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07/11/2022 Cours de Microbiologie II (M29) SV5 Partie: Génétique bactérienne Pr. Fatima BOUBRIK 2022-2023 Chapitre I : Les mutations; Nomenclature et définitions. Un locus : (pluriel=loci) = emplacement d’un gène sur le génome d’une espèce. Unité de mesure: centimorgan cM pour les eucaryotes et en minutes ou unité de recombinaison pour les procaryotes. Chez les eucaryotes (Homme 23 paires de chromosomes Chaque chromatide homologues) : 2 copies d’un même gène (2allèles) qui contient une copie occupent le même locus ou position (allèle) du même,gène au Exemple: MYH9 pour la protéine myosine-9 chez l'homme même locus est au locus génique 22q12.3 (le gène se trouve sur le bras long du chromosome 22, dans la sous-bande 3 de la bande 12 par rapport au centromère). Chez les procaryotes (bactérie haploide, un seul chromosome ADN bicaténaire circulaire = nucléoïde) * Une seule copie de chaque gène 1 seule copie de gène: *Un allèle = un des multiples états possibles d’un gène : Allèle sauvage ou allèle muté 1allèle sauvage et allèles mutants. 1 07/11/2022 Chapitre I : Les mutations. Nomenclature et définitions. Un gène se désigne par un groupe de 3 lettres en italique. Ex: his = locus de biosynthèse de l’histidine plusieurs gènes (hisA, hisB,…etc). lac = locus de dégradation du lactose. Le génotype : liste des gènes qui nous intéresse en indiquant si le gène est du type sauvage ou muté. his+: gène sauvage qui donne la capacité de synthétiser l’Histidine, his-: gène mutant. Le phénotype : Ensemble des propriétés observables d’un organisme. His+ avec H majuscule: la souche est capable de croître sans histidine, His- : la souche est incapable de croître sans histidine) Chapitre I : Les mutations; Nomenclature et définitions. Une souche = culture pure de bactéries Souche sauvage de référence Souche parentale = échantillonnage effectué dans la = souche d’origine du mutant nature Souche mutante = souche portant une mutation dans son génome 2 07/11/2022 Chapitre I : Les mutations; Nomenclature et définitions. Un milieu de culture: solide ou liquide spécialement Inoculation: (ensemencement) addition de cellules bactériennes au préparé pour la croissance ou milieu. Les bactéries ajoutées s’appellent l’inoculum. le stockage des bactéries. Ensemenseur Inoculum Une culture : mileu liquide ou solide contenant des Gélose bouillon bactéries qui ont poussé ou entrain de pousser. Colonies Incubation: processus de maintien de Bactéries en suspension la temprérature et autre conditions (milieu liquide) désirées pour la croissance bactérienne. Les Milieux de culture des bactéries MM ou M0 MMS (Milieu minimum) MC (Milieu supplémenté) (Milieu complet) Prototrophes Prototrophes Auxotrophes -Source unique de carbone et d’énergie (glucose). Prototrophes Addition de facteurs Auxotrophes -Source d’azote et de souffre (NH4)2 SO4 de croissance -Source de potassium et de manquants: phosphore (K2HPO4) Acides aminés - Source de Magnésium (MgCl2) Nucléotides et de Calcium (CaCl2) Vitamines -Fer (citrate de Fer) -Sels minéraux (sels de Cu, Zn, Co, Ni, Ti, …); -tampon phosphate: (KH2PO4/ K2HPO4). -H2O 3 07/11/2022 Aspect de la culture selon la concentration des bactéries Tapis bactérien Colonies confluentes Colonies isolées Charge bactérienne très élevée 108 Bactéries 105Bactéries 102 Bactéries Chapitre I : Les mutations; Nomenclature et définitions. MM seul (absence d’Histidine ) Une souche his+, pousse Une souche his - , ne pousse pas MM +Histidine Une souche his+ ou his - pousse MM +lactose comme unique source de C au lieu du glucose Une souche lac+ pousse Une souche lac - ne pousse pas MM (glucose = unique source de C) Une souche lac+ ou une souche lac - pousse 4 07/11/2022 Chapitre I : Les mutations; Nomenclature et définitions. Génotype: his+ pro- lac+ 3 lettres en italique en indiquant si le gène est sauvage ou muté +: la souche est capable de synthétiser cet AA Ou capable d’utiliser ce sucre comme source de carbone Phénotype: His+ Pro- Lac+ 3 lettres (1ère majuscule) écriture normale - : la souche est incapable de synthétiser cet AA Ou incapable d’utiliser ce sucre comme source de carbone Milieu de culture MM +His + Pro+lac Milieu minimum auquel on a ajouté l’acide aminé Histidine et l’acide aminé Proline (unique source de C) Dans ce milieu minimum, on a ajouté le sucre lactose au lieu du glucose comme unique source de C Code à 3 lettres des Acides Aminés Chapitre I : Les mutations; Nomenclature et