Cours de biologie générale (22 octobre 2024) PDF

20-10-24 La génétique humaine Stratégies utilisées pour établir les modes de transmission des caractères chez l’Homme radicalement différentes des approches étudiées chez le pois ou encore la souris. Pourquoi?  Peu probable d’observer des proport...

20-10-24 La génétique humaine Stratégies utilisées pour établir les modes de transmission des caractères chez l’Homme radicalement différentes des approches étudiées chez le pois ou encore la souris. Pourquoi?  Peu probable d’observer des proportions mendéliennes dans la descendance d’une seule union (croisement);  Impensable de contrôler les unions sur le critère des génotypes parentaux 1 Pourtant, 2 façons de procéder à l’analyse génétique : 1. Rassembler les résultats de populations d’effectif important et appliquer des techniques mathématiques afin de déduire si un trait est transmissible  Etudes de populations (coûteuses et longues) 2. Suivre le mode de transmission d’un trait particulier au sein de plusieurs fratries et sur plusieurs générations  Etudes familiales (très en vogue) 2  20-10-24 Etudes familiales: Visualiser les modes d’hérédité d’un caractère au sein des familles grâce aux arbres généalogiques (pedigrees) Dans le cadre d’une analyse génétique, l’arbre généalogique comporte un ensemble de symboles décrivant :  Les relations interindividuelles  L’histoire d’une caractéristique dans une famille nucléaire ou élargie 3 Arbre généalogique  homme Ο femme  Femme Jumeaux malade Homme malade  Sexe inconnu  décès Décès nourrisson 4  20-10-24 Des pédigrées nombreux et différents doivent être regroupés pour mener certaines études Pour d’autres, un seul arbre généalogique (mais d’effectif important sur plusieurs générations) peut apporter une information génétique suffisante Dans ce cas, et en dehors de toute ambiguïté, un généticien peut déterminer le mode de transmission d’un caractère contrôlé par un locus unique, en choisissant parmi 4 types différents seulement : 5 1. Manifestations autosomiques dominantes 2. Manifestations autosomiques récessives 3. Manifestations liées à l’X et récessives 4. Manifestations liées à l’X et dominantes 6  20-10-24 La transmission autosomique dominante : Environ 200 manifestations de ce type connues chez l’homme (AD) Altération de la fonction d’un organe Incidence variable 7 8  20-10-24 L’arbre généalogique représentatif d’un état autosomique est caractérisé par :  Individus atteints à chaque génération  Autant de garçons que de filles atteints  Au moins un parent atteint pour chaque individu atteint  Deux parents atteints enfants non atteints  Enfants de parents sains rarement atteints 9 La transmission autosomique récessive : Environ 900 AR répertoriées La présence de 2 allèles déficients au même locus conduit à la maladie 10  20-10-24 11  Dans le cas de maladies rares, les mariages entre cousins germains ou entre proches parents donnent naissance à des enfants atteints Quelques traits distinctifs des AR :  Certains des enfants de parents non atteints sont atteints  Garçons et filles atteints en nombre équivalent  Descendants de parents atteints sont eux-mêmes atteints 12  20-10-24 L’hérédité liée à l’X : Chez un homme fertile, la moitié des spermatozoïdes reçoit un chromosome Y et l’autre, un chromosome X Les ovocytes de la femme reçoivent un chromosome X Donc, au sein d’une population, la moitié de la génération filiale sera de type XX (filles) et l’autre moitié XY (garçons) La ségrégation des chromosomes sexuels durant la méiose maintient le rapport 1:1 au fil des générations 13 Dans le cadre des modalités de détermination du sexe, tous les fils reçoivent leur chromosome Y de leur père Un gène important dans la détermination du testicule (SRY, pour « sex determining region of the Y chromosome ») est localisé en Yp11 dans l’espèce humaine Les chromosomes sexuels n’ont pas de matériel génétique en commun, mise à part l’information portée par deux segments (au moins), appelés les régions pseudo-autosomiques 14  20-10-24 Les chromosomes sexuels dans l’espèce humaine: Les crochets numérotés indiquent l’emplacement approximatif des 2 régions pseudoautosomiques Les régions pseudoautosomiques Xp-Yp s’apparient plus fréquemment que les régions pseudoautosomiques Xq-Yq 15 Ces régions sont le lieu d’appariement et de recombinaison entre les chromosomes X et Y La précision de la ségrégation des chromosomes sexuels durant la méiose dépend de l’appariement entre