Capitolele 2 și 3 - Bacterii (PDF)

2. Structura celulei bacteriene (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) 2. 1. Caracteristici Bacteriile se pot clasifica după mai multe criterii, însă o variantă utilă de clasificare este clasificarea în funcţie de structură şi aspectul peretelui bacterian, bacteriile putând fi: - rigide, cu...

2. Structura celulei bacteriene (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) 2. 1. Caracteristici Bacteriile se pot clasifica după mai multe criterii, însă o variantă utilă de clasificare este clasificarea în funcţie de structură şi aspectul peretelui bacterian, bacteriile putând fi: - rigide, cu perete dens, imobile sau mobile; unele dintre aceste bacterii pot forma micelii (ex. bacterii din genurile Mycobacterium, Actinomyces, Streptomyces, Nocardia); dacă majoritatea bacteriilor studiate sunt cultivabile pe medii artificiale există şi bacterii care pot fi denumite ca paraziţi strict intracelulari (ex. genurile Rickettsia, Chlamydia); - flexibile, cu perete celular subţire (ex. spirochetele, Treponema spp, Leptospira spp.); - lipsite de perete celular (ex. bacteriile din genul Mycoplasma). Celula bacteriană este o celulă procariotă şi are caracteristici structurale diferite în comparaţie cu celula eucariotă (Tabelul nr. 1). Tabelul nr. 1. Caracteristici comparative (celula eucariotă / celula procariotă) Celula eucariotă Celula procariotă Nucleul - prezintă membrană - nu prezintă membrană - are mai mulţi cromozomi - are un singur cromozom, circular - prezintă aparat mitotic - absenţa mitozei - nucleul este tipic, prezintă nucleol - nu este tipic ci apare ca nucleoid Citoplasma prezintă: nu prezintă: - reticul endoplasmic - reticul endoplasmic, - mitocondrii - mitocondrii, - lizozomi - lizozomi - ribozomi 80S prezintă ribozomi 70S - membrana citoplasmatică conţine membrana citoplasmatică nu conţine steroli steroli (excepţie Mycoplasma) Peretele celular - absent sau compus din celuloză sau - are structură complexă, prezentând chitină. glicopeptid, proteine, lipide etc. - nu prezintă glicopeptid Diviziune mitoză diviziune directă (binară) Capsula absentă adesea prezentă 2. 2. Forma şi dimensiunile bacteriilor 2. 2. 1. În funcţie de formă, bacteriile se pot grupa în mai multe categorii şi pot avea: a). formă cocoidală, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat. Majoritarea steptococilor şi stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii sunt lanceolaţi, gonococii şi meningococii pot fi reniformi. Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultură în care se dezvoltă, de vârsta culturii bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum şi de modul în care are loc diviziunea în cursul procesului de creştere şi multiplicare (planul de diviziune). Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele genuri de bacterii, de ex.: - stafilococii sunt coci sferici dispuşi în grămezi („ciorchine”);  - pneumococii sunt coci lanceolaţi dispuşi doi câte doi, eventual înconjuraţi de o capsulă comună (în diplo); - streptococii sunt coci dispuşi în lanţuri etc.; b). formă de bastonaş (bacili, „rods”), drepţi cu capetele uşor rotunjite (enterobacterii), drepţi cu capetele tăiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuţite (Fusobacterium nucleatum), dispuşi uneori într-un mod caracteristic (de exemplu „în palisade”, ca şi scândurile dintr-un gard - bacilii pseudodifterici); c). aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus); d). actinomicete, care în culturi tinere formează filamente lungi, ramificate (asemănător mucegaiurilor); aceste filamente se fragmentează şi rezultă aspecte bacilare (ex. Actinomyces israelli); e). forma spiralată (bacili curbi - V. cholerae, spirili şi spirochete - T. pallidum). Unele bacterii, chiar şi atunci când rezultă prin multiplicarea unei singure celule „mamă” prezintă un pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.). În culturi vechi sau sub influenţa unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu antibiotice etc., pot apărea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care pot crea confuzii de diagnostic pentru examinatorul fără experienţă sau care nu face o examinare ţinând cont de context. Dacă are loc repicarea acestora pe mediu de cultură proaspăt iar examinarea ulterioară se face la timpul potrivit (având în vedere durata optimă de multiplicare) vor rezulta forme „tipice” pentru specia respectivă. 2. 2. 2. Dimensiunile variază în funcţie de gen, specie, condiţiile de mediu, vârsta şi stadiul de dezvoltare al culturii. În general bacteriile au dimensiuni de ordinul micrometrilor, de exemplu, pentru coci 0,5-2 m, iar pentru bacili 0,3-2/0,5-10 m. Dintre bacteriile vizibile la microscopul optic, Francisella tularensis (discutată astăzi în legătură cu posibile atacuri teroriste) poate avea dimensiuni mici, de circa 0,3-0,6 m / 0,2 m. Rickettsiile, chlamydiile şi mycoplasmele nu sunt vizibile la microscopul optic datorită dimensiunilor foarte mici. Flagelii pot atinge dimensiuni de până la 10 m. Formele filamentoase rezultate după tratamentul cu antibiotice pot depăşi această dimensiune. Bacteriile din genul Proteus pot prezenta „în mod natural” forme filamentoase, de dimensiuni mari. Cea mai mare bacterie cunoscută poartă numele de Epulopiscium fishelsoni (60-800 m / 200-500 m) (1993). Datorită dimensiunilor mici, bacteriile pot fi vizualizate numai cu ajutorul microscopului, fie clasic, cu lumina transmisă direct, atunci când utilizând un ocular cu o mărire de 10 şi un obiectiv (de imersie) cu o mărire de 90-100, se realizează o amplificare a dimensiunilor bacteriene de circa 900- 1.000, fie utilizând alte tipuri de microscoape. Spre exemplu, utilizarea preparatelor colorate prin metode în care marcajul se face cu subtanţe fluorescente va creşte puterea de rezoluţie iar numărul de câmpuri investigate poate fi mai redus în comparaţie cu investigarea unui preparat colorat clasic (a se vedea capitolul referitor la genul Mycobacterium).  Iluminarea în câmp obscur permite examinarea preparatelor proaspete şi evidenţierea agentului etiologic al sifilisului (T. pallidum), agentul etiologic al leptospirozei (Leptospira spp.), inclusiv mobilitatea acestora. Informaţii privind preparatele microscopice, executarea şi colorarea frotiurilor, tehnica examenului microscopic în diagnosticul microbiologic sunt prezentate la lucrările practice. 2. 3. Componentele structurale ale celulei bacteriene Atât din punct de vedere structural cât şi funcţional, există o serie de asemănări între celula procariotă şi celula eucariotă. Bacteriile prezintă atât elemente structurale interne cât şi structuri externe care pot şi merită a fi studiate având implicaţii în relaţiile dintre celula bacteriană şi organismul gazdă. Există două tipuri de elemente structurale, unele dintre acestea fiind întâlnite la toate speciile de bacterii (constante), altele fiind întâlnite numai în anumite condiţii şi doar la anumite specii sau tulpini bacteriene (facultative). 2. 3. 1. Structuri constante ale celulei bacteriene Structurile constante ale celulei bacteriene sunt reprezentate de: - perete, - membrană citoplasmatică, - citoplasmă (cu ribozomi şi facultativ cu incluzii, vacuole, plasmide) şi de - nucleu. 2. 3. 1. 1. Peretele bacterian Peretele bacterian înconjoară membrana citoplasmatică. Lipseşte la bacteriile din genul Mycoplasma. Are o grosime de circa 15-30 nm. Bacteriile Gram-pozitive conţin aproximativ 80-90% mureină (peptidoglican, glicopeptid parietal). Mureina este un heteropolimer al cărui schelet este format din lanţuri polizaharidice. Aceste lanţuri sunt formate prin polimerizarea, alternantă, a 2 structuri zaharidice: - acidul N-acetil-muramic (NAM) şi - N-acetil-glucozamina (NAG). Fiecare moleculă de NAM are substituit un tetrapeptid alcătuit din D şi L-aminoacizi. Se consideră că aminoacizii în formă D conferă un grad de protecţie faţă de enzimele proteolitice. Între tetrapeptidele substituite, la lanţurile polizaharidice alăturate, se stabilesc legături peptidice prin gruparea terminală ­COOH a unui tetrapeptid şi grupări terminale libere ale tetrapeptidului vecin. Astfel se formează structuri bidimensionale, destul de complicate, sub forma unor straturi care înconjoară întreaga celulă bacteriană. Bacteriile Gram-pozitive reţin violetul de metil (violet de genţiană în coloraţia „clasică”) şi au culoare violet pe frotiul colorat Gram. La unele bacterii, reţeaua de bază este acoperită de reţele suplimentare cu specificitate antigenică, alcătuite de exemplu din acid teichoic (polimer de ribitol fosfat şi glicerol fosfat), legat de regulă covalent la peptidoglican. În cazul în care structurile fosfat se găsesc în cantităţi limitate sau nu pot fi sintetizate, la nivelul peretelui bacterian putem întâlni acidul teichuronic. Dintre bacteriile Gram-pozitive se pot aminti stafilococul, streptococul, enterococul, bacilul difteric, bacilul listeriozei, actinomicetele, bacilul antraxului, clostridiile etc. În cazul bacteriilor Gram-negative se descrie un perete celular în general mai subţire dar mult mai complex. Peretele este alcătuit dintr-un strat fin de peptidoglican (circa 10-20% din structura peretelui) care este acoperit de o membrană externă. Spaţiul dintre membrana citoplasmatică şi membrana externă (include peptidoglicanul) reprezintă spaţiul periplasmic. Din punct de vedere chimic, membrana externă este alcătuită din fosfolipide, proteine şi cantităţi variabile de lipopolizaharide. Alte proteine importante care se află la acest nivel sunt porinele. Lipopolizaharidul (endotoxina) are în componenţă două structuri esenţiale: lipidul A şi polizaharidul O. Bacteriile Gram-negative se decolorează cu alcool- acetonă şi se recolorează cu fucsină diluată (au culoare roşie la coloraţia Gram). Dintre bacteriile Gram- negative am putea aminti meningococul, gonococul, enterobacteriile, vibrionul holeric, bacilul piocianic, cocobacilii Gram-negativi (ex. Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella abortus) etc. Bacteriile acid-alcool rezistente (de exemplu, mycobacteriile sau nocardiile) conţin o cantitate substanţială de lipide la nivel parietal. Rezistă decolorării cu acid-alcool (au culoare roşie pe fond albastru la coloraţia Ziehl-Neelsen); această coloraţie continuă să reprezinte o etapă esenţială în diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, indiferent de cele mai recente descoperiri privind tehnicile moderne de laborator (inclusiv utilizarea sondelor nucleotidice sau amplificarea genetică). În afară de mycobacterii (în special M. tuberculosis, dar şi numeroase mycobacterii „atipice” (non-tuberculous mycobacteria, NTM), ex. M. avium, M. intracellulare, M. kansasii), există şi alte specii bacteriene care pot apărea colorate asemănător după utilizarea metodei Ziehl-Neelsen, spre exemplu bacilul difteric (C. diphteriae). Rolurile peretelui bacterian: - prin rigiditate asigură forma caracteristică bacteriei (coci, bacili etc); - asigură rezistenţa bacteriei (de exemplu la variaţii ale presiunii osmotice şi la presiuni interioare care pot ajunge până la 20 atm.); - flexibilitatea peretelui celular la unele bacterii (ex. spirochete) poate fi explicată atât prin flexibilitatea membranei cât şi prin grosimea redusă a peptidoglicanului; - are rol antigenic (carbohidratul C la streptococ, antigenul O - polizaharidic, în cazul bacteriilor Gram-negative etc); - prezintă receptori, de exemplu pentru bacteriofagi; - are rol în diviziunea bacteriană participând la formarea septului transversal; - la nivelul lui pot acţiona unele antibiotice (exemplu beta-lactaminele, vancomicina, D-cicloserina); - la bacteriile Gram-negative este asociat cu numeroase enzime (situate în spaţiul periplasmic şi la nivelul membranei externe). Protoplastul (formă rotundă înconjurată de membrana citoplasmatică) reprezintă bacteria Gram- pozitivă după îndepărtarea completă a peretelui, de exemplu sub acţiunea lizozimului care lizează mureina. În medii hipotone protoplastul se lizează. Este o structură care nu se poate multiplica.  Sferoplastul reprezintă bacteria Gram-negativă după degradarea parţială a peretelui (conţine o cantitate mai mică de mureină). Lizozimul poate acţiona asupra peptidoglicanului numai după alterarea membranei externe (ex. după tratare cu EDTA). În medii hipotone sferoplastul se lizează. Spre deosebire de protoplast, se poate multiplica. Anumite bacterii produc autolizine (enzime hidrolitice care degradează peptidoglicanul, spre exemplu glicozidaze, amidaze, peptidaze). Este probabil ca aceste substanţe să aibă un rol în creşterea şi multiplicarea bacteriană. Formele L În 1935 s-a observat prezenţa unor germeni modificaţi structural. Au fost numite forme „L”, după numele Institutului Dr. Lister unde au fost descoperite. Nu sunt microorganisme noi, ci variante ale unor microorganisme cu peretele bacterian modificat. Utilizându-se lizozim sau penicilină ca agenţi inductori s-au putut obţine forme „L” de la majoritatea bacteriilor. Este posibil ca aceste forme „L” să explice, prin prezenţa lor în organism, anumite infecţii cronice (de exemplu infecţii ale aparatului urinar). 2. 3. 1. 2. Membrana citoplasmatică Între perete şi citoplasmă există membrana citoplasmatică având grosimea de 7-10nm; poate reprezenta circa o zecime din greutatea uscată a peretelui bacterian. Electronomicrografic apare formată din 2 straturi întunecoase separate de un strat mai clar. Este considerată un „mozaic fluid”, compusă dintr-un film fosfolipidic în care flotează proteine globulare cu extremităţile polare hidrofile expuse spre spaţiul intracelular, extracelular sau ambele. Aproape 10% din proteinele celulei bacteriene, peste 200 de feluri de proteine, sunt localizate la nivelul membranei citoplasmatice. Fosfolipidele, dispuse în dublu strat, au extremităţile polare, hidrofile, expuse contactului cu apa pe ambele feţe ale membranei şi extremităţile nepolare, hidrofobe, orientate spre stratul mijlociu al membranei. Nu conţine steroli (excepţie Mycoplasma spp). Rolurile membranei citoplasmatice sunt de: - filtru selectiv, datorită permeazelor (rol în permeabilitate şi transport); - barieră osmotică; - a conţine enzime ale metabolismului respirator (de exemplu citocromi); - a fi sediul majorităţii activităţilor enzimatice ale celulei bacteriene (de exemplu intervine activ în procesele de biosinteză); - excreţie a unor enzime hidrolitice; - a interveni activ în procese de biosinteză; - a contribui la formarea septului transversal (rol în diviziunea celulară); - a participa la procesul de chemotaxie prin receptorii de pe suprafaţa sa. Asupra membranei pot acţiona anumite antibiotice (de exemplu polimixinele). 2. 3. 1. 3. Mezozomii Mezozomii sunt structuri care se formează prin invaginarea membranei citoplasmatice de care rămân legaţi. Sunt prezenţi în special la bacteriile Gram-pozitive. Au structura chimică a membranei citoplasmatice şi aceleaşi funcţii în permeabilitate şi respiraţie. Cu un capăt se pot fixa de materialul nuclear, favorizând distribuirea în mod egal a genomului între cele două celule fiice. Au rol şi în formarea septului transversal. 2. 3. 1. 4. Citoplasma La microscopul optic, pe preparatele colorate uzual, observăm numai citoplasma bacteriană, intens bazofilă. Detaliile structurale (nucleoplasmă, ribozomi, incluzii) se pot observa numai cu ajutorul microscopului electronic. Are o structură mai simplă faţă de citoplasma eucariotelor. Este constituită dintr-un sistem coloidal format din proteine, enzime, lipide, pigmenţi, hidraţi de carbon, săruri minerale şi apă. Conţine în mod caracteristic 80% apă, menţine într-un sistem coloidal proteine, carbohidraţi, lipide, săruri etc, conţine o mare cantitate de ARN (ex. ARNm, ARNt). Particulele citoplasmatice studiate sunt: ribozomii, incluziile, vacuolele; în citoplasmă pot exista şi elemente facultative, plasmidele (formate din ADN extracromozomial). La celula tânără citoplasma este intens colorată, omogenă, conţine ARN în cantitate mare, este clară în timp ce la celula „bătrână” citoplasma are aspect granular. 2. 3. 1. 5. Ribozomii: structură, rol Ribozomii au formă aproximativ sferică, pot fi văzuţi la microscopul electronic. Mărimea lor (circa 10-20 nm) depinde de concentraţia ionilor Mg2+ şi K+. Unii ribozomi sunt liberi în citoplasmă, în timp ce alţii apar legaţi de faţa internă a membranei citoplasmatice. Din punct de vedere chimic conţin circa 65% ARNr (ribozomal). Au constanta de sedimentare de 70 unităţi Swedberg dar sunt constituiţi din două subunităţi de câte 30S şi respectiv 50S. În subunitatea mică intră o singură moleculă de ARNr, 16S şi 21 de tipuri de proteine ribozomale. În subunitatea mare intră mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex. ARNr 23S). Între cele două subunităţi se formează canalul prin care trec moleculele de ARNm (mesager) în cursul sintezei proteice. Se apreciază că într-o bacterie cu dimensiuni medii, aflată în faza de creştere activă, se sintetizează circa 500 ribozomi / minut, metabolismul bacterian fiind foarte intens. Ribozomii au rol esenţial în procesul de biosinteză proteică. Au tendinţa de a se grupa în polisomi (poliribozomi) cu eficienţă sporită în biosinteza proteică. În aceste condiţii, la un moment dat pe aceeaşi moleculă de ARNm se află în scopul traducerii mesajului genetic mai mulţi ribozomi, care constituie un ansamblu care poartă numele de polisom. Biosinteza proteică Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor. Cu toate că secvenţa de aminoacizi din structurile proteice este „dictată” de secvenţa de baze azotate din ADN, pentru că nu există afinitate şi posibilitate de cuplare între ADN şi aminoacizi este necesar ca o altă structură să permită poziţionarea aminoacizilor în lanţul viitoarei proteine. Iniţial are loc transcrierea informaţiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta această informaţie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este segmentul de ADN care deţine informaţia genetică pentru sinteza unei proteine. Segmentul de ADN care controlează sinteza unui polipeptid poartă numele de cistron.  ARNm care deţine informaţia genetică pentru sinteza unei singure catene de polipeptid poartă numele de ARNm monocistronic. La bacterii, de obicei, o moleculă de ARNm trebuie să poarte informaţia necesară pentru sinteza mai multor catene diferite şi în acest caz ARNm poartă numele de ARNm policistronic. Această situaţia particulară este datorată dimensiunii mici a acestor procariote precum şi metabolismului intens care are loc în cursul procesului de creştere şi multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenţial 3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se află deţinut de o singură moleculă de ARNm policistronic. De regulă, numai o catenă de ADN este folosită drept matriţă pentru ARNm. Transcrierea mesajului genetic este selectivă (se desfăşoară între promotor şi semnalul de terminare) şi este controlată de ARN polimeraza ADN-dependentă. Pentru traducerea mesajului genetic este necesară intervenţia la nivel ribozomal a moleculelor de ARNt (de transfer). Acestea au o dublă specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de aminoacizi există una sau mai multe molecule de ARNt; în acelaşi timp există enzime specifice fiecărui tip de aminoacid care controlează legarea corectă a aminoacizilor activaţi pe ARNt corespunzător). La nivelul fiecărui ARNt există trei nucleotide (anticodon) complementar codonului care corespunde aminoacidului. ARNt nu are niciodată la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU şi în aceste condiţii ne putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG şi UGA sunt codoni stop. Succesiunea specifică a nucleotidelor este transpusă într-o secvenţă specifică de aminoacizi care intră în constituţia lanţului polipeptidic din proteina în curs de formare. 