Cours-2 PDF - Mutations de l'ADN

**[Quelques rappels, les mutations :]** - Les macromolécules - ADN (acide désoxyribonucléique) : formés d'une chaîne nucléique (A, T, C et G) forme de stockage de l'information génétique cette information est représentée par une suite linéaire de gène. Formées de deux brins enroulé...

**[Quelques rappels, les mutations :]** - Les macromolécules - ADN (acide désoxyribonucléique) : formés d'une chaîne nucléique (A, T, C et G) forme de stockage de l'information génétique cette information est représentée par une suite linéaire de gène. Formées de deux brins enroulés en double hélices. Elles sont complémentaires. - Protéines : chaîne polypeptides. Assure les principales fonctions cellulaires. Différents repliements permettent de donner des fonctions spécifiques aux protéines. - ARN (acide ribonucléique) : forme qui permet de transférer l'information dans la cellule. Le plus souvent en simple brin. Il peut être sous différentes formes - ARN m, ARN t,... - Structure ADN - Un nucléotide de l'ADN comprend trois éléments - Une base azotée - Un désoxyribose - Un groupement phosphate - De l'ADN aux protéines **ADN 🡪 ARN 🡪 Prot** - Simple en théorie mais c'est un processus très hautement régulé (plusieurs points de contrôle à différent endroit (vérification du repliement de sa fonctionnalité pour bon fonctionnement) - Plusieurs ARNm mature et donc plusieurs prot peuvent être produites à partir d'une même séquence d'ADN 🡪 épissage alternatif - Epissage alternatif (schéma) - A partir d'un même ARN pré-messager : - Diffèrent ARN m mature, selon les séquences conservés ou supprimés dans l'ARNm mature 🡪 épissage alternatif causé par le splisosome (peut choisir d'éliminer tous les introns ou pas, peut choisir tel ou tel exons (peut choisir le 1,2 4 et le 7)) - Le splisosome peut donner en fonction de ce qu'il décide de garder ou pas une configuration différente - Elle se déroule dans le noyau - Production de différentes protéines - De l'ADN à l'ARN messager, la transcription - Utilisation de l'ARN polymérase - De l'ARN à la protéine, la traduction - ARNm lu par codon ou triplet : succession de 3 nucléotides - 61 codons 🡪 codent des AA - AUG : méthionine : codon start signal de début de synthèse - Codon stop signal de fin de synthèse protéique - Code génétique - Cadre de lecture - La lecture de la séquence d'ARNm se fait par groupes de 3 nucléotides : les triplets ou les codons. Il existe donc 3 façons : - +1 : lecture de triplets débutant au premier nucléotide - +2 : lecture de triplets débutant aux deuxièmes nucléotides - +3 : lecture de triplets débutant au troisième nucléotides - Le cadre de lecture consiste en une lecture de nucléotides 3 pat 3 (codon par codon). Le cadre de lecture de lite une séquence nucléotidique. - Une séquence de 3 nucleotides (codon d'initiation : AUG) indique le point de départ de la traduction - Un codon stop (une autre séquence de 3 nucléotides) signifie l'arrêt de la traduction - Quel que soit la molécule d'acide nucléique (ADN ou ARN) on peut distinguer toujours trois codons de lecture potentiellement codant pour des séquences en AA différent. - Code génétique - Règle de correspondance permettant au message génétique constituée de nucléotides d'être traduit en une chaine polypeptidique formée d'AA - Mots de 3 bases = triplets - Avec 3 bases et 4 possibilités pour chacune des baes 🡪 64 combinaison possible - 61 des 64 triplets codent pour des AA - 3 triplets codent pour codon stop - AUG code pour la méthionine = point de départ de la lecture de l'ARN messager - Redondant : un même AA peut être code par plusieurs triplets - Non ambigu : à chaque séquence de 3 bases consécutives portes par l'ARNm, correspond un AA donnée et un seul - Presque universel : le même chez quasiment tous les EV quelques exceptions : chez les ciliés (protozoaire unicellulaire), UAA et UAG ne sont pas de codons stop et codent pour la glutamine - Repliement des protéines - 4 structures : - Structure primaire ou séquence : chaine polypeptidique ou enchainement des AA - Structure secondaire hélice alpha feuillet béta coudes régions non structurées - Structure super secondaire - Combinaison de structures secondaires formant des domaines - Structures tertiaires : repliement des protéines dans l'unique structure native donc fonctionnelle - Structure quaternaire assemblage de plusieurs sous-unités identiques ou non (chaines polypeptidiques repliées) 1. **[Mutations de l'ADN :]** - Modification du matériel génétique (dans la séquence même, nature des nucleotides) - Biodiversité 🡪 balance introduire une variable génétique = base de l'évolution biologique - Acquisition de nouveau caractère et s'adapte à de nouvelles condition environnementales (climat, parasites, maladies,...) - Mutation naturelle aléatoire (pas de gène spécifique ciblées) - Peuvent entraîner des conséquences délétères. - Conséquences variables (positive ou négative) en fonction de la localisation - Réparation des erreurs dans la molécule d'ADN sont permanentes mais pas infaillibles 🡪 conséquences variables - Toutes les régions du génome ne mutent pas à la même vitesse (applicable chez toutes les espèces) - **Point chaud de mutation = hot spot =** site d'une molécule d'ADN où la fréquence de mutation est beaucoup plus élevée que celle des autres sites 2. **[Causes des mutations :]** - Deux sources importantes des erreurs de l'ADN 1. **Spontanées :** erreurs de réplication de la molécule d'ADN (mutation ponctuelles) - 3 types de mutations - Le changement d'1 ou + nucleotides par un autre = **substitutions** - Résultats différents après la traduction - Une substitution dans un codon par le même acide aminé : **synonyme ou silencieuse** (on peut faire un séquençage pour déterminer les mutations comme celle-ci) - Une substitution dans un codon peut se traduire par un AA différent : **faux-sens**. Elle sera d'autant plus délétère pour les fonctions de la protéine que le nouvel AA sera différent de celui qui aurait dû être traduit - Une substitution dans un codon peut se traduire par un codon stop : **non-sens**. La protéine traduite sera tronquée à cet endroit. - La perte d'1 ou + nucléotides = **délétion et insertions** - Importance variable selon leur longueur : - D'un nb de nucleotides non multiple de 3 : **décalent le cadre de la lecture** - Exemple d'insertion et de délétion entrainant une mutation de substitution - D'un nombre de nucleotides multiple de 3 : **aboutissent à la délétion ou l'ajout d'un AA dans la protéine** - L'insertion d'1 ou + nucléotides = **addition** - Erreur de réplication -- chgt plus profond - Larges insertions ou délétion de nucleotides : suppression d'exons... - Réarrangement au sein des chromosomes : duplication, inversion, insertion,... - Réarrangement entre les chromosomes : fusion entre 2 chromosomes 2. **Induites :** lésions chimiques ou physiques de la molécule d'ADN (pendant ou en dehors de la réplication) dues à la présence des agents mutagènes (radioactivités, rayon UV, les radiations solaires, les agents chimiques, les virus, les rayons X,...) - **Agents mutagènes :** agent de l'environnement qui augmentent la fréquence des mutations. Ils fragilisent la molécule d'ADN - Lésions dues aux radiations d'UV (plus de lecture possible après mais réparation possibles) - Fusion de deux thymines l'une à côté de l'autre sur un brin d'ADN = **dimère de thymine** - Fusion d'une thymine et d'une cytosine l'une à côté de l'autre sur le brin d'ADN = **dimère de thymine-cytosine** - Formation du dimère 🡪 incapacité de ces nucleotides de se lier avec leur base complémentaire situé sur le brin complémentaire - Arrêt de l'ADN polymérase lors de la réplication de l'ADN - Maladie génétique : Xeroderma pigmentosum - Sensibilité a la lumière solaire, lésions de peau et cancer cutané - Mutation des gènes permettant la synthèse des protéines qui vont éliminer les dimères provoqués par les UV 3. **[La nomenclature des mutations :]** - A chaque nucleotides correspond une position en gDNA, cDNA, protéine (p) - Brin complémentaire obtenu par reverse transcriptase de l'ADN - Les substitutions sont notées avec « \> » : c.1579G\>T - Les délétions sont notées « del » après le nucleotides ou le dernier délétés : - Simples c.1576del - Multiples : c.1576\_1588del - Les insertions sont notées « ins » après les nucléotides flanquant (de part et d'autre) - Simples : c.1578\_1579insA - Multiples : c.1578\_1579insCTA 4. **[Réparations des erreurs : ]** - Synthèse de la molécule d'ADN lors de la réplication fortement ralenti ou complètement arrêté si 2 nucleotides l'un en face de l'autre ne sont pas complémentaire - Correction des erreurs lors de la réplication effectue par des protéines nommées nucléases - Associées au complexe enzymatique de l'ADN polymérase - Plusieurs modes d'action en fonction des erreurs à réparer a. ***Réparation par excision :*** - Dommages nucléotidiques simple brin - Système de réparation coupe : - Soit **de part et d'autre du nucleotides altéré** et se sert du brin matrice pour corriger l'erreur en remplaçant le nucleotides altéré par le bon (*base excision repair*) - Soit une **petite séquence de nucleotides contenant le nucleotide altéré** et remplace l'ensemble des nucléotides par une séquence nucléotidiques complémentaire du brin matrice (cas des dimères de thymine) (*nucleotide excision repair*) b. ***Réparation par jonction d'extrémités non homologue*** - **Cassure** de l'ADN ou les **deux brins** altérés - Ne restaure pas la séquence initiale de l'ADN (absence de récupération de l'information perdu) - Restaure la continuité physique de l'ADN endommagé - Changement de l'information génétique, par délétion 🡪 apparition d'une mutation - Réparation privilégiée même si perte d'information c. ***Réparation par recombinaison homologue*** - **Cassure** de l'ADN ou les **deux brins** altérés - Le système récupéré l'information endommagée à partir de la copie non altérée sur le chromosome homologue - Couteux en terme énergétique pour la cellule, moins utilisée (que si information est très importante) 5. **[Limites de la réparation :]** - Lorsque les systèmes de réparation ne permettent pas la correction de l'erreur : - Mise en place de 2 nucléotides, l'un en face de l'autre - Pendant la réplication suivante, le nucléotide incorporé par erreur et fait désormais partie du brin matrice et dirigera l'incorporation de son nucleotides complémentaire - Chgt définitif de la séquence de l'ADN : **mutation** maintenue 