X et Y Appariement et recombinaison plus fréquents entre les régions Xp-Yp (1-1) qu’entre les régions Xq-Yq (2-2) 23 gènes localisés sur le matériel non pseudo-autosomique d’Y = gènes holandriques 285 gènes sont liés à l’X 16  20-10-24 Présence d’un seul allèle récessif lié à l’X produit un phénotype chez l’homme puisque très peu d’information génétique est partagée par les régions homologues des chromosomes X et Y :  Peu voire pas de possibilité qu’un allèle normal dominant masque l’effet de l’allèle récessif 17 Le caractère récessif ou dominant d’un gène lié à l’X est donc déterminé chez la femme qui possède 2 X Dans les arbres généalogiques d’un état lié à l’X et dominant, les traits suivants sont observés : 18  20-10-24  un individu atteint à chaque génération  toutes les filles d’un homme atteint sont touchées  une femme atteinte peut donner naissance aussi bien à des garçons qu’à des filles atteints  autant de femmes que d’hommes manifestent le trait 19 Dans le cas d’une maladie liée à l’X et récessive :  Tous les fils d’une mère malade sont atteints  Les pères atteints ne transmettent jamais le trait à leurs fils  Des parents sains peuvent donner naissance à des enfants atteints  Globalement, la maladie est plus fréquente chez les garçons que chez les filles 20  20-10-24 21 22  20-10-24 Biotechnologie Techniques de l’ADN recombiné Objectifs d’apprentissage ? Endonucléases de restriction et ligase Vecteurs de clonage Méthodes d’hybridation de l’ADN La réaction en chaîne de la polymérase (PCR) 23 23 L’objectif des techniques de l’ADN recombiné est d’introduire un gène d’un organisme donné dans une cellule hôte, dans laquelle il peut être maintenu au cours des générations et étudié. Les étapes de cette expérience sont les suivantes : 1. Extraction de l’ADN d’un organisme donneur 2. Découpage de cet ADN par des enzymes (endonucléases) 3. Insertion de chaque fragment dans un vecteur de clonage capable de se répliquer dans la cellule hôte 4. Formation des « constructions d’ADN » 5. Introduction de chaque construction dans 1 cellule hôte 6. Identification et isolement des cellules portant un insert 24 24  20-10-24 25 25 26  20-10-24 A. Endonucléases de restriction: Endonucléases de restriction de type II Reconnaissance spécifique d’une séquence d’ADN double brin (« site de reconnaissance ») Rupture des liaisons phosphodiesters qui occupent des positions symétriques sur les brins opposés de l’ADN Première identifiée ECORI car purifiée à partir de Escherichia coli :  Site de reconnaissance = GAATTC/CTTAAG  Coupure symétrique et décalée 27 27 28 28  20-10-24 Des centaines d’autres endonucléases de type II isolées à partir de bactéries très diverses avec des sites de reconnaissance spécifiques Certaines enzymes de restriction produisent des coupures décalées et cohésives (« bouts collants ») et d‘autres des coupures à bouts francs 29 29 B. Ligase: Le clonage de l’ADN représente la principale application des coupures par les endonucléases de restriction Après digestion de 2 préparations d’ADN par une endonucléase qui produit des bouts décalés et mise en commun des préparations, de nouvelles combinaisons peuvent naître suite aux nouveaux appariements entre les bases complémentaires des extensions 30 30  20-10-24 Cependant les liens hydrogènes insuffisants pour assurer une cohésion stable  Utilisation de l’enzyme « ligase » extraite du bactériophage T4 pour établir des liens covalents 31 31 32  20-10-24 C. Vecteurs de clonage: Ces premières étapes du clonage sont sans intérêt sans pérennisation de la nouvelle combinaison (ADN recombiné) Donc, un des ADN partenaires d’une ligature doit apporter l’information génétique nécessaire au maintien par la cellule hôte de l’ADN recombiné dans son intégralité La mise au point des vecteurs de clonage à apporter la solution à ce problème 33 33 Le principe repose sur l’utilisation :  De plasmides = éléments bactériens extra- chromosomiques doués d’autoréplication  De virus de bactéries (bactériophages M13, , P1)  De combinaisons des 2 (cosmides)  De chromosomes artificiels dérivés de P1 (PAC)  De séquences d’ADN de levure comportant un site de commencement de la synthèse d’ADN et de séquences de type centromère et télomère (YAC) 34 34  20-10-24 Nombre de ces systèmes servent au clonage des fragments d’ADN de taille particulière Tandis que d’autres servent à la transcription, la mutagenèse in vitro, ou encore le séquençage d’inserts d’ADN 35 35 Propriétés