Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques PDF

Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques Université Sultan Moulay Slimane Faculté des Sciences et Techniques Béni Mellal Département Sciences de la vie Licences des Sciences et Techniques (...

Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques Université Sultan Moulay Slimane Faculté des Sciences et Techniques Béni Mellal Département Sciences de la vie Licences des Sciences et Techniques (S5) (PE-SBA-TQPA) -Cours de techniques d’analyses- Méthodes d’analyses biochimiques et physicochimiques Réalisé par : Pr. Fatima BELLALI Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 1  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques Sommaire Partie I: Techniques microscopiques Partie II: Techniques de fractionnement Partie III: Techniques chromatographiques Partie IV: Electrophorèse Partie V: Techniques immunologiques Partie VI: Techniques d’analyses spectrales Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 2  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques Partie I: Techniques microscopiques I. Introduction L’œil humain ne peut distinguer des objets mesurant moins de 0,2 mm. Le microscope devient donc nécessaire pour l’observation de certains éléments biologiques et organismes dont les dimensions sont de l’ordre de micron (µm). Le problème fondamental, que les biologistes ont eu à résoudre lors de l’étude des cellules, est leur petite taille qui ne permet pas de les observer à l’œil nu. Par conséquent, les connaissances sur les cellules ont progressés avec la mise au point d’instruments d’observation (microscopes), de plus en plus perfectionnés, ainsi qu’avec l’élaboration de techniques appropriées. II. Historique Quelques dates importantes de la microscopie : 1667 : Le microscopiste anglais Robert Hooke est l'inventeur d’un microscope muni de trois lentilles. Il observe avec cet appareil les alvéoles régulières et remplies d'air du liège. 1834 : Talbot introduit une nouvelle technique permettant des différenciations dans l’image : la lumière polarisée. 1908 : Reichert développe la technique de la fluorescence pour l’adapter à la microscopie. 1929 : Bausch et Lomb créent un microscope à fluorescence adapté pour examiner des spécimens minéraux et organiques. 1934 : le chercheur allemand Zernike décrit le contraste de phase. 1939 : les premiers microscopes électroniques sont mis au point. 1955 : Le principe de microscopie confocale est décrit par Marvin Minsky, mais le premier microscope confocal utilisable en pratique n’est mis au point qu'en 1968 par Mojmir Petran. III. Définitions La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des structures biologiques. Le microscope* est un instrument muni d'un objectif et d'un oculaire qui permet de grossir l'image d'un objet de petites dimensions. Le principe est dans tous les cas le même : une onde est envoyée sur la préparation ou émise par la préparation. Cette onde est captée par un objectif qui la concentre et passe par un oculaire qui crée une image observable. La microscopie est divisée en deux grands groupes, différents par la nature de la particule élémentaire impliquée : Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 3  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques  le microscope optique, aussi appelé photonique, parce qu'il utilise des photons.  le microscope électronique qui utilise des électrons pour étudier l'objet. *Le mot microscope est composé de 2 racines étymologiques différentes, du Grec (micro= petit et scopein= voir). IV. Microscopes optiques 1. Principe de fonctionnement Dans un microscope optique la lumière (composée de photons) passe à travers un condenseur qui concentre le flux lumineux en un rayon de lumière. La lumière ainsi focalisée traverse l’échantillon. La lentille de l’objectif permet un premier grandissement (entre x4 et x200) puis la lentille de l’oculaire apporte un deuxième grossissement (en général x4) et l’œil reçoit enfin l’image agrandie. L’agrandissement final correspond au produit des deux grossissements des deux lentilles de verre. Tous les microscopes sont caractérisés par leur pouvoir séparateur = pouvoir de résolution, c'est à dire la distance limite appréciable entre 2 points = aussi limite de résolution. Pour l'œil humain, cette distance limite appréciable est de 100 à 200 µm. Le pouvoir séparateur d'un microscope est donné par la formule d'Abbe : 2. Description Un microscope est constitué principalement de l’association de deux systèmes optiques convergents, centrés sur le même axe optique, l’objectif et l’oculaire :  L’objectif est une association de plusieurs lentilles, ce système optique convergent à une faible distance focale, de l’ordre de quelques millimètres.  