Bacterii Gram-pozitive de Importanță Medicală PDF

Bacterii Gram-pozitive de importanta medicala Bacili Gram-pozitivi sporulați aerobi Familia Bacillaceae, g. Bacillus – B. anthracis -antraxul la ierbivore și accidental la om, agent important al bioterorismului; – B. cereus -intoxicație alimentară și infecții oculare sau...

Bacterii Gram-pozitive de importanta medicala Bacili Gram-pozitivi sporulați aerobi Familia Bacillaceae, g. Bacillus – B. anthracis -antraxul la ierbivore și accidental la om, agent important al bioterorismului; – B. cereus -intoxicație alimentară și infecții oculare sau cu alte localizări;  Bacillus anthracis B. cereus și B. anthracis B. thuringiensis Necesar de tiamină + - pentru creștere Hemoliză* - + Capsulă + - polipeptidică** Liză mediată de bacteriofagul + - gamma*** Mobilitate - + Creștere pe mediu hidrat de cloral (2,2,2- - + tricloro-1,1-etandiol) String test + -  Virulența La om, sporii pătrund prin leziunile tegumentare (antrax cutanat), rareori prin membranele mucoase (antrax gastrointestinal) sau prin inhalare (antrax pulmonar). Sporii germinează la locul de pătrundere și induc apariția unui edem gelatinos și congestie. Bacilii se diseminează pe cale limfatică și sanguină, se multiplică în sânge. Celulele capsulate sunt virulente și induc antraxul clinic Factori de virulența: – un polipeptid (poli-γ-D acid glutamic) din structura capsulei, care-l protejează de fagocite; – o toxină alcătuită din 3 componente proteice: antigenul protector (PA), factorul letal (LF) și factorul edematos (EF). Antigenul protector – Complexele PA + LF sau PA + EF sunt internalizate prin mecanismul endocitozei mediate de receptor sub forma complexelor heptamerice. După acidifierea endosomului, subunitățile LF și EF sunt eliberate în citosol. EF și LF au rolul componentei active (A), iar componenta PA are rolul de legare de receptorul membranar (B). Antigenul protector pare să formeze canale pentru trecerea ionilor prin membrana celulei eucariote. Factorul edematos -o adenilat-ciclază, dependentă de Ca2+. Factorul letal - o metaloprotează dependentă de Ca și de Zn. Complexul LF și PA determină leziunile tisulare, șocul sistemic și moartea, mediate de nivelele înalte de citochine. Răspunsul imun anti PA este protector. Carbune cutanat – forma buloasa  Frotiu din amprenta de splină a şoarecelui decedat după 48 ore de la inocularea suspensiei bacteriene. Coloraţie cu albastru de metilen policrom (1000x). Bacillus anthracis şi celulele splenice apar coloraţi în albastru, iar capsula colorată metacromatic în roz. Frotiu din cultura de 48 ore pe agar nutritiv. Bacili gram- pozitivi mari (0,9 micrometri/3-8micrometri) aşezaţi în lanţuri arcuite, sporulaţi, cu spor oval situat central şi care nu deformează corpul bacteriei.  Bacillus anthracis, detaliu al Bacillus anthracis. Cultură de 24 ore pe unei culturi de 24 ore pe agar agar nutritiv (1/1): nutritiv (x3). Aspectul de "cap colonii mari de 3 mm, aplatizate, de tip de meduză": periferia R. coloniei examinată cu lupa apare înconjurată de prelungiri laterale ondulate precum şuviţele de păr.  Cultură de 24 ore pe agar cu 5% sânge de Bacillus anthracis cultură de 24 ore pe agar cu 5% berbec(1/1). Coloniile mari, sânge de berbec (x3). În această imagine de detaliu observăm rugoase, alb-cenuşii, turtite, nehemolitice coloniile mari cu diametrul de 5 mm, alb-cenuşii, aparţin Bacillus anthracis ( jos ); coloniile cu rugoase, cu aspect de "sticlă pisată". morfologie asemănătoare, dar înconjurate de o zonă largă de beta-hemoliză aparţin Bacillus cereus (sus)  B. cereus Bacili mari, imobili, sporulati, aerobi, Gram pozitivi, cu capetele în unghi drept, așezati în lanțuri lungi. Se dezvoltă în alimente, unde secretă o enterotoxină și produce intoxicația alimentară. emetică – asociată cu consumul orezului diareică – produsă de consumul cărnii – asociată cu diaree masivă. Enterotoxina poate fi sintetizată nu numai în alimente, dar și în lumenul intestinal. Determinanții virulenței la Bacillus cereus: – 3 fosfolipaze C (lecitinaza, fosfatidil-colin hidrolaza, fosfatidilinozitol-hidrolaza), hemolitice; – sfingomielinaza, hemolitică; – hemolizina I (cereolizina), o citolizină termolabilă, activată de sulf -produce microperforații membranare, care perturbă controlul echilibrului ionic. În sânge, hemolizina I este inactivată de colesterol, ceea ce limitează efectele patologice în infecțiile naturale; – hemolizina II, alcătuită din două subunități (cea care mediază legarea și cea activă, cu efecte necrotice asupra enterocitelor). Activitatea sa nu este neutralizată de colesterol; – hemolizina III, denumită factorul emetic, este