BIOQUÍMICA -gulag-free.pdf

TEMA 0: INTRODUCCIÓ Bioelements primaris (C, H, O, N, P, S). Grups funcionals Carboni: electronegativitat intermèdia. Permet Hidroxil Carbonil Carboxil Amino Fosfat unir-se amb altres elements com S, O, N o més el...

TEMA 0: INTRODUCCIÓ Bioelements primaris (C, H, O, N, P, S). Grups funcionals Carboni: electronegativitat intermèdia. Permet Hidroxil Carbonil Carboxil Amino Fosfat unir-se amb altres elements com S, O, N o més electropositius com H. És la polaritat la que ens permet formar els enllaços d’hidrogen. També explica la Alcohols Cetones Aldehids Àcids Amines Èsters de P cohesió de l’H2O i la capacitat de dissoldre Famílies de substàncies que formen els grups funcionals altres elements. ENLLAÇOS QUÍMICS EN BIOMOLÈCULES Interaccions fortes Interaccions febles Enllaços iònics/salins, ponts d’H, VdW. Enllaços reversibles. Enllaços covalents. Se’n necessiten molts per poder unir molècules grans entre sí. Enllaç curt i fort entre Enllaços iònics Enllaços d’H molècules. Es formen entre dos àtoms, on cadascun ha de tenir una diferència En la reacció química: d’electronegativitat, que comparteixen parcialment un àtom d’H. Enllaços de ruptura i formació Importància en: diferent càrrega: d’aquests enllaços. - Estructura i funció de proteïnes, DNA, polisacàrids interacció Ez S. - Unió de S-Ez i hormones-receptor - Complementació d’ARNm i ARNt. AIGUA COM A DISSOLVENT La major part de les interaccions biològiques tenen lloc a l’aigua (molècula polar i molt cohesiva). El dissolvent de les molècules polars. Degut a que debilita les interaccions electroestàtiques (dipols i iòniques). * Interaccions dipols: interaccions electroestàtiques - Interaccions iòniques: interaccions entre molècules no carregades però polars. electroestàtiques entre espècies carregades permanentment, o entre ió - dipol permanent. EFECTE HIDROFÒBIC: L ’AIGUA PROMOU QUE LES MOLÈCULES HIDROFÒBIQUES S ’AGRUPIN. L’efecte hidrofòbic promou: - Formació de membranes i micel·les. - Associació proteïna-proteïna. - Plegament proteic. - Unió d’hormones esteroides als seus receptors. Lípids: molècules amfipàtiques/AMFIFÍLIQUES. INTERACCIONS DE VER WAALS Les interaccions de VdW són febles, es produeixen entre tots els àtoms i n’hi ha moltes. Es donen degut a les càrregues elèctriques fluctuants entre dos àtoms. Tenen dos components: Força atractiva (dispersió de London), que depèn de la polaritzabilitat. Força repulsiva (repulsió estèrica), que depèn de la grandària dels àtoms. IONITZACIÓ DE L’AIGUA I pH El pH és el que fa canviar les càrregues dels compostos, de manera que l’activitat de les molècules canvia (activitat enzimàtica). 2𝐻2 𝑂 → 𝐻3 𝑂 + + 𝑂𝐻 − 1 CAL TENIR EN COMPTE EL P H PER PREDIR L ’ESTAT DE IONITZACIÓ DELS SOLUTS EN AIGUA. 𝑝𝐻 = −𝑙𝑜𝑔 = log 𝐻+ Àcids i bases (Brönstred-Lowry) Àcid: tendeix a cedir protons. Base: tendeix a acceptar protons. Amb el pKw (P iònic H2O) podem calcular [H+] si coneixem [OH-] i viceversa: VALORACIONS O TITULACIONS. Àcid fort: més tendència a estar dissociat, alta Ka, baixa pKa Àcid feble: poca tendència a estar dissociat, baixa Ka, alta pKa [𝑐𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑡] 𝑝𝐾𝑎 = − log 𝐾𝑎 [𝐴− ] 𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log 𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑎 + log [à𝑐𝑖𝑑] [𝐻𝐴] Q UAN [ÀCID] = [ BASE ] LOG [𝑐𝑜𝑛𝑗𝑢𝑔𝑎𝑡] = LOG 1 = 0 ; PH = P KA P KA ÉS EL PH ON [HA] = [A-] [À𝑐𝑖𝑑] o TAMPONS: mescles d’àcids febles i les seves bases