2. 3. 1. 6. Incluziile Incluziile sunt formaţiuni care apar în citoplasmă la sfârşitul perioadei de creştere activă. Dimensiunea şi forma incluziilor citoplasmatice pot varia în funcţie de condiţiile externe. Pot conţine polimeri anorganici (de exemplu, corpusculii metacromatici ai genului Corynebacterium, la a căror descoperire a avut un rol important Profesorul Victor Babeş), substanţe anorganice simple, polimeri organici (rezervor energetic mai ales la germenii sporulaţi aerobi), lipide, cristale, granulaţii de sulf etc. 2. 3. 1. 7. Vacuolele Vacuolele sunt formaţiuni sferice care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o membrană lipoproteică numită tonoplast. Au fost descrise în mai ales la bacteriile acvatice şi ar putea avea un rol în plutirea acestora. 2. 3. 1. 8. Nucleul Masa nucleară vine în contact direct cu citoplasma. Este localizată în partea centrală a celulei. Conţine ADN, nu are nucleoli. Are afinitate pentru coloranţii bazici, dar pe preparatele colorate uzual este mascat de bazofilia intensă a citoplasmei bogată în ARN. Unicul cromozom bacterian este alcătuit dintr-o singură moleculă de ADN dublu catenar, cu aspectul unui fir lung (1.000-2.000 m), închis într-un inel şi replicat pe el însuşi, superspiralat. Mărimea cromozomului poate să difere în funcţie de specia bacteriană (şi respectiv numărul de perechi de baze); cea mai mică celulă bacteriană ar fi cea de Mycoplasma spp., la care dimensiunea este de 4.700 kpb, în timp ce cromozomul de E. coli poate avea o dimensiune de circa 3 ori mai mare. Având în vedere că dimensiunea bacteriilor este de circa 1-2 m în cazul cocilor şi de câteva ori mai mare în cazul bacililor, pentru ca materialul genetic să poată fi conţinut în acest spaţiu redus, acesta trebuie să fie compactat într-un mod remarcabil şi astfel, rezultă nucleoidul bacterian care poate fi diferenţiat microscopic. Nucleoidul este format din molecula de ADN asociată cu proteine şi o cantitate variabilă de ARN. Relativ recent (1989) s-a descoperit că există şi bacterii care deţin cromozomi lineari (ex. Borrelia burgdorferi). Toate speciile din genul Borrelia deţin şi plasmide lineare. Replicarea cromozomului bacterian se face printr-un mecanism semiconservativ. Aşa cum am menţionat, cromozomul este unic, însă în celula care se dezvoltă rapid există posibilitatea ca înainte ca prima replicare să se fi încheiat să se iniţieze încă o replicare şi în acest caz celula bacteriană va putea fi meroploidă (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori) sau chiar poliploidă (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori). Dacă replicarea cromozomială nu este succedată de diviunea celulei (aşa cum se întâmplă în mod obişnuit), putem remarca în celula bacteriană existenţa mai multor cromozomi. Cromozomii suplimentari (în total 2 sau 4) nu aduc o informaţie genetică diferită pentru că ei sunt copii ale cromozomului iniţial (identici cu acesta). Nucleul deţine informaţia genetică necesară proceselor vitale de creştere şi multiplicare. Codonul Din punct de vedere funcţional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN formează un codon. Codonii deţin informaţia genetică pentru a plasa într-o anumită secvenţă un anumit aminoacid, în lanţul polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul ribozomilor. Cistronul Cistronul reprezintă o subunitate funcţională a genei, capabilă să determine independent sinteza unui lanţ polipeptidic. Gena Gena structurală reprezintă o porţiune a genomului, respectiv o anumită secvenţă de nucleotide dispuse liniar. Genele structurale reprezintă circa 90% din ansamblul informaţiei genetice. Poartă înscrisă în structura sa informaţia genetică necesară pentru sinteza unei proteine specifice, structurale sau funcţionale (enzime). 2. 3. 2. Structuri facultative Structurile facultative ale celulei bacteriene sunt reprezentate de capsulă, cili (flagelii), fimbrii (pili) şi spori (forme de rezistenţă). 2. 3. 2. 1. Capsula: structură, rol, evidenţiere Numeroase bacterii sintetizează polimeri organici (de obicei polizaharide) care formează în jurul celulei o matrice fibroasă, numită glicocalix.  La unele bacterii glicocalixul aderă strâns de celula bacteriană şi reprezintă capsula. Există bacterii care deţin o capsulă bine definită, cu structură polizaharidică (S. pneumoniae, K. pneumoniae, unele tulpini de E. coli etc) sau cu structură polipeptidică (Bacillus anthracis etc). La alte bacterii, glicocalixul formează o reţea laxă de fibrile care se pierde parţial în mediu şi poate fi separată de corpul bacterian prin centrifugare, capsula flexibilă, care nu este vizibilă la microscopul optic. Roluri: - factor de virulenţă, împiedicând fagocitarea bacteriei şi favorizând invazivitatea; - rezistenţă faţă de surfactanţi, anticorpi; - permite aderarea unor bacterii (rol de adezină); - barieră protectoare faţă de bacteriofagi, protozoare; - conţine substanţe cu specificitate antigenică (de specie sau de tip) - antigenul K. Spre exemplu, în cazul S. pneumoniae există peste 90 tipuri antigenice capsulare în timp ce la E. coli sau la Klebsiella pneumoniae există peste 80 tipuri antigenice capsulare. Referitor la modalităţile de evidenţiere ale structurilor capsulare, este de menţionat că prin coloraţia cu albastru de metilen sau tuş de China / India, în jurul bacteriei apare un halou necolorat. Există şi coloraţii speciale pentru capsulă, de exemplu coloraţia Hiss. Structura antigenică a capsulei permite identificarea bacteriilor, spre exemplu prin reacţia de umflare a capsulei (Neufeld) atunci când se folosesc seruri polivalente sau monovalente anti-capsulare pentru identificarea pneumococilor. 2. 3. 2. 2. Flagelii: structură, rol, localizare Cilii sau flagelii conferă mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evidenţiată în preparatul proaspăt (între lamă şi lamelă) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU). Mobilitatea germenilor din genul Proteus este observată pe orice mediu de cultură solid pe care acest microorganism foarte mobil se dezvoltă (fenomenul de „invazie”). Flagelii sunt formaţiuni fine, alungite, flexibile, cu origine la nivelul corpusculului bazal. Acesta este alcătuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri aranjate ca două perechi pe o structură care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este plasat în perete şi membrana citoplasmatică. Din punct de vedere chimic flagelul este de natură proteică (flagelina). Roluri: - în mobilitate (cu o viteză de circa 50 m / secundă); cilul are o mişcare de rotaţie, asemănătoare unei înşurubări în mediu şi ca atare corpul bacterian este împins în direcţia opusă; „motorul” rotaţiei e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obţinută din ATP; - antigenic (datorită structurii proteice - antigenul H, specific de tip); - în clasificarea bacteriilor (prin număr şi distribuţie), bacteriile putând fi - monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa; - lofotriche (cu un mănunchi de flageli dispus la o extremitate);  - peritriche (cu mai mulţi flageli dispuşi de-a lungul suprafeţei bacteriene), de exemplu E. coli, Proteus mirabilis, Salmonella typhi. 2. 3. 2. 3. Fimbriile (pilii) Sunt formaţiuni scurte, fine, nu au rol în mobilitate. De obicei pilii sunt mai subţiri decât cilii. Pot fi foarte numeroase pe suprafaţa majorităţii bacteriilor; pot fi observate numai la microscopul electronic. Există pili comuni, cu următoarele roluri: - în aderenţa bacteriană (adezine); - conţin receptori specifici pentru bacteriofagi; - antigenic (la unele bacterii), ex. N. meningitidis şi N. gonorrhoeae. Există pili „F” (sexuali), determinaţi genetic de factorul de fertilitate F (episom). Aceştia îndeplinesc rolul canalului de conjugare. 2. 3. 2. 4. Sporii: structură, compoziţie chimică, rol, localizare Fenomenul de sporogeneză este mai des întâlnit la Bacillaceae (genurile Clostridium şi Bacillus). Pe sol, în condiţii de uscăciune, la adăpost de lumina solară directă, endosporii persistă zeci şi poate sute de ani. Materialul genetic este concentrat şi, împreună cu apa legată, lipide, Ca++, Mg++, este înconjurat de un strat protector (membrana sporală, cortexul sporal, învelişurile sporale). „Sâmburele” sporal împreună cu membrana citoplasmatică formează protoplastul sporal. Roluri: - formă de rezistenţă şi conservare a speciei (în condiţii favorabile un spor se poate transforma într-o bacterie / forma vegetativă; procesul de formare a sporului ar putea fi considerată una dintre cele mai primitive forme de diferenţiere, dar nu este un proces de reproducere celulară aşa cum se întâmplă la fungi sau paraziţi); - rezistă la căldură, uscăciune, la anumite substanţe chimice şi antibiotice, raze UV etc. Sporul poate fi localizat: - central sau subterminal, mai mic decât celula (ex. la Bacillus anthracis); - central sau subterminal, mai mare decât celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc); - terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de „băţ de chibrit”). Poate fi evidenţiat prin coloraţii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraţia Gram (locul sporului rămâne necolorat). Este sensibil la formol, propiolactonă etc. Este distrus prin autoclavare. 