Cours 1: Le Cycle Cellulaire (PDF)

**COURS 1** ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- Le cycle cellulaire est absolument essentiel pour la FORMATION et la SURVIE d'organismes multicellulaires -------------------------------------------------------------------...

**COURS 1** ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- Le cycle cellulaire est absolument essentiel pour la FORMATION et la SURVIE d'organismes multicellulaires ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- \*Objectif \#1 : PROPAGER LE MATÉRIEL GÉNÉTIQUE - L'objectif majeur de la division cellulaire est de créer 2 cellules génétiquement identiques 1. Définition du cycle cellulaire - Ensemble des états qui constituent et délimitent la reproduction d'une cellule - Duplication du matériel génétique - Ségrégation des constituants en 2 cellules filles - Présence de mécanismes de surveillance très stricts (il faut absolument accomplir correctement tous les événements d'un état avant de passer au suivant) - 2 types de division cellulaire - Procaryote (1 chromosome, pas de noyau) - Fission binaire : réplication du chromosome, ségrégation et cytokinèse - Eucaryote (minimum 2 chromosomes, noyau) - Mitose : cellule diploïde, c'est-à-dire qui contient 2 copies de chaque chromosome (une de chaque parent) - Méiose : cellule haploïde, c'est-à-dire qui contient une seule copie de chaque chromosome (père OU mère, au hasard) ----------------------------------------------------------------------------------- Plusieurs processus développementaux dépendent des cycles cellulaires spécialisés ----------------------------------------------------------------------------------- \*ex : croissance = ovule fécondé (1 cellule) à un humain adulte (5x10^13^ cellules) 2. Division asymétrique (ex : cellules souches) - Pour conserver leur caractère « souche », ces cellules doivent effectuer une division inégale du cytoplasme, ce qui nécessite un couplage particulier entre la division cellulaire et la couche épithéliale (niche) - La cellule touchant la niche demeure une cellule souche tandis que la cellule fille se différencie 3. Polyploïdie - Multiples copies d'un même complément génomique normal (ex : 4 copies d'un chromosome au lieu de 2) - Ce processus n'est PAS rare : les cellules du foie sont fréquemment polyploïdes car il y a absence de cytokinèse - Il dépend souvent d'un processus d'endoréplication, soit la réplication du génome sans cytokinèse (mais requiert un découplage) - Il peut aussi arriver qu'il y ait réplication sans reformer de nouveaux noyaux en télophase ce qui crée de la polyténie, soit la formation d'un chromosome géant (les chromosomes répliqués restent alignés) - Exemple : embryon précoce de drosophile - Durant le développement embryonnaire, tous les noyaux sont suspendus dans un seul compartiment de l'œuf. Suite à plusieurs cycles cellulaires sans cytokinèse, il y a formation d'un syncytium, puis le mouvement des noyaux vers la périphérie génère l'apparition des membranes plasmiques séparant les noyaux en cellules individuelles ---------------------------------------------------------------------------------------------- La prolifération aberrante des cellules cancéreuses dépend d'altérations du cycle cellulaire ---------------------------------------------------------------------------------------------- \*le cancer est une perte de contrôle de la fréquence de la division cellulaire et d'un génome instable\* 1. Phases du cycle cellulaire (36-48h) - Interphase (tout sauf la mitose) - G0 = différenciation, pas de croissance (durée indéfinie) - G1 = croissance des cellules, multiplication des organelles, préparation à la réplication de l'ADN (env. 18h) - S = réplication de l'ADN (env. 8h) - G2 = préparation des cellules pour la division (env. 8h) - Mitose - Division cellulaire = condensation et ségrégation des chromosomes, cytokinèse (env. 1h) - ATTENTION : le terme « croissance » fait référence à l'augmentation du volume d'une cellule, « division » à la multiplication d'une cellule et « prolifération » à la multiplication d'une population de cellules » 2. Organismes modèles du cycle cellulaire - Levures - Leur morphologie est diagnostique de l'étape du cycle cellulaire dans laquelle elles se retrouvent (observations faciles) - Haploïdes (plus faciles de trouver des mutants) ou diploïdes (permet des analyses génétiques complexes) - Criblage avec réplica biologique pour identifier les cellules ayant des mutations qui empêchent la progression du cycle cellulaire, puis classification cytologique - Embryon d'oursin de mer (découverte des cyclines) - Ovocytes transparents - Division cellulaire rapide et synchrone (avantage en microscopie) - Facile d'obtenir en grande quantité - Découverte des cyclines : protéine dont l'abondance augmente juste avant la division cellulaire, mais qui disparait après la division - Œuf de grenouille - Facile d'obtenir en grandes quantités - Possible d'induire un cycle cellulaire virtuel dans un extrait de protéines isolé à un stade particulier du cycle cellulaire et éliminer une protéine spécifique - Système unique pour caractériser la fonction des régulateurs du cycle cellulaire par immuno-déplétion - Cellules HeLa - Cellules humaines - Validation des découvertes sur les organismes modèles - Identification et caractérisation des éléments de régulation de G1 3. Hétérocaryons - Cellule contenant deux ou plusieurs noyaux de nature différente (ex : noyau de poulet + noyau humain) - Permet de déterminer quel « état cellulaire » ou génotype domine sur un autre - 2 hypothèses sur le cycle cellulaire : - Dominos : le cycle est composé d'évènements séquentiels et dépendants, donc il y a un arrêt s'il manque une étape - Oscillateur : il y a un « contrôleur central » qui force la progression peu importe s'il manque une étape - RÉALITÉ : aucune des 2 hypothèses : - Les évènements du cycle sont contrôlés par des mécanismes indépendants - L'initiation d'une étape dépend de l'achèvement de la précédente - Les événements n'ont lieu qu'une seule fois par cycle - Il existe un contrôle on-off pour chaque étape, donc il n'y a ni un contrôleur central ni un effet domino - La progression est sous la surveillance de points de contrôle - En G1 : avant l'entrée en phase S (est-ce que l'environnement est favorable?) - En G2 : avant l'entrée en phase M (est-ce que tout l'ADN est répliqué?) - En métaphase : avant la sortie de la phase M (est-ce que tous les chromosomes sont attachés?) -------------- Les cyclines -------------- Protéines qui régulent les protéines kinases (CDK). Elles doivent absolument interagir avec les CDK durant le cycle cellulaire pour favoriser leur stabilité (accumulation cyclique dans l'interphase et dégradation abrupte durant la mitose ½ vie très courte, instables). 