conjugades. Són sistemes aquosos que tendeixen a resistir canvis en el seu pH. Ex (àcid acètic – acetat) El sistema és capaç d’absorbir H+ o OH- a través de la reversibilitat de la dissociació dels reactius de la solució. Com a conseqüència, LA SOLUCIÓ ES RESISTEIX A UN CANVI DE P H quan s’afegeixen petites quantitats d’àcid o base. La CAPACITAT TAMPÓ ÉS MÀXIMA EN LES PROXIMITATS DEL P KA. Segons el pH que es vulgui “tamponar” s’utilitzarà una solució o una altra. Les proteïnes que contenen residus d’histidina (imidazol, aa que posseeix una cadena lateral amb un nitrogen protonat amb pka=6) poden tamponar a pH proper a 7 (comú en cèl·lules i teixits) enviant canvis de pH. Típicament es troba als centres catalítics dels Ez. 1. AMINOÀCIDS Totes les macromolècules es constitueixen a partir d’un número limitat de compostos simples. La seqüència d’aminoàcids d’una proteïna determina la seva estructura tridimensional i en conseqüència la seva funció. Seqüència: ordre determinat. Determinarà la secundària, la terciària i si de cas la quaternària. És l’estructura quaternària la que determinarà la funcionalitat de la proteïna. A l’aminoàcid també se l’anomena residu. Primària Secundària Terciària Quaternària Pèptid Helicoidal, pèptid Tridimensional, polipèptid. Amb més d’una cadena polipeptídica. Els α-aminoàcids són QUIRALS = ASIMÈTRICS. (Tenen un ordenament tetraèdric, degut al carboni-α.) ENANTIOMORF: amb 2 ordenaments diferents a l’espai imatges especulars no superposables. E LS α-AMINOÀCIDS DE LES PROTEÏNES SÓN L. La glicina és l’únic aminoàcid proteic amb C-α no quiral. Les cèl·lules sintetitzen específicament els isòmers L. Grup amino a l’esquerra: L Grup amino a la dreta: D Per a cada reacció hi ha Ez estereoespecífics. CLASSIFICACIÓ DELS AMINOÀCIDS. Segons la cadena lateral (grup R) els aminoàcids varien en: MIDA I FORMA POLARITAT CÀRREGA REACTIVITAT QUÍMICA (més o menys volum) Capacitat de formar ponts d’H Hidrofobicitat L’ ÚNICA CARACTERÍSTICA QUE DIFERENCIA ELS AMINOÀCIDS ÉS LA SEVA CADENA LATERAL. Classificació segons les característiques del seu grup R Hidrofòbics amb Carregats Carregats Polars sense cadenes laterals Aromàtics positivament negativament càrrega apolars: aliafàtiques o bàsics o àcids Alanina (Ala) Glicina (Gly): aquiral Asparagina (Asn) Isoleucina (Ile) Cisteïna (Cys) Fenilalanina (Phe) Arginina (Arg) Àcid aspàrtic (Asp) Leucina (Leu) Glutamina (Gln) Tirosina (Tyr) Histidina (His) Àcid glutàmic (Glu) Metionina (Met) Serina (Ser) Triptòfan (Trp) Lisina (Lys) Prolina (Pro) Treonina (Thr) Valina (Val) APOLARS – HIDROFÒBICS ALANINA Metil (CH3) a la cadena lateral. (ALA) GLICINA No té carboni quiral. La seva cadena lateral és un (GLY) H ISOLEUCINA 3 metils i 1 CH (ILE) LEUCINA 4 metils (LEU)  - Primer aminoàcid de gairebé totes les proteïnes. Té un sofre, que al formar un tioèter és molt METIONINA hidrofòbica. (MET) - La seva conformació afavorirà que interactuïn entre ells, per la seva hidrofobicitat i la seva afinitat (tenen grups iguals i poden associar-se). Únic aminoàcid cíclic. PROLINA Té tres C a la seva cadena lateral i està unida al (PRO) nitrogen de l’amino. Poc flexible: redueix la flexibilitat a les proteïnes, confereix rigidesa. VALINA 3 metils (VAL) POLARS SENSE CÀRREGA La seva cadena lateral no té càrrega, A PH 7. ASPARAGINA Grup carboxamida CONH2 amb un CH2 (ASN) Grup tiol (o silfhidril), SH. Té tendència a oxidar-se, formant un enllaç disulfur: covalent, molt fort. CISTEÏNA Forma un aa dimèric: CISTINA, MOLT HIDRÒFOB. (CYS) Intracatenària: S-S dins la mateixa cadena polipeptídica Intercatenària: S-S entre cadenes proteiques diferents. Ex: insulina GLUTAMINA grup carboxamida CONH2 amb dos CH2. (GLN) SERINA CH2OH (SER) TREONINA C-α unit a H OH CH3 (THR) AROMÀTICS FENILALANINA Cadena lateral 0 polar, molt simètrica. (PHE) El seu OH li permet formar ponts d’H a pH 7 i li TIROSINA confereix polaritat. (TYR) És el més polar. Polar. Els tres aa absorbeixen llum UV. TRIPTÒFAN Les solucions amb aquests aa tenen major (TRP) absorbància. Tirosina>triptòfan>fenilalanina a una longitud d’ona de 270 nm. Grup indol  POLARS, HIDROFÍLICS CARREGATS POSITIVAMENT O BÀSICS Tenen un grup imidazole. Càrrega positiva a pH 7. ARGININA Grup imidazole amb 3 CH2 (ARG) HISTIDINA Grup imidazole en anella. (HIS) A pH 7 el grup imidazole té un pKa = 6 LISINA (LYS) Grup imidazole amb 4 CH2 POLARS, HIDROFÍLICS CARREGATS NEGATIVAMENT, O ÀCIDS Tenen un COO- a la cadena lateral ÀCID ASPÀRTC Prové de l’asparagina (Asn). Un CH2 a la cadena R. (ASP) ÀCID GLUTÀMIC Prové de la glutamina (Gln). Dos CH 2 a la cadena R. (GLU) AA ESSENCIALS AA CONDICIONALMENT ESSENCIALS AA NO ESSENCIALS No són indispensables per a la població en general, No els sintetitzen els Els humans poden però han de ser aportats a poblacions específiques humans sintetitzar-lo que no els poden sintetitzar en quantitats suficients. Ala Glu Arg Gly His Met Trp Asn Ser Cys Pro Ile Phe Val Asp Gln Tyr Lys Thr AMINOÀCIDS PROTEICS POC FREQÜENTS Aminoàcids proteics amb modificacions postraduccionals Al HIDROXILACIÓ col·lagen 4-hidroxiprolina 5- hidroxilisina ACETILACIÓ A les I histones METILACIÓ 3-metilhistidina ε-N-metil-lisina ε-N-acetil-lisina treonina, serina i tirosina, poden fosforilar-se (sustitueixen grup fosfat a l’OH) FOSFORILACIÓ  AMINOÀCIDS NO PROTEICS Biosíntesi d’arginina, CICLE DE LA UREA Derivades de la tirosina. Incorporen el I (iode). Hormones tiroidals importants Tiroxina (T4) Triiodotironina (T3) Àcids i bases (Bronsted -Lowry) Àcid: espècie química que tendeix a cedir H+ Base: espècie química que tendeix a acceptar H+ A bioquímica interessen els àcids i bases febles, els que no estan completament ionitzats: parell àcid-base, conjugats. Equilibri àcid-base. Els aminoàcids poden actuar com a àcids i com a base α-carboxil i α-amino, els que estan enllaçats amb el C-α. A pH neutre, la majoria d’aa són ions dipolars o zwitterions. L’estat de ionització varia amb el pH. CORBES DE TITULACIÓ: són característiques per a cada aminoàcid i prediuen la seva càrrega neta. GLICINA HISTIDINA 3 regions amb capacitat tampó. TAMPONA A PH FISIOLÒGIC pK1: α-carboxil pKr, es desprotona la cadena lateral abans que l’ α-amino. pK2: α-amino 2 regions amb capacitat tampó +2, +1, 0, -1 NO TAMPONA A PH FISIOLÒGIC. Just en el punt d’inflexió pKa=pH pK1: α-carboxil pK2 α-ammino Regió del pK: correspon al punt d’inflexió on l’aminoàcid actua amb ambdós caràcters. Les proteïnes que contenen residus d’histidina (R pKa de 6,0) poden tamponar a pH proper a 7 (pH fisiològic) Sovint es troba en els centres actius dels Ez: l’anell imidazole pot captar o lliurar protons durant les reaccions Ezàtiques  PUNT ISOELÈCTRIC: pH en el que la càrrega elèctrica d’un aminoàcid és 0. GLICINA HISTIDINA Quan R és ionitzable: PI es calcula entre els pKa que donen lloc a Quan R no és ionitzable l’espècie Zwitteriònica (càrrega neta = 0). Examen: saber interpretar taules de pKa, veure quina càrrega tenen segons les taules