L’oculaire est lui aussi un système optique convergent dont la distance focale est de l’ordre du centimètre et qui fonctionne comme une loupe. L’objectif et l’oculaire sont placés aux deux extrémités du tube optique : la distance constante qui sépare le foyer image de l’objectif et le foyer objet de l’oculaire est appelée intervalle optique ∆ = F1′ F2. Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 4  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques En général, un microscope dispose de plusieurs objectifs et oculaires permettant d’obtenir de nombreux grossissements. La mise au point consiste à déplacer le bloc {objectif-tube- oculaire} à l’aide des boutons de réglage grossier (bouton de commande de la crémaillère) puis de réglage fin (à l’aide du bouton de commande de la vis micrométrique). L'objet est examiné par transparence il faut alors l'éclairer fortement en concentrant sur lui la lumière au moyen d'un miroir orientable, associé souvent à un système optique convergent appelé condenseur (figure 1). Figure 1: Microscope 3. Types de microscopes optiques Les microscopes optiques permettent l’observation des cellules mortes ou vivantes. Le microscope le plus courant utilise la lumière visible. Il existe plusieurs types de microscopes optiques :  les uns permettent l'observation directe de structures dont les dimensions sont de l'ordre de 0,2 µm ce sont les microscopes par transmission ;  les autres microscopes donnent des informations indirectes sur l'ultrastructure des cellules = microscope à lumière polarisée, microscope à fond noir et microscope à contraste de phase. Il existe plusieurs types de microscopes les plus utilisés sont : o Le microscope à fond clair o Le microscope à fond noir o Le microscope à contraste de phase o Le microscope à contraste interférentiel différentiel o Le microscope à fluorescence Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 5  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques 3.1 Microscope à fond clair Les microscopes à fond clair sont des instruments destinés principalement à l’étude de la structure interne des objets.. Ces microscopes permettent souvent des grossissements allant jusqu’à deux mille fois. L’image que reçoit l’observateur à travers le microscope à fond clair est formée par les rayons lumineux qui ont traversé l’objet après avoir été émis par la source. Il est bien évident que, pour ce faire, l’objet doit être très transparent, et donc très mince. Le microscope à fond clair permet d’observer des préparations colorées (sans coloration, on ne voit rien)(figure 2). Figure 2: un frottis sanguin 3.2 Microscope à fond noir La microscopie à fond noir révèle la présence, mais pas la structure, d'échantillons qui sont invisibles en fond clair, car ils sont transparents ou au-dessous du pouvoir de séparation du microscope. Dans le microscope à fond noir, l’image est créée par la diffraction de la lumière. La lumière difractée par la préparation permet la formation de l’image (Figure 3). Un dispositif placé sous la platine du microscope permet d'éclairer la préparation biologique en lumière rasante. Les rayons incidents qui traversent la préparation ne pénètrent pas dans l'objectif, seuls pénètrent dans l'objectif les rayons diffractés. On peut ainsi observer les régions des cellules qui diffractent fortement la lumière. Figure 3 : Bulles d'air dans l'eau Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 6  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques 3.3 Microscopie à contraste de phase C’est Zernicke en 1938 qui a inventé le contraste de phase (prix Nobel). Les objets biologiques à observer sont souvent très transparents et donc peu contrastés car le flux lumineux transmis par les différentes parties des cellules est similaires. Par contre, l’indice optique des différents compartiments cellulaires est très variables ce qui induit des différences de vitesse des ondes donc des retards de phase des ondes. De très faibles variations d’indices vont permettre de mettre en évidence les composés grâce à