FBPase- 1). Kinase active A retenir : Phosphatase l'insuline favorise la inactive glycolyse et inhibe la gluconéogénèse; Le glucagon exerce les effets inverses. Kinase inactive Phosphatase active  AUTRES SITES DE REGULATION GLYCOLYSE vs NEOGLUCOGENESE PEP F2,6P2 + ATP - ADP - PK PEPCK ALA - PYR OAA PC AcCoA + ADP - Cycles futiles et régulation cinétique des flux métaboliques : les effecteurs comme le F2,6P2, l'AMP ou le citrate, qui agissent réciproquement sur des enzymes antagonistes, permettent de contrôler cinétiquement 2 voies elles-mêmes opposées. Exemple : si un même effecteur multiplie par 10 la vitesse de la réaction catalysée par la PFK et divise par 10 celle de la réaction catalysée par la FBPase, le flux métabolique est multiplié par ≈ 50 en faveur de la glycolyse. NB : ces remarques s'appliquent aussi bien aux hépatocytes qu'aux cellules musculaires. Flux net, sans effecteur = 20 Flux net, avec effecteur = 992 Conclusion : les cycles futiles permettent une modulation rapide des flux métaboliques Métabolisme biochimique CYCLE DE KREBS Glc ATP Cycle de Krebs (CK) cytoplasme 2 NADH Autres noms : cycle de l'acide citrique, cycle des mitochondrie acides tricarboxyliques. La dégradation du glucose (ou d'autres sucres) en 2 Pyr absence d'oxygène n'est qu'une oxydation partielle 2 NADH (glucose->pyruvate) qui ne produit que peu d'énergie (2 ATP/glucose), et qui doit être couplée à des 2 CO2 fermentations (lactique, éthanolique ou autres) pour 2 AcCoA fonctionner. Ce mode permet toutefois aux cellules de (sur)vivre au prix d'une consommation élevée de glucose. L'oxydation complète des sucres en CO2 est un 6 NADH moyen beaucoup plus rentable de produire de 2 FADH2 Cycle de Krebs l'énergie. Il s'agit alors d'un métabolisme aérobie (O2), qui dépend du couplage de la glycolyse au cycle de Krebs, ATP lui-même couplé aux phosphorylations oxydatives. 4 CO2 Dans ces conditions, la production d'ATP est environ O2 15 fois supérieure à celle des fermentations lactique ou éthanolique.  Les étapes du cycle de Krebs ne sont pas à connaître dans les détails, mais leurs caractéristiques essentielles doivent être maîtrisées. Le CK permet l'oxydation complète (en CO2) des molécules "énergétiques" : glucides, lipides et protéines. * mais certaines étapes sont aussi impliquées dans les voies de biosynthèse. * tout est mitochondrial (chez les eucaryotes). La plupart des enzymes sont situées dans la matrice mitochondriale. Une seule est localisée dans la membrane interne. * l’ensemble, couplé à la respiration sur O2, permet une forte biosynthèse de l'ATP (= phosphorylations oxydatives). A partir du GLUCOSE : Déjà vu : la glycolyse cytosolique produit du pyruvate à partir de glucose (en absence ou en présence d‘O2) Glc → 2 Pyr, avec une faible production d'ATP En aérobiose, le pyruvate est transporté dans la mitochondrie où il subit une 1ère décarboxylation oxydative en acétyl-CoA et CO2. L’ acétyl-CoA est ensuite intégré dans le CK, où il est décarboxylé en 2 CO2. Les 3 décarboxylations du pyruvate libèrent des électrons qui alimentent une chaîne respiratoire activée par O2. Au total, chaque molécule de Pyr → 3 CO2, et chaque molécule de Glc est donc totalement oxydée en 6 CO2. Phase 1: pénétration dans la mitochondrie du pyruvate issu de la glycolyse cytoplasmique, puis transformation en acétyl-CoA par le complexe de la pyruvate déshydrogénase = décarboxylation oxydative. 