Cours de Biotechnologies végétales 2023/2024 PDF

Ce cours est destiné aux etudiants L2 " Ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique Université Ziane Achour-Djelfa- Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Cours de Biotechnologies...

Ce cours est destiné aux etudiants L2 " Ministère de l'enseignement supérieur et de la recherche scientifique Université Ziane Achour-Djelfa- Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Cours de Biotechnologies végétales Ce cours est destiné aux étudiants L3 ʺ Biotechnologie végétale et amélioration ʺ présenté par : Benmouaffeki Fatima Pour l’année universitaire : 2023/2024  Objectifs des biotechnologies végétales Définition des Ensemble de techniques qui font appel à la culture in vitro biotechnologies et à la biologie moléculaire (BM) et qui ont pour but de s’affranchir végétales des limitations liées à la reproduction sexuée: il s’agit de. techniques de Laboratoire qui mettent en jeu la culture in vitro Ceci est lié à une propriété fondamentale qu’ont les cellules végétales: la totipotence cellulaire Concept énoncé par Haberlandt en 1902 Vérifié plus tard par la découverte des hormones végétales C’est la capacité de certaines cellules ou groupes de cellules prélevées sur un organe quelconque de plantes, de régénérer un individu complet et normalement constitué, au travers d’un processus de : -Dédifférenciation -Multiplication -Différenciation cellulaire Chez les végétaux , toutes les cellules sont totipotentes. Chez les mammifères, l'ovocyte fécondé et chaque cellule fille (blastomère) de l’embryon pendant les toutes premières 4 divisions cellulaires sont les seulesvraies cellules totipotentes  1-Objectifs des biotechnologies végétales (ou vertes) Créer des nouvelles variétés de plantes: Adaptées aux besoins de l’agriculteur: -mieux adaptées aux techniques culturales, aux conditions climatiques, plus résistantes aux maladies, une meilleure efficacité racinaire, meilleur rendement… Adaptées aux besoins du consommateur (homme, animal): -avec de fortes teneurs en protéines ou en métabolites spécialisés, homogènes d’un point de vue qualité, présentant une aptitude à l’alimentation humaine ou animale… Alicaments Adaptées aux utilisations non alimentaires: -produisant des molécules thérapeutiques, produisant des matières renouvelables pour la chimie, piégeant dans le sol des polluants comme les métaux lourds… Produire des métabolites Métabolites spécialisés d’origine végétale ou autre Intérêt en pharmacologie, cosmétique, agroalimentaire, biocontrôle.. On n’a pas attendu les biotech pour créer de nouvelles variétés de plantes! Avant on faisait de la sélection classique et encore avant de la sélection massale (jusqu’en 1863) 2  En resumant : La multiplication massive de plantes saines et/ ou et/ou hybrides avec éventuellement une production commerciale; la création de nouveaux génotypes par: Sélection de variants somaclonaux ou gamétoclonaux intéressants présentant des caractères de résistance aux stress biotiques ou abiotiques).  Utilisation des cellules végétales pour la production massive de molécules à forte valeur; métabolites secondaires: médicaments, biocarburants  Comment créer une nouvelle variété avec la sélection classique? 2 parents Augmenter la variabilité génétique A (Aa) x B (Bb) Mutagénèse Fusion de protoplastes Descendance AB variée hétérogène Transgenèse Sauvetage d’embryons Edition du génome Autofécondations successives Haplodiploïdisation Lignes homozygotes AA aa BB bb CC cc DD dd … Gagner du temps Croisements entre 2 lignées 100% d’hybrides homogènes Sélection classique Passage obligatoire: Ex: bb x ff la reproduction sexuée Tous les descendants sont bf Micropropagation Biotechnologies : Multiplication Sauvetage d’embryons reproduction sexuée pas obligatoire Commercialisation Marquage moléculaire 3 Du croisement initial à la commercialisation