un système de déphasage entre lumière transmise et lumière diffractée. Cette technique permet donc de transformer une différence d’indice de phase (indice de réfraction) dans l’échantillon en une différence d’intensité. Figure 4 : Cellules Hela en culture Le principe consiste à éclairer l’échantillon avec un anneau lumineux (obtenu en plaçant une plaque percée d’un anneau dans le condenseur) et à récupérer la lumière avec un objectif spécial comportant une plaque de phase, c’est-à-dire une plaque avec un anneau (de la taille de l’image de l’anneau du condenseur par l’objectif) entrainant un déphasage de la lumière le traversant. Seule la lumière non-déviée par l’échantillon passera par cet anneau et sera ainsi en opposition de phase avec la lumière diffractée (qui passe dans le reste de la plaque de phase). Il s’ensuit des interférences destructrices au plan image ce qui permet d’observer des variations d’amplitude correspondantes à des variations de l’indice de réfraction de l’échantillon. Il y a un phénomène de halo, c'est à dire qu’on voit une ligne blanche autour des reliefs même si l’image reste plate (figure 4). Il n’y pas de réel relief mais une impression de relief dû au contraste de l’image. Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 7  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques 3.4 Microscopie à contraste interférentiel différentiel Le microscope à contraste interférentiel différentiel (DIC), inventé par NOMARSKI, est basé sur une transformation des changements d’indice de réfraction dans l’échantillon en un changement d’amplitude lumineuse, observable à l’œil. Grâce à l’utilisation de la lumière polarisée et d’un jeu de filtres spéciaux, les images sont observées avec un relief ombré (figure 5). On éclaire l’échantillon avec une lumière séparée en deux polarisations à l’aide d’un prisme de Wollaston. Ces deux rayons vont traverser l’échantillon en passant par des chemins qui peuvent être un peu différents, puis ils seront combinés à nouveau par un deuxième prisme pour former des interférences. Ces interférences destructives et constructives révèlent les structures intracellulaires, en particulier les membranes (qui présentent souvent une forte variation d’indice de réfraction). Figure 5 : cellule d’embryon de souris observée en DIC. Les contours sont visualisés avec leur relief 3.5 Microscopie à fluorescence La microscopie à fluorescence est une technique de microscopie optique qui tire profit du phénomène de fluorescence* pour observer divers composés. Elle fait désormais partie des méthodes de recherche classiques en biologie. En microscopie à fluorescence, on peut donc visualiser directement des substances fluorescentes. Pour des substances, des cellules, des molécules non fluorescentes, il est nécessaire de les marquer par des substances appelées fluorochromes, comme par exemple le DAPI (Di Amidino Phényle Indole) qui marque l'ADN et fluoresce en bleu (figure 6). Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 8  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques Figure 6: Observation de l’ADN avec un microscope à fluorescence après utilisation de fluorochrome Le pouvoir séparateur de ce microscope est supérieur à celui du microscope photonique ordinaire (utilisant la lumière blanche) puisqu'il utilise, pour éclairer la préparation, les rayons UV caractérisés par une longueur d'onde plus faible. Le principe de base du microscope à fluorescence est d'envoyer une lumière excitatrice (la lumière ultraviolette) sur l'échantillon puis de séparer la lumière de fluorescence émise du reste de la lumière excitatrice afin que seule la fluorescence* émise puisse être perçue par l'œil ou tout autre détecteur. C'est le seul mode de microscopie dans lequel l'échantillon (fluorescent ou rendu fluorescent) réémet sa propre lumière après excitation. * Fluorescence = propriété d'émettre une lumière de fluorescence qui se caractérise par une longueur d'onde supérieure à la longueur d'onde de la lumière d'éclairement. 