communes aux vecteurs de clonage : 1. Capables de conservation et réplication par la cellule hôte 2. Porteurs de 1 ou plusieurs sites, chacun unique, reconnus par des « endonucléases de restriction » et offrant plusieurs choix de clonage 2 étapes lors de l’insertion dans un site spécifique du vecteur de clonage d’un fragment d’ADN du donneur : a) la digestion de l’ADN du donneur et du vecteur de clonage par la même endonucléase reconnaissant un site unique dans l’ADN du vecteur 36 36  20-10-24 b) puis l’association des deux échantillons par la ligase de bactériophage T4 2 sites de clonage, un de chaque côté de l’insert d’ADN, sont créés par l’insertion De ce fait, lorsqu’une construction d’ADN est traitée par l’endonucléase de restriction spécifique du site de clonage initial, l’insert d’ADN est extrait dans son intégralité, à condition de ne pas contenir lui-même la séquence du site de clonage 37 37 3. Présence de gènes (marqueurs de sélection) qui permettent d’identifier les cellules hôtes porteuses de la construction d’ADN parmi les cellules qui n’hébergent pas de construction ou qui portent un vecteur de clonage dépourvu d’insert 38 38  20-10-24 Un exemple particulier : le plasmide pUC19 Reproduit dans E. coli Souvent employé pour le clonage de fragments < 8kb ADN circulaire et double brin doté :  d’une origine de réplication opérationnelle chez E. coli  d’une région de régulation du gène de la - galactosidase (lacZ’) au niveau de l’opéron contrôlant l’utilisation du lactose chez E. coli 39 39 40 40  20-10-24 VECTEUR de CLONAGE pUC19 (plasmide Université de Califormine) ADN circulaire et double brin doté :  d’une origine de réplication opérationnelle chez E. coli  De l’opéron contrôlant l’utilisation du lactose chez E. coli  du gène « ampr » de résistance à l’antibiotique ampicilline  du gène « lacI » qui code un répresseur protéique de l’expression du gène lacZ’  d’une courte séquence appelée « site de clonage mutliple » (MCS polylinker) composée de 14 sites de clonage présents en un seul exemplaire et située au centre de la région LacZ 41 41 42 42  20-10-24 Possibilité de distinguer les cellules hôtes contenant une construction d’ADN de celles qui portent le vecteur intact grâce à la couleur des colonies cellulaires qui se développent sur une boîte d’agar Lorsque des cellules portant un pUC19 intact sont cultivées en présence d’isopropylthiogalactoside (IPTG, inducteur de l’opéron lactose), le produit du gène LacI ne peut se fixer à la région opératrice/promotrice du gène lacZ’ et le gène lacZ’ codé par le plasmide est transcrit et traduit 43 43 La protéine LacZ’ s’associe avec les sous-unités protéiques codées par l’ADN du chromosome et forme une - galactosidase active Dans le cas de pUC19, la séquence de clonage multiple est insérée dans le gène LACZ’ du plasmide et ne perturbe pas la production d’une protéine LacZ’ fonctionnelle Si le milieu de culture contient le substrat 5-bromo-4- chlorindolyl--galactoside (X-gal), l’hydrolyse de ce dernier par la -galactosidase active fait apparaître un produit bleu 44 44  20-10-24 Dans ces conditions, les colonies bleues sont celles qui contiennent un vecteur intact Pour insérer de l’ADN dans pUC19, l’ADN de l’organisme donneur est coupé par une endonucléase de restriction spécifique de l’un des sites de reconnaissance de la séquence de clonage multiple et il est mélangé avec l’ADN du plasmide pUC19, traité préalablement par la même endonucléase de restriction 45 45 Après ligature par la ligase, le mélange est introduit dans les cellules hôtes qui synthétisent la partie de la - galactosidase qui s’associe avec la protéine lacZ’ pour former l’enzyme fonctionnelle Les cellules hôtes après avoir été mises au contact de l’ADN sont étalées sur un milieu contenant de l’ampicilline, de l’IPTG et du X-gal :  Les cellules qui ne contiennent aucune forme de vecteurs, modifié ou intact, ne peuvent se multiplier en présence d’ampicilline 46 46  20-10-24  Les cellules portant un vecteur circularisé sans insertion d’ADN peuvent croître en présence d’ampicilline, mais elles forment des colonies de couleur bleue parce qu’elles synthétisent une -galactosidase fonctionnelle  Les cellules hôtes portant une construction vecteur- insert produisent des colonies blanches sur le même milieu de culture Pourquoi? Cette construction décale le cadre de lecture du gène lacZ’ lorsqu’elle est insérée dans le site d’une endonucléase de restriction au sein de la séquence de