1. Types de cyclines - Cyclines G1 (½ vie de 30 minutes) - Cycline C : pic d'expression en G0 - Cycline D : pic d'expression en G1 - Cycline E : pic d'expression en G1/S (promouvoit l'entrée en S) - Cyclines mitotiques (augmentation progressive durant l'interphase, puis dégradation rapide durant la mitose) - Cycline A : pic d'expression en G2/M - Cycline B : pic d'expression en fin de M 2. Découverte des cyclines - Identification des mutants cdc2 et cdc28 (CDK1) chez l'oursin - Clonage de l'ADNc : - Cycline A chez la palourde - Cycline B chez l'oursin et la levure S. pombe 3. Expression et régulation des cyclines - En G1 : - La transcription est induite par les facteurs de transcription E2F - L'inhibition se fait par les protéines de la famille Rb - Il y a une régulation spécifique à cette phase - En S : - La transcription est induite par les facteurs de transcription B-Myb, NF-Y et FoxM1 - Localisation intracellulaire - Varie au cours du cycle cellulaire car elle dépend de la phosphorylation : - La cycline D se retrouve dans le noyau en G1 (pas phosphorylée) mais dans le cytoplasme en S (phosphorylée) - Le complexe cycline B-CDK1 se retrouve dans le cytoplasme en G2 (pas phosphorylée) mais dans le noyau en M (phosphorylée) - Points de contrôle - La protéine Rb (rétinoblastome) inhibe la prolifération cellulaire en contrôlant le cycle cellulaire par l'intermédiaire du facteur E2F (rappel : celui-ci stimule la transcription des gènes codant pour les enzymes du cycle cellulaire) - Sa phosphorylation est assurée par les complexes cycline D-CDK4/6 et cycline E-CDK2 - Inhibiteurs des CDK = CDKi - Famille Cip/Kip : inhibe les complexes CDK2 et CDK4/6 en mimiquant l'ATP ce qui retarde la progression de G1 à S (réponse aux dommages à l'ADN) - Famille Ink4 : inhibe la formation du complexe cycline D-CDK4/6 ce qui altère l'orientation des lobes des CDK (suppresseur tumoral car empêche la progression dès G0/G1) - Les kinases - Motif consensus S/T-P-X-K/R se trouve d'une part et RXL de l'autre du site de phosphorylation = enzymes très spécifiques - Ces motifs se retrouvent chez les substrats des CDK mais aussi chez les inhibiteurs de cyclines - Facteurs qui influent sur la spécificité : - Dimension du site catalytique : la profondeur de leur site catalytique détermine si la kinase peut phosphoryler des tyrosines (besoin de plus d'espace) ou des sérines et thréonines - Charges du site catalytique : phosphorylation de la Thr160 dans la boucle T par CAK pour permettre l'activation des CDK (libération du site actif) - Sites d'interaction distaux : permettent d'augmenter la concentration locale de substrats à proximité du domaine kinase - Les kinases de la famille Wee1 phosphorylent les acides aminés Thr14 et Tyr15 du site actif de CDK1 pour les inhiber (bloque l'accès au site catalytique) - Les phosphatases de la famille cdc25 enlèvent les phosphates mis par Wee1 - Résumé des modes de régulation des CDK - Transcription des cyclines et formation d'un complexe avec CDK - Phosphorylation de la Thr160 dans la boucle d'activation (boucle T) par CAK (cycline activating kinase) - Phosphorylation de la Tyr15 par Wee1 (négatif) - Déphosphorylation de la Tyr15 par la phosphatase cdc25 - Association avec les CDKi (généralement négatif) - Dégradation par le protéasome (négatif) **COURS 2** 1. Voie de dégradation par l'ubiquitine - Protéine de 76 acides aminés qui s'attache aux protéines qui doivent être dégradée par le protéasome - Le protéasome est un arrangement de 28 protéases en 4 anneaux - Un « cap » à chacune de ses extrémités lui permet de reconnaitre une chaine de polyubiquitine d'au moins 4 unités, ce qui permet de recycler l'ubiquitine et déplier la protéine pour qu'elle rentre dans le cœur du protéasome - L'inactivation des cyclines se fait par dégradation via une protéolyse dépendante de l'ubiquitine - Contrôlé par les enzymes de la famille ubiquitine ligase (E3). Il en existe 2 types : - Anaphase Promoting Complex (APC) : active par cdc20 en métaphase et par cdh1 en télophase et en G1 - SCF : essentielle durant la transition G1-S. Elle est responsable de la dégradation des protéines phosphorylées comme les cyclines D et E (sa sous-unité à boite F reconnait le substrat phosphorylé) 2. Initiation de la mitose - Augmentation de l'activité cycline-CDK A et B (synthèse des cyclines mitotiques durant la phase S) - En fin de G2 : - Cycline A-CDK1 est actif et au noyau - Cycline B-CDK1 est inactif et dans le cytosol (non phosphorylé) - Wee1 est actif - Cdc25 est exclus du noyau - Plk1 est inactif - Élément déclencheur de la transition vers M : activation de cycline B-CDK1 par Plk1 3. Fin de la mitose - Activation de l'APC par association de la cycline à sa sous-unité Cdh1 - La phosphorylation des sous-unités de l'APC permet son activation par cdc20 - ATT : la phosphorylation de Cdh1 empêche l'activation de l'APC par Cdh1 - APC + protéine adaptatrice (cdc20 ou Cdh1) = APC acquiert une spécificité de substrat ubiquitination d'une cycline dégradation - Arrêt de la dégradation : l'APC détruit sa propre enzyme ubiquitine E2 après avoir dégradé tous les autres substrats (pseudo-cannibalisme) 4. La mitose - Prophase - Duplication des centrosomes - Épaississement de la chromatine - Condensation du matériel génétique en chromosomes avec un centromère - Diviser le génome en chromosomes (génome trop grand autrement) - Diviser les chromosomes avec les centromères (idéalement au centre chromosome métacentrique) - Compacter l'ADN en nucléosomes (histones) - Compacter les nucléosomes en chromatine mitotique (histone H1) - Échafaudage chromosomique (formation de boucles de chromatine