de la variété: 12 à 17 ans sont nécessaires  1- Culture in vitro 1.1. Définition La culture in vitro est un ensemble de techniques de multiplication végétative visant à régénérer une plante à partir des explants des parties d'organes ou des organes entiers mis en culture dans un milieu artificiel spécifique (hormones,sucres, vitamines, acides aminés, sels minéraux) qui peuvent être liquides, gélosés, voire même solides avec l'emploi de la vermiculite dans un environnement contrôlé (température, pH et éclairement), et dans des conditions de stérilité strictes. La culture in vitro permet donc d'utiliser toutes les potentialités régénératrices d'une plante, jusqu'à la totipotence cellulaire, cette dernière étant la capacité des cellules individuelles à diviser, pour produire toutes les cellules différenciées caractéristiques des organes, et de se régénérer en une plante entière et dans un espace réduit. Un explant: * organe (feuille, racine, morceau d’organe ou un bourgeon, u n tissu(méristème, épiderme….),cellule protoplaste, prélevée dans le but de créer une culture de tissus ou de régénérer une plante entière à partir de ces tissus.  1.2. Applications de la culture in vitro La culture in vitro des plantes peut être utilisée pour :  Reproduire à l'identique une plante et la multiplier en grande quantité  réduire le cout de production ou les mettre sur le marché dans les plus courts délais.  Préserver des espèces rares et/ou menacées et conserver la biodiversité Elaborer de nouvelles variétés de plantes plus rapidement. Obtenir des plantes saines. Donc Tout type d’organes peut être utilisé pour la culture in vitro cependant leur réactivité est variable et dépend de nombreux facteurs comme :  L’âge de la plante-mère;  La date de prélèvement de l’explant;  La localisation de l’explant sur la plante;  La taille et la nature de l’explant;  L’espèce végétale sur lequel il est prélevé. En général, une culture passe par 4 grandes stades ou étapes : -Stade 0 : Conditionnement des plantes mères - Stade 1 : Initiation ou la mise en place des cultures (la plus délicate et difficile) - Stade 2: Multiplication - Stade 3: Enracinement - Stade 4: Sevrage et acclimatation  Avantages et inconvénients de la culture in vitro Avantages: Inconvénients :  Production rapide et continue de  Installations modernes et spécifiques nouveau matériel végétal.  - Le coût du plant in vitro est plus élevé  Les conditions de culture contrôlées que celui d'une bouture obtenue et reproductibles (lumière, température classiquement, il demande une main- et humidité contrôlées). d'œuvre spécialisée  Permet l'étude de divers processus Personnel spécialisé physiologiques. Protocoles non standardisés  Permet d’obtenir un grand nombre  Nécessité d’une transition d’individus dans des espaces réduits. Hétérotrophie/ autotrophie Permet d'obtenir des individus L'instabilité génétique uniformes génétiquement. L‟apparition d‟anomalies génétiques Facilite du transport de matériel. (certains cas d‟hyperfloraison, perte de Possibilité d’automatisation. sexualité chez certaines espèces, apparition  Comme elle se fait dans les milieux d‟organes anormaux) : c‟est la variation stériles elle permet d'éviter les risques de somaclonale. contamination par des agents L'acclimatation : le passage à des conditions pathogènes. de culture normale est parfois délicat.  1902. Découverte de la totipotence des Historique: cellules végétales par Haberland. Un tissu végétal est capable de régénérer une plante Certaines cellules végétales ont la capacité de 1950. régénérer la plante Premières entière. Cette techniques de propriété, qui culture in vitro. s'exprime dans la Il s'agit de la multiplication technique de végétative naturell e, multiplication est connue et végétative, utilisée depuis développée par longtemps, avec le Morel et bouturage par Martin, sur la exemple. pomme de terre.  