6. **[Transmission des mutations :]** - Si la mutation n'engendre pas de modification qui empêchent la survie de la cellule 🡪 sera transmise su=i la cellule se divise - Conséquences d'une mutation différente selon le type de cellules qu'elle affecte - **Mutations somatiques** - **Cellules somatiques :** cellule qui constitue l'ensemble du corps, par contraste aux cellules germinales - Mutations somatiques n'ont pas de conséquences sur l'organisme porteur de la mutation. Elle n'est pas transmise à sa descendance. - Les cellules peuvent soit mourir après cette mutation soit se clonés et peuvent provoquer un cancer (phénomène de cancérisation) - Exemple : cancer de la peau développe chez les personnes après des dizaines d'années de forte exposition au soleil - **Mutations germinales** - Mutation qui touche les cellules susceptibles de former les gamètes (spermatozoïdes et ovocytes) - Mutations germinales peuvent se retrouver portées par une cellule œuf qui serait à l'origine d'un nouvel individu - Mutation pourra être transmission de génération en génération 7. **[Mutation et naturelles :]** - Mutation naturelles spontanées, généralement rares et aléatoire : principales sources de diversité génétiques - Moteurs de l'évolution - Des mutations qui confèrent un avantage sélectif aux individus qui en sont porteurs ont une probabilité plus grande de devenir majoritaire dans la population : on parle de sélection naturelle - Les individus porteurs d'allèles qui, dans des conditions de milieu données, leur donnent une proba plus grande de parvenir à la maturité sexuelle et donc de se reproduire ont plus de descendants - La proportion des allèles dont ils sont porteurs augmente dans la population. - Arbre de la vie du à la biodiversité actuelle et des mutations actuelles (archées, bactérie et eucaryote) II. **[La PCR et ses dérivés, l'électrophorèse]** : - **Techniques d'analyse -- vue générale :** - Mis en culture des cellules - Études morphologiques - Etude des organites après une lyse - **Etudes des macromolécules** 1. **[PCR « classique » en point final]** - Polymerase Chain Reaction (PCR) - Technique d'amplification enzymatique (1986) - Recourt à une enzyme particulière - Permet à partir d'un fragment d'ADN ou ARN d'obtenir plusieurs copies de ce fragment - In vitro (dans des tubes, dans des machines) - Cycles de PCR en 3 étapes - n cycle de PCR 🡪 produisent 2\^(n) copies de la séquence ciblée - Etapes d'un cycle de PCR - 1 cycle de PCR = 3 étapes (répétés n fois) : - Dénaturation : les deux brins d\'ADN séparés par chauffage - Hybridation : deux amorces constituées de courts fragments d\'ADN complémentaires à la séquence d'intérêt (celle que l'on veut étudier) s\'hybrident sur les brins préalablement séparés d'ADN par le chauffage - Élongation (ou polymérisation) : la Taq polymérase complète la synthèse du brin d\'ADN à partir des amorces fixer à l'étape 2 lors de l'hybridation - Les primer sont les amorces - Lors de l'hybridation obtention de deux brins simples - Schéma - Réactifs de la PCR - Mix de PCR qui contient comme réactifs nécessaire - Taq polymérase - ADN polymérase thermostable (résiste à des fortes chaleurs, fortes température (presque 100°C)) - Isolée dans *Thermus aquaticus*, une bactérie thermophile (elle est maintenant synthétisée en laboratoire) - Activité exonucléasique = correction d'erreur lors de la copie de l'ADN (capable de revenir en arrière) - Désoxyribonucléotides (dNTP) - Mélange des 4 nucléotides en excès (A, T, C et G) - Nécessaire pour la Taq polymérase lors de sa synthèse - Amorces - Courtes séquences d'ADN complémentaire au début de la séquence matrice que l'on veut étudier - Point de départ à la synthèse du brin complémentaire par la Taq polymérase - Une amorce « sens » (foward) et une amorce « antisens » (reverse) qui se fixe sur les deux brins - Définit la séquence de l'amplicon (taille du produit du PCR que l'on va obtenir) - Tampon de PCR : Mg2+ (permet le bon fonctionnement de l'enzyme) - Maintenir e pH du milieu réactionnel stable au niveau optimal pour la Taq - Mg2+ cofacteurs pour la réaction de polymérisation - Mg2+ neutralisent les charges négatives des groupements phosphates de l'ADN et stabiliser les hybrides ADN/amorces - Eau stérile (permet d'ajuster les volumes) : stérile permet d'éviter les contaminations, absence de dilution - Bien mélanger les réactifs - \+ fragment d'ADN à amplifier (une fois que le mix est fait dans des nouveaux tubes) - Permet de limiter en mixant les réactifs les erreurs de pipetage et les pertes de réactifs (on peut travailler avec des petits volumes) - Température d'hybridation des amorces de PCR - Température d'hybridation Ta (annealing temp.) des amorces avec la matrice conditionne l'existence et la spécificité de l'amplification de l'ADN - Si Ta trop élevé : les amorces ne s'hybrideront pas avec la matrice 🡪 pas de synthèse de l'ADN - Si Ta est trop basse : les amorces risquent de s'hybrider de manière non spécifique avec d'autre région d'ADN de séquence proche de la matrice 🡪 amplification de fragment d'ADN non spécifique - Permet de déterminer la spécificité et la qualité de notre produit - Calcul de la Ta doit se faire lorsque l'on prépare la PCR - Température de fusion des amorces de PCR - Ta calculée pour chaque nouvelle PCR - Ta dépend de la séquence en bases des amorces - Ta \< Tm = température de demi-dénaturation ou fusion (melting temp.) - Si les 2 amorces ont des Tm différente, on va prendre la Tm la plus faible pour calculer la Ta (favoriser l'hybridation des 2 amorces) - Calculs des Ta et des Tm des amorces de PCR - Tm = 2 (A + T) + 4 (G +C) (en °C) - Ta = Tm -- 5 - Où A, T, C et G sont les nombres de chacune de ces bases dans l'amorce - Critères de design des amorces de PCR : - Taille des amorces : 16-26 nucléotides - Si plus petit 🡪 amplifications non spécifiques - Si plus grand 🡪 amorces risque de ne pas bien s'hybrider - GC% : 40 à 60 % - Limiter la formation de dimère d'amorces (amorces sens sur amorces antisens) par complémentarité de séquence  - Hair spin : épingle à nourrisse - Cross dimer : forme des boucles - Extrémité 3' pauvre en GC limite les amplifications non spécifiques - Spécificité peut être vérifier au point de vue des amorces avant la PCR - Schéma de la PCR - 1 étape : dénaturation (éloignement des deux brins) - 2 étapes : hybridation : les amorces de PCR se fixe toujours à l'extrémité 3' de la séquence que je veux amplifier. Reconnaissance par complémentarité de séquence. Toujours deux amorces que l'on utilise en même temps (sens et antisens) - 3° étapes : extension ou élongation à partir d'une copie du gène pour obtenir deux copies du gène dans le sens 5' 🡪 3'. La polymérase reconnait l'extrémité 3' libre - Second schéma de la PCR - Les variations de températures lors d'une PCR - Au début entre 20 et 30 °C - Premier changement lors de la dénaturation pout monter à 90-100°C - Deuxième changement diminution pour mettre les amorces (hybridation) vers 50°C - Troisième changement augmentation pour l'élongation - Les changements de températures sont répétés n fois - Thermocycleur automatiser les changements pour les effectuer n fois - 1^ère^ étape : dénaturation de l\'ADN à 95° Celsius (séparation des brins complémentaires) - 2^ème^ étape : hybridation des amorces (séquence de nucléotides complémentaires de l\'extrémité de la région à amplifier) à une température Tm (spécifiques de l\'amorce) - En général amorce de 15-25 nucléotides - 3^ème^ étape : élongation (synthèse du brin complémentaire à partir des amorces grâce allons-y ADN polymérase et au nucléotide milieu réactionnel). Fonctionnement de l\'enzyme à 72 °C. - Fin du premier cycle de PCR : un nouveau cycle de PCR (dénaturation-hybridation-élongation) commence. - Schéma cours (diapo) - Le thermocycleur permet d'automatiser la réaction PCR en programmant des cycles consécutifs de montée et de baisse de température - Tout petits tubes utilisés pour le thermocycleur - Présence d'un bloc chauffant et d'un clavier pour la programmation des cycles - Précaution : - Eviter la dégradation de l'ADN (le conserver dans la glace, utilisées des gants) - Eviter les contaminations - Par un ADN étranger - Aliquotage (mix de PCR pour éviter de mélange cône et pipette) des réactifs - Organisation du laboratoire en 2 ou 3 salles - Zone propre : préparation du mix de PCR - Zone pré-amplification : extraction de l'ADN, stockage échantillon - Zone post-amplification : utilisation du thermocycleur et détection - Organisation du travail : marche avant - Eviter les inhibiteurs - Purification de l'ADN (impact sur la pureté) - Dilution de l'échantillon - Ajout de BSA (sérum albumine bovine) - [[https://www.youtube.com/watch?v=MyLrs\_h1OlE]](https://www.youtube.com/watch?v=MyLrs_h1OlE) - Cinétique de la PCR - Une PCR peut être divisé en trois phases (dépendant de la quantité de réactifs qui est limité et de la qualité de la PCR) - Exponentielle (la plus rapide) - Produit de PCR \* 2 à chaque cycle et s'accumule *(en supposant que la réaction est efficace à 100%)* - Réaction très spécifique et précise - Réactifs frais et disponible - Réaction doit être optimal dans ce cas-là (100%) - Linéaire (ralentissement de l'amplification) - Au fur et à mesure que la réaction avance, certains réactifs sont consommés. - Les réactions commencent à ralentir - Le produit de PCR n'est plus doublé à chaque cycle - L'apport des réactifs et limité - Plateau (il n'y a plus d'amplification car un réactif à totalement été consommée) - La réaction s'est arrêtée, aucun produit supplémentaire n'est généré - Chaque polymérisation s'immobilise à un point diffèrent car cinétique de réaction différente/réaction - Détection sur gel pour les méthodes classiques - Le plateau désigne le point final (la fin) de la réaction - Limitation de la PCR - Les constituants présents dans le mélange réactionnel sont en quantité finie. Il arrive donc un moment où il n'y a plus assez d'amorces et/ou plus asses de nucleotides (dNTPs) pour que la réaction de synthèse d'ADN puisse continuer à se dérouler de manière exponentielle - L'efficacité de la duplication n'est pas toujours totale. Il peut ainsi arriver qu'une proportion faible mais constante des amorces ne s'hybride pas avec la matrice d'ADN à chaque étape d'hybridation des amorces. Cela peut être du a une mauvaise conception des amorces, ou bien à un choix de température d'hybridation légèrement trop élevé - Vérification des résultats de PCR - Le résultat d\'une