définitions. Opéron= unité fonctionnelle d’ADN: promoteur+opérateur +plusieurs gènes structurals g1, g2, g3,.. (gène = cistron). Les cistons sont co-transcrits en ARN polycistronique à partir du même promoteur et interviennent dans une même fonction physiologique. g1 g2 g3 AUG AUG AUG p1 p2 p3 5 07/11/2022 Chapitre I : Les mutations; Nomenclature et définitions. Exemple: l’opéron Lactose Gène =ses séquences + séquences ADN permettant son expression +séquences en cis qui le contrôlent Chapitre I : Les mutations; Nomenclature et définitions. Les bactéries avec des mutations soit dans le gène lacZ ou le gène lacY ne peuvent plus métaboliser le lactose (souches lacZ-, absence de l’activité ẞ-galactosidase et les mutants lacY parce que le lactose n’est plus transporté dans la cellule). Les mutants lacI différents, car ils expriment l'activité ẞ-galactosidase de manière constitutive et le Lactose est immédiatement transporté, sansexposition préalable à un inducteur. Nb: Inducteurs et co-répresseurs sont de petites molécules ou métabolites; alors que les répresseurs sont des protéines. 6 07/11/2022 Chapitre I : Les mutations. Maintien des caractères (Fidélité de la réplication) variabilité génétique ADN Elaboration des caractères (Mutations) (via les protéines) Chapitre I : Les mutations. Variations Génotypiques Phénotypiques (gènes) phénomènes d’adaptation, Affectent l’ensemble d’une Mutations Induites, réversibles, instables, non population fixées (rares) Exemple variation phénotypique Arthrobacter globiformis Une bactérie cocoïde (vieille culture) ensemencée dans un milieu neuf (a, b,c) change en bâtonnet. culture jeune (d, e) toutes les cellules sont bâtonnets, culture vieille (g) toutes les cellules sont cocoïdes. 7 07/11/2022 Chapitre I : Les mutations Mutants résistants à un antibiotique. Mutants non Repérage et isolement sélectionnables, des mutants. Mutants d’auxotrophie identifiables sur (compensables) milieu indicateur Chapitre I : Les mutations 1-1 Les mutants résistants à un antibiotique: mutation sélectionnable. Exemple: sélection de mutants résistants à la streptomycine (but= isolement de ces mutants dans une population sensible de 10 6 à 109 bactéries) Une population de 10 8 bactéries Strs contenant 10 mutants Strr 37°C pendant une nuit étalement Isolement des mutants Milieu gélosé = Colonies Str r streptomycine 8 07/11/2022 Chapitre I : Les mutations 1-2 Les mutants non sélectionnables, identifiables sur milieu indicateur (différencie les mutants et les parents). Exemple : mutants Lac- dans une population sauvage Lac+, les Lac+ synthétisent la b-galactosidase qui dégrade le lactose en glucose et galactose. Aucun avantage des mutants. Milieu indicateur, milieu complet +X-gal (BCIG: bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside) le X-gal est un analogue du lactose qui est dégradé par la b-galactosidase en deux composés dont l’un est bleu. Colonie bleue: Lac+ Colonie blanche: Lac- Chapitre I : Les mutations 1-3 Les mutants d’auxotrophie. Enrichissement de la culture 108 His+ et 10 His- MM liquide sans histidine+ pénicilline 106 His+ et 10 His- Traitement Isolement MM liquide des mutants Lavage de la culture Enrichissement sans histidine+ pénicilline par un agent de la culture (méthode des mutagène répliques) 104 His+ et 10 His- Lavage MM liquide sans histidine+ pénicilline 102 His+ et 10 His- Identification des His- par la méthode des répliques 9 07/11/2022 Chapitre I : Les mutations 1-3 Les mutants d’auxotrophie (suite). Isolement des mutants (méthode des répliques) 1/ Etalement de la culture après enrichissement (Colonies prototrophes et auxotrophes) 3/ Résultat après incubation 24 h = boîte mère (colonies isolées+ position de chaque colonie localisée) 2/ Repiquage des colonies sur une autre boîte de MC (facilite le repérage des colonies) Repère (flèche tracée pour faciliter la localisation des colonies) Chapitre I : Les mutations 1-3 Les mutants d’auxotrophie (suite). Réplique sur le velours 10 07/11/2022 Chapitre I : Les mutations 1-3 Les mutants d’auxotrophie (suite). Isolement des mutants (méthode des répliques) Milieu sans Histidine Boîte contrôle: MC (Repère) (Boîte mère:MC) (Repère) Chapitre I : Les mutations 1-3 Les mutants d’auxotrophie. Isolement des mutants (méthode des répliques) Méthode des répliques: recherche des mutants His- et Leu- Répliques 24h 37°C 1=MM supplémenté sans HIS 2=MM supplémenté Boîte mère sur sans Leu 3=Milieu complet Milieu complet (Milieu sélectif) (Milieu sélectif) Boite contrôle Mutant auxotrophe Leu- repéré Absence de colonie= mutant auxotrophe His- Repéré. 