4. Techniques de préparation des échantillons L'observation d'échantillons biologiques en microscopie photonique nécessite des étapes de préparation. Elles ont pour but de rendre l'échantillon mince pour que la lumière puisse le traverser (confection de coupes) et contrasté pour qu'il puisse absorber la lumière davantage que le milieu ambiant (coloration). Des coupes de quelques microns d'épaisseur ne peuvent être réalisées que si la dureté de l'échantillon à couper est convenable. Les cellules ont une consistance visqueuse et sont beaucoup trop molles pour être coupées en tranches minces. Il faut donc les durcir artificiellement pour pouvoir les sectionner. Ceci est réalisable si l'on agit sur le constituant le plus abondant des cellules = l'eau. : Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 9  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques ---> Ou bien on remplace l'eau par un autre liquide pouvant être durci dans certaines conditions = méthode d'inclusion ; ----> Ou bien on fait passer l'eau de l'état liquide à l'état solide = technique de congélation. Mais ces méthodes, qui permettent de durcir les cellules altèrent considérablement l'organisation cellulaire. C'est pourquoi il est nécessaire de consolider au préalable les structures par un ensemble d'opérations appelées fixation. Lorsque la condition de "fine épaisseur" est remplie, il faut ensuite contraster artificiellement l'échantillon = c'est l'étape de coloration. Chronologiquement ces différentes étapes s'enchainent ainsi : 1) fixation = consolider 2) inclusion = durcir 3) microtomie = couper 4) coloration = contraster 4.1 Fixation Une fixation est un traitement chimique ou physique effectué sur des cellules vivantes et permettant de pratiquer ultérieurement certaines manipulations avec un minimum de dommages pour les structures cellulaires. La fixation a pour but de tuer les cellules et de les conserver dans un état aussi proche que possible de l’état vivant. On réalise donc avant de les observer des frottis ou des coupes histologiques. La fixation peut être :  Une fixation physique (congélation, fixation à la chaleur)  Une fixation chimique (fixation à l’alcool à 98%) 4.1.1 Fixation par traitement chimique : La fixation par traitement chimique est réalisée en plaçant les cellules dans liquides que l'on appelle fixateurs. On classe les fixateurs en deux groupes selon leur action sur les protéines : - fixateurs coagulants, comme l'éthanol (CH3CH2OH), l'acide acétique (CH3COOH) dilué, les solutions aqueuses d'acide picrique (trinitrophénol) ou de chlorure mercureux (HgCl2) ; Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 10  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques - fixateurs non coagulants, comme les solutions aqueuses de tétroxyde d'osmium OsO4, ou d'aldéhydes (formaldéhyde, glutaraldéhyde, etc.). 4.1.2 Fixation par traitement physique : Le traitement physique le plus couramment utilisé pour la fixation est la congélation. La pièce à fixer est refroidie rapidement, soit par immersion dans un liquide à basse température (azote liquide -196°C), soit par détente à son niveau de gaz carbonique comprimé (-60°C). La congélation doit être rapide pour que les cristaux de glace qui vont se former ne soient pas trop gros, sinon ils risqueraient de déchirer les structures cellulaires. 4.2 Durcissement de l'échantillon * Durcissement par inclusion : Il est obtenu en remplaçant l'eau des cellules par de la paraffine chaude qui durcit en refroidissant. Le remplacement de l'eau par la paraffine n'est pas directement possible, ces deux liquides n'étant pas miscibles. On doit en premier lieu substituer à l'eau des cellules fixées de l'éthanol, puis du toluène qui peut se mélanger à la paraffine liquide (chaude). Cette paraffine remplit dans les cellules les espaces préalablement occupés par l'eau. En refroidissant, la paraffine se solidifie et donne aux cellules une consistance qui permet de les débiter en coupes minces. * Durcissement par congélation : Il peut être effectué en même temps que la fixation par la même technique, ou bien en congelant des cellules déjà fixées par un traitement chimique. 4.3 Obtention de coupes Les blocs de paraffine ou les blocs de glace contenant les cellules congelées, sont coupés en tranches à l'aide d'appareils appelés microtomes. Lorsqu'on travaille avec des échantillons congelés, le microtome est équipées d'une enceinte maintenue à -20°C. Dans les deux cas, inclusion à la paraffine ou congélation, la lame servant à trancher est un rasoir d'acier. Après inclusion à la paraffine, on peut réaliser des coupes de 2 à 5 µm, alors qu'après congélation, on peut obtenir au mieux des coupes de 5-10 µm. 4.4 Obtention de contrastes Une fois les coupes réalisées, on peut procéder à l'obtention de contrastes. Les contrastes peuvent être augmentés en utilisant le microscope à contraste de phase ou en pratiquant des colorations. Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 11  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques La coloration repose sur l’affinité particulière de certains tissus ou constituants cellulaires pour une substance colorée déterminée. De nombreux colorants* sont utilisés selon le contexte et la nature de ce que l’on veut observer. Il existe de nombreux colorants et on peut les regrouper, dans un 1er temps, en deux catégories : - les colorants vitaux : ne tuent pas la cellule ou pas immédiatement ; ils sont cependant +/- toxiques, parfois ils entrainent malgré tout la formation d'artéfacts. Ces colorants sont peu nombreux (ex rouge neutre) ; - les colorants non vitaux : leur emploi nécessite une fixation préalable de la cellule pour consolider les structures cellulaires. Ils permettent toutefois une observation assez fine grâce à de meilleurs contrastes. * Colorant = molécule qui a la propriété d'absorber certaines longueurs d'onde de la lumière et de conférer une couleur au composant qui l'a lié. V. Microscope électronique 1 Principe de fonctionnement La microscopie électronique n'utilise pas les photons pour analyser les échantillons à observer mais les électrons, ce qui va permettre de révéler les plus fines structures internes de la cellule, parfois jusqu'aux molécules, puisque les grandissements possibles vont de 1000 à 500 000 fois. Les microscopes électroniques ont un pouvoir de résolution de 0,1nm (2nm usuellement en biologie). Sous l’impact des électrons primaires sur l’échantillon il y a émission de différents signaux (figure 7). On peut distinguer donc deux techniques d'observation en microscopie électronique:  La microscopie électronique à transmission (MET) : Utilise les électrons qui traversent l’échantillon  La microscopie électronique à balayage (MEB) : Utilise les électrons émissent en surface. Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 12  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques Figure 7 : Principe du MET et du MEB 2 Microscopie électronique à transmission (MET) Dans le microscope électronique à transmission (MET), les électrons traversent l'échantillon et permettent de découvrir l'intérieur de la cellule sur des coupes d'échantillon (figure 8). Cette technique est très performante. Le faisceau d'électrons est émis par un canon à électrons, focalisé sur la préparation à l'aide de lentilles électromagnétiques et la traverse. L’échantillon disperse les électrons qui le traversent et le faisceau est focalisé par les lentilles électromagnétiques pour former une image visible agrandie de l’échantillon sur un écran fluorescent (électrons déviés)(figure 9). Son grandissement est de 75 000-5 000 000 et sa limite de résolution est de 0,1 à 1 nm. Figure 8: ultrastructure de la mitochondrie Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 13  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques Les coupes ultrafines de l'échantillon, placées sous vide, doivent être au préalable déshydratées, fixées puis imprégnés avec des métaux lourds (cuivre, nickel ou or) pour permettre le contraste entre les éléments intracellulaires. Figure 9 : Composition d’un MET 3 Microscopie électronique à balayage (MEB) Le microscope électronique à balayage (MEB) a une résolution plus faible que celle du MET. Permet d'obtenir des images avec un pouvoir séparateur souvent inférieur à 5 nm. Son intérêt est de pouvoir obtenir des images de cellules en trois dimensions (3D). L’échantillon à observer est balayé par un faisceau électronique. L’interaction entre le faisceau et l’échantillon génère des électrons secondaires. Ces électrons secondaires sont amplifiés, détectés puis interprétés pour reconstruire une image en en trois dimensions de la surface (figure 11). Le résultat est une représentation de la surface de l'objet observé, les scientifiques peuvent ainsi étudier la topographie de la cellule (figure 10). Figure10 : Observation d’un grain de pollen au MEB Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 14  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques Figure 11 : Composition d’un MEB Toujours placés sous vide, les tissus ou les cellules sont fixés et déshydratés. Puis ils sont entièrement recouverts par un matériau conducteur : une fine couche de carbone ou de platine afin d'évacuer les électrons qui s'accumuleraient dans la matière et provoqueraient des distorsions d'image. 