PCR = mélange de fragments de tailles différentes à la fin de la réaction - Gel d'électrophorèse - Permet de déterminer s'il y a des contaminations pour donner suite à un prélèvement d'un volume de PCR - La taille des fragments dépend de la distance séparant les amorces - Faire migrer le mélange réactionnel sur un gel d\'agarose - Rechercher la présence d\'un fragment correspondant à la taille attendue - Polymerase Chain Receptor (PCR) - Dénaturation (95°C) 🡪 1^ère\ étape^ - ADN cible : 1 copie. Ouverture de cet ADN cible par le chauffage pour le transformer en ADN simple brin - Réaction in vitro qui se fait par voie enzymatique - Hybridation qui se fait entre 50 et 60 °C 🡪 2eme étape - Dernière étape est l'extension ou l'élongation à 68 ou 72 °C 🡪 synthèse du nouveau brin - Vérification des résultats de PCR - Le résultat d'une PCR = mélange de fragment de tailles différentes à la fin de la réaction - Permet de déterminer s'il y a des contaminations - La taille des fragments dépend de la distance séparant les amorces - Faire migrer le mélange réactionnel sur un gel d\'agarose (électrophorèse) - Rechercher la présence d\'un fragment correspondant à la taille attendue 2. **[L'électrophorèse : ]** - C'est une méthode expérimentale de séparation des particules chargées électriquement par migration différentielle sous l'action d'un champ électrique. Elle s'applique aux protéines et à l'ADN - La vitesse de migration dépend de la charge et de la taille des particules d'électrophorèse peut se faire en phase liquide ou sur un support homogène poreux et relativement inerte (papier, gels,...) - Electrophorèse sur gels d'agarose - Gels = agarose + tampon (ions chargés + agent intercalant (BET = bromure d'éthidium). L'agarose est un polymère à base d'agar-agar purifiée qui forme les mailes du gel. Pour l'ADN le gel est constituée d'agarose diluer par un tampon avec des ions charges permettant d'entrainer les fragments d'ADN à travers un courant et d'un agent intercalant - Présence d'un sens de direction permettant les mouvements du pole -- vers le pole + (car l'ADN est chargé en groupement phosphate (chargé négativement) - Principe de l'électrophorèse - Dépôt dans le puits du gel des fragments d'ADN de différentes tailles) - Migration de l'ADN se fait a travers les maille s créer par le gel d'électrophorèse - Plus les fragments sont petits plus ils vont migrer loin car ils sont moins lourd que les gros fragments d'ADN (plus lourd et encombrer par leur taille) - La migration se fait à travers un gradient électrique - Toujours deux pôles dans l'électrophorèse - ADN lader ou l'échelle de taille moléculaire (ensemble de fragment d'ADN de taille connu dépose sur le gel dans un puits différents et serve d'échelle de comparaison avec les autres brins d'ADN) permettant de déduire approximativement notre taille d'ADN. - Révélation du gel en le sortant de la cuve et en le plaçant d'en une machine permettant de révéler sous UV pour visualiser les différents fragments - L'agent intercalant est fluorescent qui permet de révéler les différents fragments d'ADN - Un agent intercaler va se classer entre les deux brins de l'ADN - Agent est cancérigène - Marqueur de poids moléculaire que l'on fait migrer en même temps que nos fragments d'ADN étudiées - Il est possible de récupérer la bande rose : on découpe la bande sur le gel on extrait de l'ADN du gel d'agarose - On parle de bandes dans le gel - Une bande = un grand nombre de fragments d'ADN de la même taille ayant migré au même niveau - Le BET colore l'ADN en une couleur rouge-orangée - Vérification des résultats de PCR - Le résultat de PCR = mélange de fragments de tailles différentes - La taille des fragments dépend de la distance séparant les amorces - Faire migrer le mélange réactionnel sur un gel d'agarose - Recherche la présence d'un fragment correspondant à la taille des fragments attendue - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide pour les protéines - SDS-PAGE utilisée pour analyser les protéines et les séparer en fonction de la masse moléculaire de la chaine polypeptidique - C'est une technique dénaturante qui dissocie les complexes protéiques - Le SDS est un agent dénaturant - Contrairement aux acides nucléiques dont la charge est proportionnelle à leurs longueurs, il n'y a pas de corrélation entre la taille d'une protéine et sa charge nette - Ceci interdit l'analyse directe de la masse moléculaire des protéines par une électrophorèse classique directe - Recouvre les protéines - Pour séparer les protéines fct de leur taille : - On les associe à un détergent ionique charge : le SDS - Ce détergent forme des interaction hydrophobes avec la chaine peptidique de la protéine - Le complexe protéines SDS formé est fortement chargé, les nombreuses charges négatives du SDS l'emportent sur les quelques charges (positive ou négative) portées par la protéine - Les parties du SDS hydrophobes (en bleu) se fixent sur la chaine protéiques (jaune) et la recouvrent. La charge nette est dominée par celle des molécules SDS dont le nombre est proportionnelle à la longueur de la protéine - On obtient alors un complexe dont la charge totale est approximativement proportionnelle à la longueur de la chaine peptidique : - Donc la force électrostatique s'exerçant lors de la migration en présence de SDS devient proportionnelle à la taille de la protéine - Une protéine va migrer d'autant moins que sa masse est élevée - Une fois les protéines séparer, elles peuvent être colorées directement (bleu de Coomassie ou nitrate d'argent) - Plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, plus les mailles du réseau sont serrées - Pour le pourcentage d'acrylamide est élevée, moins les molécules volumineuses peuvent migrer - Une protéine migre d'autant moins que sa masse est élevée 3. **[Amplification de l'ARN (RT-PCR) : la reverse transcription PCR]** - PCR à partir d'un échantillon d'ARNm (qui va être amplifier) - ARNm d'abord retro transcrit grâce à la rétrotranscriptase inverse 🡪 synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc) - ADNc ensuite amplifiée par PCR - Difficulté : ARNm : facilement dégradées et contaminées par de l'ADNg (ADN exogène) 🡪 vigilance pendant les manips - Transcriptase inverse = ADN polymérase ARN dépendante - Brin d'ARNm = matrice pour catalyser la synthèse du brin d'ADNc - C'est l'inverse » de la transcription de l'ADN en ARNm par l'ARN polymérase - Première étape : la RT (de tous les ARNm) - Besoin d'une amorce avec les extrémités 3'-OH libre - ARNm eucaryotes à amplifier sont polyadénylées en 3' 🡪 amorces = une séquence poly T - Dans ce cas, tous les ARNm de l'échantillon sont a priori copiés en ADNc - Deuxième étape : la PCR, amplification spécifique de la séquence d'intérêt - Taq polymérase : synthèse du second brin d'ADNc en utilisant le premier brin comme matrice - Ensuite, le PCR permet d'amplifier le fragment d'ADN cible double brin - Le produit final = un ADN dont l'un des brins est complémentaires à l'autre brin a la même séquence que cet ARN d'intérêt (à la substitution près de U en T) - Rétrotranscription d'un ARN suivie d'une amplification par PCR - Exemple d'application : - Identification de virus à ARN - Etude de l'expression d'un gène 4. **[PCR quantitative (qPCR) ou PCR en temps réel :]** - La PCR n'est en général pas quantitative si on analyse le résultat de l'amplification à la fin du processus d'amplification, c\'est-à-dire lorsque les échantillons se trouvent dans la phase stationnaire. Ceci est illustré sur le schéma suivant comparant deux modes d'analyse du résultat de l'amplification par PCR - Notion de quantification pas présente dans la PCR classique - Limite de la PCR en point final - Si on analyse le résultat au bout de 40 cycles, on constate que les quantités d'ADN à amplifier sont peu près similaire pour tous les échantillons - Or ces différents échantillons possédaient des quantités initiales très différentes. En effet, il faut moins d'une vingtaine de cycle de PCR pour pouvoir détecter des quantités significatives d'ADN dans l'échantillon bleu alors qu'il faut 30 cycles pour obtenir les mêmes résultats significatifs à partir de l'échantillon rouge - Par conséquent, l'efficacité d'amplification est la même, l'échantillon rouge possédaient bcp moins d'ADN matrice que l'échantillon bleu au début de l'expérience - L'analyse en point final n'est donc pas appropriée pour déterminer - La PCR quantitative (qPCR) - Permet de mesurer la **quantité initiale d'une séquence d'ADN cible** par la quantification du signal fluorescent en temps réel grâce à un **marqueur** fluorescent qui se lie à l'ADN cible - **A la fin de chaque cycle d'amplification** 🡪 quantité de l\'amplicon mesurée - Cinétique complète de la PCR 🡪 **quantification** de la quantité initiale d'ADN cible - Cinétique de la qPCR - 3 phases : - Une phase d'initiation = le bruit de fond, la quantité d'ADN amplifiée est insuffisante pour générer un signal fluorescent pour dépasser ce bruit de fond de l'appareil (phase lente). Ils ne sont pas pris en compte. - Une phase exponentielle : La quantité d'ADN amplifiée génère un signal fluorescent \> au seuil de détection de l'appareil, puis le nombre de produit amplifié double à chaque cycle C'est lors de cette phase qu'on effectue les mesures. Ils vont être interprétables. - Une phase de plateau : Certains réactifs deviennent limitants, il n'y a plus d'amplification exponentielle. - 3 paramètres : - Avec une ligne de base - Une ligne de seuil (déterminé lorsque l'intensité du signal fluorescent suffisant pour pouvoir être mesurer) - Cycle de seuil (moment où le nombre de cycle dépasse le bruit de fond pour devenir exponentielle) - Mesures : - Analyse en phase exponentielle, car données plus précises pour la quantification - Dans cette phase exponentielle, l'appareil de la qPCR calcule les deux valeurs : - La ligne seuil = niveau de détection auquel une réaction atteint une intensité fluorescente \> bruit de fond - Le cycle de PCR où l'échantillon atteint ce niveau = cycle de seuil = Ct - Valeur Ct utilisée pour l'évaluation quantitative - Ct = cycle seuil = cycle threshold = nombre de cycles de PCR à partir duquel la valeur de l'intensité de fluorescence est significativement différente du bruit de fond - Ct atteint en début de la phase exponentielle - Ligne de base = niveau de fluorescence du bruit de fond - Plus la quantité d'ADN initiale sera faible, plus le Ct sera élevé - Mode de mesure : - Des sondes fluorescentes se