Western Blotting - Biotechnologie II - PDF

Biotechnolog ie II Inho ud Deel I: Eiwitten, eiwitsynthese en eiwittechnologie 1 Samenstelling en structuur van eiwitten 2 Eiwitsynthese 3 Analyse van eiwitten 4 Zuivering van eiwitten Deel II: Genregulatie 5 Genregulatie in bacteriën 6 Genregulatie bij eukaryoten 7 Gentechnologie voor...

Biotechnolog ie II Inho ud Deel I: Eiwitten, eiwitsynthese en eiwittechnologie 1 Samenstelling en structuur van eiwitten 2 Eiwitsynthese 3 Analyse van eiwitten 4 Zuivering van eiwitten Deel II: Genregulatie 5 Genregulatie in bacteriën 6 Genregulatie bij eukaryoten 7 Gentechnologie voor het opsporen van functionele domeinen in DNA Biotechnologie 2 II Inho ud 3 Analyse van eiwitten Omgaan met eiwitten 1. Denaturatie van eiwitten 2. Eéndimensionale polyacrylamidege lelektroforese 3. Iso- elektrofocusserin g (IEF) Biotechnologie II 3 Blotting van eiwitten = Western blotting Biotechnologie 4 II Blotting van eiwitten = Western blot Elektroblot ! Semidroge blot Capillaire blot (niet tekening hieronder) Biotechnologie 5 II  Elektroblotting Biotechnologie 6 II Semi-droge blotting Biotechnologie 7 II Geschikte matrices voor transfer  Nitrocellulose  0,22µm  hydrofobe interactie  PVDF-membranen polyvinylfifluoride  hydrofobe interactie  Activeren in methanol !  Nylonmembranen : Positief geladen  Hogere bindingscapaciteit  aspecifieke placque immunodetectie ↗  Problemen voor chemische kleuring (coomassie) Oplossing : niet geladen nylon membraan Biotechnologie 8 II Apparatuu r Afhankelijk van blottingmethode Biotechnologie 9 II  Elektroblotting Biotechnologi 1 e II 0  Elektroblotting Transferbuffer Lage ionsterkte Afh eiwitten, membraan, detectiemethode Biotechnologie 1 II 1  Semi-droge blotting 2 plaat-elektroden Minder buffer nodig Sneller Biotechnologie 1 II 2 Blotting: directionaliteit ! SDS-PAGE: membraan aan anode : -  + Klassieke transferbuffer Product Hoeveelheid SDS-PAGE Glycine 2,9 g Tris 5,8 g SDS 0,37 g Methanol 200 ml Aanlengen Tot 1 liter met dH2O Natieve gels: afhankelijk van pH van de buffer Alkalische buffer -  + Zure buffer +  - Biotechnologie 1 3 II Analyse van Western blots Algemene detectie (kleuring) Ponceau S kleuring Coomassie Zilverkleuring Colloïdaal goud …. Commerciële kits Biotechnologie 1 II 4 Ponceau S kleuring Informatie ? - ……………… - ……………… - ……………… Biotechnologie 1 II 5  Analyse van Western blots Specifieke detectie immunodetectie Vooral op nitrocellulose & PVDF Blokkeren 5% BSA of 5% melkpoeder (1u, KT) Incubatie primair antilichaam (1u, KT, of O/N, 4°C) Wegwassen ongebonden AL (TBST) Labeling via secundair antilichaam met ‘merker’ (1u, KT) Wegwassen ongebonden AL (TBST + finaal TBS) Detectie merker Biotechnologie 1 II 6 Biotechnologi 1 e II 7 SPECIES antilichamen ! Biotechnologie 1 II 8 Wat ontbreekt in dit resultaat ? ………………………………………………. Tip : denk terug aan de controle die nodig was bij RT-PCR Biotechnologie 1 II 9 Biotechnologie 2 II 0 Biotechnologie 2 II 1 Wat kan je detecteren via Western blot met immunodetectie ? Hou steeds in de gaten welke grootte je verwacht tov de merker Biotechnologie 2 II 2 Analyse van Western blots Specifieke detectie Polyclonale antilichamen Monoclonale antilichamen Relatief goedkoop en snel Duur en traagproductieproces productieproces Kan niet-specifieke antilichamen Enkel specifieke antilichamen opleveren Herkent meerdere epitopen Herkent enkel één epitoop voor voor één antigen één antigen Eens hybridoma gemaakt : Lot tot lot variabiliteit constant mogelijk en hernieuwbaar productieproces met robuuste outcome en dus (bijna) geen lot tot lot - variabiliteit Biotechnologie 2 II mogelijk 3 Analyse van Western blots  Specifieke detectie detectie radio-actieve eiwitten: 3H, 14C of 35S immunodetectie radio-immunodetectie (125I) fluorescentie-immunodetectie in situ; cytologische/histologische toepassing FITC LiCoR immuno-enzymassay AP HRP Biotechnologie 2 II 4 Analyse van Western blots Specifieke detectie : LiCoR Voordeel: 2 lagen op 1 blot: multiplex Gevoelig Nadeel Commerciëel buffersysteem Speciaal uitleesapparaat Biotechnologie 2 II 5 