clonage multiple et bloque alors la synthèse d’une protéine lacZ’ fonctionnelle 47 47 Aucune -galactosidase active n’est donc produite et le X-gal présent dans le milieu ne peut être converti en un composé bleu. Les colonies restent par conséquent de couleur blanche Toutes les colonies blanches contiennent donc un morceau d’ADN inséré dans un pUC19 Chaque colonie est issue d’une seule cellule et chaque cellule a reçu en général un seul plasmide 48 48  20-10-24 L’introduction d’ADN (la transformation) dans une bactérie hôte est un processus peu efficace Il est donc nécessaire de disposer de marqueurs de sélection, comme les gènes ampr et lacZ’ pour distinguer les cellules qui portent les constructions vecteur-insert d’ADN des cellules non transformées et des cellules qui contiennent le plasmide d’origine circularisé lors de la réaction de ligature On abaisse la quantité de plasmide circularisé en traitant l’échantillon d’ADN du plasmide, qui a été coupé par l’endonucléase de restriction, avec la phosphatase alcaline 49 49 50 50  20-10-24 Cette enzyme enlève les groupements 5’-phosphate aux deux extrémités du plasmide linéaire, ce qui empêche la circularisation par la ligase du bactériophage T4 Les deux groupements phosphates apportés par l’ADN du donneur (qui est clivé) suffisent à ligaturer les molécules d’ADN du donneur et du plasmide L’étape de la phosphatase alcaline n’est pas totalement efficace 51 51 Il reste donc nécessaire de caractériser sans ambiguïté après la transformation les cellules portant un plasmide circulaire, ce qui correspond aux colonies de couleur bleue dans l’exemple du système pUc19 52 52  20-10-24 53 53 D. Criblage des construction d’ADN par les techniques d’hybridation : Après sélection des cellules hôtes hébergeant une construction d’ADN, il est nécessaire d’identifier la ou les colonies porteuses d’un insert spécifique  Méthodes d’hybridation : appariement de brins nucléotidiques (sonde) complémentaires de l’insert pour générer des duplex d’ADN 54 54  20-10-24 Etape 1 : dénaturation de l’ADN (ex., chaleur) pour produire des molécules d’ADN simple brin suite à la rupture des ponts hydrogène entre les bases Etape 2 : renaturation (reformation des ponts hydrogène) en refroidissant lentement la solution Etape 3 : L’ADN des préparations contenant peut-être l’ADN cible est dénaturé et les molécules simple brin sont maintenues isolées par fixation sur un support solide (membrane de nitrocellulose ou de nylon Etape 4 : La sonde d’ADN est marquée (radioactif ou autre), dénaturée, et mêlée à l’ADN supposé de la cible 55 55 Marqueur radioactif, fluorescent ou autre Etape 5 : La membrane est rincée pour éliminer la sonde, non fixée et testée pour la présence du marqueur  si la sonde ne s’hybride pas, alors aucun marquage ne sera révélé 56 56  20-10-24 Cas particulier de l’hybridation in situ : Possibilité d’assigner une séquence d’ADN humain cloné à une région précise d’un chromosome Méthode inestimable pour la cartographie génétique La sonde marquée (fluorescence) est un insert mis en présence de chromosomes dénaturés et on visualise ensuite la localisation du marquage 57 57 58 58  20-10-24 La réaction en chaîne de polymérase (PCR) : Technique très utilisée pour amplifier l’ADN et produire in vitro de grandes quantités d’une séquence d’ADN spécifique Elément essentiel = une paire d’amorces d’oligonucléotides de synthèse (± 20 nucléotides chacune) complémentaires de régions sur des brins opposés et qui encadrent la séquence choisie pour l’amplification Après hybridation avec l’échantillon d’ADN, les extrémités 3’-OH des amorces sont orientées l’une vers l’autre 59 59 La réaction en chaîne de polymérase (PCR) : Le second impératif d’une PCR est de disposer d’une ADN polymérase résistante à la chaleur (95°C) (exemple, ADN Taq polymérase extraite de la bactérie Thermus aquaticus) Une PCR classique compte un très grand nombre de cycles comprenant chacun 3 étapes : 1. Dénaturation de l’ADN (échantillon porté à 95°C) 2. Renaturation de l’ADN (abaissement lent de la température à 55°C permettant l’appariement des amorces aux séquences complémentaires de l’ADN testé) 60 60  20-10-24 La réaction en chaîne de polymérase (PCR) : 3. Synthèse de l’ADN (réchauffement à 75°C pour obtenir une activité optimale de la Taq polymérase ) En présence des 4 désoxyribonucléotides (en excès), la synthèse d’ADN débute du côté de l’extrémité 3’-OH de chaque amorce 61 61 62 62  20-10-24 63 63 64 64