fixent soit : - Sur l'ADN double brin (technologie SYBR) - Le colorant libre en solution émet peu de fluorescence (1). Il est libre dans le milieu, l'ADN n'est pas encore dénaturé - Durant l'étape d'élongation (2), une augmentation de la fluorescence est associée à la quantité de colorant se fixant (s\'incorporent) à l'ADN double brin naissant (3). - En temps réel, l'augmentation du signal de fluorescence est observée pendant l'étape de polymérisation et l'émission fluorescente décroît complètement lorsque l'ADN est dénaturé au cycle suivant. - L'émission de fluorescence est mesurée à la fin de chaque étape d'élongation pour chacun des cycles par un système de lecture intégré à l'appareil de qPCR qui permet de suivre l'augmentation de la quantité d'ADN amplifié durant la réaction. - Il est libre dans la solution est se fixe uniquement sur l'ADN double brin synthétisé - A chaque nouveau cycle baisse de la fluorescence. Suivi de la quantité d'ADN amplifié - Plus on a de la fluorescence, plus l'ADN est amplifié. Elle est quantifiée par la machine de la qPCR - Sur une séquence d'ADN précise (technologie molecular Beacon ou balise moléculaire) - Les balises moléculaires sont des molécules en forme d'épingle à cheveux, dans lesquelles les bases de l'épingle sont le fluorochrome et l'extincteur (1). - La boucle de l'épingle est constituée d'une séquence complémentaire à une séquence interne de la molécule amplifiée. - Les balises moléculaires sont composées de 3 éléments : le **fluorochrome**, **l'extincteur** (inhibiteur du fluorochrome lorsqu'il est à proximité de celui-ci) et une **région centrale** qui est complémentaire constituée de nucléotides à l'ADN cible (absence de compétition avec l'amorce) - Lorsque le fragment à amplifier est absent, la balise moléculaire est sous forme d'épingle à cheveux, et l'extincteur, près du fluorochrome, empêche ce dernier d'émettre son signal (1). - Si la balise se lie à l'amplicon, l'extincteur et le fluorochrome s'éloignent, et il y a émission de fluorescence (2). La balise à une forme plus relaxée. - La Taq polymérase en avançant va pousser la balise qui se décroche : extinction du signal (3). - Ne fluorescent qu'une fois fixées à l'ADN cible - Pour chaque échantillon, l'émission de fluorescence enregistrée à la fin de **chaque cycle de PCR** permet de définir une valeur de Ct (permet de tracer la courbe) - Principe : a chaque cycle PCR le nombre de produits PCR double - Les deux quantifications répondent à des problématiques différentes - Quantification **relative** = variations de l'expression d'un gène entre deux ou plusieurs échantillons différent (l'un par rapport à l'autre ; comparaison) - Quantification **absolue** = nombre de copies initiales d'un gène requiert une courbe standard. On cherche le nombre initial de copie d'un gène (faire une courbe) - Comment passer d'une fluorescence à un résultat - Détermination des Ct - Ct : intersection entre la courbe d'amplification et la ligne seuil - Comparaison des Ct - Quantification absolue : résultat en nombre absolue de copie. Besoin d'une courbe standard - Ct inversement proportionnel au nombre de copies d'ADN cible dans l'échantillon - On va reporter les résultats sur la courbe - Le moins concentré a une valeur de Ct la plus élevée  - Besoin de la courbe étalon pour déterminer le nombre de copie initial (ou la concentration initial) présent dans l'échantillon d'origine - Ne pas apprendre les calculs juste comprendre les courbes - Quantification relative : résultat : rapport entre Ct (augmentation ou diminution par rapport au calibrateur. Pas de standard mais un **contrôle** **endogène** et un **calibrateur**) - Sans correction d'efficacité mais avec un calibrateur - Hypothèse : les efficacités du gène cibles et gène de référence sont égales à 100% - **Contrôle endogène :** gène qui ne varie pas entre les échantillons testés et amplifié en même temps que le gène cible (tout le temps exprimés) - Gène présent dans l'échantillon mais qui n'est pas le gène cible de la PCR - L'amplification réussie du contrôle endogène permet de déduire que : - L'ADN a bien été extrait et purifié de l'échantillon - Contrôle de qualité - Permet de voir qu'il n'y a pas de problème avec la méthode expérimentale - L'ADN n'a pas été dégradé pendant la procédure d'extraction et de purification - L'amplification de l'ADN est bien réussie - Calibrateur = échantillon auquel tous les autres sont comparés = échantillon « non traité » ou « temps zéro ». Le RQ du calibrateur = 1 car il ne varie pas par rapport à lui-même - Il est nécessaire pour la méthode de calcul - Méthode de **ΔΔCt :** - **ΔCt = Ct gène -- Ct contrôle endogène** - **ΔΔCt = ΔCt échantillon -- ΔCt calibrateur** - **RQ = Relative quantification = 2\^(-ΔΔCt)** - Le calibrateur est fixé à une valeur de 1. Les autres échantillons ont une valeur par rapport à ce calibrateur. - Une valeur de 10 signifie que l'expression de ce gène est de 10 fois plus que le calibrateur. - Une valeur de 0,1 signifie que l'expression est de 10 fois moins que le calibrateur. - Exemple :  - Application de la PCR en temps réel - Détection et quantification microbienne : parasite, virus, bactérie ou mycètes dans le domaine médical par exemple - Oncologie - Expression génétique 5. **[PCR multiplex :]** - Amplification de plusieurs amplicons dans **[un même échantillon]** en même temps grâce à l'utilisation de **plusieurs** **paires d'amorces différentes** - Températures d'hybridation des amorces doivent être **optimisées** 🡪 toutes les paires d'amorces fonctionnent bien en une seule étape - Taille des amplicons des différents gènes amplifiés doivent être **différentes** 🡪 bandes distinctes sur le gel d'électrophorèse - Deux conditions nécessaires : température proche de la température d'hybridation et taille d'amplicons différentes pour amplifier en une seule étape un échantillon d'ADN - Plusieurs couples d'amorces 🡺 plusieurs amplicons - Contraintes - Longueur d'amplicons différentes - Design des amorces - Tm proches pour toutes les amorces - Spécificité des couples d'amorces - Risque de formation de dimères - Exemples d'applications : - Identification de pathogène - Génotypage (recherche de SNP) 6. **[PCR nichée (nested PCR) :]** - But : **réduire la quantité de produits** non spécifiques dûs a la liaison des amorces à des sites autres que l'ADN cible 🡪 amplification de séquences inattendues - 2 PCR successives - 2 paires d'amorces différentes (outer pair and inner pair) pour un même locus utilisé successivement - La seconde paire d'amorces censée amplifier une séquence se trouvant au sein du produit de la première PCR - Première étape : l'ADN cible subit la 1^ère^ PCR avec une 1^ère^ paire d'amorce (outer pair) et le produit PCR pourrait contenir de l'ADN amplifié non spécifique - Deuxième étape : Le produit de la première réaction subit une seconde PCR avec une seconde paire d'amorces (inner pair) dont les sites d'hybridation sont localisés après l'extrémité 3' de chacune des amorces utilisées dans la première PCR. Il est très improbable que le produit non souhaité au départ contienne les sites de liaison pour cette seconde paire d'amorces, assurant que le produit de la seconde PCR soit très peu contaminé par du produit non souhaité - On l'utilise pour augmenter la spécificité de fixation des amorces - On le fait quand l'amplification de la première PCR n'est pas spécifique 🡪 on va augmenter la spécificité de la PCR - Le produit de la seconde PCR est plus court que le premier - Si le mauvais locus a été amplifié par la première PCR, il est peu probable que lors de la seconde PCR ce locus soit présent 🡪 augmentation de spécificité - 2 PCR successives - 2 couples d'amorces - 2^ème^ amplicon interne au 1^er^ donc plus petit - Une spécificité accrue - Exemples d'applications : - Identification de virus à ARN - Amélioration de la spécificité de l'ADN amplifié 7. **[PCR digitale en micro-compartiments (PCR numérique) :]** - **Quantification absolue** de la quantité d'ADN cible présent dans un échantillon (comme la qPCR mais il a besoin d'une courbe étalon et qu'il n'est pas séparé) - Echantillon de départ va être séparées en **plusieurs micro-compartiment = puits** - PCR lancée en parallèle et séparément dans chaque puits - Certains puis contiennent la séquences cible 🡪 amplification - D'autres ne la contiennent pas 🡪 pas d'amplification - Les amplicons seront marqués par des sondes fluorescentes (de couleurs différentes) - Proportions de signaux différentes : générer un nombre absolu de séquences cibles présentes dans l'échantillon - Analyse des altérations du nombre de copies d'un gène, les mutations rares, le séquençage... - Chaque puits est chargé d'un mélange d'échantillon, de mix et de marqueur fluorescent - Chaque puits est analysé individuellement : détecter la présence (positif) ou l'absence (négatif) d'un signal - Pour compenser les puits qui aurait reçu plusieurs molécules de la séquence cible, un facteur de correction est appliqué selon le modèle Poisson - Avantages de la PCR numérique par rapport à la qPCR classique - Permet une quantification absolue sans courbe standard et sans contrôle endogène - Plus sensible - Plus précise : réplicats de PCR, la technologie sera d'autant plus précise que le nombre de compartiment sera important - Le signal de la séquence mutée est noyé dans la PCR classique qui n'est pas sensible - Détecter le SARS-CoV-2 par PCR - PCR numérique pour la détection de l\'ARN viral du SARS-CoV-2 - Test de diagnostic in vitro - Quantification absolue - Trois gènes viraux ciblés : - COVID-19 (N gene) - COVID-19 (RdRP gene) - Sarbecovirus (E gene) - Amorces et sondes fluorescentes - Besoin de 3 paires d'amorces - E : gène de la protéine d\'enveloppe - M : gène de la protéine de membrane - N : gène de la protéine de la nucléocapside - ORF : cadre de lecture ouvert - RdRp : gène de l\'ARN polymérase ARN-dépendante - S : gène de la protéine du pic - Cycles de PCR répétés environ 50 fois : obtenir un grand nombre de molécules d'ADN viral - La formation de produits de PCR visualisée à la fin de chaque cycle de - PCR, en incorporant un signal fluorescent aux molécules d'ADN en cours de formation - Plus il y aura des molécules d'ADN formées, plus le signal fluorescent sera important et donc permettra de détecter la présence du virus - On va atteindre la phase exponentielle plus vite  III. **[Clonage de l'ADN, technique de l'ADN recombinant :]** 1. *[Présentation de l'ADN recombinant :]* - *ADN recombinant :* combinaison entre l\'ADN d\'un organisme donneur (séquence d'intérêt = insert) + celui d'un vecteur (en général un plasmide bactérien, qui peut être d\'une espèce totalement différente) - *Un plasmide :* une molécule d\'ADN distincte de l\'ADN chromosomique, capable de réplication autonome et non essentielle à la survie de la cellule - Double brin et généralement circulaires - Majoritairement dans les bactéries et chez les levures - *Clonage :* amplification d'un fragment d'ADN cible par des micro-organismes après son insertion dans un vecteur (*in vivo*). Technique de construction de l'ADN recombinant - *Les cellules transformées* ayant intégré un ADN recombinant peuvent alors exprimer la protéine recombinante (par exemple une protéine d'une espèce différente, une protéine mutée\...) - Pourquoi cloner ? - Amplifier ou exprimer un fragment spécifique d'ADN pour pouvoir ensuite l'analyser - Produire en grande quantité la protéine codée par un gène d\'intérêt → étudier sa fonction et sa structure - Analyser sa structure 3D, la séquencer (protéine) - Capable de faire une transcription et une traduction - *Vecteur :* fragment d'ADN capable d'autoréplication (réplication autonome dans les cellules, souvent un plasmide) qui accueillera l'insert - *Insert :* fragment d'ADN qu'on souhaite cloner - *Vecteur natif :* vecteur sans l'insert - *Vecteur recombinant :* vecteur avec l'insert - *Cellule hôte :* cellule qui va recevoir le vecteur natif ou recombinant (souvent une bactérie) - *Cellule transformée :* cellule qui a reçu le vecteur natif ou recombinant → repérée grâce à un premier marqueur de sélection - *Cellule recombinante :* cellule qui a reçu le vecteur recombinant (vecteur avec l'insert) → repérée grâce à un deuxième marqueur de sélection. Cellule transformée avec un insert. - *Stratégie de clonage :* technique générale (principe) 1. Origine de l'ADN de l'organisme donneur  2. Amplification du fragment d'ADN du donneur 3. Présentation d'un vecteur 4. Insertion de l'ADN dans le vecteur - Digestion - Ligation 5. Amplification de l'ADN recombinant obtenu 6. Vérification de la construction 2. *[Étape du clonage de l'ADN :]* - Choix du plasmide (vecteur en bleu) - Plasmides naturels ne sont pas utilisés tels quels car un vecteur doit : - Être aussi **petit** que possible (efficacité de transmission) - Être **cartographié** - Se **répliquer** facilement dans la cellule hôte (Ori) 🡪 capable d\'auto-réplication - Posséder un **marqueur de sélection** (cellules transformées vs cellules non transformées - Posséder un **marqueur** (clones transformés par un vecteur recombiné contre ceux transformés par ce vecteur non recombiné) 🡪 permet de distinguer les clones transformés par un vecteur recombiné - Posséder une variété de **sites de restriction** différents (chacun en un seul exemplaire) (polylinker) pour placer différentes enzymes de restriction à un endroits précis - Digestion par les enzymes de restriction : - Coupent l'ADN **double brin** au niveau **de sites de reconnaissance spécifique** = site de restriction (outils de la biologie moléculaire : ciseaux moléculaires assez spécifique) - Capable de reconnaître et de couper spécifiquement une courte séquence de l'ADN de 4 à 10 paires de base - Leur nom = 3 ou 4 lettres : - La première lettre en majuscule 🡪 la première lettre du genre de la bactérie - La seconde et troisième lettre en minuscule 🡪 deux premières lettres de l'espèce bactérienne - La quatrième lettre 🡪 la souche bactérienne, en majuscule mais n'est pas présente sur toutes les enzymes de restriction - Enfin, un chiffre romain donne le numéro d'ordre de caractérisation de l'enzyme - Exemple : - EcoRI : enzyme de restriction provenant d'Escherichia (genre) coli (espèce) souche RY317 ayant été la première à avoir été découverte  - Possèdent des séquences de site **palindromiques** de restrictions - Certaines enzymes donnent des bouts francs après la coupure d'autres vont couper en escalier pour former des extrémités dites cohésive ou bouts collants 🡪 ciseaux moléculaires - EcoRI va reconnaître un même site et va le couper toujours de la même manière - Obtention de bout cohésifs - SmaI va couper entre le G et le C pour obtenir des extrémités de bouts franc - Ligature se fait par une ligase permet de rétablir les liens entre les différents nucléotides (insert + vecteur) - Vecteur natif ou non recombinant qui ne possède par l'insert - Le plus intéressant est celui qui possède l'insert et qui est un vecteur dit recombinant - ADN ligase joint des bouts compatibles forme une liaison entre le groupement 5\'- phosphate d\'un segment d\'ADN et le groupement 3\'-OH du segment précédent sur le même brin - Les sites de restrictions se trouvent de part et d'autre du gène que l'on veut cibler - Dans le plasmide même site de restriction dans le polylinker - **Digestion** par l'enzyme présente dans le plasmide et de part et d'autre du gène cible - Libère les extrémités - Bout cohésif qui permet de mettre le gène cible dans le plasmide - **Mise en communs du plasmide et du gène** (mise en présence) - Complémentarité des nucléotides - Ligase va reformer les liaisons entre les différents nucléotides - **Ligation** - On va avoir insérer dans le bon sens le gène cible dans le plasmide - On a vu un seul résultat possible de la ligation entre un gène et un plasmide digéré par EcoRI. - D'autres résultats sont possibles : - Le plasmide coupé pourrait se recirculariser sans intégrer le gène - Le gène pourrait s'insérer dans le plasmide dans la mauvaise orientation car les deux extrémités cohésives EcoRI sont identiques (minorité de cas). Problématique car peut pas être lu (tout sera inverser)  - 3 cas peuvent être observés dans le cas ou nous utilisons les bactéries - Cellule recombinante - Cellule non transformée - Cellule non recombinante - Amplification des plasmides recombinants dans les bactéries hôtes - Les plasmides contenus dans les bactéries vont être mis sur une gélose et vont se multiplier pour former des colonies - Schéma 3. *[Plasmide pBR :]* Gène de résistance à l'ampicilline 🡪 les bactéries qui le reçoivent peuvent être sélectionnées sur un milieu additionné d'ampicilline Gène de résistance à la tétracycline contenant des sites de clonage 🡪 sélections des bactéries recombinantes (ayant reçu le plasmide recombinant) Nombreux sites uniques de clonage 🡪 digérés par une enzyme de restriction (ex : BamHI), il est linéarisé (avec des extrémités cohésives) Origine de réplication 🡪 pont de départ de réplication de l'ADN plasmidique indépendamment du chromosome bactérien - Digestion du plasmide par BamHI - On a alors des plasmides linéarisés et quelque plasmides non coupés - Ajouter l'ADN à insérer et faire agir une ligase - On contient des plasmides recombinés où le gène tet est interrompu par l'ADN étranger - Dans le tube coexistent deux sortes de plasmides - Le plasmide natif portant bla et tet fonctionnels - Le plasmide recombiné portant le gène bla fonctionnels et tet interrompu mais toujours présents Lorsque ces plasmides vont transformer des bactéries hôtes sensibles à l'ampicilline et à la tétracycline, on va obtenir 3 types de bactéries : - Celles qui n'ont pas etre transformées (50 à 90 %) qui sont restées sensibles à l'ampicilline et à la tétracycline - Celles qui ont reçu un plasmide natif qui sont devenues résistantes à l'ampicilline et à la tétracycline - Celles qui ont reçu un plasmide recombine qui sont devenue résistante à l'ampicilline mais sont restées sensibles à la tétracycline Exemple de plasmide : pBR - En deux étapes, on va pouvoir repérer les bactéries recombinantes - Toutes les bactéries sont étalées sur un milieu contenant de l'ampicilline - Celles qui poussent 🡪 ont avalé un plasmide (natif ou recombiné) - Elles sont répliquées sur un milieu additionné d'ampicilline et de tétracycline - Celles qui poussent ont reçu un plasmide natif - Celles qui ont reçu un plasmide recombiné (ne poussent pas) sont récupérées sur la matrice  - Sélections des clones recombinants - Le plasmide pBR : repérage des clones portant des plasmides recombinés en 2 étapes - Les pUC : une nouvelle famille de plasmides en une étape 4. *[Plasmide pUC :]* Peut etre utiliser comme un plasmide - Possédé une origine de réplication 🡪 point de départ de la réplication de l'ADN plasmidique indépendamment du chromosome bactérien (caractéristique principale) - Polylinker 🡪 région spécifique du plasmide qui contient des sites de restriction uniques - Un gène de résistance à l'ampicilline (amp) 🡪 confère aux bactéries qui le reçoivent une résistance à l'ampicilline. Les bactéries qui ont ce caractère vont être sélectionnées car elles vont se développer sur un milieu additionné d'ampicilline. Les cellules hôtes qu'on a choisi au début ne possède pas ce caractère au début (plasmide présent dans la cellule) - Le gène lacZ qui code la B-galactosidase 🡪 cette enzyme a pour propriété d'hydrolyser le Xgal incolore en un produit bleu - Obtention de deux clones - Clone blanc (pas de B-galactosidase) - Clone bleue (plasmide recombinant présent dans la cellule) - Le polylinker se situe à l'intérieur (au début) du gène lacZ - lacZ et amp sont des marqueurs de sélection - Polylinker situé dans le début du gène lacZ Un plasmide pUC natif aura le gène lacZ fonctionnel (code β-galactosidase) → une bactérie qui le portera, cultivée sur milieu additionné de Xgal, deviendra bleue - Bactéries transfectées en présence d'un inducteur de lacZ (IPTG = isopropyl-thio-galactoside) : on induit la synthèse de l'enzyme dans les colonies. - En faisant pousser ces colonies en présence d'un substrat artificiel (X-Gal incolore) on permet son hydrolyse par l'enzyme qui libère le produit X (5Br,4Cl-indol bleu). **Nous allons garder la bactérie qui reste incolore pour cultiver dans le** Clone bleue sont les bactéries non recombinantes sont résistante à l'ampicilline mais possède encore le lacZ Un pUC recombiné aura le gène lacZ non fonctionnel 🡪une bactérie qui le portera donnera un clone blanc Remarque : il faut que la souche bactérienne utilisée ait perdu l'activité de sa galactosidase avant sa transformation 🡪 on utilise des souches délétées pour l'ensemble de l'opéron la (dont fait partie le lacZ) - Sélection des clones recombinants - Choix d'une souche sensible à l'ampicilline - Plusieurs bactéries peut se former - Pas de plasmide pas d'ampicilline, gène lacZ sera délétères elle ne vont pas pousser - pUC natif, résistance à l'ampicilline, le