11 07/11/2022 Chapitre I : Les mutations Repérage Mutants Isolement (méthode des quadrants) Culture pure Conservation des souches (congélation, lyophilisation) Chapitre I : Les mutations Hérédité Indépendance Discontinuité Caractéristiques d’une mutation Rareté Stabilité Spontanéité 12 07/11/2022 Chapitre I : Les mutations Rareté, Indépendance d’une mutation La mutation n’affecte qu’un tout petit nombre d’individus Taux de mutation µ = probabilité pour une bactérie de Rareté muter pendant le temps d’une génération (10-6 à 10-9) ≠ Fréquence des mutants = résultante de µ et de la sélection exercée sur le mutant Une mutation ne modifie pas l’aptitude d’une bactérie à subir une autre mutation affectant Indépendance un autre caractère Escherichia coli lac+his+:µ lac+ --> lac-= 10-7 µ his+ --> his-= 10-6 µ lac+his+ --> lac-his-est de 10-7 x 10-6 = 10-13 Expérience sur les mutations: spontanéité (1), rareté (2), stabilité (3) -Population sensible à la canavanine Colonies confluentes (tapis) -Etalement de 10 8 Cellules 24H 37°C (les 4 colonies issues des 4 mutants sont là présentes) -Milieu sans Canavanine (1) et (2) Répliques sur milieu avec Canavanine = agent sélectif Ensemencement d’une Colonies confluentes colonie résistante à la canavanine Toutes résistantes à la Etalement de 2x103 cellules Canavanine gélose avec Canavanine Bouillon sans canavanine (3) 13 07/11/2022 Chapitre I : Les mutations Les types de mutants. Mutants nutritionnels. Mutants résistants aux Mutants morphologiques. agents antimicrobiens. Les types de mutants Mutants pleiotropes Mutants létales conditionnels. Chapitre I : Les mutations Les types de mutants. Les mutants morphologiques. Modification des caractères morphologiques: les flagelles, les dimensions de la cellule, la forme, la surface de la colonie….. Les mutants nutritionnels. Apparition ou disparition d’un besoin nutritionnel (mutants auxotrophes, mutants de catabolisme Lac- par exemple) Les mutants résistants aux agents antimicrobiens. Mutants résistants aux antibiotiques, métaux lourds. 14 07/11/2022 Les types de mutants. Les mutants létales conditionnels. Les mutants pléïotropes. Mutation dans un gène dont le produit est indispensable à la L’effet de la mutation n’est pas limité au gène cellule. atteint mais s’étend à l’expression de plusieurs Phénotype des mutants = mort cellulaire. gènes mutants cryosensibles ou thermosensibles. Exemple: mutations dans les séquences des E coli dnaATs (mutation) opérateurs et les gènes des protéines régulatrices (répresseurs et activateurs). DnaA protéine d’initiation de la réplication (essentielle) est thermosensible, devient inactive à 42°C Cette souche pousse à 30°C = conditions « permessives ». Meurt à 42°C =conditions « non permessives » caractère Phénotype du mutant=mort cellulaire Les agents mutagènes. à l’origine des mutations induites avec augmentation de la fréquence d’apparition des mutations à 10-3 (mutations spontanées de 10-6 à 10-9) Agents intercalants Chimiques Analogues des bases Agents désaminants *Radiations ionisantes. rayons X et g Physiques *Radiations non ionisantes UV Biologiques Transposons 15 07/11/2022 Les agents chimiques. *Agents intercalants. Exemple : Acridine orange, bromure d’éthidium Molécules planes (1) qui s’intercalent dans le plan entre deux paires de base, provoquent l’étirement de l’ADN (2). L’ADN polymérase ajoute une base (microinsertion) (3) entraînant des mutations de changement de cadre de lecture, ou reste bloquée (4). Les agents chimiques. *Les analogues des bases. Même structure que les bases, défauts d’appariement, substitutions de base. Ex « 5-BU » deux formes existent en solution: -non ionisée (forme cétone BU), la plus fréquente, s’apparie avec A -ionisée (forme énol BU) très rare s’apparie avec G (G1, G2, G3: générations) A Br CH3. H O H A T G C C C C C C Erreur.. Mutant BU Mutation A G C N N N N. G2. A.T G.C H C H H C H Transition T A BU A G1.. O O G3 5-Bromouracil Thymine Bactérie T BU parentale (ADN) 16 07/11/2022 Les agents chimiques. *Les agents désaminants (Acide nitreux HNO2) * alkylants (Méthyl méthane sulfonate, Ethyl méthane sulfonate…). Interagissent avec l’ADN. Provoquent un changement chimique d’une base et un mauvais appariement. H H H C NH2 H C O C C C C U N N HNO2 N N. H C H C H A U O O. Cytosine Uracile C U A T... G G A C Altération. Mutation G C.G T.A 17 07/11/2022 La liaison du groupement alkyle conduit à: - Un