par le complexe condensine et la topoisomérase II) - Formation de supertours dans l'ADN par le complexe condensine (activé par phosphorylation par CDK) - Pro-métaphase - Disparition de la membrane nucléaire par phosphorylation des lamines ou déchirement (permet aux microtubules d'avoir accès aux chromosomes) - Formation du réseau de microtubules autour des centrosomes - Microtubule = unité fondamentale du fuseau mitotique composée d'assemblages de dimères de tubuline α et β a. Fibres K : se connectent directement aux kinétochores b. Fibres interpolaires : s'étendent vers le centre c. Fibres astrales : stabilisent les pôles - Centrosome = organelles pour l'organisation des MT et site de construction du kinétochore (pont entre le centromère et les MT) - Attachement voulu : amphitélique (bi-orienté, égal) régulé par les deux points de contrôle du fuseau mitotique (kinétochores inattachés et tension des MT) - Taxol = médicament anti-cancer = agent anti-mitotique empêche la dépolymérisation des microtubules - Métaphase - Migration équatoriale des chromosomes - Dépend de l'attachement des MT aux kinétochores (régulé par les 2 points de contrôle) - Stabilisation du fuseau mitotique - Anaphase - A : attraction des chromosomes vers les pôles (raccourcissement des fibres k) - Cohésine : protéine de 4 sous-unités organisée en anneau (configuration régulée par l'hydrolyse de l'ATP, restreint physiquement les chromatides sœurs) d. Association avec les chromosomes (G1) e. Établissement de la cohésion fonctionnelle (S) f. Inactivation des bras des chromosomes (prophase) g. Inactivation finale (transition vers anaphase) - Séparase : perte de cohésion a. La séparase est retenue par la sécurine avant l'anaphase (la destruction de l'interaction se fait via l'APC-cdc20) - B : migration des chromosomes sur les fuseaux mitotiques vers les pôles (élongation des fibres interpolaires) - Télophase - Dénouement des chromosomes - L'activité cycline B-CDK1 est éliminée, ce qui inactive toute la machinerie mitotique - Reformation de la membrane nucléaire - Cytokinèse - Séparation physique de la membrane cellulaire pour obtenir 2 cellules - Anneau contractile : organelle hautement dynamique responsable de l'exécution de la cytokinèse. Composé de h. Actine : contraction pour cliver i. Myosine : contraction pour cliver j. Septine k. Aniline : connecte les 3 autres types de filaments 5. Cancer - Oncogène = « gas pedal » = promouvoit le développement d'un cancer - Suppresseur = « brake pedal » = bloque le développement d'un cancer - Les composants les plus impliqués dans l'oncogenèse (p53/pRb) sont également impliqués dans la régulation G1/S - Régulation par les complexes cyclines-CDK, surtout de types D, E et CDKi - Seulement en G1 car il s'agit du seul moment où la cellule est sensible aux signaux environnementaux avant de rentrer irrémédiablement en phase S - Causes : mutation/aberration des voies de signalisation, inactivation des p53, phosphorylation excessive de Rb, inactivation des CDKi - Cascade p53 pour la réparation des dommages à l'ADN : - Dommage à l'ADN - P53 - P21 (CDKi) - Blocage en G1 - Senescence : mécanisme de suppression tumorale défini par l'établissement d'un arrêt essentiellement irréversible de la prolifération en G0/G1 **COURS 3** 1. Méiose - Division cellulaire essentielle pour la gamétogenèse (cellules reproductrices haploïdes) - 1 méiose = 4 spermatozoïdes - 1 méiose = 1 œuf et 3 petites cellules (donc 1 seul gamète) - Un seul cycle de réplication de l'ADN suivi de 2 divisions cellulaires (+ recombinaison homologue entre les chromosomes) - Division 1 (réductionnelle perte de ploïdie) : formation de synapses chromosomiques et recombinaison homologue - Division 2 (équationnelle maintien de la ploïdie mais perte d'une copie) : formation de noyaux haploïdes - La plupart des événements régulateurs de la mitose sont présents en méiose - Éléments spécifiques : - Prophase 1 : condensation des chromosomes, formation du complexe synaptonemal, recombinaison homologue, disparition du complexe synaptonemal, chromosomes bivalents uniquement attachés par des chiasmata (but = former le complexe synaptonemal pour stimuler la recombinaison homologue et créer des chiasmata qui empêchent les chromosomes de se séparer) - Le fuseau méiotique ne s'attache qu'à un seul kinétochore par paire de chromatide sœur donc on préfère le type syntelique bio-orienté (bonne tension, stable) au lieu de l'amphitelique comme en mitose - La recombinaison homologue rend chaque gamète unique (chaque cellule en méiose 1 présente 2^n^ possibilités de combinaisons, soit 8 388 608 chez l'humain) **COURS 4** 1. Source de cellules - Cultures primaires : cellules tirées directement d'un tissu donc sans modifications (ce ne sont PAS des lignées cellulaires) - Avantages : plus représentatif, accès aux cellules d'animaux génétiquement modifiés - Inconvénients : difficile à isoler et à faire pousser, faible rendement, coûts élevés - Lignées cellulaires : peuvent être achetées et modifiées - Avantages : production en grande quantité, disponibilité commerciale, moins dispendieux - Inconvénients : moins représentatif, cellules transformées 2. Visualisation *in situ* (directement dans le tissu) - Microscopie à épifluorescence (voir si la protéine est présente) - Détection de protéines par immunocytochimie : immobilisation de la protéine d'intérêt, anticorps primaire, anticorps secondaire marqué avec un fluorophore - Microscopie confocale (voir où est située la protéine dans le tissu) - Avantage : bien meilleure résolution - Inconvénients : plus long, plus cher 3. Isolation cellulaire - Fluorescence activated cell sorter (FACS) - Cellules en suspension (liquide) - Passage par un laser qui charge une goutte négativement en présence d'une cellule fluorescente et positivement en absence de cellule fluorescente - Passage par des électrodes pour séparer les cellules positives, négatives et même les gouttes qui n'ont pas été chargées - Microdissection par laser - On recouvre une lame avec des cellules régulière puis on dépose un amas de cellules cancéreuses au centre de celle-ci. Un premier laser va couper autour des cellules cancéreuse (on obtient l'entièreté des cellules