gène lacZ est toujours fonctionnel pas de croissance mais les clone vont devenir bleue - pUC recombiné, résistant à l'ampicilline, le lacZ est interrompu pas de croissance est les clones vont devenir blanc 5. *[Bio-production :]* [Définition :] production de molécules biologiques (protéines, anticorps, hormones\...) par des systèmes vivants Les molécules qui sont les plus souvent produites sont des anticorps, des protéines ou des enzymes - **[Production de protéines :]** Les cellules hôtes recombinants peuvent produire l'ARNm et la protéine codées par le gène cloné (insert). Les cellules sont ensuite lysées pour extraire les protéines = purification - **[Biomédicament =]** tout médicament dont la substance active est une macromolécule thérapeutique produite par le vivant En grande majorité de nature protéique, et donc tous des médicaments injectables. Vaccins non vivants, anticorps thérapeutiques, hormones protéiques\... Tableau avec les types de protéines qui peuvent traiter des maladies (elles sont produites par l'organisme) **[Avantages des biotechnologies contre synthèse chimique :]** - \+ économique en terme d'NRJ (utilisent des matériaux renouvelables) - Les enzymes utilisées ne vont générer qu'un seul produit alors que les produits chimiques vont générer des déchets collatéraux +/- important Production industrielle d'un biomédicament Biomédicament besoin de cellules transformées, maintien en culture dans des conditions bien spécifiques **[Avantages des systèmes d'expression :]** - Croissance rapide et peu couteuse (1 génération toutes les 20-30 min pour *E. coli*) - Non pathogènes pour l'humain - Système génétique bien connu, nombreuses souches améliorées pour optimiser l'expression des protéines - Bon rendement de production des protéines (plusieurs dizaines de grammes par litre de culture) - Facilités de purification des protéines **[Inconvénients des systèmes d'expression bactériens :]** - Faible efficacité pour la transformation des bactéries (pénétration des plasmides) - Production de molécules simples - Incapables de produire des protéines à structure complexe (anticorps) - Pour être stable, actives *in vivo* et donc efficaces chez l'humain, ces protéines doivent subir des modifications post-traductionnelles propres aux mammifères (repliement, clivage, association de sous unités, glycosylation), mécanismes que les procaryotes ne mettent pas en œuvre - Nécessaire de lyser la bactérie pour récupérer une molécule qui n'est généralement pas sécrétée 🡪 complexifie le processus extraction/purification et nuit aux rendements de purification 6. *[Autres systèmes d'expression :]* Diversité des systèmes d'expression - Le choix du système d'expression est guidé par les modifications que la protéine doit subir pour être biologiquement active - Le vecteur doit être adapté à l'hôte choisi - Il faut connaître le compartiment cellulaire dans lequel la protéine d'intérêt se replie ou exerce son activité biologique naturelles - Selon que cette protéine est cytoplasmique, membranaire ou se replie dans un compartiment extra cytoplasmique, le vecteur devra contenir des séquences spécifiques permettant l'adressage de la protéine dans la cellule - Vont permettre de faire un choix entre les différents systèmes d'expression Diversités des systèmes d'expression - L'utilisation d'outils informatique prédictifs facilite l'analyse de la structure primaire des prot 🡪 indication sur sa localisation cellulaire - La présence d'une hélice hydrophobe 🡪 la protéine est insérée dans une membrane, ou doit éventuellement la traverser au cours de sa biosynthèse pour atteindre un compartiment cellulaire différent du cytoplasme dans lequel elle est synthétisée - La construction du vecteur devra tenir compte de tous ces éléments indispensables à l'adressage correct de la prot dans l'hôte cellulaire **[Production d'une protéine par une cellule animale :]** **[Les levures et les champignons :]** - Même facilités expérimentales et industrielles que les bactéries - Eucaryotes inférieurs, réalisant certaines modifications post-traductionnelles, (glycosylation simple, ponts disulfures) mais peuvent produire simultanément des sucres indésirables rendant les protéines immunogènes **[Cellules de mammifères :]** - Le + utilisé - Cellules d'hamster (CHO, BHK) et cellules murines (NSO) ; cellules humaines : cellules de rétines (cellules PER.C6), des cellules cancéreuses du col de l'utérus (HeLa), LT (Jurkat), qui présentent l'avantage de la glycosylation humaine - Les protéines sécrétées dans le milieu de culture ont subi les modifications post traductionnelles propres aux mammifères - Inconvénients : faible capacité de production, coût de production élevés **[Les plantes transgéniques :]** - Tabac, colza, maïs, riz, soja, pomme de terre... - Faible coût de production - Sécurité par rapport aux risques infectieux pour les humains - Inconvénients : les protéines produites, stockées dans les feuilles ou les graines, difficile à extraire et à purifier, et les extraits peuvent contenir des substances (protéases, polyphénol) mauvaise pour les humains **[Comparaison des différents systèmes d'expression :]** 7. *[Différences entre le clonage et la PCR :]* +-----------------------------------+-----------------------------------+ | **PCR** | **Clonage** | +-----------------------------------+-----------------------------------+ | Méthode in vitro | Méthode in vivo | +-----------------------------------+-----------------------------------+ | Fragments à amplifier de petite | Fragments assez longs (selon la | | taille (en moyenne 1000-2000 pb) | nature du vecteur) | +-----------------------------------+-----------------------------------+ | Rapide et facile | Longue et fastidieuse demandant | | | un post-traitement après clonage | | | et un plus haut niveau de | | | connaissances (large choix de | | | plasmides, des enzymes de | | | restriction, des ligases, des | | | bactéries...) | +-----------------------------------+-----------------------------------+ | Pas d'expression possible de la | Possibilité d'exprimer un gène | | séquence d'ADN en protéine | par la bactérie hôte → produire | | pendant la PCR | en grande quantité la protéine | | | correspondante codée par le gène | | | d\'intérêt → étudier la fonction | | | et la structure d\'une protéine. | +-----------------------------------+-----------------------------------+ | Applications : | Applications : | | | | | - Mettre en évidence la | - La transgénèse (insertion | | présence d\'un fragment | d\'un gène \"étranger\" dans | | d\'ADN donné dans un | un organisme). Il est | | échantillon (tests de | possible de cloner un gène | | dépistage ou | dans un vecteur, d\'amplifier | | d\'identification) | ce vecteur dans une bactérie, | | | puis d\'extraire à nouveau ce | | - Ajouter à un fragment d\'ADN | vecteur pour l\'injecter dans | | d\'intérêt de courtes | un embryon (de mouche, de | | séquences à ses extrémités | souris, de grenouille, de | | (des sites de restriction aux | maïs, etc\...) → organisme | | extrémités d\'une séquence | génétiquement modifié qui | | d\'ADN amplifiée afin d\'en | intégrera dans son génome une | | faciliter l\'insertion | copie du transgène que l\'on | | ultérieure dans un vecteur) | souhaite lui voir exprimer. | | | | | - Introduire des mutations au | | | sein d\'une séquence d\'ADN | | | que l\'on souhaite cloner par | | | la suite dans un vecteur. | | | | | | - RT-PCR permet de n\'amplifier | | | que la partie codante d\'un | | | gène. | | +-----------------------------------+-----------------------------------+ IV. **[Séquençage de l'ADN :]** **[Décryptage des fonctions d'un génome grâce au séquençage :]** - Information obtenue par séquençage de l'ADN : - ATTCGATAGCAACGTAGATTCTGGAGTTGATCAAGGAACCTGTCTCCACAAAGTGTGAC - Information que l'on aimerait obtenir : - But : déterminer la succession de nucléotides A, T, C, G d'un fragment d'ADN - Différentes technologies : - Séquençage de Sanger (1^ère^ génération) : fragments de l'ADN cible de différentes tailles finissant par des nucléotides marqués = "chain terminator" - Séquençage de 2^ème^ et 3^ème^ génération : à grande échelle → augmentent la vitesse et diminuent le prix du séquençage **[Evolution des technologies de séquençage : à titre informatif]** Gagne en vitesse, en performance et en cout 1. **[Séquençage de Sanger (1^ère^ génération)]** - Méthode de synthèse enzymatique - Développée par Frederick Sanger et ses collègues en 1977 - Limite de taille : fragments de 1000 pb maximum d. **[Réactifs : ]** - ADN polymérase - Une seule amorce = ADN simple brin qui se fixe sur l'ADN matrice, point de départ à la polymérase, complémentaire à l'extrémité 3\' du fragment à séquencer - Les désoxyribonucléotides (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) en excès - L'ADN matrice à séquencer - Les didésoxy ou chain-terminating ribonucléotides (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) chacun marqué différemment en petites quantités e. **[Les didésoxyribonucléotides ddNTP :]**  - H à la place du groupement OH sur le carbone 3' du ribose : - Impossibilité d'ajouter un nucléotide après (réaction va s'arrêter si la polymérase met un ddNTP) - Empêchent la poursuite de l'élongation - La terminaison se fait statistiquement sur toutes les positions possibles Terminaison d'une chaine par un ddNTP à la place d'un dNTP pour ne pas former une nouvelle liaison 4 réactions de séquençage en parallèle dans 4 tubes distincts, contenant chacun un seul type de didésoxyribonucléotide : - ADN matrice + amorce + ADN pol + dNTP + ddATP - ADN matrice + amorce + ADN pol + dNTP + ddTTP - ADN matrice + amorce + ADN pol + dNTP + ddGTP - ADN matrice + amorce + ADN pol + dNTP + ddCTP 1. L\'ADN est **dénaturé**. L'amorce se fixe [sur le brin à séquencer (l'autre brin n'est pas utilisé)]. L'ADN polymérase utilise aléatoirement les nucléotides présents dans le milieu pour copier le brin matrice en **synthétisant** un brin complémentaire. - ADN connu permet de faire hybrider l'amorce et de synthétiser le brin d'ADN à séquencer - Fragment de toute les tailles possibles peuvent être obtenues - Polymérase reconnaît l'extrémité 3' de l'amorce et va synthétiser le nouveau brin dans le sens 3'-5' 2. Lorsque l\'ADN polymérase choisi par hasard un **didésoxyribonucléotide** marqué (rare) et qu\'elle l\'incorpore, la chaîne en synthèse **s\'interrompt** prématurément. - Elongation c'est arrêté à différent endroits (il est arrêté de manière prématurée) - On peut obtenir de fragments de tailles similaire ou différente - Il existe statistiquement **des fragments de toutes les tailles** (correspondant à un arrêt de la synthèse à chaque nucléotide) et beaucoup de fragments d\'une même taille. - Les fragments commencent tous au même endroit sur l\'ADN matrice (déterminé par l\'amorce). - Ceux qui possèdent la même longueur se terminent par le même ddNTP marqué. - Les doublons vont être enlevés lors d'une électrophorèse car ils vont migrer au même moment 3. Les fragments sont **séparés** en fonction de leur taille sur un gel. On obtient une succession de bandes. Séparation par électrophorèse. 