4 étapes catalysées par un complexe constitué de 3 sous-unités E1, E2 et E3 (MM = 2 106 g.mole-1) A retenir : Après entrée dans la mitochondrie, le pyruvate est décarboxylé, oxydé et transformé en acétyl-CoA grâce au complexe multienzymatique de la pyruvate déhydrogénase. L'acétyl-CoA peut ensuite intégrer le cycle de Krebs (entre autres voies métaboliques)  CH3-CO-COO- CO2 Exemple : complexe de la PDH bovine Le cœur (vert) comprend 60 molécules de E2, arrangées en 20 trimères pour former un dodécahèdre pentagonal. Le domaine lipoyl de E2 (bleu) pointe NAD+ un bras mobile vers l'extérieur et touche les sites actifs des molécules de E1 (jaune) arrangées autour de E2. Les sous-unités E3 (rouge) sont liées au NADH cœur où elles sont parcourues par le bras mobile de E2. Taille du complexe : 40-50 nm, soit ≈ 2 fois celle du ribosome. CoA-SH CH3-CO-CoA E1, pyruvate déshydrogénase E2, dihydrolipoyl transacétylase E3, dihydrolipoyl déshydrogénase  Cofacteurs thiamine pyrophosphate (TPP) lipoamide Lipoamide  Cofacteurs Thioester La liaison thioester R-CO-S-R' est très réactive. Son hydrolyse exergonique (ΔG’° = -31,5 kJ.mole-1) est énergétiquement équivalente à celle de l'ATP. L’acétyl-CoA est le principal transporteur/donneur universel de résidus acétyle "CH3-CO-". Le coenzyme A peut également s'associer à d'autres résidus acylés (par ex. succinyl-,voir plus loin). Etape 1:décarboxylation du pyruvate grâce à la thiamine pyrophosphate (TPP, vitamine B1). E1 Etape 2 : oxydation du groupe hydroxyéthyle "- CHOH-CH3"en groupe acétyle "-CO-CH3", avec transfert sur le lipoamide lié à E2 par un long bras E2 mobile, via la réduction d'un pont disulfure → formation de l'acétyl lipoamide. Etape 3 : transfert catalysé par E2 du groupe acétyle de l'acétyl-lipoamide sur le CoASH E2 → libération d'acétyl CoA et de la forme réduite du lipoamide. Etapes 4 et 5 : oxydation du lipoamide catalysée par Dihydrolipoamide + FAD E3 et le FAD, puis réoxydation du FADH2 aux → Lipoamide + FADH2 dépends de NAD+ E3 FADH2 + NAD+ → FAD + NADH + H+ Grandes lignes du CK (2) : Les noms des intermédiaires du CK sont à retenir, pas les formules. Les 4 carbones restants permettent de régénérer l'oxaloacétate initiateur. 5- Le succinyl-CoA est transformé en succinate et permet la phosphorylation directe de GDP en GTP (guanosine triphosphate, équivalent énergétique de l'ATP). 6- Le succinate est déhydrogéné en fumarate en présence de FAD qui est réduit en FADH2. 7- Le fumarate est hydraté en malate. 8- le malate est oxydé en oxaloacétate en présence de NAD+. → A ce stade, l'oxaloacétate est régénéré et un 2ème tour de cycle peut s'engager.  Ne pas apprendre leurs noms par cœur, sauf pour 8 enzymes contrôlent le CK : celles étudiées dans les encadrés 1- citrate synthase 2a et b - aconitase 3- isocitrate déshydrogénase 4- α-cétoglutarate déshydrogénase 5-succinyl-CoA synthase 6-succinate déshydrogénase 7-fumarase 8-malate déshydrogénase Toutes ces enzymes sont matricielles, sauf la succinate déshydrogénase localisée dans la membrane interne mitochondriale et qui fait partie de la chaîne respiratoire. Décarboxylations (2 sites) Production d'électrons (4 sites) qui alimentent la A retenir ! chaîne respiratoire Phosphorylation directe (1 site) Bilan carboné : à chaque tour du CK, entrée de 2C sous forme d'acétyl CoA et sortie de 2 C sous forme de CO2  Bilans carboné et redox de l'oxydation complète du pyruvate A connaître CH3-CO-COO- PYR NADH,H+ + 4 NAD+ CO2 +FAD CH3-CO-SCoA + GDP + Pi OAA CIT NADH,H+ NADH,H+ 3 CO2 FUM CO2 + 4 NADH,H+ +FADH2 ADP FADH2 α-KG SUCC NADH,H+ + GTP GTP CO2 SUCC-CoA CH3-CO-COOH + 3 H2O → 3 CO2 + 10 H+ +10 e- 4 NAD+ + 4 H+ → 4 NADH FAD + 2 H+ + 2e- → FADH2 1° La chaîne respiratoire transfère les électrons qui lui parviennent (NADH, FADH2) à l'oxygène → Le fonctionnement du cycle de Krebs illustré ci-dessus est donc strictement dépendant des conditions aérobies. 