o proteină sau un grup de proteine cu gr. mol. mică, foarte stabile la căldură, la acțiunea proteazelor și la variația pH. Este un dodecadepsipeptid. Lecitinaza m. Nagler  Bacili Gram-pozitivi sporulați anaerobi g. Clostridium C. perfringens C.septicum C. novyi C. difficille C. tetani C.botulinum Lecitinaza + - + - - - Spor subterminal subterminal central Subterminal subterminal terminal Mobilitate - + + + + + Beta hemolizã + + + - + + Fermentarea + + + + - + glucozei Reducerea + + + - - - nitraților la nitriți  Virulenta exotoxine de o mare diversitate structurală, cu proprietăți imunogene proprii. – 8 tipuri de tulpini de C. botulinum – 5 tipuri de tulpini de C. perfringens enzime: colagenaze, proteaze, DN-aze, neuraminidaze neurotoxine: toxina tetanică (produsă de C. tetani), toxina botulinică (produsă de C. botulinum); enterotoxine: enterotoxina (eliberată de C. perfringens tulpini de tip A) produce intoxicația alimentară acută la om; tulpinile iota și ε de C. perfringens produc enterotoxemie la oi, viței, miei și cobai; C. sordelii produce o toxină hemoragică, asociată cu diaree la viței și oi; histotoxine sau toxine citolitice produse de unele tulpini de C. perfringens, agenții gangrenei gazoase și ai celulitei anaerobe; citotoxine (toxine ce acționează asupra citoscheletului), produse de C. difficile: toxinele A și B ce produc colita sau diareea asociate cu antibioticele la om sau tulburări diareice la animale. Toxinele care alterează citoscheletul produc ruperea actinei F (filamentoase) în celulele sensibile. – toxina A de C. difficile este o enterotoxină puternică.  Organismul Maladia Toxinele letale majore Mecanismul toxicității C. perfringens tip A Gangrena gazoasă Toxina α Fosfolipaza C dependentă de Ca C. perfringens tip C Intoxicație alimentară Enterotoxina Modificări de permeabilitate ,, Gangrena gazoasă Toxina α Fosfolipază dependentă de Ca ,, Enterita necrotică Toxina β Citotoxina C. septicum Gangrena gazoasă Toxina α Hemolizină, citolitică C. novyi tip A Gangrena gazoasă Toxina α Citotoxină C. sordelii Gangrena gazoasă Toxina letală Citotoxină ,, Diaree hemoragică Toxina hemoragică Citotoxină, enterotoxină C. tetani Tetanus Tetanospasmina Neurotoxină, clivajul sinaptobrevinei C. botulinum tip A, B, Botulism Toxina botulinică Neurotoxină, clivajul sinaptobrevinei C1, D, E, F, G C. difficile Diaree și colită Toxina A Citotoxine, ruperea filamentelor pseudomembranoasă Toxina B de actină asociată cu administrarea antibioticelor  Clostridii histolitice - contaminări simple - celulita anaerobă - mionecroza clostridiană (gangrena gazoasă).  C. perfringens – 4 toxine letale majore (α, β, ε, ι (iota):5 tipuri toxigene: A, B, C, D, E – 9 toxine minore (antigene solubile) δ, θ (hemolizină), k (colagenaza), λ (protează), µ, ν (DN-aza), γ, eta şi neuraminidaza (sialidaza, creşte vâscozitatea sângelui şi favorizează tromboza capilară). – Enterotoxina poate cauza intoxicaţii alimentare produce creşterea permeabilităţii capilarelor, vasodilataţie şi creşterea motilităţii intestinale.  Toxina α – o fosfolipază C (o lecitinază dependentă de Ca), – metaloprotează cu Zn, de 53 kDa, – produce o hemoliză incompletă pe agar-sânge. – In vivo, α-toxina produce hemoliza intravasculară, agregare plachetară, leziuni capilare, liza leucocitelor, hipotensiune şi bradicardie – Este factorul major al mionecrozei (gangrena gazoasă). Toxina-β – toxină letală majoră produsă de tulpinile B şi C de C. perfringens. – leziunile enteritei necrotice la pacienţii cu un nivel scăzut al dietei proteice. Toxina-ε – produsă de tulpinile de tip B şi D, ca protoxina – creşterea permeabilităţii peretelui intestinal, cu creşterea înglobării toxinei, care acţionează sistemic ca o toxină letală. După intrarea în circulaţie produce hiperemie renală, edem pulmonar, exces de lichid pericardic. Toxina iota – sintetizată de tulpinile E de C. perfringens izolate din intestinul de viţel cu semnele enteritei şi ale intoxicaţiei generale. – alcătuită din două proteine, distincte biologic şi imunologic (iota-a şi iota-b). Activitatea toxică este produsă de amestecul celor două proteine. Asupra actine globulare a muşchilor striaţi şi actinei nemusculare - ADP-ribozilate. – Este dermonecrotică şi letală pentru şoarece. Enterotoxemia este produsă de enterotoxine, β-toxină şi toxina ε.  