Els pèptids es formen per la unió d’aminoàcids: condensació, es perd aigua. Enllaç peptídic. El més comú és que s’hidrolitzin. CÀRREGA NETA DELS PÈPTIDS Pèptids cadenes de n residus d’aminoàcids enllaçats covalentment entre el grup α-carboxílic d’un aminoàcid i el grup α-amino de l’aminoàcid contigu. Tots els grups α-carboxílic i α-amino dels aminoàcids estan formant enllaços, a excepció dels grups α-amino i α-carboxílic dels extrems del pèptid. En la CÀRREGA ELÈCTRICA NETA PARTICIPEN únicament aquests EXTREMS del PÈPTID, i els GRUPS IONITZABLES de les CADENES LATERALS dels aminoàcids. ELECTROFORESI D’AMINOÀCIDS I PÈPTIDS L’electroforesi és una tècnica molt utilitzada per a la separació d’aa i pèptids curts en solució. Els aminoàcids se separen en funció de les seves càrregues sota l’acció d’un camp elèctric. Si es troba en el punt isoelèctric, neutre; amb càrrega + va cap al pol -; amb càrrega - va cap al pol +. Relació entre pH i la càrrega de la proteïna Relació entre pH i funció pH > pI, la càrrega de la proteïna: - Enllaços pH Estructura Funció pH < pI, la càrrega de la proteïna: + febles 2. ESTRUCTURA DE LES PROTEÏNES PROTEÏNES: POLÍMERS LINEALS D’ α-AMINOÀCIDS α-carboxil + α-amino → enllaç peptídic – amida S’allibera un H2O FORMACIÓ DE PÈPTIDS: CADENA POLIPETÍDICA Una cadena polipeptídica està formada per: o Un esquelet constant: Cadena principal o backbone o Les cadenes laterals variables, R. L’esquelet polipeptídic té una gran facilitat per formar ponts d’hidrogen, a través de: o Grup Carbonil (C=O) (acceptor de ponts d’hidrogen) o Grup amino (N‐H) (donador de ponts d’hidrogen) UNA CADENA POLIPEPTÍDICA TÉ DIRECCIONALITAT (amino terminal – residu del carbonil terminal) Les cadenes polipeptídiques poden enllaçar-se covalentment entre elles mitjançant ponts disulfur que es formen per oxidació de dos residus de Cys. (intra o inter-catenaris) DIFERENTS MIDES I COMPOSICIONS - La majoria de proteïnes contenen entre 50 i 2.000 AA (MW 1 AA≈110) - El pes molecular de les proteïnes oscilꞏla entre 5.500 i 220.000 g/mol - La massa d’una proteïna s’expressa en Dalton → 1 Da ≈ massa 12C/12 (~ H) Una proteïna amb un PM de 50.000 g/mol té una m de 50.000 Da o 50 kDa NIVELLS ESTRUCTURALS DE LES PROTEÏNES E. PRIMÀRIA E. SECUNDÀRIA E. TERCIÀRIA E. QUATERNÀRIA Conformació local Plegament tridimensional de Disposició espacial de dues o Seqüència d’aa d’una part del pèptid tota una cadena polipeptídica més subunitats polipeptídiques Ponts d’H entre α- Unions no peptídiques entre Enllaç peptídic Unions entre grups R CO i α-NH cadenes pp. ESTRUCTURA PRIMARIA – SEQÜÈNCIA D’AA Enllaços covalents entre aa (enllaços peptídics). Determina: o Estructura 3D de les proteïnes o El mecanisme d’acció → funció biològica → Patologia molecular Cada proteïna té una SEQÜÈNCIA D’AA ÚNICA que donarà lloc a una ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL ÚNICA que determinarà una FUNCIÓ ÚNICA. L’ENLLAÇ PEPTÍDIC - És PLA. 6 àtoms en el mateix pla: Cα, C=O, NH, Cα - Té caràcter de doble enllaç. - No permet la rotació: RIGIDESA. - Sense càrrega. - S’estabilitza per RESSONÀNCIA. - Pot tenir 2 configuracions: TRANS CIS Impediments estèrics: impedeixen que aquesta part de la molècula reaccioni Cα en costats oposats Cα en el mateix costat Més estable (majoria dels Inestable enllaços) Cas especial: Prolina. Impediments estèrics similars en les dues formes. X-Pro, trans o cis Enllaç peptídic vs. Enllaços del C α Amb rigidesa de doble enllaç, Enllaços