Cours Protéines 7 .pptx

Mouvements En solution les protéines bougent . Difficile à voir en cristallographie: ce qui bouge dans le cristal est non visible, mais possible de comparer des cristaux différents d’une meme protéine . Possible aussi de détecter la mobilité en RMN ou parfois en Microscopie électronique Mouvement d’...

Mouvements En solution les protéines bougent . Difficile à voir en cristallographie: ce qui bouge dans le cristal est non visible, mais possible de comparer des cristaux différents d’une meme protéine . Possible aussi de détecter la mobilité en RMN ou parfois en Microscopie électronique Mouvement d’une boucle de surface dans la Triose Phosphate isomerase Mouvement relatif des domaine (Lyzozyme du Bacteriophage T4) Structure quaternaires ention ne pas confondre domaines et sous unités (ou monomeres) Structure de la bgalactosidase Une sous unité de la bgalactosidase Hormone de croissance sur son récepteur Structure quaternaires Les structures oligomeriques peuvent être homo ou hétéro oligomeriques Les sous unités (monomeres) peuvent être reliées par des ponts disulfure mais ce n’est pas particulièrement fréquent L’interaction entre sous unités est souvent forte Les homo-oligomeres sont très souvent symétriques Les sous unités d’une protéines oligomeriques peuvent coopérer. Les assemblages peuvent donner des structures de grandes tailles (capside virales, complexe multi-protéiques, filaments, tubes etc) Expression, purification et analyse des protéines Expression de Protéines « recombinantes » Source de gène: • -PCR sur ADN genomique ou cDNA -Gène synthétique Hôte d’Expression: • E. Coli •Levures (P Pastoris, S Cerevisiae) •Cellules d’insectes (vecteur Baculovirus) •Cellules Mammifères •Expression « in vitro » • Le vecteur d’expression contient les signaux permettant la transcription et la traduction de la séquence à exprimer • Le vecteur d’expression doit être adapté à l’hôte d’expression Technologie des Protéines recombinantes Essentielle pour produire : • Des protéines « médicament » • des protéines naturellement peu abondantes • des protéines modifiées par mutagènese dirigée • des protéines « fusions » ou « étiquetées » pour faciliter la purification et la détection • des protéines marquées pour les études structurales • Cristallo X : Seleno-Met • RMN : isotopes C13/N15 Purification des protéines Préparation des extraits cellulaire à partir des bactéries Methodes chimiques: •Lysozyme •Détergents + étapes de congélation/ décongélatio Ultra sons Attention aux protéases dans l’extrait brut Travailler vite, au froid, en présence d’inhibiteurs de protéases Compression /Depression (Presse de French Précipitations fractionnées au sulfate d’ammonium Effet du sulfate d’ammonium et du pH •Effet de la protéine •Effet du pH • Les protéines précipitent à une forte concentration en sulfate d’ammonium • La solubilité dépends du pH de la solution • Les protéines précipitées ne sont pas dénaturées • Cela permet de fractionner mais Pour enlever l’excès de sel : Dessalage par dialyse Mais aussi : dessalage par tamis moleculaire (G25) hromatographie: Montage expérimental Séparation par Chromatographie d’exclusion Synomymes courants: Filtration sur gel, gel filtration, tamis moléculaire, SEC Volume d’exclusion (Vo): volume d’élution des molécules trop grosses pour diffuser dans les pores = volume externe aux billes Volume total (Vt): volume d’elution des petites molécules accédant à l’ensemble du volume des pores. Vt > Vo Les protéines ne s’accrochent pas sur le gel Donc leur volume d’élution doit etre compris entre Vo et Vt ritére de séparation  Taille de la protéine : les protéines de taille importante sortent avant les plus petites Ce qui compte ici c’est la taille de la protéine dans son état natif (attention si structure quaternaire)  attention si forme non globulaire Séparation beaucoup moins résolutive que l’électrophorèse Choix du gel Kav = (Ve- Vo)/(Vt-Vo) Chromatographie d’exclusion : déssalage rapide et efficace…. Chromatographie d’Echange d’ions •CM (carboxymethyl: COO •S Sulfopropyl (---SO3-) •DEAE (amine tertiaire) •QAE (ammonium quaternaire) Chromatographie d’Interaction Hydrophobe téine n’est pas denaturée, donc peu de surface hydrophobe accessible ation sur les groupes hydrophobes de la colonne est renforcée par le sulfate d’ammonium présent initialem otéines sont décrochées par une baisse de la concentration en sulfate d’ammonium Chromatographie d’affinité sur chélate de Nickel NTA: NitriloTriacetic Acid Elution (0,2 à 0,5M Imidazole) Lavage (20m M Imidazole) Dépot Purification avec « His-tag » : Automatisable Robots de purification Un schéma classique de purification Suivi d’une purification 1) Densité optique à 280 nm 2) Electrophorèse : pureté ? 3) Activité biologique ou Western blot (identité?) 4) Vérification de la masse (Spectrométrie de Masse) et de l’état d’agrégation Rendement d’une étape = quantité de la protéine recherchée aprés l’étape quantité de la protéine recherchée avant l’étape Facteur de purification = pureté relative (ou Activité spécifique) après l’étape pureté relative (ou Activité spécifique) avant l’étape aration de peptides en chromatographie phase inve ou RP (Reverse Phase) chromatography Eluant: Eau /TFA et Acetonitrile : CH3-CN • Les peptides n’ont en général pas de structure tertiaire stable: pas de risque de dénaturation • Pour produire les peptides a partir d’une protéine: protéase • Protéase : Souvent trypsine (coupe après K ou R)