Petite histoire de la culture in vitro 1902, Haberlandt, chercheur allemand, énonce le concept de la totipotence cellulaire végétale. Il réussit à faire survivre in vitro, quelques mois, de petits amas cellulaires (poils staminaux ou glanduleux ou des fragments d’épiderme) mais sans multiplication.. 1932, White (U.S.A.), réussit une culture de racines de tomates. 1934, Gautheret, en France, cultive et multiplie des cellules cambiales de saule en introduisant des auxines dans le milieu. 1939, Gautheret réussit des cultures indéfinies de tissus de carotte. 1944, Buvat par les techniques de culture de tissus met en évidence le phénomène de dédifférenciation: la rejuvénation. 1949, Limasset et Cornuet notent l’absence de virus dans les méristèmes de tabacs virosés. 1952, Mettant à profit les travaux précédents, Morel et Martin à l’I.N.R.A. de Versailles, régénèrent des plantes entières saines de Dahlia, variété «le Rêve» indemne de virus à partir de culture de méristèmes de plants infectés par trois virus différents. De la même manière ils sauveront la variété de pomme de terre “la Belle de Fontenay” en 1954. 1954, Muir obtient les premières cultures de cellules isolées à partir de cals friables, cultivées en milieu liquide agité. 1957, Skoog et Muller régénèrent des racines et des tiges à partir de cals sous l’influence de l’auxine et de cytokinine. 1958, Stewart et Reinert obtiennent des embryons somatiques de carottes à partir de culture de racines et mettent ainsi en évidence le principe de totipotence cellulaire énoncé par Haberlandt en 1902. 1962, Murashige et Skoog mettent au point pour des cultures de tissus de tabac le fameux milieu de culture M.S. utilisé largement en culture in vitro. 1964, Guha et Maheshwari, en Inde, obtiennent des plantes haploïdes de Datura innoxia Mill. à partir de culture d’anthères. 1971, Au Japon, Takebe régénère des plantes entières de Nicotiana tabacum à partir de protoplastes. 1972, Carlson obtient le premier hybride somatique interspécifique par fusion de protoplastes entre différentes espèces de tabac.. 1976, San Noeumdans (l’équipe du Pr. Demarly à Orsay) réussit la première culture d’ovaires d’orge non fécondés. Cette même année, Seibert réussit à initier des pousses d’œillets à partir d’apex conservés à -196°C. C’est le début de la cryoconservation pouvant être utilisée pour la constitution de banques de gènes. 1983, Van Montaigu crée en Belgique les premières plantes transgéniques transformées par Agrobacterium tumefaciens. 7  4. Totipotence C’est l’aptitude de la cellule végétale à exprimer la totalité de ses potentialités pour donner un organisme entier. Une cellule est dite totipotente quand elle a la capacité de se différencier en n'importe quelle cellule spécialisée et de se structurer en formant u n organisme pluricellulaire. E n effet, les cellules végétales, prélevées sur u n organe quelconque d'une plante, possèdent la capacité de régénérer un individu complet identique à la plante mère. La totipotence débute par la formation de cals : amas de cellules indifférenciées qui permet de régénérer u n individu entier génétiquement identique à la plante mère. Pour cela, il faut que les explants soient placés dans des conditions appropriées. Schéma explicatif de la totipotence  2-Technique de multiplication des végétaux in vitro 2.1. Conditions de culture in vitro Dans les chambres de culture quelque soit la technique, la culture in vitro requiert des conditions de culture précises.  