4. Il suffit de **lire** la succession des bandes pour connaître l\'ordre des nucléotides (lecture automatique par les détecteurs du séquenceur). Avant tout se faisait à la main f. **[Séquenceurs capillaires :]** - On a remplacé l'électrophorèse sur gel par une électrophorèse capillaire (EC) séparation dans des tube - EC a été conçue pour séparer des espèces chimiques selon leur rapport charge/taille à l\'intérieur d\'un petit tube capillaire très fin - Plus rapide et plus précis. - Permet de lire jusqu'à un millier de séquences de bases - Les 4 nucléotides passent dans le même tube capillaire à l'aide de quatre marqueurs fluorescents différents qui permet de les distinguer 🡪 obtention d'un seul - Tout est automatisé actuellement - Ces instruments ne réalisent que **la séparation des brins et la lecture des pics**, il faut avoir lancer la réaction de séquençage (et mettre en contact l'ensemble des réactifs) et après il faut mettre notre résultat de réaction dans la machine - Les réactions de séquençage et la purification doivent être réalisées séparément en amont - L\'appareil est composé de : - Plusieurs capillaires - Un système d\'électrophorèse (les deux pôles et le générateur) - Un laser (excite les ddNTP suite à leur passage dans le capillaire) - Une caméra (permet de savoir la nature du dNTP intégrer) - Capillaires remplis d\'un polymère = tamis moléculaire (c'est-à-dire le support sur lequel les fragments vont être retenu selon leur taille) - Molécules d\'ADN migrent tout au long du capillaire sous l\'effet d\'un très haut voltage = séparation en fonction de leur longueur - Un rayon laser traverse chaque tube capillaire = excite les ddNTP fluorescents incorporés à l\'ADN au cours de la réaction de séquençage - Une caméra mesure l\'émission de fluorescence après excitation par le rayon laser au fur et à mesure que les copies d\'ADN passent devant le laser - Les ddNTP fluorescents sont distingués les uns des autres selon la longueur d\'onde émise et la couleur émise - La dernière étape est la lecture des profils bruts (lecture des pics) = détermination de la séquence 2. **[Séquençage de 2^ème^ génération :]** a. **[Séquençage nouvelle génération à haut débit :]** - Parallèles : plusieurs réactions de séquençage simultanées - Petit support : réactions sur puce - Rapides - Moins coûteuses que technique de Sanger - Plusieurs technologies : **Roche 454 ou pyroséquençage**, Illumina, Ion Torrent\... b. **[Pyroséquençage :]** - **Séquençage par synthèse** (création d'un nouveau brin), par opposition au séquençage par terminaison de chaîne - Séquençage d'un ADN monobrin par synthèse du brin complémentaire, base par base - Détection à chaque étape de l'activité de la polymérase par une autre enzyme **chimioluminescente** (production de lumière après une réaction chimique) : la luciférase - On détecte l'activité de la polymérase base par base - Lecture directe de la séquence en même temps que la réaction de séquençage sans besoin d'électrophorèse (pas besoin de ddNTP) - Les dNTP sont ajoutés l\'un après l\'autre (et non pas tous ensemble comme dans Sanger) - Si le dNTP ajouté est complémentaire du dNTP du brin matrice, il est incorporé dans le brin en cours de synthèse et un pyrophosphate inorganique (PPi) est libéré - Mélange réactionnel : - **Matrice** d\'ADN simple brin hybridée à une **amorce** - Incubée avec **l'ADN polymérase, ATP sulfurylase** (convertit le pyrophosphate en ATP), **luciférase** (convertit la luciférine en oxyluciférine avec émission de lumière), **luciférine** (substrat de la luciférase) et **apyrase** (dégrade les nucléotides en surplus non incorporés par l\'ADN polymérase)  - Nucléotides (dNTP) ajoutés les uns après les autres (différent du séquençage de Sanger) - Si c'est le bon nucléotide : incorporation et libération d'un pyrophosphate (PPi) - PPi 🡪 ATP par action de l'ATP-sulfurylase - L'ATP apporte l'énergie nécessaire à la réaction de la conversion de la luciférine par la luciférase. Cette réaction génère de la lumière visible dont l'intensité est proportionnelle à la quantité d'ATP - Le capteur capte le signal lumineux et le traduit par un pic sur le pyrogramme. - Hauteur du pic : proportionnelle à l\'intensité du signal lumineux par la luciférase, elle-même proportionnelle au nombre de nucléotides incorporés au même moment. On en déduit la séquence du fragment à partir de la taille des pics obtenus. 3. **[Séquençage de 3^ème^ génération :]** a. **[Séquençage en temps réel sur molécule unique :]** - **SMRT :** single molecule real time technique de Pacific Biosciences - **Séquençage en temps réel sur molécule unique** grâce à l'immobilisation au fond d'un puits d'une molécule d'ADN polymérase - L'incorporation de chaque nucléotide associé à un fluorochrome sur son phosphate est mesurée en temps réel grâce à un système spécifique placé sous la plaque support - Technique beaucoup plus sophistiquée que les techniques de séquençage de 2^ème^ génération - \(A) La polymérase est immobilisée au fond. - \(B) Chaque nucléotide est marqué par un fluorochrome différent (G en rouge, C en jaune, T en vert, A en bleu) ayant des spectres d'émission différents. Lorsque le nucléotide est incorporé par la polymérase (1), un signal lumineux est produit et permet d'identifier le nucléotide incorporé (2). Les cavités de la puce vont capter les photons émis par la fluorescence du nucléotide intégré, qui est activé par rayon laser, et la rediriger vers un capteur. (3) La partie marqueur fluolinker-pyrophosphate est coupée du nucléotide et sort de la zone de la puce ce qui arrête la diffusion de la fluorescence. (4) La polymérase avance à la position suivante. (5) Le nucléotide suivant est incorporé au template par la polymérase, générant ainsi un nouveau signal fluorescent (base A). b. **[Comparaison des techniques :]** à titre informatif 4. **[Applications du séquençage :]** - Séquençage d\'un génome inconnu (séquençage de novo) → découverte de nouvelles espèces, souches\... - Recherche de polymorphismes (allèles) dans une population → lien avec des maladies - Découverte d'ADN ancien dans les fossiles - Epigénétique (identifier les sites de méthylation) - \... - Peut se faire à différente échelle : a. **[Métagénomique : ]** - Etude du génome d\'un organisme prélevé directement **dans un environnement** (intestinal, océan, sols, \...) **sans besoin de le cultiver**, à l\'inverse d\'un organisme de laboratoire - Caractériser les différents génomes présents dans un échantillon → caractériser les micro-organismes pathogènes présents chez un patient, étudier l'évolution des espèces (phylogénie moléculaire) \... - Description génomique du contenu de l\'échantillon, mais aussi aperçu du potentiel fonctionnel d\'un environnement - Certaines conditions de cultures pour des organismes ne peuvent pas être reproduites en laboratoire. Ainsi nous avons pu identifier des organismes dont on ne soupçonnait pas l'existence jusqu'à une étude par la métagénomique. b. **[L'ADN environnemental (ADNe) :]** - Le principe de l'ADNe repose sur le prélèvement et l'analyse de l'ADN **présent directement** **dans un environnement** (et non pas à l'intérieur d'un organisme). - En prélevant l'ADN que les individus laissent dans l'environnement, on peut indirectement détecter leur présence et déterminer l'espèce à laquelle ils appartiennent. - ADNe = mélange complexe d'ADN de plusieurs origines (nucléaire, mitochondrial ou chloroplastique \[dans le cas des végétaux\]) 1. Échantillonnage de l'environnement 2. Extraction de l'ADN 3. Amplification de l'ADN 4. Séquençage de l'ADN 5. Analyse bio-informatique des données - **[Limites de l'ADNe :]** 1. [Problème d'échantillonnage :] La probabilité de retrouver de l'ADN d'une espèce dépend de la densité d'ADN relâchée par cette espèce, qui dépend de son abondance. Une espèce peu présente risque de ne pas être détectée. 2. [Contamination :] Faux +, contaminations à tout moment entre la collecte des échantillons et l'analyse des données. Le principal risque de contamination se fait dans les laboratoires d'analyse de l'ADN (plusieurs échantillons simultanément étudiés). 3. [Erreurs d'amplification et de séquençage ] 4. [Capacité d'identification dépendante de la bibliothèque des barcodes de référence :] Erreurs de référencement d'espèces dans la bibliothèque, taux de reconnaissance des séquences cibles - **[L'ADNe et ses applications :]** - [Analyse de régimes alimentaires : ] - En analysant l'ADN des contenus stomacaux d'animaux capturés ou d'excréments, on peut directement avoir accès à un ensemble de données génétiques provenant d'organismes qui ont été ingérés et consommés. - En détectant les espèces auxquelles appartiennent ces séquences, on peut en déduire le régime alimentaire de l'individu échantillonné. - [Estimation de la biodiversité actuelle et passée d'un écosystème : ] - Estimation des différentes espèces présentes dans différents types d'environnements - L'ADN prélevé dans les sédiments, le pergélisol ou les calottes glaciaires permet de déterminer les espèces ayant vécu dans ces milieux et de reconstruire la biodiversité passée. Par exemple, des échantillons de carottes glaciaires du Groenland datés d'il y a 2 000 à 4 000 ans contenaient des molécules d'ADN qui ont permis la détection de plantes, de champignons, d'algues et de protistes (Willerslev et al. 1999). 