C. histolyticum produce cel puţin 5 toxine-enzime: - α-toxina necrozantă şi letală produce moartea animalelor în 24 de ore de la injecţia intramusculară. Tegumentul şi muşchii adiacenţi zonei injectate sunt complet lizate; - β-toxina are efecte colagenazice - metaloprotează care clivează colagenul nativ triplu-helix şi gelatina. Pe baza proprietăţilor fizice s-au identificat 7 variante de colagenaze; - γ-toxina, o protează activată de gruparea tiol, ce digeră gelatina, cazeina, dar este inactivă faţă de colagen; - δ-toxina, o enzimă proteolitică cu actvitate elastazică, inactivată reversibil în prezenţa agenţilor reducători; - ε-toxina, o hemolizină labilă la O2, asemănătoare serologic cu cele produse de alte clostridii.  C. difficile Agentul colitei pseudomembranoase(PMC) post-tratament cu antibiotice C. difficile este toxigen – enterotoxină (toxina A – de 400-600 kDa) – citotoxină (toxina B – de 360-500 kDa) Toxina A se leagă de gangliozidul GM1 al bordurii în perie a enterocitului şi este la fel de activă ca şi toxina holerică. Toxina B are acţiune predominant citotoxică şi este mai puternică decât toxina A. Diagnosticul infecției cu C. difficile -detectarea uneia sau ambelor toxine în scaun și prin observarea endoscopică a pseudomembranelor sau a microabceselor mucoasei colonului la pacienții cu diaree post tratament cu antibiotice, în special cu ampicilină și clindamicină. Alte bacterii anaerobe din microbiota normală Surse de izolare Coci Gram-pozitivi Peptostreptococcus spp. Tractul respirator, infecții intra-abdominale, infecții subcutanate Streptococi microaerofili Sinuzite, abcese craniene Bacili Gram-pozitivi- nesporulati Actinomyces spp. Abcese intracraniene, pneumonii, infecții ORL Propionibacterium acnes Infecții cardiace și intracraniene Bifidobacterium spp. Otite Bacili Gram-negativi Bacteroides fragilis grup (Bacteroides fragilis, B. Infecții intra-abdominale, infecții al tractului genital thetaiotamicon) la femei, infecții neonatale, sepsis Prevotella spp., Porphyromonas spp. Infecții orofaciale, pneumonii, peritonite, Prevotella oralis Infecții orofaciale Prevotella B. oris-buccae Infecții orofaciale și intra-abdominale P. bivia, P. disiens, Fusobacterium spp. Infecții ale tractului genital la femei Fusobacterium nucleatum Infecții orofaciale, respiratorii,, abcese intracraniene Fusobacterium necrophorum Pneumonii Tratamentul empiric de urgență în infecțiile cu anaerobi Coci Gram-pozitivi Coci Gram-negativi Bacili Gram-negativi anaerobi Bacili Gram-pozitivi anaerobi anaerobi anaerobi Penicilina cefalosporine Penicilina cefalosporine Penicilina Penicilina, cefalosporine, clindamicină vancomicină cloramfenicol clindamicină La tulpinile producatoare de eritromicinã, lincomicină, vancomicină imipenem penicilinaza: metronidazol, clindamicină, vancomicină, sparfloxacină cloramfenicol, clindamicină, rifampicină, sparfloxacină imipenem, cefoxitin și combinatii cu inhibitori de beta lactamaze (amoxicilinã – clavulanat, ampicilina– sulbactam, ticarcilina – clavulanat). Nu se folosesc ciprofloxacina Nu sunt eficiente Nu se recomandă și metronidazolul aminoglicozidele, metroniodazolul (majoritatea cotrimoxazolul, cefalosporinele bacililor sunt rezistenți). de generatia III – a, chinolonele și monobactamii Bacili Gram-pozitivi nesporulați aerobi g. Listeria 6 specii – L. monocytogenes şi L. ivanovii sunt implicate în patologia umană şi respectiv animală – bacil scurt (asemănător ca morfologie cu Corynebacterium), uneori grupat în lanţuri scurte, Gram pozitiv, cu forme cocobacilare, facultativ anaerob, nesporulat, necapsulat, pozitiv pentru catalază, ce creşte uşor pe geloză nutritivă, iar pe agar- sânge produce hemoliză completă de tip β. – Psichrofile – -10% dintre adulţii sănătoşi pot fi purtători de Listeria în intestin  Listeria monocytogenes. Cultură de 24 ore pe mediul selectiv PALCAM (1/1). Selectivitatea este dată de polimixină, acroflavină, clorură de litiu, ceftazidim, esculină, manitol. Coloniile sunt negre sau cenuşii inconjurate de un halou brun-închis.  Teste de identificare – Catalaza + – Mobilitate in umbrela la 25oC – Testul CAMP L. monocytogenes Hemoliza in bloc diferita CAMP- Streptococcus agalactiae de cea in sageata  Diagnosticul diferential al L. monocytogenes fata de alte bacterii Gram- pozitive  L. monocytogenes este un patogen oportunist. Risc ridicat de infecţie: – nou-născuţi, gravide, persoanele imunocompromise şi debilitate (cu malignităţi, supuse chimioterapiei sau terapiei imunosupresoare, cu ciroză sau alcoolism, cu insuficienţă renală, diabet sau lupus) şi vârstnicii de peste 60 de ani, la care poate provoca infecţii severe (septicemie şi meningită). – mortalitatea la aceste grupe de risc este de 30-40%. – Tropism ridicat pentru SNC si placenta  Factori de virulenta internalina Inl A proteina Act A (inductoare a polimerizării actinei) P60 –declanseaza endocitoza Listeriolizina O – factor major al virulenţei esenţială pentru creşterea