La lumière : Chez les plantes cultivées in vitro, la photosynthèse n'est pas une activité nécessaire Puisque l‘énergie est fournie par les glucides du milieu. Cependant, même une Photosynthèse réduite persiste dans les tissus. De plus la lumière est indispensable au déclenchement et au bon déroulement de certains processus morphogénétiques L’intensité lumineuse s’exprime en Lux est peut varier de 2000 (déclenchement d’organogenèse (rhizogenese, caulogénese), entretien de certains tissus) à 10 000 Lux (néoformation de bourgeons, plantules) selon la culture. La photopériode :  Est souvent de 12-16 heures /jour ;  joue un rôle très important dans la dormance, la tubérisation, l’induction florale, réversion vers l’état végétatif (L’organogenèse est indépendante de la photopériode) Hygrométrie: Elle doit atteindre les 100% d‘humidité relative dans les flacons. Stérilité : Comme les milieux sont riches et les conditions de cultures favorables pour un développement bactérien ou fongique (contamination ou infection) La technique de culture in vitro exige beaucoup de soin pour le maintien des cultures en condition d’asepsie. Lorsque l’on a des cultures infectées, cela peut provenir de différentes causes. Il peut s’agir d’un champignon (moisissure) ou d’une bactérie. S’il s’agit d’un champignon, on voit un développement mycélien qui a une texture feutrée, souvent blanche ou grisâtre. S’il s’agit d’une bactérie, on voit alors un voile d’aspect laiteux, développé à l’intérieur du milieu et à la surface. Si l’infection part de la zone de contact entre les tissus et le milieu, ce sont les tissus eux-mêmes qui sont la source de l’infection. Si l’infection part d’un point quelconque du milieu, la source de l’infection peut être soit l’air, soit une mauvaise stérilisation du milieu, soit une infection de l’air ambiant par l’intermédiaire de l’eau de condensation au niveau du couvercle Il faut donc manipuler dans des conditions d'asepsie rigoureuses : ‐ Matériels passés à l'alcool et flambés (pinces, Scalpels et bistouris) passés à l'alcool+eau distillée stérile (aiguilles ;lames de rasoir) la verrerie est mise dans une étuve (120 ºC ;45 minutes) ‐ Désinfection des plantes issues d’une culture hydroponique sur substrat inerte à la Javel (quelques instants)ou Hgcl2 (0.5‰ pendant 1-3 heures )ou puis rinçage a l'eau distillée avant l'extraction de l'explant.  Méthodologies générales N’importe quel fragment de plante= explant 1 Prélever un Plantes de serre ou du milieu naturel fragment de plante Aseptisation Utiliser des solutions désinfectantes Eau de javel = hypochlorite de Na: 2 à 12% Hypochlorite de Ca : 50 à 100g/L H2O2 : 10 à 30 % Ethanol 70% Chlorure mercurique 0,1% …… Concentration/Durée d’action Des prétraitemetns des plantes mères peuvent être envisagés (fongicide…) 6  2-Méthodologies générales La culture in vitro 3 Culture en conditions contrôlées 1 Prélever un O2 fragment de plante H20 éthylène CO2 aseptisation 2 L’introduire dans un récipient aseptique Milieu stérile Enceinte de culture Notion d’aseptie!!!! 8  Méthodologies générales 2 L’introduire dans un récipient aseptique Milieu stérile Récipients adaptés à la taille des explants et leur sa façon de se développer Autoclavables ou jetables Autoclavage Matériel 134°C pdt 35 min Milieux 121°C pdt 20 min ou 115°C pdt 25min 9  2.1.2.Milieu de culture. La composition du milieu de culture dépend du:  matériel végétal (espèce, variété, cultivar..Etc.),  type d’explant (taille),  l’objectif de la culture….. Très généralement il est composé de sucre (énergie), des éléments minéraux, des régulateurs de croissance, des vitamines, des composés organiques (acides aminés….) La concentration de ces composés peut varier d'une espèce à l'autre, mais ces variations n'ont qu'une incidence faible sur les réactions des cellules. Les facteurs essentiels sont Les régulateurs de croissance qui stimuleront la multiplication cellulaire et orienteront la morphogenèse  Support inerte (milieu semi‐solide) : permet de solidifier le milieu et réalise un complexe colloïdal à faible pouvoir de rétention des ions. On utilise comme support inerte l’Agar ou le gelose ( 6-10g/l pH: 5,6 – 5,8  2.1.2.Milieu de culture. Composés inorganiques (sels minéraux) o  Macro -éléments: sont absorbées sous formes d’ions  L’azote (N) : essentiel dans la synthèse des acides nucléiques, des protéines, des chlorophylles, des acides aminés et des hormones.  