2° La respiration produit un gradient de protons qui permet l'activation de l'ATP synthase → production d'ATP. Bilan énergétique et redox de l'ensemble glycolyse-cycle de Krebs-phosphorylations oxydatives Pour info Régulations du CK Le CK est régulé : * Par la charge énergétique de la cellule (ATP, ADP, AMP) : haute charge inhibitrice basse charge activatrice * Par la disponibilité en substrats et en produits (acétyl-CoA/CoA, acides gras, NAD+/NADH, succinyl-CoA, citrate) : produits inhibiteurs substrats activateurs *Par des seconds messagers (Ca2+).  Discussion (1) IMPORTANT ! Les intermédiaires du CK sont constamment régénérés. Ils catalysent la décarboxylation oxydative de l’ AcCoA en 2 CO2, avec production de cofacteurs réduits qui alimentent la chaîne respiratoire. Pb :certains de ces intermédiaires sont également les précurseurs de diverses biosynthèses : leur consommation incontrôlée pourrait entrainer le désamorçage du CK avec arrêt de la respiration mitochondriale (i.e. mort cellulaire)... D'où la nécessité absolue d'entretenir ce cycle de façon à l'ajuster aux besoins, grâce aux réactions anaplérotiques (de remplissage): 4 réactions assurent essentiellement cette fonction anaplérotique (à ne pas apprendre dans les détails) : * Pyruvate + CO2 + ATP ↔ Oxaloacétate + ADP + Pi (pyruvate carboxylase,foie et reins) * Phosphoénolpyruvate + CO2 + GDP ↔ Oxaloacétate + GTP (PEP carboxykinase, cœur et muscle squelettique) Phosphoénolpyruvate + CO2 ↔ Oxaloacétate + Pi (PEP carboxylase,plantes supérieures, levures et bactéries) * Pyruvate + CO2 + NADPH ↔ Malate + NADP+ (enzyme malique, large distribution Le CK est un « hub » (commutateur, routeur) cellulaire impliqué dans le pro- et eucaryotes) catabolisme et dans l'anabolisme Discussion (2) IMPORTANT ! * Les 2 carbones qui entrent dans le CK sous forme d'AcCoA, en Glc sortent sous forme de 2 CO2 CH3-CO-COO- Chez les mammifères, le CK ne NADH,H+ PEP PC peut donc pas servir à la biosynthèse CO2 nette de glucose à partir d'AcCoA (via la gluconéogenèse). CH3-CO-SCoA PEPCK * Par contre, on peut produire du OAA CIT glucose à partir du PVRUVATE, via l'OAA NADH,H+ (grâce à la PC) et la gluconéogenèse. NADH,H+ On évite ainsi les 2 décarboxylations FUM CO2 associées au CK. FADH2 α-KG SUCC NADH,H+ * Toutefois, de nombreux organismes GTP CO2 (bactéries, levures, plantes) peuvent SUCC-CoA synthétiser le glucose à partir d'AcCoA... Comment ? Grâce au "shunt glyoxylique" ou voie du glyoxylate.  Voie du glyoxylate 2 CH3-CO-SCoA GLUCOSE Chez ces organismes, le shunt glyoxylique permet OAA CIT de court-circuiter le CK. Il repose sur 2 enzymes, isocitrate l'isocitrate lyase et la malate synthase. lyase → Résultat :on évite les 2 décarboxylations du CK. iCIT MAL GLYO Bilan net carboné : 2 AcCoA (4C) → OAA (4C), au CO2 lieu de AcCoA (2C)→ 2 CO2 (2C) FUM α-KG SUCC De nombreux micro-organismes et plantes utilisent CO2 ce shunt pour synthétiser du glucose ou SUCC-CoA d'autres sucres à partir d'acides gras, d'abord dégradés 2 AcCoA → OAA en AcCoA par la β-oxydation. COO- → La production d'OAA qui en résulte permet bien la | synthèse de Glucose à partir d'AcCoA issu des acides CH2 O=CH-COO- gras. | glyoxylate Ce shunt est absent chez les mammifères, qui ne CH-COO- peuvent donc produire de sucres à partir d'acides | gras. HO-CH-COO- -OOC-CH 2-CH2-COO - succinate malate synthétase CH2-COO- | HO-CH-COO- malate CH3-COSCoA  Pour info Collaboration glyoxysome-mitochondrie Dans les glyoxysomes, les acides gras sont oxydés en acétyl-CoA qui est converti en succinate