2. 4. Povestiri adevărate 2. 4. 1. Sporii bacterieni; Izbucnire epidemică de infecţii cu Clostridium novyi tip A în rândul utilizatorilor de droguri administrate injectabil, în Scoţia În Scoţia, în perioada aprilie-august a anului 2000, s-a raportat un număr fără precedent de îmbolnăviri în rândul utilizatorilor de droguri pe cale injectabilă. Au fost identificate 60 de cazuri (23 confirmate şi 37 probabile), la subiecţi cu vârsta medie de 30 de ani, dintre care 31 erau de sex feminin (51,66%). Toţi pacienţii erau consumatori de droguri administrate prin injecţie intramuscular şi subcutanat (în acest caz a fost vorba despre un preparat compus din heroină şi acid citric). 20 (87%) dintre cazurile confirmate au evoluat către deces. Din totalul pacienţilor, 15 au prezentat fasciită necrozantă, 22 au dezvoltat edem la locul de injectare, iar 13 au prezentat pleurezie. În 20 (54%) dintre cazurile probabile şi 14 (61%) dintre cele confirmate au existat legături familiale sau sociale între subiecţi. Semnele clinice cel mai des înregistrate au fost: durere şi edem marcat la nivelul locului de injectare; în câteva dintre cazuri, în afară de aceste semne, pacienţii au prezentat insuficienţă multi-organică. O caracteristică a sindromului de afectare multi-organică a fost reprezentată de reacţia leucemoidă, cu leucocitoză la valori foarte ridicate, cu deviere la stânga a formulei leucocitare (numeroase leucocite tinere, nesegmentate). Probe din heroina confiscată (pură şi în combinaţie cu acid citric), probe de sânge şi fragmente tisulare (recoltate antemortem şi postmortem) au fost trimise către laboratoarele de referinţă din Glasgow şi Londra, dar şi către laboratorul Centrului pentru prevenirea şi controlul bolilor (CDC, Atlanta, SUA). Supoziţia iniţială (infirmată prin testele de laborator) a fost cea de contaminare a drogurilor cu spori de Bacillus anthracis. Testele efectuate pe probele recoltate au evidenţiat contaminarea masivă cu spori de Clostridium novyi, tip A, a drogurilor injectabile recuperate (probabil datorită condiţiilor precare de obţinere, stocare şi transport ale acestora). Autorităţile au emis ipoteza că o cantitate mult mai mare de droguri se poate afla în circulaţie şi această situaţie ar putea fi considerată ca o adevărată „bombă biologică” pentru populaţia consumatoare de droguri. Microorganismul cel mai frecvent izolat din probele recoltate de la pacienţi (în condiţii de anaerobioză şi transportate corespunzător, la adăpost de oxigen) a fost Clostridium novyi. Din probele recoltate s-au izolat, de asemenea, Clostridium perfringens şi Clostridium saccharolyticum. În cazul în care autorităţile de sănătate publică nu s-ar fi gândit, în cazul diagnosticului diferenţial, şi la o ipoteză în care germenii anaerobi să fie implicaţi, izbucnirea epidemică ar fi putut să rămână fără diagnostic etiologic. Pe lângă prezenţa sporilor, demonstrată prin tehnici de laborator, a fost utilizată testarea efectului citopatic asupra culturilor monostrat de linii celulare Vero şi astfel s-a demonstrat prezenţa alfa-toxinei produsă de C. novyi, tip A, în probele recoltate. Alfa-toxina este eliberată la nivelul procesului infecţios (locul injectării drogului, unde prin realizarea condiţiilor de anaerobioză, sporii trec în formă vegetativă se multiplică şi bacteriile sintetizează exotoxina), în ţesutul subcutanat, conduce la instalarea unui răspuns inflamator local intens, cu edem marcat. Alfa-toxina are o contribuţie patogenică şi în situaţiile cu evoluţie spre insuficienţă multi-organică, asociat cu hipotensiune arterială, reacţie leucemoidă şi fasciită necrozantă. Condiţiile de anaerobioză sunt atinse deoarece soluţia de heroină tamponată cu acid citric produce necroză tisulară la locul injectării (în cazul în care soluţia ar fi fost injectată intravenos, sporii ar fi fost distruşi de către mecanismele de apărare ale gazdei, la nivel sanguin).  În cazul în care ipoteza unei afectări datorită sporilor proveniţi de la bacterii anaerobe ar fi fost emisă de la început şi dacă nu s-ar fi instituit (la o parte dintre cazuri) antibioterapia empirică cu antibiotice / chimioterapice cu spectru larg anterior recoltării probelor, procentul de infecţii cu etiologie confirmată ar fi putut să fie mai mare. S-au emis mai multe comunicate de presă pentru a pune în temă populaţia şi pentru a alerta comunitatea medicală şi pe eventualii consumatori de droguri. 2. 4. 2. Capsula bacteriană Multe s-au scris despre Neisseria meningitidis, meningococul, răspunzător pentru izbucniri epidemice de meningită, cu urmări îngrijorătoare (decese, sechele). Infecţiile meningococice rămân încă o problemă de sănătate la nivel mondial iar înţelegerea mecanismelor prin care Neisseria meningitidis eludează mecanismele de apărare ale gazdei este foarte importantă. Meningococul determină boala prin invazivitate şi multiplicare, aderând la celulele umane şi invadându-le însă după această etapă procesul rămâne, în mare parte, un mister. Unul din atributele de patogenitate ale meningococului este reprezentat de capsula polizaharidică, cu un rol clar demonstrat în supravieţuirea bacteriană în fluidele extracelulare. Studii recente au arătat că aceeaşi structură contribuie şi la supravieţuirea intracelulară. Sistemul complement este unul dintre factorii de apărare foarte importanţi în protecţia subiecţilor faţă de infecţia cu N. meningitidis; totuşi acest microorganism s-a adaptat şi a dezvoltat mecanisme proprii de protecţie anti-complement. Structurile bacteriene de genul capsulei polizaharidice precum şi cele care „imită” structurile proprii (self) ale gazdei sau leagă molecule proprii organismului salvează germenul de la liză celulară şi fagocitoză. Se pare că Neisseria meningitidis îşi foloseşte eficient proprietăţile, atât extra- cât şi intracelular. Prin inocularea de tulpini capsulate şi necapsulate marcate izotopic în culturi celulare de celule fagocitare şi nefagocitare umane s-a încercat monitorizarea invazivităţii şi multiplicării intracelulare. Rezultatele au fost surprinzătoare deoarece capsula, care diminuează capacitatea de aderare la membrana celulară şi de intrare a germenului în celulă, este esenţială pentru supravieţuirea intracelulară a microorganismului. Un posibil mecanism prin care se produce această supravieţuire ar fi cel al rezistenţei capsulare la peptidele cationice antimicrobiene (CAMPs – cationic antimicrobial peptides), componente ale sistemului imun înnăscut. Degradarea intracelulară a bacteriilor internalizate poate fi legată de o multitudine de mecanisme, printre care acţiunea pH-ului, stresul oxidativ sau acţiunea enzimelor litice şi a peptidelor antimicrobiene. Teoretic prezenţa capsulei ar putea interfera, direct sau indirect, cu oricare din aceste mecanisme. În particular s-a evidenţiat deja medierea rezistenţei pentru Klebsiella pneumoniae la CAMPs de către capsula sa, polizaharidică. În ceea ce priveşte capsula N. meningitidis, studii preliminare au arătat deja că tulpinile necapsulate sunt mai susceptibile acţiunii defensinelor, protegrinelor şi polimixinei B, asemănătoare CAMPs. Polimixina B, un peptid ciclic de origine microbiană, a fost folosită ca model al CAMPs datorită proprietăţilor ei de permeabilizare a membranei externe a germenilor Gram-negativi. Experimental s-a măsurat rata de supravieţuire a meningococilor timp de 45 de minute în diferite concentraţii de polimixină B. Rezultatele au confirmat că absenţa capsulei scade viabilitatea microbiană în prezenţa polimixinei B. Acest model pe culturi celulare susţine ipoteza conform căreia capsula N. meningitidis reprezintă un mecanism major pentru supravieţuirea intracelulară a bacteriei din cursul infecţiei. 2. 4. 3. Importanţa examenului microscopic Examenul bacteriologic direct are o mare importanţă pentru diagnosticul de etapă, dar şi pentru cel definitiv; poate schimba radical indicaţia de tratament precum şi prognosticul pentru respectivul pacient. În cadrul examenului bacteriologic direct, examenul preparatului proaspăt între lamă şi lamelă a rămas „ruda săracă”, fiind mai rar folosit (prea rar); informaţiile obţinute pot fi însă foarte utile. La un pacient seropozitiv stadiul C3, cu diaree trenantă şi severă, examenul citobacteriologic a arătat prezenţa unor formaţiuni rotund ovalare interpretate ca levuri, probabil candidozice. În ciuda tratamentului antifungic pentru levuri diareea a rămas la fel de severă şi starea gravă. La o nouă examinare a materiilor fecale, de data aceasta şi a preparatului proaspăt între lamă şi lamelă, colorat cu albastru de metil, s-au văzut (datorită colorantului) aceleaşi formaţiuni rotunde dar cu capsulă, ridicându-se suspiciunea unei infecţii cu criptococ, care ulterior s-au identificat după culturi şi repicări repetate pe medii specifice. Dar ce este de subliniat este că schimbarea imediată a tratamentului a condus la remiterea simptomatologiei şi îmbunătăţirea stării pacientului.  3. Fiziologia bacteriană (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) 3. 1. Constituţia chimică a bacteriilor 3. 1. 1. Apa: procent, rol Apa reprezintă peste 75-85% din greutatea umedă a bacteriei. Există apă liberă (mediu de dispersie) şi apă legată fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puţină apă, în special apă legată. Bacteriile sunt fiinţe „acvatice” prin excelenţă. Vacuolele sunt formaţiuni sferice care conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o membrană lipoproteică numită tonoplast. Au fost descrise în mai ales la bacteriile acvatice şi ar putea avea un rol în plutirea acestora. Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti faptul că apa reprezintă un mediu de dispersie, este reactiv în reacţiile metabolice, reprezintă etapa finală a unor reacţii oxidative etc. 3. 1. 2. Substanţele minerale Substanţele minerale reprezintă 2-30% din greutatea uscată a bacteriei şi variază în funcţie de specie, vârsta culturii, compoziţia chimică a mediului. Unele elemente intră în compoziţia diferitelor structuri (exemplu sulful intră în structura aminoacizilor, fosforul în structura fosfolipidelor etc). Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti faptul că favorizează schimburile cu mediul, participă la reglarea presiunii osmotice, pot stimula creşterea şi funcţia bacteriei (de exemplu fierul în cazul bacilului difteric, care condiţionează şi producerea de toxine), activează unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului şi a potenţialului de oxido-reducere. Aşa cum am menţionat anterior, la ++ + nivel ribozomal se găsesc Mg şi K. 3. 1. 3. Glucidele În structura bacteriană se pot găsi glucide simple cu rol în metabolismul intermediar glucidic, precum şi glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urmă au o serie de roluri, spre ex. participă la realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor bacterii etc. Există teste biochimice în care se urmăreşte utilizarea sau imposibilitatea utilizării unui anumit zahar de către o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei respective (în special în cazul enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc). Testările biochimice sunt de mare utilitate şi în studiul fungilor (auxanogramă, zimogramă). 3. 1. 4. Proteinele Există proteine simple (cu rol în metabolismul intermediar protidic) şi proteine complexe, cum ar fi: mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul hialuronic din structuri de tip capsular), cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi) sau nucleoproteinele (ex. în acizii nucleici). Este de remarcat prezenţa în structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul diaminopimelic, precum şi a aminoacizilor în forma D (ceea ce reprezintă o adaptare biochimică a bacteriilor faţă de acţiunea nocivă a enzimelor proteolitice). 3. 1. 5. Lipidele  Reprezintă mai puţin de 10% din greutatea uscată a bacteriilor şi variază cantitativ în funcţie de specie, vârsta culturii (cresc în celulele „îmbătrânite”, reprezentând probabil un semn de degenerescenţă) şi compoziţia mediului. La mycobacterii, sunt în cantitate mai mare (circa 20-40%), în special la nivel parietal şi determină o serie de proprietăţi specifice, inclusiv afinitatea tinctorială. Lipidele se pot găsi libere în vacuole, combinate sau făcând parte din diferite structuri ale celulei bacteriene (perete, membrană, mezozomi). Dintre lipidele bacteriene putem aminti: acizii graşi speciali (acidul mycolic la mycobacterii), cerurile (acizi graşi plus alcooli monovalenţi superiori), care se găsesc în cantitate mare la bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. în peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc). Dintre acestea, ceara D pare a fi implicată în inducerea hipersensibilităţii întârziate (de tip IV). Se mai pot enumera: fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema pallidum (agentul etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului bacteriilor Gram-negative, cu activitate toxică. 3. 1. 6. Pigmenţii Pigmentogeneza este caracteristică bacteriilor cromogene şi este dependentă de condiţiile de cultivare. Producerea de pigmenţi poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. în cazul tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa sau în cazul unor specii din genul Staphylococcus). Trebuie să reţinem încă de la început faptul că în cazul stafilococilor, pigmentogeneza este doar un caracter orientativ şi nu vom clasifica drept „patogenă” o tulpină de stafilococ în funcţie de „culoarea” coloniei. Stafilococii sunt condiţionat patogeni. Testul orientativ privind patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui efectuat în mod obligatoriu pentru toate tulpinile izolate de la pacienţi. După localizarea pigmentului, bacteriile pot fi: - cromofore (pigmentul este legat în citoplasmă); - paracromofore (pigmentul este prezent în perete sau în stratul mucos, de exemplu la S. aureus sau la Staphylococcus epidermidis); - cromopare (pigmentul este difuzibil în mediu, de exemplu la Pseudomonas aeruginosa). În afară de faptul că datorită producerii de pigmenţi (albastru, galben-verde, maro etc în cazul Ps. aeruginosa sau auriu, citrin, alb în cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul de laborator se poate orienta în alegerea testelor de identificare într-un anumit context clinic şi microbiologic, putem aminti faptul că pigmenţii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecţie faţă de radiaţiile UV (pigmenţi carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborată de P. aeruginosa faţă de B. anthracis) şi rol enzimatic. 3. 1. 7. Enzimele În cazul bacteriilor se poate aprecia că metabolismul este foarte intens. Capacitatea de a elabora anumite enzime este determinată genetic (există peste 2000 de determinanţi genetici diferiţi), precum şi prin mecanisme de control care pot modifica bagajul enzimatic în funcţie de necesităţi.  După locul de acţiune, enzimele bacteriene se pot împărţi în: enzime extracelulare (exoenzime), de exemplu hidrolazele; enzime ectocelulare (în membrana citoplasmatică, reglând permeabilitatea selectivă), de exemplu permeazele; enzime intracelulare. În raport cu reacţia catalizată, enzimele pot fi: hidrolaze, transferaze, oxidoreductaze, liaze, izomeraze etc. După modul de apariţie, enzimele pot fi: constitutive (există totdeauna în celulă, indiferent de natura mediului); inductibile (sunt sintetizate de către bacterie numai ca răspuns la anumiţi compuşi apăruţi în mediu). Studierea comportamentului enzimatic este foarte utilă în taxonomie. Fiecare unitate taxonomică bacteriană (gen, specie) are un spectru de activitate enzimatică propriu; studierea acestuia poate avea o deosebită importanţă în identificarea bacteriilor. 3. 1. 8. Substanţe cu acţiune antibiotică - plasmidul „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu efect asupra altor bacterii receptive înrudite (de exemplu colicinele elaborate de E. coli); - unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu, B. licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizează gramicidina, iar B. polymyxa sintetizează polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astăzi, din alte genuri, vezi capitolul nr. 48). 3. 1. 9. Vitaminele bacteriene Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate fi secretată de exemplu de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc; tiamina (B1), care poate fi sintetizată de E. coli, riboflavina sintetizată de B. subtilis, vitaminele B2 şi B12 sintetizate de B. megaterium etc. sau vitaminele din grupurile B şi K, care pot fi sintetizate sub influenţa florei bacteriene intestinale umane. 3. 1. 10. Factorii de creştere Factorii de creştere sunt metaboliţii esenţiali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe baza substanţelor care se găsesc în mediul extern. Factorii de creştere trebuie neapărat incluşi în mediul de cultură în cazul în care dorim să izolăm microorganismul respectiv, numit „microorganism pretenţios” (ex. factorii X şi V trebuie incluşi în mediul de izolare pentru Haemophilus influenzae). Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptându-se la viaţa parazitară, devin dependente de o serie de astfel de factori de creştere (unele sunt atât de dependente încât nu pot fi cultivate „in vitro”, de exemplu bacilul leprei - Mycobacterium leprae). 3. 2. Metabolismul bacterian 3. 2. 1. Nutriţia bacteriană Nutriţia bacteriană reprezintă suma proceselor metabolice care conduc la producerea de materiale convertibile în energie şi în diferite componente celulare. Nutrienţii sunt substanţe ale căror soluţii pot traversa membrana citoplasmatică pentru a fi antrenaţi în reacţiile metabolice care asigură creşterea şi multiplicarea celulară.  În raport cu sursa de energie, bacteriile se împart în: - bacterii care folosesc energie luminoasă şi trăiesc la lumină (photobacterii) şi - bacterii care îşi procură energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic şi trăiesc la întuneric (scotobacterii, chimiosintetizante). În raport cu sursele folosite ca material de sinteză în ambele diviziuni se diferenţiază: - bacterii autotrofe, capabile să-şi sintetizeze toţi compuşii organici din materie anorganică şi - bacterii heterotrofe, dependente de prezenţa unor compuşi organici. Nutriţia principalelor bacterii studiate Majoritatea bacteriilor comensale, condiţionat patogene sau patogene importante pentru om, sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se diferenţiază în funcţie de tipul respirator. Există şi bacteriile paratrofe, a căror energie trebuie oferită de gazdă. Bacteriile paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu microorganismele din genurile Rickettsia şi Chlamydia, care depind nutriţional de o gazdă vie). Creşterea microbiană necesită polimerizarea unor substanţe mai simple pentru a forma: proteine, acizi nucleici, polizaharide şi lipide. Aceste substanţe se obţin fie din mediul de cultură, fie sunt sintetizate de către celulele în creştere (sunt necesare diferite coenzime şi legături macroergice de tipul celor din ATP). Substanţele necesare şi coenzimele implicate se pot obţine dintr-un număr relativ redus de precursori metabolici. Dacă o celulă bacteriană primeşte substanţele necesare, va sintetiza diferite macromolecule, iar