Le phosphore (P): essentiel à la photosynthèse, la respiration.  Le potassium (K) : nécessaire pour la division cellulaire, aide dans les voies de synthèse des glucides, des protéines et de la chlorophylle. Calcium (Ca): impliqué dans la formation des parois cellulaires, le développement des racines et des feuilles, la translocation des sucres, des acides aminés.  Magnésium (Mg): impliqué dans la photosynthèse et la respiration. Actif dans l'absorption du phosphate et la translocation de phosphate et de l'amidon. Soufre (S) : impliqué dans la formation des nodules et dans la synthèse de la chlorophylle, composant structurel d'acides aminés et d’enzymes.  Fer (Fe): impliqué dans la synthèse de la chlorophylle, respiration et la photosynthèse. sodium(Na) : impliqué dans la synthèse de la chlorophylle, l'osmose (le mouvement de l'eau dans les cellules végétales) ainsi qu'à l'équilibre ionique dans les cellules, aide à l'ouverture et à la fermeture des stomates ce qui contribue à réguler l'équilibre hydrique interne.  2.1.2.Milieu de culture. Chlore (Cl) : impliqué dans le processus de la photosynthèse. O  Micro-éléments : Appelés parfois oligo-éléments, et bien qu'ils ne soient nécessaires à la plante qu'en faibles concentrations, leur rôle est essentiel.  Cuivre (Cu): Impliqué dans photosynthèse et la respiration. Synthèse de la chlorophylle et utilisé comme catalyseur de réaction.  Manganèse (Mn): impliqué dans la régulation enzymes et des hormones croissance. intervient dans la photosynthèse et la respiration.  Molybdène (Mo) : impliqué dans la réduction enzymatique des nitrates en ammoniac. aide à la conversion de phosphate inorganique à la forme organique.  Zinc (Zn): impliqué dans la production d'hormones de croissance et de la chlorophylle.intervient dans la respiration et la synthèse des glucides.  Bore ( B) : impliqué dans la production d'hormones de croissance et de la chlorophylle,dans la respiration et la synthèse des glucides.  Méthodologies générales Eléments minéraux Les macroéléments minéraux: N, P, K, Ca,Mg, S Fournis sous forme de sels N: nitrate NO3- et ammonium NH4+ NH4NO3 Dans le nombreuses molécules ADN,hormones, alcaloïdes… P: phosphate PO3- Dans l’ATP K: sous forme d’ions libres et mobiles K+ dans la plante Rôle osmotique Ca: dans les parois et les membranes Perméabilité membranaire Mg: sous forme de MgCl2 Activateur enzymatique S: sous forme d’ions sulfate SO4-- Dans les protéines Les microéléments minéraux: Zn, B, Mn, Cu, Co, Fournis sous forme de sels Ni, AL, Mo, Rôles variés CuSO4 par ex Le Fer: non assimilé par les plantes sous forme de sel Transfert d’électrons fourni sous forme chélatée (par un agent chélateur : l’EDTA) 11 Milieux de Murashige et Skoog (1962) : milieu MS de Gamborg (19): milieu B5  Méthodologies générales 3 Culture en Le transfert de l’explant végétal conditions contrôlées dans le récipient aseptique qui renferme le milieu de culture stérile se fait sous hotte à flux laminaire O2 H20 éthylène CO2 Enceinte de culture Lumière: Photopériode Qualité de la lumière (bleu caulogenèse, rouge rhizogenèse) Energie Température Thermopériode Echanges gazeux Dépendent de la taille récipient et du mode de capuchonnage 13 Composés organiques  Sucres : Dans le cas de tissus végétaux placés en culture in vitro, l'assimilation chlorophyllienne est nulle ou insuffisante pour assurer la survie et le développement de l'explant. Dès lors, on ajoute des sucres, aux milieux de culture pour fournir à l'explant une source de carbone, optimaliser la croissance des tissus et pour orienter l’organogenèse (rhizogenese, caulogènese),fournir de l'énergie nécessaire pour la croissance des tissus et maintiennent une pression osmotique donnée du milieu de culture(Saccharose, glucose, myoinositol, manitol, sorbitol