senzills, permet rotacions sense rotació ELS ENLLAÇOS DEL Cα DELS AA SÓN SENZILLS I PURS. Els enllaços del C-α amb els grups amino i carbonil poden rotar-hi al voltant. La llibertat de rotació permet els diferents plegaments de les proteïnes. ESTRUCTURA SECUNDÀRIA Conformació local d’algunes parts de la cadena polipeptídica fruit de disposicions estables que, generalment, formen Periòdiques No periòdiques estructures regulars repetitives. Hèlix α (α-hèlix) Girs ß (ß turns) (girs de 180º) Full plegat ß (ß sheet) Llaços o bucles Ω MODELS PER REPRESENTAR ESTRUCTURES DE PROTEÏNES Cartoon model (ribbon)) Stick model Main chain model Surface model L’HÈLIX α - Estructura en espiral en la que la cadena principal està a l'interior, formant l’esquelet, i les cadenes laterals dels residus estan projectades cap l'exterior de l'hèlix. - Cada volta de l’hèlix allotja 3.6 residus. - L’estructura helicoidal es manté estabilitzada per PONTS DE H INTRACATENARIS entre els grups NH i els CO que estan distanciats 4 residus a la seqüència aminoacídica. (n + 4) - Així, aa que a la seqüència es troben a un distància de 3-4 posicions, a l’espai estan molt a prop l’un de l’altre. Les hèlix α d’una proteïna se solen representar amb espirals o amb cilindres Estabilitat de l’hèlix α ESTABILITZEN DESESTABILITZEN Ponts d’H entre grups R Residus Prolina o Glicina: Prolina: N forma part d’un anell Interaccions iòniques rígid (no rotació N-Cα) Glicina: sense impediments estèrics entre grups R No àtom H en N (no formació de (més flexibilitat conformacional) ponts d’hidrogen) Forces hidrofòbiques Grups R ramificats en el carboni ß (Val, Thr, Ile), per impediments entre grups aromàtics estèrics Grups R amb grups formadors de ponts d’H a prop de la cadena principal que poden competir amb CO i NH de la cadena principal (Ser, Asn, Asp) Forces de repulsió entre grups R carregats -Residus Glu consecutius: -Residus Lys i Arg: càrregues + càrregues - E L CONTINGUT D ’ HÈLIX Α DE LES PROTEÏNES OSCIL · LA EN UN RANG MOLT AMPLE FERRITINA: emmagatzematge de Fe. 75% dels R es troben forma d’hèlix α. MIOGLOBINA: emmagatzematge d’O. 78% dels R es troben en forma d’hèlix α. FULL PLEGAT ß O FULL ß - Estructura formada per dues o més regions d’una mateixa cadena polipeptídica o de diferents cadenes polipeptídiques (anomenades cadenes ß). - L’esquelet de la cadena ß es troba estès en zigzag. - La distància entre dos aa successius al llarg de la cadena ß és més gran que en l’hèlix α. -Les CADENES LATERALS D’ AA SUCCESSIUS S’ ORIENTEN EN SENTITS OPOSATS DE FORMA ALTERNADA , per sobre i per sota del pla que conté la cadena. Es forma quan vàries cadenes ß es disposen en un mateix pla i s’uneixen entre elles a través de ponts d’H intercatenaris. Els ponts d’H entre els grups NH i CO connecten aa de les cadenes principals adjacents, de manera que l’estructura s’estabilitza. Els grups R són projectats perpendicularment al pla de la fulla de manera alternada en sentits oposats. La seva disposició pot ser: Antiparal·lela Paralꞏlela Mixta L’orientació amino-terminal a carboxi- Les cadenes principals adjacents Hi ha fulls ß (formats terminal de cadenes principals s’orienten en el mateix sentit. normalment per 4 o 5 adjacents és oposat. Els ponts d’H Els ponts d’H connecten cada aa cadenes - poden ser ≥ entre els grups NH i CO connecten d’una cadena amb dos aa diferents de 10 -) totalment cada aa amb un aa de la cadena la cadena adjacent separats per un paral·lels/ antiparal·lels