intracelulară a bacteriei – hemolizină (Hly). – Nu este toxică pentru organismul animal, dar lizează eritrocitele, eliberând cantitatea de Fe necesar bacteriei. – Colesterolul inhibă ireversibil activitatea citolitică a acestei familii de toxine-enzime. Două tipuri de fosfolipază C (plc A şi plc B)  Erysipelothrix rusiopathiae bacil Gram pozitiv, pleomorf colonii mici transparente, strălucitoare se decolorează uşor şi uneori apare ca fiind Gram negativ. produce H2S /se deosebeşte de L. monocytogenes. catalaza, oxidaza şi indol negative beta-hemolitic la om, leziuni de culoare violacee la degete, caracterizate prin edem şi durere, nesupurative endocardite Tratament cu Penicilina G  Dignostic de laborator Catalaza – Atmosfera de CO2 Crestere pe geloza sange/chocolat – colonii gri sau translucide cu hemoliza alfa Producere de H2S pe TSI Aspect pleomorf, bacili, lanturi scurte, in V, uneori forme filamentoase  Corynebacterium sp. specii patogene pentru om şi animale; specii patogene pentru plante; specii nepatogene. C. diphteriae - difteria C. minutisimum - dermatoză a pielii C. mycetoides –ulcere cutanate C. urealyticum -infecţii urinare C. ulcerans - faringită exudativă sau ulcere ale tegumentului mâinii; C. ovis -limfadenita granulomatoasă acută sau pneumopatii cu eozinofile. C. xerosis C. pseudodiphtheriticum C. pseudotuberculosis C. jekeium  Corynebacterium diphteriae agentul cauzal al difteriei (boala eradicata)- toxemie produsa de toxina difterica Tozina lizogenica- tox+ Boala controlata prin vaccinare Toxina de tip AB Inhbia sinteza proteica – inactivarea EF2 degenerarea parenchimatoasă şi depozitarea lipidelor în ficat, necroza muşchiului cardiac, a ficatului, rinichiului, corticosuprarenalelor, uneori cu hemoragii ample. În stadiile primare, toxina favorizează invazivitatea prin distrugerea celulelor epiteliale şi a celulelor inflamatorii fagocitare  Forme clinice Respiratorie – Contaminarea pacientilor neimunizati prin picaturile Flügge – Incubatie 2-5 zile – Simptome: febra, dureri in git, stare generala alterata – Formarea pseudomembranelor dure (albicioase, gri) Extrarespiratorii – Sistemice - insuficenta renala, hepatica, afectarea SNC – Forme cutanate – zonele tropicale, favorizate de intreruperea continuitatii cutanate, suprainfectie cu CGP  Diagnostic de laborator Medii selective - Serum Tellurite /modified Tinsdale, Colonii gri, brune cu halou negru Geloza sange – colonii nehemolitice Bacili GP nesporulati, in palisada, L, V, litere chinezesti, pleomorfici  Evidentierea granulatiilor metacromatice Babes Ernst Cultivare pe mediu Loeffler sau Pai Coloratie Loeffler albastru de metil Testul Elek pentru producerea toxinei - imunodifuzie  Actinomicete Bacili Gram pozitivi – acido-alcoolo-rezistenti - g. Mycobacterium; – reacţie uşor pozitivă -în g. Nocardia, – negativi pentru acido-alcoolo-rezistenţă aparţin g. Streptomyces şi Actinomadura. Nocardia -aerobe, Gram pozitive, pozitive pentru testul catalazei şi acidorezistente, produc urează şi hidrolizează parafina. In substrat, filamentele se ramifică, iar cele aeriene se fragmentează şi formează cocobacili. Nocardia este un agent patogen oportunist – N. asteroides - infecţie pulmonară cronică (purulenta), cu posibilă diseminare la creier şi tegument. Pentru diagnostic -frotiuri din spută, puroi, LCR sau chiar din materialul biopsiei  Actinomicetomul - infecţie cu progresie lentă, distructivă, nedureroasă, care se iniţiază în ţesutul conjunctiv al dermului şi se diseminează prin continuitate în ţesuturile adiacente Produs de bacterii filamentoase ramificate: Nocardia asteroides, N. brasiliensis, Actinomadura.  Actinomyces israelii şi A. naeslundii – componente minore ale microbiotei orale şi a tractului digestiv – Procese infecţioase cronice, supurative, granulomatoaseîn zonele traumatizate ale mucoaselor. – In granulomul infecţios se găsesc şi alte bacterii din microbiota orală: Actinobacillus actinomycetemcomitans, Haemophilus aphrophilus, Eikenela corodens, Capnocytophaga etc. A. israelii este facultativ anaerob şi creşte în atmosferă cu CO2. Diagnostic – se examinează puroiul din leziunile granulomatoase pentru prezenţa structurilor granulare. Granulele sunt tari, lobulate, alcătuite din macrofage şi alte componente tisulare, filamente bacteriene măciucate corineforme şi mici concreţiuni de sulf elementar, formate prin oxidarea H2S rezultat din metabolismul aminoacizilor cu sulf. Actinomicoză: "granule de sulf" prezente în lichidul pleural într-un caz de actinomicoză pulmonară". Puroi fluid cu grunji galbeni de 0,2/1mm, ce reprezintă colonii ale actinomicetului infectant.  