secvenţa aranjării componentelor în aceste macromolecule este determinată fie după un model ADN- ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidraţi şi lipide. După ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansamblează, formând structuri supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor şi activitatea căilor metabolice sunt foarte bine reglate (există o permanentă balanţă a biosintezei). Microorganismele reprezintă un grup de celule vii care utilizează o mare diversitate de căi metabolice; de exemplu, mai multe căi diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui singur compus simplu, benzoatul, iar o singură cale metabolică pentru benzoat poate fi reglată de mai multe sisteme de control. Principiul determinant pentru căile metabolice este acela al organizării unui număr relativ mic de tipuri de reacţii biochimice, într-o ordine specifică. Multe dintre căile biosintetice se pot deduce având în vedere structura chimică de la care se porneşte, produsul final şi eventual unul sau doi metaboliţi intermediari. Principiul determinant al reglării metabolismului este acela că enzimele par a fi „chemate” în joc numai când activitatea lor este necesară. Activitatea unei enzime poate fi modificată variind fie cantitatea ei, fie cea a substratului pe care acţionează. În unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuată prin cuplarea unor efectori specifici (metaboliţi care modulează activitatea enzimatică).  De multe ori, activitatea unei enzime care catalizează o etapă metabolică iniţială este (poate fi) inhibată de produsul final al căii respective. O astfel de inhibiţie nu poate depinde de competiţia pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiţia depinde de faptul că enzimele reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzimă are atât un situs catalitic de legare cu substratul, cât şi unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite efectori). Legarea unui efector de situsul său duce la o modificare conformaţională a enzimei, astfel încât afinitatea situsului catalitic scade (inhibiţie allosterică) sau creşte (activare allosterică). Când o bacterie peritriche se mişcă, flagelii se asociază şi se mişcă împreună, rezultând o deplasare liniară. La diferite intervale de timp, bacteria îşi schimbă direcţia (flagelii „se dau peste cap”). Acest comportament face posibilă chemotaxia: o celulă care se îndepărtează de sursa atractantului chimic îşi schimbă sensul de mişcare mult mai frecvent în comparaţie cu una care se apropie de atractant şi ca o însumare, bacteria se va deplasa înspre atractant. Spre exemplu, prezenţa unui zahar sau a unui aminoacid este sesizată de receptori specifici localizaţi pe membrana celulară (de multe ori acelaşi receptor participă şi la transportul membranar al acelei substanţe). Celula bacteriană este prea mică pentru a fi capabilă să detecteze existenţa unui gradient chimic (în spaţiu), dar s-a demonstrat experimental că detectează gradienţii în timp (de exemplu, concentraţia unei substanţe scade în timp ce bacteria se îndepărtează de sursă şi creşte în timp ce aceasta se apropie de sursă). Anumiţi compuşi acţionează ca respingători (R), iar alţii ca atractanţi (A). Un mecanism care ar explica răspunsul celulei faţă de R/A ar implica metilarea şi respectiv demetilarea unei proteine specifice din membrană, care depinde de GMPc. Atractanţii produc o inhibiţie tranzitorie a demetilării acestei proteine. Respingătorii stimulează demetilarea. Mecanismul prin care o modificare în comportamentul celular se produce ca răspuns la o modificare de mediu poartă numele de transducţie senzorială. Aceasta pare să fie responsabilă de: chemotaxie; aerotaxie (deplasarea către concentraţia optimă de O2); fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe către lumină); deplasarea spre acceptorul de electroni etc. 3. 2. 2. Respiraţia bacteriană Respiraţia reprezintă suma reacţiilor biochimice aerobe sau anaerobe producătoare de energie. Mecanismul de bază este reprezentat de oxido-reducerea biologică (pierderea ionilor de hidrogen sau a electronilor) de către o substanţă chimică (donor) şi transportul lor pe molecula unei alte substanţe numită acceptor (prima se oxidează, a doua se reduce: AH2 + B A + BH2). În funcţie de natura acceptorului final, respiraţia poate fi: aerobă sau anaerobă. Respiraţia aerobă (oxibiotică) În respiraţia aerobă, acceptorul final de electroni este reprezentat de oxigen. Respiraţia aerobă necesită existenţa membranei celulare. Electronii sunt pasaţi de la un reducător la un oxidant prin membrană cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reducător frecvent utilizat este NADPH-ul. Enzimele catenei respiratorii sunt:  - nicotinice (cu coenzima NAD şi NADP); - flavinice (cu gruparea proteică FMM sau FAD); - ferice (grupul prostetic conţine Fe sub formă de derivaţi ai protohemului, spre exemplu citocromi, citocromoxidază, peroxidază etc). NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (flavin mononucleotid); FAD (flavin adenin dinucleotid). Pentru sinteza ATP-ului se utilizează fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator) cuplată cu partea terminală a lanţului respirator. Respiraţia anaerobă (anoxibiotică) În respiraţia anaerobă acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substanţă anorganică diferită de oxigen sau de orice substanţă organică (fermentaţia); fosforilarea se face la nivelul substratului. Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care se rezultă prin fermentaţia zaharidelor şi reprezintă un caracter fiziologic stabil, foarte important din punct de vedere taxonomic şi biochimic. Etapele fermentaţiei sunt mai reduse, câştigul energetic fiind mai mic. De exemplu în cazul genului Clostridium, prin fermentaţie acetică se obţine 1 mol ATP, iar prin fermentaţie butirică se obţin 0,5 moli ATP. Fermentaţia butirică a fost descoperită de Louis Pasteur în anul 1861 (produsă de Vibrion butyrique, numit ulterior Clostridium butyricum). Rolul biologic al fermentaţiei este reprezentat de producerea energiei şi nu de obţinerea unor produşi finali. Sinteza ATP-ului Sinteza ATP-ului se realizează prin cuplarea reacţiilor de oxidoreducere cu reacţiile de fosforilare. În respiraţia aerobă se utilizează mai ales fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator) cuplată cu partea terminală a lanţului respirator. În respiraţia anaerobă fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii şi acceptorii fiind metaboliţi anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaţia). Energetica respiraţiei bacteriene Prin fosforilarea oxidativă se pot obţine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoză. Prin fosforilarea substratului se pot obţine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoză. Energia este folosită apoi în procese metabolice de asimilaţie. Tipul respirator În raport cu utilizarea proceselor pentru obţinerea energiei şi de relaţia cu oxigenul din mediu, bacteriile se pot grupa în 4 „tipuri respiratorii” principale: - strict aerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvoltă numai în prezenţa unei presiuni crescute a O2, care este folosit ca acceptor final unic. Aceste bacterii posedă catalază, peroxidază, citocromi (de exemplu catalaza desface H2O2 toxic pentru celula bacteriană) şi utilizează numai procese de respiraţie. Unele specii aerobe (exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta în medii lipsite de oxigen, dacă în mediu sunt prezenţi nitratul sau nitritul;  - strict anaerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai în absenţa O2. Nu pot supravieţui în prezenţa O2, care nefiind redus are o acţiune bactericidă. Nu au catalază, peroxidază (care acţionează asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii folosesc pentru obţinerea energiei numai procese de fermentaţie. Pentru cultivarea lor este necesară utilizarea unui mediu cu potenţial redox foarte scăzut. - aerob facultativ anaerob, atunci când bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc) se dezvoltă mai bine în mediile cu oxigen, prin procese de respiraţie, dar pot prezenta ambele tipuri respiratorii, în funcţie de potenţialul redox. Nu au catalază sau citocromoxidază, dar au peroxidaze flavoproteice. În acest tip se încadrează majoritatea bacteriilor studiate. - anaerob microaerofil, atunci când bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolerează mici cantităţi de O2. 3. 3. Căi metabolice Metabolismul glucidic Polizaharidele utilizabile de către bacterii, nu pot pătrunde ca atare în celulă. Ele sunt degradate de 2 categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care scindează unităţile monozaharidice din extremităţile lanţurilor polizaharidice) şi endohidrolaze (care hidrolizează unităţile interne). Polizaharidele existente în celulă ca materiale de rezervă, au o degradare diferită, prin fosforoliză, rezultând hexozo-monofosfaţi. Principalele căi metabolice (de catabolism) sunt: a). calea hexozo-difosfaţilor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care în final pentru 1 mol de glucoză se obţin 1 mol de acid piruvic şi 2 moli ATP; b). calea pentozo-monofosfaţilor; c). calea Entner-Doudoroff (pentru bacterii din grupul Pseudomonas). Metabolismul lipidic Multe bacterii degradează trigliceridele prin lipaze exocelulare în glicerol şi acizi graşi liberi. Activitatea lipazică poate fi cercetată pe medii care conţin glicerol-tributirat. Pentru degradarea lipidelor unele bacterii, de exemplu Clostridium perfrigens, posedă enzime specifice (lecitinaza D, fosfolipaza C). Prin degradarea fosfolipidelor din membrana hematiilor, fosfolipaza C conferă bacteriilor proprietatea de hemoliză. Acizii graşi sunt degradaţi preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii graşi reprezintă surse de energie foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic generează 129 moli de ATP). Bacteriile saprofite au proprietăţi lipolitice intense, participând la biodegradarea grăsimilor şi uleiurilor (mai ales în mediul marin). Metabolismul proteic În lumea bacteriană mai răspândiţi sunt D-aminoacizii. Aceştia pot forma diferite polipeptide cu activitate antibiotică (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de exemplu capsula bacilului anthraxului. Participă de asemenea şi la formarea peretelui celular (de exemplu D-Ala).  