5. **[Décryptage des fonctions du génome humain grâce au séquençage : ]** - Obtention d'une suite de nucléotides - On cherche à mettre en liaison le gène et son expression (expression d'un caractère) - Mettre en liaison les fonctions que peuvent avoir les gènes et qu'elles sont les conséquences d'une mutation sur les fonctions de celui ci - Les différences entre individus aident à décrypter le génome - Séquençage de nombreux génomes: bases statistiquement associées avec un trait - Les similarité entre espèces aident à décrypter le génome - Element ultra conservés entre les espèces (souris et Homme) - Certaines régions ont des séquences identiques même entre espèces éloignées. Les mutations dans ces régions ont été éliminées par la sélection naturelle → région à fonction importante? V. **[Epigénétique :]** **[Introduction :]** s'exprime plus ou moins, différence d'évolution, peut se transmettre d'une génération à une autre génération et peut être réversible 1. **[Définitions :]** **Génétique :** étude des caractères héréditaires transmissibles selon les lois de Mendel. Ces caractères sont portés par les gènes et codés par l'ADN **Epigénétique :** études des caractères, tels les changements des états de transcriptions des gènes, qui sont héritables au cours des divisions cellulaires qui n'impliquent aucun changement de la composition de la séquence d'ADN. Ces caractères sont en général réversibles et sont causés par des modifications dites épigénétiques (méthylation et d\'acétylation). On ne touche pas à sa composition nucléotidique. Modification de l\'état de transcription - Pour donner une image métaphorique, si le génome est comparé aux phrases d\'un livre, l\'épigénome correspond à ses accents: un même texte peut alors être interprété différemment selon que certains mots ont des accents graves, aigus ou circonflexes. **Génotypes :** séquences d'ADN correspondant à un caractère héréditaire donnée (phénotype) **Épigénotype :** ensembles des modifications épigénétique correspondant à un état de transcription particulier d'un gène (expression ou répression) **Modification épigénétique :** modifications chimiques qui s'ajoutent aux génotypes pour former un épigénotype. Elles sont responsables des états de transcriptions des gènes 2. **[Compaction de l'ADN :]** - Voir schéma et cours du S2 en génétique - **[La chromatine :]** - Dans les cellules eucaryotes (et archées), le matériel génétique est organisé en structure complexe constituée d'ADN et de protéines (=histones) - Cette structure = **chromatine** (du grec khroma : couleur et sôma : corps) - Il est localisé dans le noyau des cellules eucaryotes - Modification de la configuration des gènes par épigénétique - **[Le nucléosome : ]** - **Histones :** protéines associées à l'ADN et participe à la formation de la chromatine - ADN s'enroule autour d'un octamère d'histones fait de paires d'histones *H3, H4, H2A et H2B*, ce qui forme l'unité de base de la chromatine : le **nucléosome** (unité de bases dans la compaction de l'ADN) - **Nucléosome** **:** un complexe constitué d'histones et d'ADN - C'est le **premier** niveau de compaction de l'ADN - Des niveaux de compaction supérieurs sont obtenus à l'aide d'autres protéines - Nucléosome = unité de base de la chromatine = premier niveau de compaction de l'ADN =ADN+octamère d'histones - **[Le nucléofilament :]** - L'unité fondamentale de la chromatine est appelée le nucléosome qui est composé d'ADN et d'histones - Cette structure est ensuite régulièrement répétée pour former le nucléofilament (deuxième niveau de compaction) qui peut, lui-même, adopter des niveaux d'organisation plus compacts. - **[Compaction de l'ADN : ]** - Dans la chromatine, l\'ADN s\'enroule en 2 tours autour de chaque nucléosome. - Une cinquième histone (H1) coiffe chacun de ces complexes 🡪 chromatosome - Cet enroulement permet déjà une légère condensation, état naturel de la **chromatine** - On compare cette structure à un collier de perles (mais dans ce cas les perles ne sont percées mais maintenues par le fil qui les entoure) - Un nouvel enroulement beaucoup plus serré se forme grâce à l'histone H1. Cela aboutit à la formation d'un filament plus « trapu » - Celui-ci est aussi replié sur lui-même pour former des **boucles** et cette structure est elle-même enroulée. - **[Structure de la chromatine :]** - Structure de la chromatine (dépend des modifications épigénétiques) - Divisé en deux états pour permettre la transcription : - Euchromatine (= chromatine relâché) : la machinerie de transcription peut se fixer sur cette structure - Hétérochromatine (= chromatine condensé) : la distance entre les différents chromosomes est réduite au maximum - Cette structure dépend de l'étape dans lequel va se trouver la cellule - **[Un génome, des épigénomes :]** 3. **[Méthylation de l'ADN :]** a. **[Etat de la chromatine :]** - La transcription de l'ADN en ARN est facilitée lorsque la chromatine est décondensée. - Cet état permet aux protéines du complexe de transcription d'accéder à l'ADN. - La relation méthylation/expression peut être complexe selon les espèces. - Chez les eucaryotes, lorsque le promoteur d\'un gène est méthylé, le gène en aval est en [général] réprimé et n\'est donc plus transcrit en ARNm. b. **[Méthylation de l'ADN :]** - Méthylation de l\'ADN = processus épigénétique dans lequel certains nucléotides peuvent être modifiés par l\'addition d\'un groupement méthyle (-CH3 ). - Enzymes **DNMT** pour "DNA methyl-transferase" - DNMT3A, -3B et -3L → méthylent l'ADN de novo (dans les cellules germinales) - DNMT1 → maintient la méthylation au cours des divisions cellulaires, se positionne au niveau de la fourche de réplication de l\'ADN et copie le profil de méthylation de l\'ADN parental sur le brin néo-synthétisé - Chez les mammifères, les cytosines méthylées se trouvent souvent dans des zones riches en cytosines et guanines, **appelées îlots CpG** - Les îlots CpG = fragments d\'ADN d\'au moins 200 pb, riches en CG - L\'essentiel des sites de méthylation de l\'ADN = cytosines qui précèdent une guanine (CpG - le \"p\" signifie phosphate) c. **[Rôle de la méthylation de l'ADN :]** - La méthylation de l\'ADN est un processus réversible mais les mécanismes exacts de déméthylation sont encore incertains. d. **[Epigénétique mariage à trois : ]** - Trois types de modification épigénétique - Modification des histones (acétylation et méthylation) - Méthylation de l'ADN - ARN non codant - Agit directement ou non sur la conformation de la chromatine - Deux états de conformation qui permettent une activité du gène ou une inactivité du gène (permettant la fixation des facteurs de transcription ou non en fonction de l'accessibilité) - Modification épigénétique : permet le remodelage de la chromatine e. **[Méthylation de l'ADN et des histones :]** - Epigénétique causé par des facteurs environnementaux (développement) f. **[ARN non codants :]** - ARN qui ne code pas pour des protéines - Interagissent avec les transcrits de gènes, les ARNm, ou des modulateurs transcriptionnels, pour les contrôler - Mécanisme d'action de l'ARN (miARN) - **[Mécanismes épigénétique agissant sur l'expression des gènes :]** - Les mécanismes épigénétique peuvent agir sur - La transcription des gènes (remodelage chromatinien) - La traduction des ARNm (ARN non codants) - **[Epigénétique et maladies : ]** - Le rôle de l'épigénétique est étudié dans le dvlpt et la progression des maladies complexes et multi factorielle, comme les maladies neurodégénératives ou métaboliques - Les marques épigénétiques sont potentiellement réversibles 🡪 cibles thérapeutiques intéressantes - Approches diagnostiques différentes et dvlpt de nouvelles thérapies **4. [Modifications post-traductionnelles des histones : ]** - La méthylation de l'ADN n'est pas la seule modification épigénétique - Les modifications post-traductionnelles des histones (méthylation, acétylation, phosphorylation, ubiquitination...) affectent aussi l'état de la chromatine → régulent l'expression d'un gène a. **[Méthylation des histones :]** - Principalement sur des résidus lysine et arginine - Par des enzymes appelées histones méthyltransférases (**HMT**) - Souvent associée à une répression transcriptionnelle - Méthylation sur l'ADN : ajout d'un groupement directement sur l'ADN b. **[Acétylation des histones : ]** - Ajout d'un groupement **acétyle (--CO-CH3)** sur des lysines - Enzymes appelées histones acétyltransférases (**HAT**) - Acétylation des lysines : → Stabilise la chromatine décondensée → Activation transcriptionnelle **Balance acétylation/désacétylation des histones :** - Quand elle est dans un état désacétylé, la chromatine est condensée (hétérochromatine), inhibant ainsi la transcription de l'ADN.  - - Les histones acétyltransférases (HAT) acétylent les histones, ce qui entraîne une décondensation de la chromatine (euchromatine), permettant la transcription. - Les histones désacétylases (HDAC) désacétylent les histones et recondensent l'euchromatine en hétérochromatine → inhibition de la transcription Modification épigénétique entraînant le remodelage chromatinien et modifiant l'expression des gènes - Méthylation de l'ADN - Modifications des histones (méthylation, acétylation\...) - ARN non codants **5. [ARN non codant :]** - En plus des causes moléculaires telles que la méthylation de l'ADN, les modifications d'histones et le remodelage chromatinien, l'expression des gènes peut être régulée par l'action des ARN non codants. - ARN qui ne codent pas pour des protéines - Interagissent avec les transcrits de gènes, les ARNm (régule les ARNm codant), ou des modulateurs transcriptionnels, pour les contrôler - **Petits** ARN non codants et **longs** ARN non codants - Dérégulations dans leur biogenèse et leurs fonction → vieillissement et maladie a. **[Micro ARN (stARN)]** - Petits ARN non codants les plus importants en épigénétique - En moyenne de 18 à 22 nucléotides - Régulent près de la moitié des ARNm - Chaque miARN peut avoir jusqu'à plusieurs centaines de gènes cibles - Régulent l'expression des gènes après la transcription via **leur liaison avec les ARNm** - Interrompt leur traduction (leur transformation en protéine) - Liaison physique - Deux mécanismes de régulation qui dépendent du degré de complémentarité entre la séquence des miARN et celle de leurs ARNm cibles : - Si la complémentarité de séquence est parfaite (le microARN est complémentaire en tout point à la séquence de l'ARNm), la liaison du miARN entraînera la **dégradation** de l'ARNm **(voie 1)** - Si la complémentarité de séquence est imparfaite (Complémentaire mais certaines séquences ne le sont pas complètement) , il n'y aura pas de dégradation de l'ARNm mais une **inhibition** de sa traduction en protéine **(voie 2)**  6\. Techniques d'analyse des modifications épigénétiques - Techniques d'analyse - Techniques d'analyse de l'ADN méthylé - Traitement chimique au bisulfite de sodium - Traitement chimique au NaHSO3