Frotiu din cultura în anaerobioză a unor "granule de sulf". Coloraţie Gram (x1000). Se observă bacilii gram-pozitivi ramificaţi ce se fragmentează în forme cocoide şi bacilare  Mycobacterium tuberculosis BAAR, obligat aerobi in vivo infectează ţesuturile cu o presiune parţială crescută a O2. Conţin o cantitate mare de lipide, glicolipide şi ceruri, care le conferă caracterul hidrofob al suprafeţei celulare, precum şi acidorezistenţă sau rezistenţă la dezinfectanţii simpli si supravieţuirea speciilor parazite în monocit. Timpul de generaţie este mai mare de 20 de ore. Speciile de interes clinic: M. tuberculosis, M. leprae şi M. avium intracellulare (M. avium complex =MAC). Mycobacterium tuberculosis frotiu din probă de spută concentrată şi decontaminată. Coloraţia Ziehl-Neelsen (1000x): bacili fini (0,2 - 0,6/1 – 10 micrometri) drepţi sau uşor încurbaţi, cu aspect de litere unghiulare, coloraţi în roşu. Celulele inflamatorii şi bacteriile neacido-rezistente sunt colorate în albastru.  Leziunile infecţiei cu M. tuberculosis: – tipul exudativ reacţie inflamatorie acuta, cu edem, PMN, monocite, în jurul bacililor tuberculoşi pulmonari. – tipul productiv formarea granulomului cronic, format din 3 zone: – zona centrală, cu celule mari, multinucleate, de origine monocitară, cu bacili tuberculoşi; – o zonă intermediară, cu celule epitelioide, adeseori orientate radiar; – o zonă periferică, cu limfocite, monocite, fibroblaste şi fibre de colagen  Evoluţia granulomului tuberculos Granuloamele care conţin bacili de M. tuberculosis rămân latente pentru zeci de ani, la circa 90% dintre cei aproximativ 2 miliarde de indivizi cu infecţie latentă, dar fără manifestări clinice. 10%, celulele centrale ale granulomului se lizează – Din lipsa O2, proliferarea bacililor tuberculoşi, acţiunea TNF şi a limfocitelor Tc. – După liza celulelor centrale ale granulomului, se formează granuloame cazeoase (de consistenţa cheagului de cazeină), favorabile dezvoltării celulelor de M. tuberculosis. – După ruperea peretelui fibros, bacilii se diseminează prin contiguitate în ţesutul adiacent, pe cale sanguină, în alte organe sau pe cale aeriană, la alţi indivizi. – Distrugerea ţesutului granulomatos, ce duce la cazeificare şi cavitaţie, este o particularitate a tuberculozei şi rareori sau chiar absent în celelalte granuloame, imune sau neimune  Frotiu din cultura de Mycobacterium tuberculosis în mediul lichid (Middlebrooke). Coloraţia Ziehl- Neelsen (1000x): se observă dispoziţia bacilului acido-rezistent în corzi Mycobacterium tuberculosis cultură de 4 flexuoase datorată cordfactorului săptămâni pe mediul Lőwestein-Jensen: creştere eugonică, colonii rugoase uscate, conopidiforme, de culoare bej.  1Micobacterii fotocromogene, de la stânga la dreapta, M. marinum, M. kansasii, M. simiae. Cultura de 3 săptămâni pe mediul Lőwestein-Jensen: colonii gălbui, rotunde, "S", cu tendinţă la creştere rugoasă (centru). 2: Micobacterii scotocromogene (M. gordonae, M. flavescens) cultura de 14 zile pe mediul Lőwestein-Jensen: colonii galben-portocalii, "S", cu aspect untos în eprubeta stângă (M. gordonae). 3: Micobaterii cu creştere rapidă, cultură pe mediul Lőwestein-Jensen. Primele colonii observate după 6 zile. Fotografiile culturilor în vârstă de 8 zile: Mycobacterium chelonae (stânga) colonii "R" gălbui, creştere luxuriantă în subcultură; Mycobacterium fortuitum (dreapta) colonii "S" gălbui şi creştere eugonică în subcultură.  M. avium complex (MAC) =M. intracellulare (MAI) – este cel mai comun agent infecţios oportunist la pacienţii imunocompromişi (SIDA), după ce numărul limfocitelor TCD4 scade sub 100/µL. – Temperatura optimă de creştere este de 41 o. Mac este ubicvitar în mediile naturale: s-a izolat din sol, ape, alimente, animale, inclusiv de la păsări. M. leprae a fost descris de Hansen (1873) lepra leproidă, cu evoluţie gravă, asociată cu leziuni tegumentare nodulare multiple, un număr enorm de bacili de M. leprae în granuloamele lepromatoase (peste 1010/g de ţesut) şi implicare sistemică a nervilor. – Testul la lepromină este negativ sau slab pozitiv. – Proliferarea bacililor produce leziuni tegumentare distribuite difuz sau localizate în noduli. Granuloamele sunt formate din macrofage inactive, gigante, provenite prin fuziune, încărcate cu bacili. Lipseşte infiltratul limfocitar, ceea ce dovedeşte absenţa IMC. Tegumentul este infiltrat cu celule T supresoare. S-a demonstrat anergia celulelor T, cu specificitate faţă de antigenele bacilului leprozei. lepra tuberculoidă – cu evoluţie favorabilă, neprogresivă – granuloame tegumentare bine organizate, în care macrofagele sunt diferenţiate în celule epitelioide, celule gigante Langhans active, care omoară şi digeră bacilii de M. leprae. – infiltratul limfocitar al granulomului este intens, cu predominanţa limfocitelor TCD 4, care secretă IFN γ. Interferonul activează macrofagele din focar, devenind capabile să inhibe creşterea şi diviziunea celulelor de M leprae. La periferia granulomului se găsesc limfocite TCD8. – Testul la lepromină este pozitiv, iar IMC este funcţională. Leziunile nervilor se datorează proliferării bacililor şi răspunsului IMC, în situsuri adiacente filetelor nervoase. Infecţia se transmite, probabil, datorită contactului prelungit al copilului mic, cu persoanele care elimină un număr mare de bacili.  