Enzym- immunoassay: secundair antilichaam gekoppeld met enzyme AP HRP Chromoge Chromogeen: en: BCIP AEC, DAB + NBT Chemiluminog Chemiluminog een: Luminol een: AMPPD Eventueel en CSPDLAM’s bij luminiscentie  signal/noise ratio verbeteren Gevoeligheden tot 5-10pg!! Biotechnologie 2 II 6  Signal/noise ratio is … … hier … Biotechnologie 2 II 7 AP Chromogeen: BCIP + NBT Biotechnologie 2 II 8 AP Chemiluminogeen: AMPPD Biotechnologie 2 II 9  AP Chemiluminogeen: CSPD Biotechnologie 3 II 0 Biotechnologie 3 II 1 HRP Chromogeen: AEC : 3-amino-9-ethylcarbazol  rood DAB : 3,3'- diaminobenzidine  bruin Biotechnologie 3 II 2 HR P Chemiluminog een: Luminol Biotechnologie 3 II 3 Chemiluminogene detectie X-ray film (fotografie) gevoeliger omslachtig er Saturatie film Automatische luminometers soms iets minder gevoelig, maar wel bredere dynamische range snel onmiddellijk digitaal beeld Biotechnologie 3 II 4 Nog grotere gevoeligheid (1pg!!): Gebiotinyleerd sec. antilichaam- biotin + streptavidin-AP of streptavidin-HRP Immunogoudmethode: sec.antilichaam met colloidaal goud en zilverlactaat Kleinere gevoeligheid Sec.antilichaam kan vervangen worden door prot.A maar gevoeligheid daalt met factor 10 tot 50 ten opzichte van normaal Biotechnologie 3 II 5 Biotechnologie 3 II 6  Enkel voor nitrocellulose Biotechnologie 3 II 7  Molmassamerkers :Voorgekleurde Enkel voor films, film over blot leggen en aanduiden Worden wel geblot, maar zijn niet te zien na detectie Gebiotinyleerde opgespoord met (strept)avidine HRP of anti-biotin HRP Worden geblot, en zijn zichtbaar na detectie Biotechnologie 3 II 8 Stripping blots Mogelijk om antibody lagen van blot te verwijderen, zonder gebonden proteïnes te verwijderen Strippen kan enkel bij chemiluminogene en fluorometrische detectie. NIET bij chromogene detectie Tot 2x strippen mogelijk Biotechnologie 3 II 9  Stripping blots Was membraan 3x met 1xTBST Voeg stripbuffer toe en strip gedurende minimum 30’ bij 60°C hybridisatie oven, 1 uur als niet mogelijk om te schudden Was membraan 4x met 1xTBST Blokkeer het membraan in 5% melk in TBST Vervolgens normaal Westernblot analyse protocol Stripbuffer 100 mM B-Mercapto Ethanol 2% SDS 62,5 mM Tris HCl pH 6,7 Biotechnologie 4 II 0 Biotechnologie 4 II 1 Western blot problemenLuchtbellen Te droog werken bij standaard blotting Biotechnologie 4 II 2 Western blot problemen Achtergrondprobl eem Onvolledig blokkeren Gecontamineerde blokkeeroplossing of wasbuffers Substraatreactie te lang Exposure reactie te lang Te veel antilichaam Antilichaam reactie met blokkeerbuffer (ph-Ab  BSA, niet melk !) Onvoldoende wasstappen Onvoldoende detergent in wasbuffer Biotechnologie 4 II 3 Western blot problemen Grote vlekprobleem Droog membraan Onvoldoende wassen Biotechnologie 4 II 4 Western blot problemenKleine vlekproblemen (spots) Contaminatie van vuile oppervlakken, vingers Biotechnologie 4 II 5 Samenvattin g Biotechnologie 4 II 6 Samenvattin g Biotechnologie 4 II 7 Oefeni ng Wat bedoelt men met "blokkeren van de aspecifieke bindingsplaatsen" op de membraan ? Waarom is dat nodig en hoe doe je dat? Biotechnologie 4 II 8 Oefeni ng 2. Ik heb een immunoblot gedaan van gezuiverd mIL6 en anti-muis IL6, opgewekt in varken, als primair en varken anti-konijn enzymconjugaat als secundair antilichaam gebruikt. Ik krijg geen signaal na detectie. Wat is de oorzaak denk je? Biotechnologie 4 II 9 Oefeni ng 3. Waarom is het nuttig om na blotting eerst een Ponceau S kleuring te doen? Biotechnologie 5 II 0 Oefeni ng 4. Monoklonale antilichamen zijn niet altijd geschikt voor immunoblotting van een SDS- PAGE. Waarom? Biotechnologie 5 II 1 Oefeni ng 5. Wanneer ik een immunoblot doe (na SDS-PAGE) van een bepaald eiwit dat slechts uit één polypeptideketen bestaat blijk ik meerdere bandjes onder de betrokken eiwitband te vinden die eveneens immunodetecteerbaar zijn. Wat zou de oorzaak kunnen zijn? - - - Biotechnologie 5 II 2 Inho ud 3 Analyse van eiwitten Omgaan met eiwitten 1. Denaturatie van eiwitten 2. Eéndimensionale polyacrylamidege lelektroforese 3. Iso- elektrofocusserin g (IEF) Biotechnologie II 5 3