site abasique (détachement de la base de la chaîne) ou - Une base alkylée (modifiée) Les agents physiques. Radiations= mutagènes très puissants *Les radiations ionisantes: Effet indirect par ionisation de l’eau (formation des radicaux libres= atomes ou molécules instables avec des électrons non appariés qui endommagent l’ADN) et Effet direct par excitation des particules (particules ionisantes). *Les radiations non ionisantes: UV, pas de changement de la structure de l’eau. pic d’absorption de l’ADN et ARN à 260 nm. UV (100 à 400 nm) : Dimère de thymine. Arrêt de progression de l’ADNpol. UV CGATAACTAG GCTATTGATC CGA TAG GCT ATC 18 07/11/2022 Les radiations ionisantes La mutagénèse dirigée. Technique in vitro- utilisation d’ADN synthétique- qui permet le remplacement d’une base à une position précise par une autre base ; remplacement d’un AA par un autre AA (Analyse des interactions entre protéines ou entre protéine et ADN). 19 07/11/2022 Le test d’Ames pour les carcinogènes. Pour l’identification des produits naturels ou artificiels potentiellement carcinogènes pour l’homme. Principe: Tous les carcinogènes (agents provoquant le cancer par lésion de l’ADN), sont des mutagènes. Organisme test: Salmonella typhimurium (ST) His-. Cette souche ne pousse pas sur un milieu minimum. Le test mesure la réversion de ST His- vers la prototrophie (His+). *Le test est positif si le nombre de mutants (révertants) avec le produit à tester est au moins le double du nombre de mutants spontanés. Apolaires, liposolubles Elimination difficile Foie Phase I: Enzymes monooxygénases:Cytochrome P459 Phase II: Enzymes de conjugaison Facile par le rein (hydrosoluble) 20 07/11/2022 (NADPH,O2) (Gélose de surcouche) Le test d’Ames pour les carcinogènes. ST+S9 mix ST+ S9 mix ST+ S9 mix ST+ S9 mix ST+ Produit (C2) +GS +GS + Produit à + Produit (C2) +GS tester (C1) +GS + GS 37°C pendant 24 à 48 heures MM+HIS MM MM MM MM Test positif : nombre de mutants révertants avec le produit est au moins le double de mutants spontanés 21 07/11/2022 *Variante du test d’Ames (test qualitatif) Chapitre 2 : Les Antibiotiques. Toxicité Antibiotique sélective Gram - : Produit naturel, (bactéries) mb ext=barrière de synthétique ou semi perméabilité naturelle synthétique pour les substances hydrophobes et de Effet bactériostatique grande taille. (inhibe les bactéries) Effet bactéricide Gram +: Pas de barrière (tue les bactéries) 22 07/11/2022 Les types d’ATB selon le mécanisme d’action et la cible. Cible = Inhibition de la synthèse du peptidoglycane et lyse cellulaire Bactéricides La paroi Famille des b-lactamines, Glycopeptides et Fosfomycines Gram+ et Gram- (interférence avec la synthèse des protéines) bactériostatiques à large spectre Le ribosome Famille des Aminoglycosides , Tétracyclines (se fixent sur la ss- unité 30 S)- Familles des Macrolides (50 S) Les types d’ATB selon le mécanisme d’action et la cible. Cible = Interaction avec la gyrase, blocage de la réplication Familles de l’Acide Nalidixique, les Quinolones, L’ADN Novobiocine Altération et dommages de l’ADN Famille des Nitrofuranes et 5-nitro-imidazolés Inhibition de l’ARN polymérase L’ARN Famille des Rifamycines 23 07/11/2022 Les types d’ATB selon le mécanisme d’action et la cible. Cible = Augmentation de la perméabilité de la membrane plasmique La membrane membrane externe endommagée Plasmique Effet plus sur les Gram- , Familles des Polymixines Analogues d’un intermédiaire dans la voie de synthèse de coenzymes. Les coenzyme du métabolisme cellulaire Famille des Sulfamides, triméthropim est un analogue de PAB (intermédiaire dans la synthèse du Folate ou vitamine B9 nécessaire à la synthèse des bases) 24 07/11/2022 Les stratégies des bactéries pour résister aux antibiotiques. Vitesse de la pénétration(entrée) de l’ATB Concentration intra bactérienne de l’ATB Vitesse de l’élimination de l’ATB (inactivation ou excrétion) Stratégies des bactéries pour résister aux ATB Dégradation de Source extérieure Modification de Réduction de la l’ATB par des de coenzymes la cible par perméabilité enzymes mutation cellulaire Inactivation de Protéines b-lactamase l’ATB par Gyrase mutée ribosomiques dégrade les b- O- (l’acide nalidixique) mutées lactamines phosphorylation, (Macrolides, aminoglycosides) N-acétylation 25 07/11/2022 L’Antibiogramme. Préparation de la suspension bactérienne 2,0 4,0 3,0 0,5 1,0 Solution McFarland=standards de turbidité pour préparer les suspensions de microorganismes (billes de latex ou sulfate de baryum) 