adjacent. residu. o mixtes. Representacions esquemàtiques del full ß Poden ser gairebé plans, però la majoria adopten una forma més o menys torçada. Model esquemàtic girat 90º, per mostrar més Model esquemàtic Proteïna d’unió a àcids grassos clarament les torsions GIRS ß I LLAÇOS Ω Les cadenes polipeptídiques poden canviar de direcció mitjançant girs i llaços, permetent que adoptin formes tridimensionals globulars. A diferència del full ß i l’α-hèlix, són aperiòdics. Gir ß (ß turn o gir invertit). Gir de 180º (4 residus implicats). El grup CO del residu i d’una cadena polipeptídica s’uneix mitjançant un pont d’H al grup NH del residu i+3 per estabilitzar el gir. Sovint participen: - Gly (i+2): Petit i flexible - Pro (i+1): Per poder adoptar la configuració cis, particularment adequada per un gir tancat Llaços o bucles Ω (Ω turns) (Ω per suggerir la forma) A diferència de les hèlix α i els fulls ß els llaços no presenten estructures periòdiques regulars. Domini variable d’un anticòs: llaços a la superfície que permet interaccions amb altres molècules. Els girs i els llaços es troben a la superfície de les proteïnes: sovint participen en les interaccions entre proteïnes i altres molècules. ESTRUCTURES SUPERSECUNDÀRIES “motius estructurals” o “plegaments” Són AGRUPACIONS D ’ESTRUCTURA SECUNDÀRIA : Combinacions molt estables d’elements d’estructura secundària. DOMINIS - Unitats estructurals i funcionals. - Regions d’una cadena polipeptídica que són estables de manera independent, amb FUNCIÓ DETERMINADA. Podrien ser funcionals si es transferissin a una altra proteïna. - Varien en grandària des d’uns 30 fins a 400 residus d’aa.  Receptor nuclear: cada domini té una funció concreta Zones compactes de les proteïnes amb entitat estructural pròpia connectades per segments flexibles de la cadena polipeptídica. Estructura terciària - Aminoàcids allunyats en la seqüència lineal de la proteïna o continguts en diferents estructures secundàries poden interaccionar en l’estructura plegada. - Plegament, o disposició tridimensional, de la cadena polipeptídica a l’espai. - I NTERACCIONS FEBLES ENTRE CADENES LATERALS (enllaços iònics, forces hidrofòbiques, VdW, ponts d’H). - De vegades, mitjançant enllaços covalents (ponts disulfur). MIOGLOBINA (1 cadena de 153 aa) Proteïna soluble en aigua plegada en estructures compactes amb nucli apolar. Estructura quaternària - Disposició espacial d’una proteïna 2 ≥ subunitats polipeptídiques i la naturalesa de les seves interaccions. - Hi ha proteïnes que en el seu estat funcional estan formades per més d’una cadena polipeptídica (cadascuna d’elles s’anomena SUBUNITAT). Proteïnes fibroses Proteïnes globulars Cadenes Plegades en formes compactes globulars Disposades en filaments llargs polipeptídiques o esfèriques Tipus Normalment varis tipus d’estructura Majoritàriament 2ària. 3ària simple d’estructura secundària. Terciària més complexa Solubles o insolubles, amb disposició Normalment insoluble en H2O (aa Solubilitat espacial de residus segons el seu entorn hudròfobs a linterior i la superfície) i funció Estructural (suport, forma i protecció Ez i proteïnes reguladores. Diversitat Funció externa a cèl·lules i teixits) estructural i funcional PROTEÏNES FIBROSES Estructures de protecció Α-hèlix, unides per Αqueratina Insolubles, de duresa i flexibilitat variables Enllaços disulfur Col·lagen Alta resistència a la tracció, sense estirament Triple hèlix del colꞏlagen α-QUERATINA o Component principal de