cancéreuses sous lesquelles il y a une couche de cellules normales) et un second va l'envoyer dans un contenant - Single cell RNAseq - Cellules en suspension (liquide) - Tampon de lyse et ajout de microparticules - Huile on obtient des gouttelettes contenant une cellule et une microparticule - Lyse cellulaire (libération de l'ARN) - Hybridation de l'ARN - Bris des gouttelettes - Transcription inverse (on obtient des STAMPs : single-cell transcriptomes attached to microparticles) - PCR - Séquençage et analyse 4. Purification de protéines - Fractionnement cellulaire (seulement bris de la membrane, organelles intactes) - Centrifugation (toujours la première étape): séparation par taille et densité les composants plus lourds sédimentent en premier - Par vélocité (faible gradient de sucrose): séparation selon la vitesse de sédimentation a. Séparation plus précise b. Dépôt en bandes selon le poids et la forme - Par densité (haut gradient de sucrose ou césium de chlore): séparation selon la densité c. Descend dans le gradient et s'arrête à la densité qui correspond à la sienne d. Méthode très sensible - Choc osmotique  - Ultrasons - Trituration : passage des cellules par un embout de pipette - Homogénéisation - Chromatographie - Échange d'ions (billes positives ou négatives) : séparation selon la disposition des charges à la surface des protéines \*dépend de la force ionique et du pH de la solution de resuspension\* technique la **moins précise** - Diethylaminoethylcellulose (DEAE-cellulose) avec les charges positives - Carboxymethylcellulose (CM-cellulose) avec les charges négatives - Filtration par gel : séparation par taille - Protéines de grande taille sortent en premier car elles ne sont pas retenues par les pores - Affinité : séparation par affinité (interactions avec la matrice) technique la **plus précise** - Fixation du substrat à la matrice par des liens covalents 5. Identification de protéines - Insertion d'un tag (purification et/ou localisation cellulaire) - His-tag : purification par colonne avec matrice de Nickel - C-myc-tag : purification par colonne avec anticorps (myc = facteur de transcription) - Ex : la reconnaissance du tag sur Netrin-1 au lieu de la reconnaissance directe de Netrin-1 permet de faire la distinction entre Netrin-1 endogène et exogène - GST-tag : purification par colonne avec glutathionne immobilisé - La protéine X fusionnée au GST se lie aux billes recouvertes de glutathionne - Ajout de l'extrait cellulaire interaction des protéines avec la protéine X - Ajout d'une solution de glutathionne pour éluer la protéine de fusion avec les protéines d'interaction - SDS-PAGE - Le SDS charge négativement les protéines - Le β-mercaptoéthanol défait les ponts disulfures - Migration dans le gel selon la taille (de la cathode (-) à l'anode (+)) - Bleu de Coomassie : liaison non-spécifique aux protéines chargées négativement (toutes car on utilise du SDS) - Nitrate d'argent : liaison spécifique et sensible aux protéines (détecte les concentrations faibles) - Western Blot (protéine connue) - Transfert des protéines du gel à la membrane - Blocage de la membrane avec BSA - Anticorps primaire pour reconnaitre la protéine d'intérêt - Anticorps secondaire conjugué à une enzyme - Ajout du substrat de l'enzyme pour le convertir en signal (couleur ou fluorescence) - Séparation selon le point isoélectrique (protéine inconnue) - 1^ère^ séparation : selon la charge intrinsèque dans un tampon avec un détergent non-ionique, du β-mercaptoéthanol et de l'urée la protéine se déplace jusqu'au pH où elle a une charge nulle - 2^ème^ séparation : selon la taille par électrophorèse avec SDS (à angle droit avec la 1^ère^ séparation) - Spectrométrie de masse - MALDI-TOF: matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight spectrometry - Matrix-assisted: la protéine est fragmentée par la trypsine et cristallisée sur une matrice de métal ou de céramique par un acide organique - Laser desorption : le laser projette les protéines sous forme de gaz ionisé (une ou plusieurs charges positives) - Les ions sont accélérés dans un champ de haut voltage électrostatique vers le détecteur - Time of flight : la masse et la charge de la protéine déterminent le temps qu'il lui faut pour arriver au détecteur (petite protéine vole rapidement et protéine très chargée vole rapidement) 6. Techniques d'interactions protéines-protéines - Co-immunoprécipitation - Conditions NON dénaturantes (pas de mercapto) - Formation du complexe et reconnaissance par l'anticorps - Si les antigènes A et B n'interagissent pas, l'anticorps A va seulement reconnaitre l'antigène A - Si les antigènes A et B interagissent ensemble, l'anticorps A va reconnaitre le complexe AB - Précipitation - Ajout de la protéine A marquée au sepharose 4B - Analyse par SDS-PAGE avec l'anticorps [anti-B] - Il n'y a rien lorsqu'il n'y a pas d'interaction entre les antigènes A et B - Il y a une bande lorsqu'il y a interaction entre les antigènes A et B - Interaction *in vitro* (pull-down) - Construction de protéines hybrides avec GST et expression dans E. coli - Purification des protéines hybrides par liaison au glutathionne marqué avec sepharose 4B - Clivage du GST par la thrombine - Purification par liaison du GST au glutathionne marqué avec sepharose 4B (il nous reste seulement la protéine voulue) - Détermination de l'interaction entre la protéine purifiée et une autre protéine hybride) ex : A-GST-sepharose 4B et protéine B - Analyse du surnageant par SDS-PAGE e. Si le surnageant ne contient PAS de protéine B, il y a eu une interaction entre A et B f. Si le surnageant contient la protéine B, il n'y a PAS eu d'interaction entre A et B - Mutant dominant négatif - Basé sur le fait que beaucoup de protéines sont constituées de domaines qui se replient de façon indépendante - Expression d'un domaine protéique qui va bloquer la fonction de la protéine endogène 7. Quantification d'interactions biomoléculaires - Résonance plasmon de surface - Le rayon de lumière incident frappe un film d'or sur lequel la protéine cible est immobilisée - Ceci excite les plasmons de surface (oscillation des électrons à angle droit avec le film) - La liaison de la protéine cible au film change sa