grâce au shunt glyoxylique. Les réactions du shunt glyoxylique se déroulent simultanément à celles des mitochondries, et communiquent via des échanges d'intermédiaires. Le succinate produit dans les glyoxysomes est converti en malate mitochondrial qui peut passer dans le cytoplasme pour assurer la gluconéogenèse et la production de saccharose chez les plantes, ou bien alimenter les phosphorylations oxydatives via le CK mitochondrial. La régulation de l'activité isocitrate déhydrogénase (IDH) du CK détermine la partition de l'isocitrate entre les cycles de Krebs et du glyoxylate. Si la charge énergétique des cellules est élevée, l‘ IDH est inhibée: activation du shunt. Si la charge énergétique est faible, c'est l'inverse :activation du CK. Pyruvate déhydrogénase et cancer Afin d'éviter que la majorité du pyruvate produit par la glycolyse n'alimente le CK en hypoxie, l'activité PDH est régulée dans de nombreux types de tumeurs. HIF et myc induisent l'expression de la pyruvate déshydrogénase kinase PDHK1 qui phosphoryle et inactive la PDH. Les électrons issus du pyruvate n'alimentent plus la chaîne respiratoire via le CK, d'où une baisse protectrice de production des ROS. Remarque : l'activation coordonnée de la LDHA et de la PDHK1 amplifie la production et l 'exportation de lactate à partir du glucose. Le dichloroacétate (DCA) inhibe la PDHK1, et réoriente Nature (2012) 491:364 ainsi le flux de pyruvate vers les mitochondries des cellules tumorales hypoxiques, ce qui ralentit voire bloque leur cytoplasme extérieur Glc CO2 prolifération. Les traitements anti-angiogéniques destinés à couper + H2O l'oxygénation des tumeurs induisent HIF qui en retour CA9 Lact active la PDHK1, la LDHA et l'anhydrase carbonique (CA9). + H+ CO2 HCO3- + H+ CA9 catalyse la conversion extracellulaire du CO2 en HCO3-, + H2O HCO3- facilitant ainsi l'exportation des H+ qui accompagnent la forte production de lactate en hypoxie. Les inhibiteurs pharmacologiques de HIF, LDHA, et/ou de CA9, provoquent une réorientation du pyruvate vers la mitochondrie et/ou une hyper-acidification nuisibles aux tumeurs hypoxiques. De nombreux traitements combinés ou non sont en phase d'essais cliniques. Commentaires, questions-réponses : 1° Le CK permet l'oxydation complète des composés carbonés (sucres, graisses et protéines) en CO2. Les électrons ainsi libérés (NADH,H+ et FADH2) sont transférés à l'oxygène à travers une chaîne respiratoire, permettant in fine une forte production d'ATP. Le CK est donc strictement aérobie (dans les bactéries et les mitochondries). Il participe aussi aux biosynthèses, d'où la nécessité de son "remplissage". A retenir : Passage pyruvate -> acétyl-CoA -> CK Noms des intermédiaires, pas les formules Commentaires sur la dia des 8 enzymes contrôlant le CK Bilans carboné et redox de l'oxydation complète du pyruvate Principe des réactions anaplérotiques Intérêt de la voie du glyoxylate Rôle de la PDH dans le cancer. 2° Questions-réponses Ecrire l'équation complète (substrats, produits et cofacteurs) de la réaction catalysée par la pyruvate déshydrogénase...... Même question pour la citrate synthétase...... Quelles sont les étapes de décarboxylation associées au CK ?...... Où produit-on du NADH ?......du FADH2 ?...... Où procède-t-on à une phosphorylation directe ?...... Pourquoi le CK ne permet-il pas d'utiliser l’acétyl-CoA comme source de carbone pour la gluconéogenèse ?....... Ecrire l'équation complète (substrats, produits et cofacteurs) de la réaction catalysée par la pyruvate carboxylase. Quel est le rôle régulateur de cette réaction?...... A quoi sert l'enzyme malique ?.......