4 Technique de préparation de l’échantillon La séquence de manipulation est analogue à celle qui a été exposée pour la microscopie optique. a) Fixation : encore plus exigeante (les artefacts sont plus visibles), elle est réalisée avec des fixateurs spéciaux, comme : le tétraoxyde d’osmium OsO4 et le glutaraldehyde C5H8O2. b) Déshydratation : elle suit le même principe qu'en microscopie optique; mais elle est délicate car les tissus doivent être conservés jusqu'au niveau moléculaire. c) Inclusion : elle se fait dans un milieu très dur, dans des matières plastiques telle que la résine. Une fois refroidi, durci par polymérisation, on obtient un échantillon solide. Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 15  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques d) Coupe : effectuée sur un ultramicrotome, elle fournit des tranches encore plus minces, de 50 nm. 1 Techniques de coloration Les échantillons destinés à la microscopie sont colorés soit positivement, soit négativement. Dans la coloration positive, on incube l’échantillon biologique en fines tranches dans des solutions de métaux lourds (acétate-oxyde d’osmium, acétate d’uranyle, acétate de plomb). Ces métaux lourds s’accumulent dans diverses structures cellulaires, qui apparaissent en sombre sur l’image (figure 12). Figure 12: Coupe de globule blanc colorée positivement La coloration négative permet d’examiner les structures biologiques intactes, les bactéries, les organites isolés et les macromolécules (figure 13). On place l’échantillon biologique sur un film et on attend que les els de métaux lourds se déposent sur le film atour de l’échantillon ; l’échantillon est ainsi coincé dans une pellicule de colorant impénétrable aux électrons et apparait en clair sur un fond sombre. Figure 13 : filaments d’actine colorés négativement Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 16  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques 2 Technique d’embraque métallique L’ombrage métallique est une méthode qui met en évidence la surface des structures subcellulaires isolées ou des macromolécules (figure 14). On couvre l’échantillon d’un mince film d’atomes vaporisés sous vide à partir d’une électrode, de platine par exemple. Le métal est projeté de coté sur l’échantillon de sorte que les surfaces de celui-ci tournées vers l’électrode d’où s’échappent les atomes de métal seront plus contrastées que les autres. E contraste différentiel se manifestent par un effet d’ombre, qui montre l’échantillon en trois dimensions sur les microphotographies. Figure 14 : embraque métallique 3 Technique de cryofracture La méthode de cryofracture, couplée à l’ombrage, a permet d’étudier la structure des membranes. On plonge l’échantillon dans l’azote liquide (-196àC) et on le fracture à l’aide d’une lame de couteau ; souvent la ligne de fracture passe au centre de la bicouche lipidique de la membrane et révèle les faces internes de la membrane cellulaire; en ombrant ensuite la préparation au platine, puis en détruisant le matériau biologique avec un acide, on obtient une réplique métallique de la surface de l’échantillon (figure 15). Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 17  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques Figure 15: la cryofracture 4 Technique de croydécapage La réplique de cryofracture est, par elle-même, une technique extrêmement utile, mais elle peut encore servir pour donner plus d’informations quand on y ajoute une étape de cryodécapage (figure 16). Cette étape permet de voir non seulement les faces intérieures d’une membrane, mais aussi ses faces extérieures. Au cours de cette étape, l’objet congelé et fracturé, toujours dans la chambre froide, est placé sous vide à une température élevée. On réalise ensuite le décapage de la surface de l’échantillon en sublimant une fine pellicule de glace superficielle (cryodécapage). Après on enchaine avec un ombrage métallique, sous vide et à froid. On a ainsi réalisé un vrai moulage extrêmement précis de la surface fracturée de l’échantillon : la réplique. Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 18  Méthodes d’analyses biochimiques et physico-chimiques Figure 16 : le croydécapage Licences des Sciences et Techniques (S5)(PE-SBA-TQPA) | Cours de techniques d’analyses 19