Vitamines: Les vitamines sont des substances organiques reconnues pour stimuler la croissance. Elles sont particulièrement utiles en micropropagation lorsqu’un fragment seulement de la plante est utilisé pour générer la culture de plantes entières. On comprendra que dans ces circonstances, la synthèse endogène (par le tissu végétal lui- même) de vitamines risque d’être insuffisante et que le milieu devra y suppléer en conséquence. Les vitamines les plus fréquemment utilisées sont la thiamine, la pyridoxine, la biotine, le pantothénate de calcium (0.1-1 mg/l)  Antioxydants :acide ascorbique(1-10mg/l)+acide citrique (50-100 mg/l) pour éviter le brunissement de certains tissus. Acides aminés : Tyrosine,phenylalanine,methionine,cysteine,glutamine,glycine,asparagine ,proline, favorisent l’organogenèse et la prolifération des cellules  Charbon activée :(0.5-5 g/l) : dans les cultures de l’apex pour arrête l’inhibition de la croissance des tissus et le brunissement du milieu par les composés phénoliques et les tanins secrétés par l’explant initial en adsorbant ces derniers. Obscurément du milieu ce qui favorise la croissance des racines ou rhizoïdes.  Régulateurs de croissance : Ces substances sont utilisées à des doses très faibles. Les trois principaux groupes de régulateurs de croissance d’usage fréquent sont les auxines, les cytokinines et les gibbérellines. Le choix du ou des régulateurs utilisés ainsi que leur quantité est généralement guidé par la littérature. Elles commandent le programme de croissance des cellules végétales; Leurs effets varient avec les concentrations utilisées et le dosage, à doses élevés, ils peuvent se montrer inhibiteurs ou toxiques. Les cellules des plantes ont la capacité de régénérer un organisme complet >>> l'apport d'hormones en quantités appropriées dans un milieu où croissent des cellules déclenche la formation d'organe. Ainsi, selon la proportion d'auxine et de cytokinine, les cellules donnent naissance à des tiges, à des racines ou à des tissus indifférenciés  Méthodologies générales Milieux de culture -Eau Rapport Auxine/Cytokinine -éléments minéraux (macro, micro et Fer-Edta) -vitamines R1 Ex: Agar, Stérilisation des milieux : -par autoclavage (121°C pdt 20min ou 115°C pdt 25min) -par filtration (0,2m) pour les éléments thermolabiles 10  A. L’auxine un groupe d'hormones végétales essentielles à la croissance et au développement des plantes. Les auxines sont impliquées dans de nombreux processus physiologiques des plantes, tels que la croissance des tissus, la formation des racines, la régénération des tissus, et même la réponse des plantes aux stimuli extérieurs tels que la lumière et la gravité. L’auxine est fabriquée dans l’apex des tiges, dans les méristèmes et les jeunes feuilles des bourgeons terminaux à partir d’un acide aminé, le tryptophane. Une fois fabriquée, l’hormone migre vers ses cellules cibles. Ce transport s’effectue des apex vers la base, on dit que le transport de l’auxine est polarisé. Apex : les cellules synthétisent l’auxine (à Transport l’aide de précurseurs de l’auxine comme le tryptophane) Effet biologique : croissance  Rôles de l’auxines Les Auxines possèdent de nombreuses propriétés: Stimule la multiplication cellulaire et l’élongation des cellules( en activant la multiplication cellulaire (mitose); Agit positivement sur l’accroissement en épaisseur de la tige, la croissance des fruits;  Favorise la rhizogenèse des racines (Amènent la formation de racines) ; Cordonne les phénomènes de différenciation et de croissance de diverses parties de l’arbre les principaux auxines Acide phénylacétique,L’acide β Indolyacétique (AIA), L’acide β Indolypropionique (AIP), L’acide β Indolybutyrique (AIB),Acide naphtylacétique (ANA), Acide β naphtoxyacétique ( NOA),Acide 2,4 Dichlrophenoxyacétique ( 2,4 –D)  B/Les cytokinines  C ’est une famille d ’hormones  Les cytokinines sont des découverte par Skoog , quand il hormones synthétisées remarqua des résultats aberrants ou par la racine. non cohérents dans l ’étude des  Lorsque l’on injecte de la auxines. Il appela cette nouvelle cytokinine à la base formed ’hormones les kinétines, puis d ’une tige, on remarque cytokinines. que cette dernière migre vers le bourgeon où elle se concentre. Elle favorise le débourrage des bourgeons axillaires.  