Căile de degradare sunt reprezentate mai ales de: a). transaminarea şi dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au căi proprii de catabolism, utile în identificare); b). decarboxilarea aminoacizilor. 3. 4. Căi biosintetice particulare 3. 4. 1. Formarea structurilor precursorilor biosintetici glutamat, aspartat etc. se realizează utilizând inclusiv structuri chimice care în lumea vie sunt utilizate numai de către bacterii, de exemplu acidul diaminopimelic sau acidul dipicolinic. 3. 4. 2. Sinteza peptidoglicanului Sinteza peptidoglicanului se desfăşoară pe parcursul mau multor etape. Începe prin sinteza în citoplasmă a UDP-acid N-acetil muramic-pentapeptid (NAM). Această structură se ataşează de bactoprenol (un lipid din membrana celulară), după care urmează un lanţ de reacţii biochimice. Legarea încrucişată finală se realizează printr-o reacţie de transpeptidare în care terminaţiile amino libere ale pentaglicinei înlocuiesc reziduurile terminale ale D-Ala de la peptidul învecinat. Reacţia este catalizată de transpeptidaze, un set de enzime numite şi PBPs (penicillin binding proteins) care au atât activitate de transpeptidaze şi carboxipeptidaze, dar controlează şi gradul de legare a peptidoglicanului (aspect foarte important în diviziunea celulară). La nivelul lor se pot lega penicilinele şi alte medicamente beta- lactamice. Această cale de biosinteză are o importanţă particulară în medicină, oferind şi baza acţiunii selective a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracină, vancomicină, cicloserină etc). Spre deosebire de celulele gazdei, microorganismele sunt izotone cu fluidele organismului. În interiorul lor presiunea osmotică este foarte mare şi viabilitatea lor depinde de integritatea peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului celular. Orice compus care inhibă o etapă în biosinteza peptidoglicanului la o bacterie în creştere va putea produce liza bacteriană (efect bactericid). 3. 4. 3. Sinteza LPZ Sinteza este asemănătoare cu cea a peptidoglicanului; în ambele situaţii, o serie de subunităţi se asamblează pe un lipid transportor la nivelul membranei şi apoi sunt transferate în „fabrica” polimerului în creştere pentru realizarea peretelui celular. Toate componentele LPZ sunt sintetizate şi ansamblate la nivelul membranei citoplasmatice. 3. 4. 4. Sinteza capsulei extracelulare Capsula se sintetizează enzimatic din subunităţi activate. În sinteza capsulei extracelulare (poate avea structură polizaharidică sau peptidică) nu sunt implicate lipide transportoare de provenienţă membranară. Prezenţa capsulei este adesea determinată de condiţiile de mediu. De exemplu, dextranii se pot sintetiza pornind de la sucroză şi acest lucru se va realiza doar dacă există sucroză în mediu. 3. 4. 5. Sinteza substanţelor de rezervă  Când nutrienţii sunt în exces, bacteria poate converti o parte din ei în granule de rezervă (vacuole), de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutină, care diferă de la o bacterie la alta. 3. 5. Cultivarea bacteriilor 3. 5. 1. Definiţii utile Populaţia reprezintă o multitudine de indivizi ai unei specii care convieţuiesc într-un anumit biotop. Clona este populaţia care rezultă dintr-o singură celulă prin înmulţire vegetativă (diviziune binară). Tulpina reprezintă populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure izolări în cultură pură. Temperatura de dezvoltare În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi: - mezofile, cu temperatura optimă de 30-37ºC; - psichrofile, cu temperatura optimă în jur de 20ºC (unele acceptând temperaturi apropiate de 0ºC; Listeria spp. poate supravieţui sau se poate chiar şi multiplica la temperatura din frigider); - termofile, cu temperatura optimă de 50-60ºC (unele putând să se multiplice şi la temperaturi apropiate de 95ºC, ca de ex. Thermus aquaticus). Nu sunt patogene. Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în marea lor majoritate mezofile. 3. 5. 2. Noţiuni de creştere şi multiplicare bacteriană Creşterea oricărui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creşterea volumului celular raportată la creşterea suprafeţei este mai mare, în cursul creşterii se ajunge la un punct critic. Multiplicarea celulară este o consecinţă a creşterii. Se restabileşte raportul optim dintre volumul şi suprafaţa celulei. Multiplicarea majorităţii bacteriilor se face prin diviziune simplă (binară). Sporii nu reprezintă forme de multiplicare (aşa cum se întâmplă în cazul fungilor sau paraziţilor). 3. 5. 3. Cultivarea bacteriilor Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecţii, trebuie ca din produsul recoltat de la pacient să obţinem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură, pentru ca ulterior să îi putem studia diferitele caractere în vederea identificării. Metodele de cultivare a bacteriilor urmăresc mai multe obiective: obţinerea unei populaţii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaţiile propuse, prevenirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism străin şi izolarea fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în culturi monomicrobiene denumite „culturi pure”. Nu există un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricărei bacterii. Termenul „însămânţare” defineşte operaţia de introducere a unei cantitaţi de germeni într-un mediu de cultură artificială, în timp ce pentru culturile celulare, ouă embrionate şi mai ales animale de experienţă folosim termenul „inoculare”. Cultivarea se realizează prin însămânţarea bacteriilor pe medii de cultură. Mediile solide sau lichide care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene se numesc medii de cultură.  Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă numele de cultură bacteriană. Mediile de cultură Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii şi pe medii artificiale. Există anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot fi cultivate decât pe gazde vii, aşa cum se întâmplă în cazul virusurilor, respectiv: animale de laborator, ouă de găină embrionate sau culturi de celule. Majoritatea bacteriilor, fungii şi unele protozoare se pot cultiva şi pe medii artificiale. Mediile de cultură artificiale trebuie să fie nutritive (să conţină factorii de creştere necesari), să fie sterile, să aibă un anumit pH (de obicei între 7,2-7,6), să aibă o anumită presiune osmotică, să aibă umiditatea favorabilă multiplicării germenilor etc. Clasificarea mediilor de cultură artificiale Aceste medii se pot clasifica după starea de agregare, după natura ingredientelor, după complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale), după scopul urmărit (de transport, de izolare, de identificare etc.), după conţinutul în apă etc. Există medii de cultură simple (agar, apă peptonată, bulion simplu etc) şi medii de cultură mai complexe (agar-sânge, bulion glucozat, agar Muller-Hinton etc). Medii speciale Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite bacterii (de exemplu mediul Lőffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric). Prin conţinutul său în substanţe antimicrobiene, mediul selectiv inhibă dezvoltarea altor bacterii decât cea a cărei izolare se urmăreşte. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii în care includem antibiotice (faţă de care bacteria care se doreşte a fi izolată este rezistentă). Mediul de îmbogăţire favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene, inhibând dezvoltarea florei de asociaţie dintr-un produs patologic. Funcţionează concomitent ca mediu selectiv şi ca mediu electiv (de exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de îmbogăţire utilizate pentru izolarea Salmonella typhi). Mediul diferenţial conţine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate fi sau nu metabolizat, determinând modificarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu, agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care diferenţiază bacteriile lactoză-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoză-negative (Shigella, Salmonella). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză), TSI (3 zaharuri şi fier), MIU (mobilitate indol uree). Colonia izolată Pe medii solide, germenii însămânţaţi în suprafaţă produc colonii.  Colonia este totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clonă bacteriană. Coloniile izolate se pot obţine de exemplu prin tehnica însămânţării prin dispersie (cu ansa bacteriologică sau cu tamponul). După prelevarea cu ansa a unei porţiuni din produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizează ansa; se verifică temperatura, prin atingerea mediului într-o zonă neînsămânţată, cât mai periferic; cu ansa sterilă se trasează a doua latură a poligonului; se resterizează ansa şi se repetă procedeul descris până la realizarea a 4-5 laturi, fără a atinge prima latură. În acest mod, pe ultimele „laturi” ale poligonului se vor putea observa după trecerea timpului necesar multiplicării bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. Incubarea constă în menţinerea mediilor de cultură însămânţate, în condiţiile necesare pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvoltă şi duc la apariţia unei culturi în circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optimă de dezvoltare (asigurată în termostat) pentru că timpul de generaţie este de circa 30 minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaţie de 12-27 ore şi în acest caz cultura devine pozitivă în 2-8 săptămâni. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesară incubarea în anaerobioză (ex. în medii la care s-au adăugat ingrediente cu activitate reducătoare sau în anaerostat); dorim să subliniem că dacă transportul nu se face în condiţii de anaerobioză, nu vom mai obţine nici un rezultat indiferent de mediile utilizate. Dinamica multiplicării bacteriilor în culturi Culturile bacteriene sunt discontinue când se realizează în volum limitat de mediu, care nu este reînnoit şi continue atunci când mediul de cultură este continuu reînnoit. O populaţie bacteriană poate fi menţinută indefinit în faza de multiplicare exponenţială dacă se adaugă continuu mediu de cultură proaspăt, cu omogenizare prin curent de aer steril şi evacuare a unei cantităţi corespunzătoare de cultură (de exemplu în dispozitivul numit chemostat sau turbidostat). Chemostatul utilizează un mediu de cultură în care unul dintre nutrienţi, aflat în concentraţie mai redusă decât ceilalţi, funcţionează ca factor limitant al creşterii. Mediul de cultură proaspăt este admis în vasul de cultură în ritmul în care este consumat factorul limitant, iar cultura este evacuată cu acelaşi ritm. Cultura este menţinută astfel la o valoare constantă şi submaximală ratei de creştere, reglată prin factorul limitant. Chemostatele sunt foarte utile pentru obţinerea de tulpini mutante pentru că după ce rata de multiplicare a fost determinată şansa de selectare a acestor tulpini este mai mare. În laboratorul de microbiologie clinică, de regulă se utilizează culturile discontinue. Timpul de generaţie Populaţia care rezultă prin diviziunea unei bacterii creşte în progresie geometrică cu raţia 2. Timpul necesar pentru dublarea populaţiei se numeşte timp de dublare sau timp de generaţie. Timpul de generaţie în faza exponenţială şi în condiţii optime de cultivare este determinat genetic. De exemplu, pentru E. coli este de circa 20 minute (ca şi pentru majoritatea bacteriilor studiate). Pentru Mycobacterium tuberculosis timpul de generaţie poate avea o valoare între 12-27 ore.  Fazele dezvoltării unei culturi bacteriene Teoretic, dinamica unei populaţii bacteriene ar trebui să evolueze exponenţial. Dinamica reală a populaţiei bacteriene în cultură discontinuă are însă o evoluţie caracterizată printr-o curbă la care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmică; faza staţionară şi faza de declin. Faza de lag Numărul bacteriilor însămânţate rămâne staţionar sau scade; germenii se adaptează la condiţiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, îşi consumă până la dispariţie incluziile, cresc mult în dimensiuni, dar nu se divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag durează aproximativ 2 ore. Faza de multiplicare logaritmică (exponenţială) Celulele bacteriene prezintă caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt însă ceva mai mari), citoplasma este intens bazofilă şi omogenă, lipsită de incluzii. Bacteriile sunt foarte sensibile la antibiotice. Această fază este adecvată pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor în vederea preparării de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenţială durează aproximativ 2-3 ore. Faza staţionară Multiplicarea este realizată în progresie aritmetică, dar pentru că numărul bacteriilor care sunt distruse este aproximativ egal cu numărul bacteriilor nou apărute rata de creştere devine nulă. Germenii au morfologia caracteristică speciei; în această fază realizăm identificarea germenilor. Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene începe formarea sporilor. Faza staţionară durează aproximativ 2-3 zile. Faza de declin Substratul nutritiv sărăceşte, apar metaboliţi toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se produc şi enzime autolitice, rezervele de hrană din incluzii (ex. acidul poli-β-hidroxi butiric sau glicogenul) se consumă, pentru un timp sursa de energie rămâne doar ARN-ul celular. Unele bacterii pot persista 2-3 luni. În acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare şi se exprimă o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru o durată limitată de timp. La speciile sporogene, fenomenul de sporogeneză devine foarte intens. Aspectul culturilor pe medii solide Condiţiile de cultivare şi aspectul culturii sunt caractere cheie în identificarea bacteriilor. Aspectul coloniilor variază între diferitele bacterii, fără a permite diferenţieri definitive de specie (dar au utilitate în contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene şi în contextul general al diagnosticului de laborator, care la rândul său trebuie să aibă loc într-un context în care punem în balanţă şi alte elemente, clinice, paraclinice; colaborarea între medicii de diferite specialităţi este esenţială). Se examinează dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm şi mici, sub 1 mm), conturul (circular, lobat, zimţat), relieful (plat, bombat, acuminat, papilat), suprafaţa (lucioasă, granulară, rugoasă), culoarea (pigmentate, nepigmentate), opacitatea (transparente, opace), consistenţa, aderenţa la mediu, prezenţa sau absenţa hemolizei (pe medii de tipul geloză-sânge).  Colonia S (smooth) are suprafaţă bombată şi netedă, margini circulare şi adesea aspect strălucitor. Germenii păstrează structura antigenică şi nu aglutinează spontan cu soluţie salină fiziologică. Germenii capsulaţi îşi păstrează capsula. Virulenţa este conservată. Majoritatea bacteriilor studiate formează colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli, etc). Colonia R (rough) este plată, suprafaţa ei prezintă rugozităţi, marginile sunt crenelate. Structura antigenică nu este caracteristică. Nu păstrează capsula. Virulenţa nu este conservată (excepţii Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteriae). O bacterie care în mod caracteristic duce la apariţia unei colonii de tip S (ex. o enterobacterie), în cazul în care testele de identificare prin reacţii antigen-anticorp (ex. aglutinare pe lamă, folosind anticorpi cunoscuţi) nu se efectuează la timpul potrivit ci mai târziu, prin „înbătrânire” va suferi anumite modificări, coloniile vor deveni de tip R iar identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai fi posibilă. Colonia M (mucoid) este mare, strălucitoare, mucoasă. Este dată de exemplu de bacteriile care prezintă capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). Coloniile de Streptococcus pneumoniae pot fi şi de tip S şi de tip M. În cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obişnuite nu vom putea obţine colonii izolate (a fost descris fenomenul de „invazie”). Cultura se întinde pe toată suprafaţa plăcii în strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de „invazie” poate fi inhibat prin incorporarea în mediu de acizi sau săruri biliare, tiosulfat de sodiu etc. Aspectul culturilor pe medii lichide Bacteriile şi fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată masa de lichid, tulburându-l. Bacteriile strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafaţa mediului. Ca un aspect particular, în apa peptonată Vibrio cholerae se poate dezvolta şi formează un „văl” la suprafaţa mediului. În acest caz, pH-ul mediului este 9-9,5. Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbură omogen mediul (majoritatea bacteriilor). Variantele R realizează o tulburare mai puţin omogenă. Pot lăsa mediul limpede, formând flocoane care se depun sau un strat (văl) la suprafaţa mediului (de exemplu bacilul difteric sau bacilul tuberculos). Alte informaţii privind mediile de cultură, diferitele tehnici de cultivare, examinarea culturilor bacteriene şi diferitele tehnici de identificare fenotipice utile în diagnosticul microbiologic sunt prezentate la lucrările practice. 3. 6. Povestire adevărată Era prin anul 1928 când Alexander Fleming, investigând caracteristicile stafilococilor, a descoperit în mod accidental penicilina printr-o „eroare de cultivare”. Fleming era deja cunoscut drept un cercetător de excepţie prin activitatea deja desfăşurată, de ex. datorită descoperirii lizozimului (1922); pe de altă parte, omul de ştiinţă demonstra un grad de neglijenţă în activitatea de laborator.  Întors din concediu în septembrie 1928, a găsit câteva dintre plăcile cultivate anterior, contaminate cu un fung din genul Penicillium şi a decis să le arunce într-o soluţie de dezinfectat. Puţin mai târziu, vrând să arate unui coleg câteva dintre rezultatele activităţii sale, a găsit câteva plăci care nu fuseseră încă „dezinfectate” iar de această dată a observat o mică zonă, la contactul dintre cultura fungică şi cultura bacteriană, zonă în care bacteriile nu s-au dezvoltat. Pornind de la această observaţie, Fleming a obţinut un extract din cultura fungică, cu proprietăţi bactericide. Pentru că fungul făcea parte din genul Penicillium a denumit acest extras penicilină. A publicat rezultatele acestei descoperiri în anul 1929. Au mai trecut aproape 16 ani, timp în care s-a reuşit izolarea şi stabilizarea acestui extract, şi în anul 1945 s-a înregistrat producerea antibioticului revoluţionar numit penicilină. Pentru descoperirea sa, Fleming împreună cu biochimistul Ernst Chain şi farmacologul Howard Florey au fost laureaţi cu Premiul Nobel pentru Fiziologie şi Medicină în anul 1945.