1 mL 1 mL ≈ McF=1,0 3 108 cfu/mL 3 107 cfu/mL 3 106 cfu/mL Jour1 : [bactéries]F ~ 106/ml Mueller-Hinton 0 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 [ATB]F en mg/l Témoin Dilutions Etalement 0.1 ml Jour 2 : (incubation 18- 24h à 37°C) Témoin CMI 0.1ml 0.1 ml 0.1 ml (étalement- incubation 24h J3 Colonies (survivants) 26 07/11/2022 Calcul de la CMI et CMB CMI (concentration minimale inhibitrice): la concentration d’antibiotique où aucune croissance bactérienne n’est visible à l’œil nu (pas de trouble visible). CMI=2 mg/l d’Ampicilline. CMB (concentration minimale bactéricide): la concentration d’antibiotique où le pourcentage de survie est inférieur ou égal à 0,01%. La CMB peut être de 2, 4 ou 8 mg/l. X=% de survie N0 (témoin)= 6x105 UFC/ml 100% de cellules vivantes NCMI= 6x104UFC/ml XCMI= 10% de cellules vivantes N2xCMI= 30 UFC/ml X2xCMI= 0,005% de cellules vivantes Dans notre cas CMB=4 mg/l On calcule le rapport CMB/CMI CMB/CMI=1, ATB bactéricide La méthode de diffusion Ensemencement avec une *culture pure d’organisme pathogène. L’inoculum est étalé par un écouvillon ou par inondation (on sèche la boîte 10min à 37°C). On dépose ensuite les disques imprégnés chacun d’un ATB différent. Une croissance quasi confluente va se développer après incubation. 16 mm 0 mm P 35 mm Disque d’antibiotique 6µg P = Pénicilline 27 07/11/2022 Pour chaque ATB il y’a une échelle de concordance entre le diamètre mesuré et la CMI Vincent Jarlier DIU Mal Inf Antibiogramme Diamètre CMI Echelle de concordance Notion de concentrations critiques d’un ATB Les concentrations critiques c et C sont des concentrations définies en fonctions des CMI des germes et des concentrations sériques ou tissulaires habituelles de l’antibiotique. c : concentration critique inférieure représente la concentration sanguine ou sérique moyenne obtenue après administration de la dose habituelle de l’ATB au malade. C : concentration critique supérieure, représente la concentration sanguine ou sérique obtenue après administration de la dose maximale non toxique, toléré par le malade (représente le seuil de toxicité de l’ATB). 28 07/11/2022 S = souche sensible : CMI ≤ c Ø≥D Traitement à dose habituelle par voie générale. La concentration sérique de l’ATB doit être supérieure Disque ATB ou égale à la CMI. I = intermédiaire : c F’ (F’a) a et A sont deux allèles du même gène sur le chromosome F a chromosome a Hfr F’a conjugaison F a A X x F’a F- Méroploïde a/A (diploïde partiel pour le marqueur a) Utilisé dans des tests de complémentation 80 40 07/11/2022 Détermination de l’ordre d’entrée des gènes. La conjugaison interrompue. Détermination de l’ordre d’entrée des gènes. La conjugaison interrompue. trp+thr+ gal +rpsL+ trp - thr - gal - rpsL - Hfr X F- Trp+Thr+ Gal +Strs Trp- Thr - Gal – Str r T0 T20 T40 Milieu de sélection MM +Glc +Thr +Str Recombinants obtenus Trp+ Str r MM+ Glc+ Trp +Str Thr+ Str r MM+Trp+Thr+Str +Gal (unique source de C) Gal+Strr 41 07/11/2022 Détermination de l’ordre d’entrée des gènes. La conjugaison interrompue: courbes de fréquence de recombinants Augmentation du nombre de recombinants avec le temps 50 - Chaque allèle du donneur apparaît pour la 1ère fois à un Thr+ Nombre de recombinants pour 100 Hfr instant précis après le début du croisement chez le receveur. 40 Cartes génétiques des bactéries en mn (100 min pour le chromosome) 30 Gal+ oriT + moitié de F 20 thr gal trp 8 25 33 minutes Trp+ 10 17 mn 8 mn 25 mn 10 20 30 40 50 60 70 Fragment Hfr Temps (minutes) La conjugaison continue (2h). *Séparation spontanée entre Hfr et F- On sélectionne pour les recombinants Thr+ (marqueur proximal) et on analyse ces recombinants pour voir s’ils ont *un marqueur proximal ou précoce: proche reçus les autres marqueurs de l’origine de transfert (a plus de chance Hfr F- Fragment Hfr transféré d’être transféré avant la séparation des OriT bactéries). 