llana, pèl, ungles, plomes, banyes... (vertebrats) o Consta de dues hèlix α enrotllades entre si formant una superhèlix anomenada SUPERHÈLIX α. (encreuament individual contrari al que formen) - Encreuades per INTERACCIONS FEBLES (VdW i iòniques) (flexibilitat) - Unides per PONTS DISULFUR covalents entre residus de Cys propers (duresa – resistència) α-queratina: cabell ondulat 1. Agent reductor en calent (reducció d’enllaços disulfur i la calor trenca els ponts d’H/desestructuració hèlix α) 2. Agent oxidant (nous enllaços disulfurs diferents) – en fred (ponts d’H: reestructuració d’hèlix α): cabell ondulat Estructura del cabell: dues hèlix α en paralꞏlel (aminos al mateix costat) s’enrotllen en sentit L per formar filaments d’α- queratina, que formen estructures d’ordre superior (protofilaments i protofibrilꞏles) COL·LAGEN Principal component fibrós de pell, genives, dents, tendons, cartílags i ossos. Proteïna més abundant en mamífers. És extracel·lular. Estructura particular: triple hèlix del col·lagen -TRES cadenes polipeptídiques HELICOIDALS (α), cadascuna ≈ 1.000 residus de llargària, s’enrotllen l’una al voltant de l’altra i formen un CABLE SUPERHELICOIDAL, que s’estabilitza per PONTS D’H ENTRE LES CADENES. -L’interior del cable és molt compacte, i presenta una alta resistència. L’hèlix de colꞏlagen és diferent de l’hèlix α: - Hèlix amb 3 residus d’aa PER VOLTA (Gly – X – Y) - La GLICINA APAREIX en la seqüència d’aa CADA TRES RESIDUS , molt sovint la seqüència G LY -PRO-4-H YP 35% Gly 21% Pro – 4-Hyp (permeten el gir) 11 % Ala - Els OH de la Hyp participen en la formació de ponts d’H intercatenaris, i la seva absència provoca escorbut. - Interior molt compacte, explica la necessitat de Gly cada tres residus (aporta torsió) - N O HI HA PONTS D’ H DINS D’ UNA CADENA : l’hèlix s’estabilitza per repulsions estèriques entre els anells de Pro i Hyp (anells allunyats en adoptar-se la forma helicoidal). Col·lagen – Alimentació Escorbut: Degeneració del teixit conjuntiu. PROTEÏNES GLOBULARS - Molta diversitat estructural i funcional - Estructuralment complexes: plegament de diferents fragments uns sobre altres. - Estructura 3ària s’estabilitza per interaccions entres cadenes laterals d’aa que ocupen posicions allunyades en la seqüència lineal. - Compactes. MIOGLOBINA - Proteïna soluble en aigua plegada en estructures compactes amb nucli apolar. -70% estructura hèlix α. Distribució d’aa: - Aa hidrofòbics en l’interior. - Estructura molt compacta amb pocs espais buits - Molts aa polars a l’exterior. - Estabilitat per interaccions hidrofòbiques. En entorn aquós el plegament de les proteïnes ve marcat per la tendència dels aa hidrofòbics a ser exclosos de l’aigua. Les cadenes laterals hidrofòbiques queden amagades. Cas d’excepció: PORINES Proteïnes capgirades/invertides que travessen, típicament, les membranes. Distribució d’aa: - Aa polars a l’interior carregats envoltant un canal aquós. - Aa hidrofòbics a l’exterior per interaccionar amb membranes DESNATURALITZACIÓ DE PROTEÏNES Es desfà l’estructura tridimensional, no trenquen enllaços peptídics (no hi ha proteòlisi). La conformació NATIVA és L’ACTIVA, és ÚNICA i la MÉS ESTABLE termodinàmicament. Agents desnaturalitzants: - Calor: afecta interaccions dèbils (proteïnes termoestables). - Canvi de pH: canvi de càrregues en R. -Desnaturalitzants químics: o Alcohol – acetona. o Urea - Clorur de guanidini: trenquen enllaços no covalents d‘una proteïna. o β-mercaptoetanol: (reductor) trenca