La cytokinine contrôle le développement des feuilles.  Rôles de la cytokinine Stimule la division cellulaire. Mobilisent les métabolites et maintiennent une certaine activité des cellules. Retarde le vieillissement des feuilles. Joue un rôle dans la levée de la dormance et la croissance des bourgeons au printemps. Agissent en synergie avec les auxines avec un effet stimulant sur le métabolisme et sur la division cellulaire. (Si de fortes concentrations de cytokinines sont combinées à des concentrations plus faibles d'auxines, les cytokinines ; -Agissent en synergie avec les auxines ; - Activent la multiplication cellulaire (mitose) avec la formation d'un cal. Principaux cytokinines : La kinétine ( 6 furfuryl aminopurine) , La benzyladénine (6 benzylaminopurine) (BAP) ,la 2 isopentényladénine (2 i P),la zéatine - Rapport Auxine/Cytokinine +Hormones: R1 10  Les Gibbérellines : Provoque l’allongement des entre nœuds et contribue donc à la croissance en longueur des rameaux. Gibbérelline A  La micro propagation in vitro ou le clonage végétal.1. Définition et technique :La micropropagation appelée également microbouturage, est une technique est très utilisée à travers le monde pour multiplier des plantes dont la reproduction est difficile, comme les orchidées. Elle permet la création d'un grand nombre de clones, parfaitement sains. L'explant utilisé est par exemple un fragment de tige. Les plantes se reproduisent par la voie sexuée via les graines, mais elles utilisent pour certaines aussi une autre voie, celle de la multiplication végétative. La particularité de cette reproduction est que les plantes filles qui en sont issues sont identiques génétiquement à la plante mère: c'est le clonage végétal ou multiplication conforme qui est exploitée depuis des siècles par les horticulteurs et jardiniers : bouturage, marcottage, greffage etc. La micro propagation in vitro dérive de ce phénomène naturel. On cultive des explants végétaux stérilement, sur un milieu artificiel et dans un environnement contrôlé. Suite aux subcultures successives on obtient alors des plantes identiques à la plante de départ et que l'on peut multiplier à l'infini. On exploite ainsi la propriété de totipotence des cellules végétales.  Fig: le microbouturage du rosier à partir d’un seul fragment de rosier L’objectif de la technique de La micro propagation in vitro est de produire en grande quantité des cultivars d'intérêt horticole, sylvicole, ou agronomique qui viennent d'être créés ou découverts ou qui ont toujours un intérêt. Il peut s'agir également de plantes difficiles à reproduire naturellement. Avantages de La micro propagation in vitro : -les plantes obtenues sont génétiquement identiques à la plante ou variété de départ. - La puissance de multiplication du clonage in vitro permet une production d'un grand nombre de plantes génétiquement homogènes en un laps de temps court. En 1 an, on peut produire en théorie plus de 4 millions de plants d'œillets à partir d'un seul apex, ou encore 50 000 plants de framboisiers alors que traditionnellement on en obtient 50. - Les plantes obtenues sont de qualité car en très bon état sanitaire, avec un enracinement régulier, des ramifications nombreuses, donc une vigueur accrue. Le volume de plantes nécessaire à la mise sur le marché des nouvelles variétés est plus rapidement atteint. -La production de plantes in vitro permet de s'affranchir des saisons. - Les cultures peuvent être ainsi