8 min * un marqueur distal ou tardif: éloigné de l’origine de transfert. *un gradient naturel de transfert des 25 min marqueurs est crée 33 min *La fr des recombinants chez la réceptrice est fonction de 2 paramètres: Trp gal thr -gradient de transfert Recombinants Thr+ = 100% des recombinants ont Thr+ -recombinaison (CO pour intégrer le Recombinants Gal+ = 60% marqueur) Recombinants Trp+ = 20% 42 07/11/2022 La conjugaison continue (2h). Détermination du lien entre les gènes (cartographie fine). - on sélectionne pour le marqueur distal (tous les marqueurs ont une probabilité égale d’être transmis). Les fréquences de recombinaison ne dépendent que de la distance entre les gènes étudiés et non du gradient du transfert. Unités : pourcentage de recombinaison établir les classes de recombinants dans un croisement trifactoriel (trois marqueurs chromosomiques). La classe la plus faible est celle qui nécessite 4 CO. Exemple de détermination du lien entre les gènes. Hfr leu+ arg+ met+ Str s x F-leu- arg- met- Str r. - Marqueur distal ou tardif = leu+ (donc sélection des recombinants Leu+ après la fin de la conjugaison). - Marqueurs non sélectionnés= arg+ et met+. - Nécessité de 2 CO pour incorporer n’importe quel fragment transmis, dans le chromosome F-. La conjugaison continue (2h). Détermination du lien entre les gènes (cartographie fine). 4% des recombinants 9% des recombinants 87% des recombinants (classe sauvage) 0% des recombinants (les plus rares) 43 07/11/2022 La conjugaison Tableau comparatif Transfert de F Mobilisation du chromosome par F Durée de transfert 2 min 100 min Cassure des paires de bactéries non oui Devenir de la réceptrice F+ F- Recombinaison homologue non oui Chapitre 5 : La transduction. TRANSDUCTION =transfert d’ADN bactérien via un phage Transduction spécialisée ou Transduction restreinte généralisée l Transfert d’un P1, P22 Transfert gène spécifique de n’importe quel gène 44 07/11/2022 La transduction généralisée. P1 Ca2+ Lysat P1 La transduction généralisée. Titration du lysat de P1 (une même quantité de bactéries est mélangée avec des dilutions en série du lysat et on étale le mélange sur un milieu gélosé). Lysat de P1 (le trouble a disparu car les Bactéries ont lysées ou éclatées) 45 07/11/2022 La transduction généralisée. Titration du lysat de P1 10-2: 30 plages de lyse N= 30 x 102x 10= 3x 104 P1 /ml Tapis bactérien Plages de lyse 0.1 ml de la dilution 10-2 du lysat résultat après incubation 24h 37°C La transduction généralisée. moi= nombre de phage/nombre de bactérie. l’étape de la fixation du phage nécessite la présence du calcium dans le milieu. Le lysat phagique est utilisé pour infecter une bactérie receveuse avec une multiplicité d’infection très faible moi= 0.1 (un phage pour dix bactéries). Si N= 3x 104 P1 /ml, nombre des bactéries= 3x 105 UFC /ml On a 3 cas possibles dans la population bactérienne receveuse: 46 07/11/2022 La transduction généralisée. *moi=0.1 *enlever le Ca à la fin De l’étape de l’infection a+ a- a- Bactérie non infectée a+ a+ a+ Cycle lytique Recombinant recherché P1 transducteur Fr de co-transduction lac+ 50 transductants lac+ (=100%) Varie de 100% à 0% chez la bactérie réceptrice lac- leu- mal- 100% leu+ Résultats des marqueurs non sélectionnés : lac+mal+ leu+ : 3 colonies mal+ 54% lac+ mal+ leu-: 10 colonies lac+ mal- leu+: 24 colonies lac+ mal- leu-: 13 colonies 50 26% 0% Chromosome de la lac+ leu+ mal+ bactérie donneuse Taille maximale de l’ADN bactérien encapsidé par erreur =100kb (taille du génome du P1) 47 07/11/2022 La transduction généralisée. Fréquence de co-transduction: Fréquence avec laquelle un marqueur non sélectionné est apporté en même temps qu ’un marqueur sélectionné, lien entre les gènes. Si distance est sup à 100 Kb (2 min) pas de co-transduction Ex: marqueur selectionné c+ On cherche parmi les transductants c+, combien on a de B+ et A+ (co-transductants) 0% co-T D Taille de l’ADN de P1=100 Kb Marqueurs situés à une distance > à 100 Kb de c+ ne seront pas co-transduits. 100 Kb Transduction spécialisée ou restreinte Produite par un phage « tempéré » Ex: le phage l d’E.coli milieu riche : le répresseur CI milieu pauvre : le répresseur CI est n’est pas activé activé 48 07/11/2022 Transduction spécialisée ou restreinte 10 6 l sauvages Induction UV d’une bactérie lysogène pour l: cycle lytique 1 ldgal+ TYPE II Le lysat (10 6 l+ et 1 ldgal+) est appelé ldgal lysat BFT = basse fréquence de ldgal transduction gal + - L’addition de ce lysat à une culture de gal + bactéries gal- permet d’obtenir quelques X X transductants gal+ X gal - Recombinaison 2 crossing over gal - Recombinaison 1 crossing over Transductant Gal+ gal + gal + Génome l gal - Transductant Gal+ 49 07/11/2022 Chapitre 6 : La recombinaison génétique. Recombinaison homologue ou générale Les séquences qui interagissent ont de grandes régions d’homologie (quelques dizaines de paires de bases). Recombinaison illégitime Regroupe un ensemble d’événement rare Recombinaison spécialisée ou site spécifique La séquence identique peut être seulement de quelques paires de bases. Recombinaison réplicative lors de la transposition Recombinaison homologue. Plusieurs modèles ont été proposés (celui montré est celui de Meselson et Radding). 