composition moléculaire de surface (augmente l'indice de réfraction) et donc l'angle de résonance du faisceau de lumière (l'or a un nuage d'électrons très bien défini) - Cette technique permet donc de détecter les interactions de liaison en analysant la réflexion d'une onde de lumière - Fluorescence resonance energy transfer (FRET) - La protéine X est liée à une protéine qui fluoresce en bleu (excitation par la lumière mauve = émission de lumière bleue) et la protéine Y est liée à une protéine qui fluoresce en vert (excitation par la lumière bleue = émission de lumière verte) - S'il n'y a pas d'interaction entre les protéines X et Y, la protéine qui fluoresce en vert ne sera pas excitée et il y aura émission de lumière bleue - S'il y a une interaction entre les protéines X et Y, il y aura un transfert d'énergie entre les protéines fluorescentes et il y aura émission de lumière verte - Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) - Même principe que FRET, mais le donneur est une protéine luciférase qui s'excite en présence de son substrat (luciférine) puis transfère l'énergie à l'accepteur qui est une protéine fusionnée au GFP - La différence est donc que le BRET ne requiert pas de lumière externe pour l'excitation du donneur 8. Interactions protéine-chromatine - Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) - Fixation des protéines à la chromatine avec du formaldéhyde - Lyse des cellules - Fragmentation de l'ADN (sonication) - Précipitation avec des anticorps contre les protéines d'intérêt - Défaire la fixation pour enlever les protéines de la chromatine - Amplifier les fragments obtenus par PCR 9. Animaux transgéniques (introduction d'une mutation) - Gène remplacé : seulement le gène mutant est actif - Gène knockout : aucun gène n'est actif - Gène ajouté : le gène normal ET mutant sont actifs **COURS 5** 1. Dynamisme et stabilité du cytosquelette - Composition : microtubules, filaments d'actine et ADN - Rôles : - organise la cellule dans l'espace et lui permet d'interagir avec son environnement - change la forme de la cellule pour qu'elle se déplace - réorganise le contenu de la cellule durant la division cellulaire - 3 types de filaments : - Filaments d'actine : forme de la surface cellulaire et locomotion - Microtubules : localisation des organelles et direction du transport intracellulaire - Filaments intermédiaires : rigidité et force mécanique - Le cytosquelette se réorganise rapidement durant la division cellulaire - Le cytosquelette est stable car il maintient la polarité cellulaire - Les protofilaments simples sont instables car ses unités ne sont liées que par des liens non-covalents faibles, donc ils s'assemblent de manière à être thermodynamiquement stables - Les contacts latéraux renforcent les filaments (la disposition décalée des FI par rapport aux MT leur confère une plus grande stabilité) 2. Polymérisation des filaments - La formation des filaments à partir de petites sous-unités (protéines) permet une réorganisation rapide et efficace du cytosquelette - Des faibles liens non-covalents se forment entre les 3 types de filaments ce qui permet une polymérisation et dépolymérisation rapide - Polymérisation - Ajout d'une sous-unité protéique à l'extrémité du filament - La vitesse d'addition est donnée par la constante de vitesse K~on~ - Un polymère hélicoïdal (comme les filaments) est stabilisé par de multiples contacts entre ses sous-unités adjacentes nucléation - La concentration critique : concentration de sous-unités de cytosquelette libres à laquelle la vitesse d'addition du côté (+) est égale à la vitesse de dissociation du côté (-) - Cc = K~on~/ K~off~ - La croissance du filament se fait au pôle (+) - Treadmilling (conservation de la longueur bien qu'il y ait activement de la polymérisation/dépolymérisation) : effet de déplacement dû à l'addition du côté (+) et à la dissociation du côté (-) - se produit à des concentrations intermédiaires de sous-unités (entre les valeurs de concentrations critiques des formes T (ATP) et D (ADP)) - Cc(T) \< Cc(D) - Cc(pôle +) \< Cc(pôle -) - Dépolymérisation - Suppression d'une sous-unité protéique à l'extrémité d'un filament - La vitesse de perte est donnée par la constante de vitesse K~off~ - Les MT se dépolymérisent beaucoup plus vite à une extrémité contenant du GDP qu'à une extrémité contenant du GTP (coiffe GTP favorise la polymérisation) 3. Microtubules - Constitué de 13 protofilaments eux-mêmes formés de sous-unités de α et β-tubuline (1 hétérodimère de tubuline = 1 sous-unité de protofilament) - Le GTP dans l'α-tubuline est physiquement immobilisé donc il n'est jamais hydrolysé - l'α-tubuline se trouve à l'extrémité (-) - Le nucléotide dans la β-tubuline peut être du GTP ou du GDP et participe à l'assemblage et au désassemblage des MT - la β-tubuline se trouve à l'extrémité (+) - stabilisation de l'extrémité (+) par la présence d'une coiffe GTP - lorsque présente : croissance rapide - lorsque absente : désassemblage rapide - l'hydrolyse du GTP par la β-tubuline change la conformation linéaire du protofilament (devient courbé) - le reste du MT est composé de dimères de tubuline-GDP donc est moins stable - nucléation - se fait dans le centre d'organisation des MT (MTOC) - MTOC = centrosome (se trouve près du noyau) - se fait de l'extrémité -- (dans le MTOC) vers l'extrémité + (sort du MTOC) - la conformation astrale des MT (extrémité (+) mobiles et (-) stables) permet de sonder l'environnement et placer le centrosome au centre de la cellule - le complexe en forme d'anneau de tubuline γ (γ-TuRC) sert de plateforme pour la nucléation - l'extrémité (-) des MT est associée aux anneaux de γ-tubuline - plus de 50 copies de γ-TuRC sont contenues dans la matrice fibreuse qui compose le centrosome (MTOC) - le centrosome (MTOC) contient 2 centrioles (structures cylindriques disposées à angle droit) - peuvent devenir les corps basaux des flagelles - organisent la matrice du centrosome et assurent sa duplication pendant la division cellulaire - composés d'un court cylindre de MT modifiés et une série de protéines accessoires 4. Protéines régulatrices de la stabilité des microtubules - Stabilisantes (MT plus longs mais moins dynamiques) - MAP-4 : favorise la récupération - XMAP-230 : augmente le taux d'élongation et diminue de nombre de catastrophes - XMAP-215 : augmente de taux d'élongation - Déstabilisantes (MT plus courts mais plus dynamiques) - XKCM1 et MCAK : augmentent le taux de catastrophes ATP dépendantes - Op18 : séquestre les dimères et augmente le taux de catastrophes - Kar3p : augmente la dépolymérisation au pôle (-) - Katanine : coupe les MT - Libère les MT du centrosome (important pour la dépolymérisation lors de la division cellulaire) - 2 sous-unités : a. Petite : hydrolyse l'ATP et coupe le MT b. Grande : dirige la katanine vers le centrosome - MAP : protéines associées aux MT - MAP2 : possède un long domaine extra-MT qui permet l'espacement entre les MT - Tau : possède un court domaine extra-MT qui permet la condensation des MT - +TIPs : (+) end tracking proteins - Associées à l'extrémité (+) des MT - Influencent la dynamique de croissance - Certaines +TIPs permettent de positionner les MT sur des structures cellulaires - EB1 : essentielle pour le positionnement et l'ancrage des MT vers le fuseau mitotique 5. Moteurs moléculaires - Les MT sont importants pour l'organisation du cytoplasme et le transport vésiculaire - 2 types de protéines motrices (assurent le transport antérograde et rétrograde des vésicules dans les cellules nerveuses) : - Kinésines - Transport des organelles en se déplaçant vers une extrémité du MT - Le domaine moteur se lie au MT et l'hydrolyse de l'ATP génère la force motrice (liaison de l'ATP à la tête de la kinésine provoque un mouvement qui propulse le 2^ème^ moteur vers l'avant) - Composées de 2 chaines lourdes et 2 chaines légères pour chaque moteur - Seul le domaine moteur est commun aux différents isoformes - Mouvement lent - 3 groupes principaux selon la position du moteur: c. N-KIF : moteur en N-terminal (majorité des cas, sur chaines lourdes), transport vers l'extrémité (+) d. M-KIF : moteur au milieu, dépolymérise les MT par mécanisme ATP dépendant (pas d'orientation précise) e. C-KIF : moteur en C-terminal, transport vers l'extrémité (-) - Le site de liaison du cargo (ce qu'il faut transporter) est en C-terminal - L'orientation du 2^ème^ moteur dicte la direction de déplacement de la kinésine - Dynéines - Transport vers l'extrémité (-) du MT - Hydrolyse l'ATP pour se déplacer (la dynéine est détachée du MT lorsque l'ATP est lié donc son hydrolyse provoque l'attachement au MT) - 2-3 chaines lourdes (incluant le moteur) - Nombre variable de chaine intermédiaires et légères - Portion N-terminale se lie aux chaines légères et à d'autres chaines lourdes - La tête annulaire est composée de 6 domaines AAA (4 d'entre eux sont des ATPase) et une chaine lourde C-terminale - Plutôt rapides - 2 grandes catégories : f. Dynéines cytoplasmiques  i. Homodimères de chaines lourdes avec 2 moteurs ii. larges complexes iii. se retrouvent dans la majorité des cellules eucaryotes iv. transport des vésicules v. centre l'appareil de Golgi dans la cellule g. Dynéines axonémiques vi. Hétérodimères et hétérotrimères avec 2 à 3 moteurs vii. Mouvements rapides des MT qui propulsent les flagelles et les cils viii. Très rapides 6. Microtubules dans le cycle cellulaire - Les MT forment le fuseau mitotique qui divise les chromatiques sœurs (anaphase) et sépare les chromosomes aux pôles opposés - 3 types de MT : - MT astraux  - MT kinétochores  - MT interpolaires  - Kinésine 5 : 2 domaines moteurs qui interagissent avec les extrémités (+) des MT anti-parallèles sépare les pôles du fuseau - Kinésine 14 : voyage vers l'extrémité (-) en se liant aux MT anti-parallèles attire les pôles - Kinésines 4 et 10 : voyagent vers le (+) en s'attachant aux chromosomes éloignent les pôles - Dynéines : voyagent vers le (-), organisent les MT, lient les MT astraux à l'actine et sépare le fuseau mitotique en tirant les pôles vers le cortex cellulaire - Les MT s'attachent aux chromosomes via les kinétochores - Les extrémités (+) s'associent directement aux kinétochores via des sites de liaisons spécialisés - 3 forces transportent le chromosome sur le MT h. Dépolymérisation de l'extrémité (+) des MT exception car il faut raccourcir rapidement les MT pour ramener les chromatides sœurs i. Les MT avancent vers les pôles en se désassemblant à l'extrémité (-) j. Transport via les kinésines 4 et 10 - Drogues qui perturbent la dynamique de polymérisation des MT - Taxol : lie et stabilise les MT - Colchicine et colcémide : lie les sous-unités et empêche leur polymérisation - Vinblastine et vincristine : lie les sous-unités et empêche leur polymérisation - Nocodazole : lie les sous-unités et empêche leur polymérisation 7. Filaments d'actine - Nucléotide (ATP ou ADP) enfoui dans le monomère d'actine - Filament d'actine = 2 protofilaments qui s'enroulent en hélice (relativement flexible) - S'assemblent vers l'extrémité (+) avec des sites de liaison de l'ATP à l'extrémité (-) croissance de (-) vers (+) - Étape limitante de la polymérisation = nucléation (phase de latence) - Peut être réduite ou supprimée en ajoutant des noyaux préfabriqués (fragment de MT déjà polymérisés ou filaments d'actine) - La nucléation peut être catalysée par les ARPs (actin-related protein) et les formines concentré dans les régions de croissance rapide de l'actine (ex : lamellipode) - Complexe ARP2/3 (analogue du γ-TuRC) : provoque la nucléation à partir de l'extrémité (-) et permet l'élongation rapide à l'extrémité (+) la présence d'un facteur d'activation provoque un changement de conformation qui permet l'assemblage rapide d'actine (moyen le plus efficace de provoquer la nucléation, angle de 70 degrés) k. L'extrémité (+) est équivalente à l'actine l. L'extrémité (-) ne permet pas la polymérisation - Formines : dimères connectés à la membrane plasmique m. Nucléation des filaments d'actine non-branchés n. Chaque sous-unité a un site pour l'actine monomérique ix. 1^ère^ sous-unité : capture le monomère d'actine x. 2^ème^ sous-unité : présente le second monomère d'actine et provoque la polymérisation o. Reste associée à l'extrémité (+) du nouveau filament permet la liaison d'un autre monomère d'actine - Plus grande densité d'actine à la périphérie cellulaire (dicte la forme et le mouvement