Lepra tuberculoidă, stânga: maculă la nivelul obrazului stâng. Dreapta: zone depigmentate la nivelul toracelui. În aceste zone, sărace în bacili, neulcerate şi puţin contagioase, sunt prezente tulburări de tip nevritic (anestezii).  Lepra lepromatoasă : leziuni granulomatoase distructive ce invadează tegumentul. Lepra lepromatoasă: facies leonin  În partea stângă : Mycobacterium leprae, bacil acido-rezistent dispus în aglomerări compacte de bacili aliniaţi paralel şi cap la cap, numite "globi". În dreapta: frotiu din raclatul unei leziuni ulcerate de lepră lepromatoasă; coloraţia Ziehl-Neelsen modificată (1000x): bacili acidorezistenţi intra şi extra celulari dispuşi în "globi leproşi". DIAGNOSTICUL DE LABORATOR în infecțiile produse de bacteria Mycobacterium tuberculosis dr. Georgiana Ramona Muk  Tuberculoza - boală infecto-contagioasă cauzată de Mycobacterium tuberculosis, cu evoluție cronică și largă răspândire în populație (în marea majoritate a țărilor lumii) care, netratată sau incorect tratată, are o rată de mortalitate ridicată. 2018 - 10 milioane de cazuri OMS- tuberculoza este o urgență epidemiologică metode adecvate și accesibile de diagnostic, tratament și resurse materiale pentru controlul tuberculozei pe plan mondial dificultăți generate de suprapunerea pandemiei COVID-19 România prezintă cea mai mare incidență a tuberculozei din Europa, de 5,5 ori peste media Uniunii Europene în anul 2018.  RECOLTAREA, PĂSTRAREA ȘI TRANSPORTUL PROBELOR LA LABORATOR - Probe DE CALITATE BUNĂ REZULTATE de calitate bună Laboratorul poate să prelucreze pentru examenul bacteriologic BK o varietate de produse biologice. - produse biologice polimicorbiene care conțin floră normală de colonizare: spută, urină, secreții din leziuni cutanate, sau produse care nu au fost recoltate aseptic - material biologic steril, de obicei fără microorganisme de contaminare, provenit din colectii închise (lichid cefalorahidian, pleural, pericardic, sinovial, ascitic, sânge). SPUTA de bună calitate este în cantitate de 3-5 ml, cu particule purulente; este frecvent vâscoasă și mucoidă; poate fi fluidă, dar să conțină fragmente de țesut necrozat; poate li stratificată în culori de la alb mat la verde. TRANSPORT RAPID CĂTRE LABORATOR!!! SE VOR PĂSTRA LA FRIGIDER 4-8°C. !!! etichetare corectă și recoltare în recipient adecvat produsului recoltat  EXAMENUL MICROSCOPIC Examinarea microscopică are avantajul că este simplă, rapidă, economică și contribuie la identificarea surselor de infecție. Specificate înaltă Sensibilitatea metodei limitată Identifică bacilii acido-alcoolor rezistenți Examenul microscopic evidențiază bacilii acido-alcoolo-rezistenți din produsele biologice și comportă trei etape: ⮚ Pregătirea frotiului ⮚ Colorarea frotiului ⮚ Examinarea la microscop Pentru preparea frotiului se poate folosi una dintre următoarele metode: ⮚ Examinare directă (se ia cu ansa bacteriologică de unică folosință sau pipeta de unică folosintă produsul biologic și se etalează cât mai uniform pe centrul lamei într-un strat subțire); ⮚ După decontaminare/concentrare: metoda NALC-NaOH – centrifugare obligatorie sau metoda Petroff: NaOH/HCl sau KH2PO4  EXAMENUL MICROSCOPIC Limitări Avantaje ▪BAAR/ml > 5.000-10.000/ml ▪simplă ▪Sensibilitate limitată (la HIV +) ▪rapidă ▪Identifică BAAR dar nu identifică bacilul Koch ▪economică ▪Nu distinge bacilii viabili de neviabili ▪identifică sursele de infecție ▪Nu diferențiază BAAR sensibili/rezistenți  EXAMENUL MICROSCOPIC Există 2 METODE de COLORAȚIE și EXAMINARE MICROSCOPICĂ folosite în laboratoarele de bacteriologie BK: - colorație ZIEHL NEELSEN Se examinează la microscop optic: oculare 10x – obiectiv cu imersie 100x (mărire1000x) - colorația fluorescentă (AURAMINĂ O sau AURAMINĂ-RHODAMINĂ) Se examinează la microscopul cu fluorescență (UV) imediat după uscare se folosesc oculare de 10x și obiective de 20-25x și 40-45x. Principiul metodei: conținutul bogat în acizi micolici din structura peretelui micobacterian face ca aceste bacterii să fixeze la cald compușii de anilină (fuchsina) sau substanțele fluorescente fără încălzire, colorantul rezistând la decolorarea cu alcool acidulat, de aici și denumirea de BAAR. Pentru ușurarea examinării este necesară colorarea fondului preparatului: albastru de metilen – pentru ZN și pentru colorația fluorescentă cuparea fluorescenței preparatului cu albastru de metilen sau permanganat de potasiu.  