programmées afin d'utiliser rationnellement les surfaces de serres. -La réduction du nombre de pieds mères nécessaire à la production de boutures permet un gain de place dans les serres d'où une économie d'énergie. --Pour les espèces fruitières ou ornementales, en multipliant in vitro, il est possible de s'affranchir des portes-greffes. Ainsi les arbres ou arbustes obtenus ne présenteront pas de problème de rejet de "sauvageon".. Avantages: -Le microbouturage permet de multiplier des espèces difficiles à reproduire naturellement telles les orchidées d'où une diminution du coût de production. En faisant germer les graines d'orchidées in vitro , la présence des champignons symbiotiques est inutile. La culture in vitro permet de multiplier des plantes stériles Il est possible de conserver des variétés anciennes à l'abri des parasites et pathogènes, dans un espace réduit dû à la miniaturisation des vitroplants: plus de 1 000 plants/m2. - On peut reboiser très rapidement des plantations qui pourraient être ravagées par des parasites ou des catastrophes naturelles. -Les vitroplants sont très facilement transportables d'un pays à l'autre sans risques sanitaires. Fig: Exemple d’une culture in vitro par de microbouture  Inconvénients de La micro propagation in vitro Le coût du plant in vitro est plus élevé que celui d'une bouture obtenue classiquement, il demande une main-d'œuvre spécialisée qui représente environ 60% à 70 % du prix de revient car l'automatisation est limitée.  3- Les technologies de clonage a- La micropropagation Permet de multiplier les plantes rapidement en grande quantité = clonage Nécessite 4 étapes: 1- Phase initiale (prélèvement de l’explant et mise en CIV) 2- Phase de multiplication (obtention de nombreux bourgeons) Milieu avec A/C < 1 3 Phase de développement (enracinement des bourgeons) Transfert sur milieu avec A/C > 1 4 Phase d’acclimatation (sortie des plantes d’in vitro) 2 stratégies différentes: Explants avec ou explants sans méristèmes Dépend de l’espèce végétale 14  1-Callogenèse: Le cal est un amas cellulaire (n’a pas de forme précise) dont la croissance se fait de manière anarchique. Il y a plusieurs catégories de cals qui se distinguent par : couleur,aspect : lisse ou noduleux ou consistance : compact ou friable ( Le cal est le tissu de néoformation produit par l’explant initial ou après des repiquages successifs. Pour la production de cals, on utilise généralement des explants dépourvus de méristèmes comme : morceaux de racines, feuilles, hypocotyles ou entrenœuds. Ou à partir de cals ou de protoplastes. Dans un milieu renforcé par des régulateur de croissance, les embryons zygotiques et les méristèmes sont souvent utilisés pour la production de cals embryogènes. Les spécialistes arrivent à distinguer d’après l’aspect du cal sa capacité à régénérer des plantules par : 2/Organogenèse : ce sont des cals qui sont capables, dans des conditions de milieu favorables, de former des bourgeons. Ces derniers peuvent alors être excisés pour former des plantes entières. Ce sont des cals organogènes. Embryogenèse somatique : ce sont des cals capables de former des embryons somatiques les caractéristiques de l’explant initial qui influencera les capacités de callogenèse sont : L’espèce est le génotype de la plante mère; La nature de l’organe dont il est issu. L'âge est la position de l’organe sur la plante  La taille de l’explant. mère; 3-Caulogenèse Désigne à la fois l'initiation et le développement des bourgeons terminaux, axillaires, adventifs. Les tiges néoformées in vitro peuvent apparaitre sur l’explant initial ou sur un cal. Ils sont induits sur n’importe quel type d’organe ou de tissu y compris sur ceux qui ne les produisent pas dans les conditions naturelles ( Camefort,1977 ; Zryd, 1988 ; Margara, 1989). -Le développement de tige in culture in vitro exige un équilibre hormonale: Auxine/BAP (cytokinine)