cellulaire) - La polymérisation des filaments d'actine se fait suite à l'hydrolyse de l'ATP - Les protéines liant l'actine (ABP) peuvent contrôler leur polymérisation - Thymosine : se lie au monomère d'actine et bloque sa polymérisation ce qui inhibe son association avec d'autres monomères d'actine et bloque son activité ATPase - Profiline : se lie à l'extrémité (+) au site opposé à celui de l'ATP et bloque le site où le prochain monomère se lie à l'extrémité (-) force l'ajout de monomères à l'extrémité (+) - L'addition de monomères change la conformation de l'actine et réduit l'affinité pour la profiline donc elle finit par se détacher en ajoutant un monomère d'actine supplémentaire - Certaines formines ont un domaine d'interaction avec le complexe profiline-actine augmente la vitesse de polymérisation - Les ABP permettent à l'actine de s'organiser en différentes structures : p. Spectrine : tétramère qui sépare 2 filaments de 200nm q. Fimbrine : 2 sites adjacents de liaison à l'actine pour maintenir 2 filaments très proches r. α-actinine : dimère qui sépare 2 filaments de 30nm s. filamine : dispose l'actine en forme de « V » créé une matrice quadrillée espacée et flexible qui permet le déplacement - Cofiline : se lie à l'actine monomérique et polymérique puis provoque une torsion du filament pour le compacter affaiblit les liens du filament et dissocie l'ADP-actine plus facilement - Elle se lie préférentiellement aux filaments ADP-actine (l'hydrolyse de l'ATP est un processus lent donc elle dégrade l'actine la plus ancienne) - ERM (ezrin, radixin and meosin): protéine dont le C-terminal se lie directement à l'actine et le N-terminal se lie aux portions intracellulaires des récepteurs transmembranaires des glycoprotéines - Communication des signaux extracellulaires directement au cytosquelette d'actine - Protéines de coiffe - Extrémité sans coiffe = croissance possible aux deux extrémités - Extrémité avec coiffe = croissance du côté (-) seulement - La polymérisation est plus dynamique et rapide à l'extrémité (+) - Une protéine de coiffe à l'extrémité (+) réduit la vitesse de polymérisation et dépolymérisation 8. Actine - Myosines (moteurs protéiques de l'actine) : 2 chaines lourdes et 4 chaines légères - Le domaine de liaison des nucléotides des myosines et des kinésines est conservé - La phosphorylation des chaines légères par MLCK active les myosines-II - Changement de conformation des têtes de myosine accès à l'actine - Relâche la portion C-terminale et permet l'assemblage en fragments bipolaires - L'hydrolyse d'ATP permet de générer une force - Drogues qui affectent les filaments d'actine : - Phalloïdine : lie et stabilise les filaments - Cytochalasine : ajout de coiffe à l'extrémité (+) - Swinholide : brise les filaments - Latrunculine : lie les sous-unités et empêche leur polymérisation 9. Filaments intermédiaires - Renforcent les cellules - Permettent de maintenir l'intégrité de la cellule et des tissus - Dépolymérisation des FI (ex : vimentine) entraine un affaissement de la cellule et une désorganisation du cytosquelette - 4 types : - Nucléaires : lamines A, B et C - Vimentine-like : vimentine, desmine - Épithéliaux : kératine - Axonaux : protéines neurofilament (NF-L, NF-M, NF-H) - Polymérisation - La région α-hélicoïdale est sous forme de monomère - Formation d'un dimère coiled - Superposition de deux dimères coiled tétramère - Assemblage de deux tétramères - 8 tétramères enroulés pour former un filament **COURS 6** 1. Cytosquelette nucléaire - Squelette nucléaire (matrice nucléaire) - Réseau de fibres trouvé à l'intérieur du noyau (analogue au cytosquelette de la cellule) - Résiste à la digestion par la DNAse et à l'extraction par le sel - Riche en filaments intermédiaires (lamines) - Principal élément squelettique de la cellule animale - Base du cytosquelette - LINC (Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton) - Ancre les 3 types de filaments du cytosquelette (actine, MT, FI) à l'enveloppe nucléaire - Nesprines 1, 2 et 3 (Nuclear Envelope Spectrin-Repeat proteins): ancrées aux membranes nucléaires externe (ONM) et interne (INM) a. Nesprines de la ONM : se lient à la F-actine, la plectine et aux moteurs des MT b. Nesprines de la INM : interagissent dans l'espace intraluminal avec les domaines SUN (Sad1 et UNC-84) des protéines - Lamines - Maladies associées : mutation dans le gène des lamines de type A (LMNA) ou dans les gènes codant les protéines de liaison des lamines à la membrane nucléaire - Dystrophie musculaire Emery-Dreifuss (EDMD) c. Déformation des joints d. Faiblesse musculaire progressive e. Manifestations cardiaque - Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS) - Se retrouvent à travers le nucléoplasme mais surtout concentrées en proximité de la INM - LAP1, LAP2β (Lamina-associated proteins) et LBR (Lamin B receptor) lient la lamine à la INM - LAP2β, émerine et MAN1 sont des protéines de la INM interagissent avec l'ADN via BAF (Barrier to auto-integration factor) - Mécanotransduction - Lamine A, titine et BAF se lient directement à l'ADN ou aux histones - BAF est requis pour l'expression de certaines cyclines et pour la progression du cycle cellulaire - Émerine s'associe directement aux lamines et aux protéines de la membrane nucléaire (nesprines 1 et 2) - L'association entre émerine, lamine A et les LINC provoque la mécanotransduction - Organise les filaments d'actine 2. Migration cellulaire - Développement - Nécessaire lors de l'embryogenèse - Développement du système nerveux - Développement du système vasculaire - Adulte - Réponse immunitaire (macrophages, neutrophiles) - Remodelage du tissu conjonctif - Pathologies - Cancer - Métastases - Processus - Formation d'aspérités (protubérances) qui sont riches en actine - Attachement : le cytosquelette d'actine se connecte de la membrane plasmique au substrat (intégrines) - Les points d'ancrage = plaques d'adhérence a. Les intégrines font le pont entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette - Traction : le cytoplasme est tiré vers l'avant - Se fait par polymérisation locale accrue de filaments d'actine (à l'extrémité (+) des filaments) - Rappel : la cofiline se lie à l'actine sous forme ADP (plus