3/ Recombinaison 4/ ADN exogénote (du donneur) Intégré dans l’ADN du receveur 1/ Discontinuité 2/ Les monomères de Rec A se fixent sur (3’OH libre) 3’OH libre pour former un filament de nucléoprotéine et cherche l’homologie chez l’ADN receveur 50 07/11/2022 Recombinaison homologue Le complexe multienzymatique RecBCD 3’ RecBCD 5’ chi Extrémité libre (bout franc) 5’ Endonucléase simple brin coupe l’ADN déroulé 4 à 6 nuc du côté 3’ de chi 3’OH (points chauds de recombinaison) RecA *Le complexe multienzymatique RecBCD : C’est un complexe à activité exonucléase simple et double brins, à activité hélicase et activité endonucléase simple brin. Crée des régions simples brins aux points chauds (chi) de recombinaison pour permettre à RecA de se fixer. L’analyse par Etude de la distance entre les gènes. recombinaison Probabilité qu’une même opération de Localisation de recombinaison implique deux gènes est deux gènes l’un par proportionnelle à la distance entre ces rapport à l’autre gènes sur le chromosome Deux gènes différents Limites de très proches (pas de l’analyse par recombinants): Test de recombinaison. complémentation 51 07/11/2022 Recombinaison homologue Deux mutations conduisant à un même phénotype Test de sont-elles localisées dans le même gène ou dans deux complémentation gènes différents très proches? Analyse de dominance/ récessivité Construction de souches diploïdes partielles utilisation de plasmides recombinants (F’,..) ou de (mérodiploïdes) sachant bactériophages transducteurs dans une souche que la bactérie est réceptrice recA (pas de recombinaison) haploïde Le diploïde retrouve le phénotype Construction de sauvage: complémentation (les diploïde : mutations sont sur deux gènes allèle mutant/allèle différents) mutant Le diploïde a le phénotype mutant: mutations sur le même gène Test de complémentation Exemple: Construction de diploïdes partiels mutant/mutant Un parent sauvage His+ (synthétise les deux protéines HisA et HisB, essentielles pour avoir hisA1 / hisB2 hisA1 / hisB3 le phénotype His+) et trois mutants His- (une des protéines manque) hisA1 hisA1 hisB2 hisB3 Phénotype His + Phénotype His+ Mutations 1 et 3 Mutations 1 et 2 dans des gènes différents dans des gènes différents Phénotype His- Mutations 2 et 3 dans le même gène 52 07/11/2022 Analyse de la dominance/la récessivité. *Le diploïde a le phénotype sauvage = Allèle mutant Test de complémentation récessif par rapport à l’allèle sauvage Construction de diploïde: *Le diploïde a le phénotype mutant = Allèle mutant allèle sauvage / allèle mutant dominant par rapport à l’allèle sauvage Chapitre 7 : La transposition. *Transposition = transfert d’un petit morceau spécialisé d’ADN ou d’une copie de ce morceau d’un site à un autre. (fréquence de 10-5 à 10-7 par génération. TE: Elément Transposable ou gène sauteur). - Il se trouve dans le chromosome bactérien, ADN du phage et les plasmides. -Il peut engendrer une variété de réarrangements dans le génome (Délétions, insertions, inversions). -Il n’y a en effet aucune similitude de séquence entre les sites échangés. Le système est Rec indépendant. -Les réarrangements provoqués auront donc aléatoires. 53 07/11/2022 Chapitre 7 : La transposition. Les transposons sont classés selon la structure génétique et le mode de transposition: a/ Transposon simple (séquences d’insertion « IS ») ; b/ Transposon composé; c/Transposon famille « TnA » IR (répétition inverse) 5’-CTGACTA……………….TAGTCAG- 3’ 3’-GACTGAT………………ATCAGTC- 5’ tnpA c/ Transposon « TnA » tnpA res tnpR ampR tnpA Gènes de résistance tnpA IR IR Chapitre 7 : La transposition. Transposon simple (IS) Transposition non Gène de transposase réplicative Élémént cryptique(pas de phénotype) Transposon composé Transposition non Gène de la transposase tnpA réplicative Transposons composés Gène d’une résistance Gène de la transposase Gène d’une résistance Transposon famille TnA (nouveau phénotype) Gène de la transposase tnpA Transposition Gène de la résolvase tnpR réplicative Gène d’une résistance 54 07/11/2022 Création de répétition directe et transposition. -Au niveau du site ou séquence cible (GTCGCAGA) de l’ADN hôte, on a une coupure en chicane par la transposase, qui génére des bouts collants. -Le transposon se lie aux extrémités simples brins de l’ADN. Après réplication de l’ADN simple brin (polymérisation) et ligation, on obtient des répétitions directes de l’ADN cible. Transposition réplicative: (i)Les deux molécules d’ADN sont d’abord entaillées pour former des extrémités libres. a- h. Les extrémités a et f sont jointes, de même que g et d. Cela laisse b , c, e , et h libres. (iii)Deux de ces extrémités libres restantes du donneur (b et c) servent comme amorces pour la réplication (synthèse) de l'ADN, jusqu'à ce que b atteigne e et c atteigne h. Ces extrémités sont ligaturées pour compléter le co- intégrat (le transposon entier a été dupliqué). Un crossing over se produit entre les deux sites res (résolution) des deux copies du transposon, laissant deux molécules d’ADN indépendantes, portant chacune une copie du transposon. 