Examen microscopic - colorația cu fluorocromi 450x, BAAR pozitiv (după Daniela HOMORODEAN, 2017) Examen microscopic BAAR pozitiv, 1000x, colorația Ziehl-Neelsen (original) - se numără BAAR care apar ca bastonașe roșii pe fundalul albastru al preparatului - rezultat negativ doar după ce se examinează 300 câmpuri microscopice Examen microscopic pozitiv grămezi BAAR, 1000x, colorația Ziehl-Neelsen (original) - Examen microscopic pozitiv BAAR 3+, 1000x, colorația Ziehl-Neelsen (original) -  INTERPRETARE EXAMINARE MICROSCOPICĂ Mărirea în examinarea fluorescentă Mărire 200- ZIEHL-NEELSEN, mărire 1000x: 1 Mărire 400x: Scala IUATLD/WHO 250x: 1 lungime=2cm=100CME 1lungime=2cm= lungime=2cm=c corespund la orespund la 1000 400CME din CME din mărirea mărirea de 1000x de 1000x Rezultat 0 BAAR/1 0 BAAR/1 NEGATIV BAAR 0 BAAR/1 lungime lungime lungime Numărul exact de BAAR/ 100 1-9 BAAR/1 lungime câmpuri Împarte numărul POZITIV BARR 1+ 10-99 BAAR/1 lungime Împarte numărul BAAR observați BAAR observați la 4 la 10 POZITIV BARR 2+ 1 – 10 BAAR/câmp POZITIV BARR 3+ >10 BAAR/câmp CME: câmpuri microscopice examinate  CULTIVAREA MICROBACTERIILOR NECESITATE ⮚ în scop de diagnostic definitiv de tuberculoză ⮚ pentru monitorizarea evoluției în cursul tratamentului ⮚ pentru identificarea Mycobacterium tuberculosis ⮚ pentru testarea sensibilității micobacteriilor la substanțe anti-TB (ABG) Pentru cultivare sunt folosite medii solide, pe bază de ou - LOWENSTEIN JENSENsau pe bază de agar, dar și medii lichide, care pot aduce un plus de pozitivitate de până la 10% față de mediu solid (ex. Middlebrook 7H9, folosit în sistemele automate de cultivare Bactec MGIT 960, BacT/ALERT și VersaTREK)  CULTIVAREA MICROBACTERIILOR AVANTAJE –mediu solid ⮚ 10-100 BAAR/inocul - sensibilitate mai mare decât microscopia ⮚ distinge bacilii viabili ⮚ cantitativă: număr de colonii ⮚ necesară pentru monitorizarea tratamentului ⮚ confirmă diagnosticul de tuberculoză ⮚ crește numărul cazurilor confirmate cu 20%, în plus față de microscopie ⮚ permite detectarea precoce a cazurilor contagioase ⮚ permite obținerea de colonii izolate pentru testarea sensibilității la tuberculostatice  CULTIVAREA MICROBACTERIILOR LIMITĂRI – mediu solid ⮚ mai complexă și mai scumpă decât microscopia ⮚ necesită facilități pentru procesarea probelor, incubare, echipament ⮚ personal instruit, antrenat ⮚ probele trebuie să fie decontaminate ⮚ nnecesită condiții de biosiguranța cel puțin de nivel 2 ⮚ rezultatele se obțin după 21-60 zile  CULTIVAREA MICROBACTERIILOR AVANTAJE și LIMITĂRI –mediu lichid AVANTAJE LIMITĂRI ⮚ Rezultatele se obțin mai rapid ⮚ complexă (17 zile) ⮚ costisitoare ⮚ Sensibilitate înaltă ⮚ necesita personal instruit, antrenat ⮚ Informații despre viabilitate ⮚ Nu oferă informații asupra numărului de ⮚ Culturile sunt utilizate pentru colonii - calitativă identificare și ABG, teste ⮚ Risc de contaminare mai mare decât în genetice mediul solid ⮚ Confirmă cazurile BAAR ⮚ Necesită echipament/service/întreținere negativ ⮚ Necesită condiții de biosiguranță de nivel 3 ⮚ ABG în mediul lichid ⮚ Este mai scumpă decât cultura în mediul solid  CULTIVAREA MICROBACTERIILOR METODA DE DECONTAMINARE CU NaOH (Petroff) Principiu: NaOH în soluție 4% are atât efect mucolitic cât și bactericid asupra majorității microorganismelor. Înainte de însămânțare este necesară neutralizarea NaOH cu soluție HCl 8% sau fosfat monopotastic 15% în prezența unui indicator de pH. Avantaj: metoda este accesibilă din punct de vedere tehnic, reactivii sunt ieftini și stabili câteva luni. Dezavantaje: timpul de contact cu NaOH trebuie să fie strict respectat; este destul de agresivă, distrugând până la 60% din bacterii, la care se adaugă cele îndepărtate în timpul centrifugării. Timpul necesar prelucrării unei probe este de aproximativ 60 minute, iar prelucrarea a 20 de probe durează aproximativ 120 minute.  ⮚ Izolarea BAAR pe mediu Lowenstein-Jensen; ⮚ Incubare – până la 2 luni, la 37°C. ⮚ Citiri intermediare la 48h; 21, 30, 45 și 60 zile Interpretarea rezultatelor (PNCT – România, OMS –TB Balcani) Creșterea micobacteriilor Notarea rezultatului Absența coloniilor Negativ Testul rapid AgMPT 64 Sub 30 colonii Se notează exact numărul de colonii pentru confirmarea 30 – 100 colonii Pozitiv + M. tuberculosis. Peste 100 colonii izolate Pozitiv ++ Colonii confluente nenumărabile Pozitiv +++ Interpretarea finală a rezultatelor Examen Examenul prin Interpretare finală microscopic cultură clinică Pozitiv Negativ NEGATIV Negativ Pozitiv POZITIV Pozitiv Pozitiv POZITIV  CULTIVAREA MICROBACTERIILOR Examin morfologic macroscopic al culturilor mediul LJ M. tuberculosis – colonii R, colorate crem-gălbui M. bovis/M. canetti – colonii S, alb-gălbui NTM – colonii S sau R, albe, gălbui, portocalii, gri, roz NTM-micobacterii netuberculoase  CULTIVAREA MICROBACTERIILOR Examen morfologic microscopic din culturilor mediul LJ  CULTIVAREA MICROBACTERIILOR TESTUL IMUNOCROMATOGRAFIC – AgMPT64 Descrierea testului  TESTAREA SENSIBILITĂȚII LA SUBSTANȚELE ANTITUBERCULOASE Principiu Compararea creșterii bacteriene de pe tuburile cu mediu care conține substanțe antituberculoase cu creșterea bacteriană de pe tuburile fără substanțe anti-TB (tuburi martor, control). În mod natural tulpinile de M.tuberculosis sunt tulpini sensibile „in vitro” la concentrațiile critice folosite pentru toate substanțele anti-tb. Populațiile de M.tuberculosis sunt heterogene, alcătuite din diverse sub- populații, cu mutanți rezistenți la tuberculostatice.  TESTAREA SENSIBILITĂȚII LA SUBSTANȚELE ANTITUBERCULOASE Tehnici de testare: - directă – folosește ca inocul produsul patologic cu conținut mare de BAAR, după ce produsul a fost decontaminat - indirectă – folosește ca inocul cultura micobacteriană Dintre tehnicile standardizate recomandate de OMS cele mai folosite în România sunt: metoda concentrațiilor absolute, metoda proporțiilor în mediul LJ și metode proporțiilor în mediul lichid Middlebrook. Concentrațiile critice față de care se face testare sunt revizuite, aprobate și comunicate de către OMS. TESTAREA SENSIBILITĂȚII LA SUBSTANȚELE ANTITUBERCULOASE Metoda proporțiilor pe LJ - prima citire la 28 zile, dacă nu există creștere conformă pe tuburile test se incubează până la 42 zile Metoda concentrației absolute, seria scurtă de testare (rifampicină și RMP izoniazidă). - prima citire la 21 zile, dacă nu există creștere conformă pe tuburile test INH se incubează până la 28 zile  METODE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ Pentru diagnosticul TB prin metode de biologie moleculară sunt disponibile mai multe metode bazate pe principii diferite, care pot identifica secvențe genetice diverse. Dintre acestea, în laboratoarele din România se folosesc în condiții de program de control al tuberculozei două sisteme: -hibridizare inversă pe suport de nitroceluloză-LPA (GenoType- HAIN) -qPCR (GeneXpert).  METODE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ ⮚ Managementul programatic al tuberculozei rezistente ⮚ Identificarea rapidă a tulpinilor multirezistente ⮚ Reducerea timpului de confirmare a tuberculozei ⮚ NU înlocuiesc metodele actuale standardizate pentru detectarea Mycobacterium tuberculosis și a profilului de rezistență, doar le completează ⮚ Sunt costistoare  METODE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ GenoType – LPA Sistemul GenoType folosește un ansamblu de echipamente, specifice pentru fiecare etapă de lucru, cu kituri de reacție diferite în funcție de scopul testării: 1. Extracție ADN 2. Amplificarea PCR 3. Hibridizare 4. Evaluarea și interpretarea rezultatelor. Kituri folosite: ⮚ MTBDRplus -folosit pentru identificarea simultană a complexului M. tuberculosis și evidențierea mutațiilor de rezistență la RMP și INH, iar în cazul MTBDRsl, pentru identificarea cazurilor de TB-XDR ⮚ Kiturile MTBC și CM sunt folosite pentru identificarea specilor de Mycobacterium în culturile pozitive pe mediul solid LJ și mediul lichid în sistem MGIT.  METODE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ GenoType MTBDRplus - apartenența la complexul M. tuberculosis (banda TUB pozitivă)  METODE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ GeneXpert Sistemul GeneXpert este complet automatizat, cu cartușe de unică folosință. ⮚ Rezultatul este generat automat ⮚ Aplicabil în culturi sau spută, sediment din diferite produse centrifugate ⮚ 3 tipuri de cartușe disponibile: Xpert MTB/Rif, Xpert MTB/RiF Ultra și Xpert MTB/XDR ⮚ Cel mai folosit Xpert MTB/RIF Ultra – prezintă trei țintre diferite de amplificare, limita de detecție de 16 UFC/ml, comparativ cu 131 UFC/ml pentru Xpert MTB/RIF. Recomandările actuale ale OMS referitoare la folosirea cartușului de tip Ultra: ⮚ Test inițial de diagnostic pentru adulții și copiii cu semne și simptome de tuberculoză ⮚ Testare extrapulmonară selectată (LCR, ganglioni limfatici și țesuturi).