ancienne) ce qui permet un « treadmilling » efficace et unidirectionnel - La myosine II contracte le réseau d'actine et réoriente les fibres le nouveau réseau recrute plus de myosine II ce qui génère une force de contraction qui rétracte le réseau en aval (ramène la partie arrière) - Remodelage du cytosquelette - Il faut une polarisation initiale de la cellule pour permettre sa locomotion - Les signaux extracellulaires viennent de la famille des GTPases Rho (Cdc42, Rac, Rho) b. Les Rho sont des GTPases monomériques de la famille des Ras qui sont actifs lorsque lié à un GTP (inactif avec GDP) - Étapes : - Activation de Cdc42 sur la membrane plasmique : polymérisation de l'actine et formation de faisceau formation de filopodes ou microspikes - Activation de Rac : polymérisation de l'actine à la périphérie cellulaire formation de lamellipodes c. Rac-GTP : active WASP (+++ nucleation d'actine) et PAK (active la filamine, bloque la myosine II stabilise les lamellipodes et empêche la formation de fibres tactiles) d. Rac-GTP peut aussi activer Rho mais avec une cinétique lente (Rac forme un nouveau réseau d'actine et Rho provoque la contraction et la tension) - Activation de Rho : fasciculation de l'actine avec la myosine II formation de fibres tactiles (points d'ancrage) et co-localisation avec les intégrines e. Rho-GTP : active la formine formation de faisceaux d'actine et active les Rho Kinases (ROCK) bloquent la cofiline donc stabilise l'actine + bloque la phosphatase des MLC donc +++ de phosphorylation des MLC = +++ contraction = +++ formation de fibres tactiles - WASP (Wiskott-Aldrich Syndrome) s'active lorsque lié à Cdc42-GTP et provoque la liaison du complexe ARP +++ de nucléation d'actine 3. Matrice extracellulaire (MEC) - Le tissu conjonctif est celui qui a le plus de matrice extracellulaire - Lame basale - Mince couche flexible et résistante composée de molécules de matrice - Composée de 2 types de cellules f. Protéines fibreuses : glycoprotéines laminine, collagène de type IV et nidogène i. Lamine : protéine d'adhésion (principale molécule de la lame basale; rôle d'organisation) 3 longues chaines de polypeptides (α, β, γ) maintenues par des ponts disulfures ii. Collagène de type IV : 3 chaines tressées qui s'assemblent en filet pour créer une tension iii. Nidogène : attache la laminine au collagène g. Chaines de polysaccharides : glycosaminoglycanes (GAG) reliées à une protéine pour former des protéoglycanes perlécan iv. Perlécan : attache la laminine au collagène - Synthétisée par les cellules qui reposent sur elle - Peut influencer le métabolisme, déterminer la polarité, organiser les protéines et servir au déplacement - Fibronectine : protéine de la MEC qui permet aux cellules de s'y attacher - Glycoprotéine composée de 2 larges sous-unités connectées par des ponts disulfures - Le domaine fibronectine de type III se lie aux intégrines 4. Attachement des cellules à la MEC - Intégrines : récepteurs membranaires qui relient la MEC au cytosquelette - Composé de 2 glycoprotéines α et β - N-terminal extracellulaire qui se lie à la MEC (lamine, fibronectine) - C-terminal intracellulaire qui se lie aux protéines ancrées dans le cytosquelette (talin) - Cellule épithéliale : les hémidesmosomes ancrent la kératine (intracellulaire) de la cellule à la lamine (MEC) de la lame basale via des protéines d'ancrage (plectine et dystonine) - Changement de conformation - Forme active : attachement à la MEC, chaines α et β séparées - Forme inactive : pas d'attachement, chaines α et β sont rapprochées et adhèrent ensemble - Activation « outside-in » : h. liaison d'un ligand au domaine extracellulaire empêche la proximité des récepteurs donc les chaines intracellulaires se séparent i. talin se lie à la sous-unité β assemblage des filaments d'actine j. l'intégrine est prête pour attraper son ligand extracellulaire - Activation « inside-out » : k. Talin en compétition avec la chaine α pour le site de liaison à la chaine β la portion extracellulaire s'ouvre et devient active l. Modulée par le phosphoinositide PIP2 qui active la talin à la chaine β v. PIP2 est généré par des GPCR ou des RTK - FAK : régulateur de la polarité de migration cellulaire - Facilite la formation du front migratoire - Activé par les ilots d'intégrines - Module l'activité des membres de la famille Rho - FAK facilite l'activation des GEF (Guanine exchange factor) et GAP (guanine activating protein) qui sont des modulateurs de l'activité Rho 5. Composition de la MEC - Les glycosaminoglycanes (GAG) sont composés de sucres (répétition du même disaccharide) - 1^er ^: toujours un amino-sucre (souvent sulfaté donc chargé négativement) - Ex : N-acetylglucosamine - 2^ème ^: souvent un acide uronique - Acide glucuronique ou iduronique - 4 types : - Hyaluronane (N-acetylglucosamine + acide glucuronique) m. GAG le plus simple n. PAS de groupe sulfate o. Rempli des espaces durant l'embyogenèse p. Résiste aux forces de compression - Sulfate de chondroïtine et dermatane sulfate - Sulfate d'héparane - Sulfate de kératane - Très rigides - Hydrophiles (charge négative) forment des gels hydratés - Conformation étendue - Collagène de type IV - Peut être une chaine α simple ou une triple chaine - La glycine est le seul acide aminé assez petit pour s'insérer dans le polymère - Produit en grande quantité par le tissu conjonctif (abondant dans les os et la peau) - Très riche en proline (stabilise le trimère) et en glycine (chaque 3^ème^ aa) - Liens covalents entre les différentes fibres pour former des pontages +++ de force de traction - Le collagène de type IX se lie au collagène de type II pour permettre l'organisation des fibres de collagène - Protéoglycane - GAG lié de façon covalente à une protéine - Les ribosomes membranaires produisent le polypeptide dans le RE, puis les chaines de polysaccharides sont assemblées dans le Golgi - Élastine - Assure l'élasticité des tissus - Hautement hydrophobe - Présente dans la peau et les vaisseaux sanguins - Riche en proline et en glycine - N'est pas glycosylée - Composée de 2 courts segments en alternance - Segment hydrophobe mobile (responsable de l'élasticité) - Segment en hélice α riche en alanine et lysine (liaisons transversales)