55 07/11/2022 Chapitre 7: Les plasmides. 1- Elément génétique dans le cytoplasme 2- Techniques d’isolement des plasmides, de la bactérie propriétés physiques, migration en gel Ne doit pas bloquer la réplication et la d’agarose survie de la souche hôte. ADN double brin circulaire - linéaire possible (Taille 1 à 1000 kb) En moyenne 0,2 à 4% de la taille du chromosome, forme superenroulée dans la cellule Des milliers de plasmides différents dans la nature. 300 plasmides naturels chez E. coli Chapitre 7: Les plasmides. Pas d’existence en dehors d’une cellule hôte. -Transfert possible au moment de la division cellulaire (Mécanisme le plus fréquent) ou par transformation naturelle (peu probable) -Transfert par conjugaison est spécifique de certains plasmides : plasmide F (pilus F), plasmide R (pilus R) Réplication des plasmides chez les bactéries à gram- Mécanisme analogue à la réplication du chromosome Initiation de la réplication à un point fixe: l’origine de réplication Réplication bidirectionnelle (intermédiaire en q) - parfois unidirectionnelle 56 07/11/2022 Réplication des plasmides chez les bactéries à gram+: réplication selon le mécanisme du cercle tournant DSO= double strand origin, rep=protéine d’initiation de réplication (codée par le plasmide), polIII=ADN polymérase III, SSO=Single strand origin. Chapitre 7: Les plasmides. Contrôle du nombre de copies: au niveau de la vitesse d’initiation de la réplication. -Plasmide stringent - faible nombre de copies (1 à 2 copies par cellule). Régulation très stricte lors de la répartition des plasmides (dans les cellules filles lors de la division) -Plasmide relâché - fort nombre de copies (10 à 100 copies par cellule). Répartition au hasard Plasmide entrant Incompatibilité entre plasmides. - Plusieurs plasmides différents dans une même souche. Borrelia burgdorferi: 17 plasmides -Transfert d’un plasmide dans une cellule hôte qui héberge déjà un autre plasmide -Pas de réplication du plasmide entrant, Perte lors des divisions ultérieures de la bactérie; Les deux plasmides sont incompatibles. 57 07/11/2022 Chapitre 7: Les plasmides. Elimination d’un plasmide Guérison de la bactérie « curing » Le rôle biologique des plasmides. -Action de composés qui inhibent spécifiquement la réplication du plasmide (acridine orange). -Dilution du plasmide lors des divisions successives (bactéries guéries). Guérison spontanée possible Orange acridine RTF R 89/0 oriV mer inc sul IS str fus Plasmide cml R100 IS Gènes tra IS IS tet RTF=Resistance Transfert Factor (gènes de transfert et réplication) oriT , R à taille très variable (résistance ATB) 58 07/11/2022 Plasmide de virulence. Intestin grêle Présent chez les microorganismes pathogènes Fixation du microorganisme sur une cellule Plasmide de Colonisation de certains sites spécifiques virulence Chromosome Synthèse de substances telles que toxines, enzymes… Destruction de la cellule hôte Ex: Souche entèropathogène d ’E. coli Colonisation de l’intestin grêle grâce au facteur antigénique de CFA colonisation CFA et production de deux toxines (hémolysine et entérotoxine) Hémolysine Entérotoxine Lyse globules rouges Sécrétion eau sels Diarrhée Plasmide producteur de bactériocine -On a présence de gènes de structure, de dégradation et de transport Chromosome Plasmide -La bactériocine est un peptide synthétisé par les bactéries contenant ce plasmide. Elle inhibe ou tue les cellules qui ne la produisent pas - Présence d’un gène codant pour une protéine immunité spécifique à la bactériocine, Localisée dans la membrane interne (protection de la Transport bactérie productrice) -Le nom de la bactériocine dérive de l’espèce qui la produit Bactériocine Colicine chez E. coli Subtilisine chez B. subtilis etc… NH2 COOH Colicine Translocation Fixation au Activité colicinogénique récepteur Protéine immunité 59