reversiblement els ponts disulfur. Dos carbonis i un tiol (S-H) o mercapto. Les dues molècules s’oxiden i redueixen els ponts disulfur de dues cisteïnes (una cistina). La seqüència d‘aa determina la conformació Desnaturalització Renaturalització Pèrdua de la funció Recuperació de la funció Adopta una conformació a l’atzar Adopta la seva estructura 3D nativa LA INFORMACIÓ NECESSÀRIA PER ESPECIFICAR L ’ESTRUCTURA 3ÀRIA ACTIVA RESIDEIX A LA SEVA SEQÜÈNCIA D’ AA Desnaturalització: Pèrdua d’estructura 3D suficient per originar una pèrdua de funció. Transició de la forma plegada a la desplegada: Procés cooperatiu. PLEGAMENT DE PROTEÏNES El plegament/desplegament de proteïnes és un procés ràpid i cooperatiu. La pèrdua d’interaccions en una zona de la proteïna probablement desestabilitza la resta de l’estructura: TRANSICIÓ COOPERATIVA. Tot i això, han d’existir estructures intermediàries transitòries i inestables entre l’estat natiu i el desnaturalitzat. El plegament de proteïnes no és a l’atzar Les proteïnes es pleguen per una ESTABILITZACIÓ PROGRESSIVA D’ INTERMEDIARIS més que no pas per atzar. El plegament de les proteïnes té TENDÈNCIA A RETENIR ELS INTERMEDIARIS PARCIALMENT CORRECTES perquè són lleugerament més estables que les regions desplegades. La predicció d’estructures 3D de proteïnes és encara un gran desafiament “Les prediccions de l’estructura secundària que adopten fragments de 6 o menys residus tenen al voltant d’un 60% de fiabilitat.” Seqüències de penta- i hexapèptids adopten una estructura en una proteïna i, en canvi, en una altra proteïna n’adopten una completament diferent. PROTEÏNES QUE AJUDEN AL PLEGAMENT D’ALTRES PROTEÏNES Xaperones moleculars Proteïnes que faciliten rutes de plegament correctes o aporten microentorns on pugui donar-se el plegament o Xaperonines: complexes proteics o Hsp70 : eviten agregacions inapropiades per unió a regions hidrofòbiques (abundants en cèlꞏlules sotmeses a temperatures elevades) ALTERACIONS EN EL PLEGAMENT: PATOLOGIES Fibrosi quística Generalment causada per una mutació genètica de la proteïna CFTR* (Regulador de la Conductància Transmembrana de la Fibrosi Cística) que causa la deleció d’un residu Phe i provoca el plegament incorrecte de la proteïna, que acabarà degradant-se. (*CFTR funciona com canal de pas pels ions clorur) Amiloïdosis: malalties en què una proteïna soluble (globular) adopta un estat mal plegat i desenvolupa fibres amiloides insolubles intra- o extracelꞏlulars. Tenen tendència a l’agregació. Les fibres amiloides estan molt ordenades en estructures tipus full ß. Les cadenes ß estan orientades perpendicularment a l’eix de la fibra, i en ocasions es formen fulls ß de dues capes. o LOCALITZADES que provoquen NEURODEGENERACIÓ: ▪ Alzheimer. Associació supramulecular de fulls ▪ Parkinson, ß-sinucleïna: cossos de Lewy ß, pèptid ß-amiloide → plaques amiloides). ▪ Encefalopaties espongiformes transmissibles, ▪ Huntington, huntingtina prió. o SISTÈMIQUES SECUNDÀRIES, associades a ARTRITIS REUMATOIDE, proteïna amiloide A sèrica (SAA). ALTERACIONS EN EL PLEGAMENT: MALALTIES PRIÒNIQUES Malalties degeneratives rares en el cervell de mamífers causades pel PLEGAMENT INCORRECTE de la proteïna prió que genera agregats. Es coneixen com ENCEFALOPATIES ESPONGIFORMES, perquè el cervell està ple de forats. En humans En animals Kuru i malaltia Bestiar boví: BSE (encefalopatia espongiforme bovina, o malaltia de les vaques boges) de Creutzfeld- En ovelles i cabres: scrapie, tremolor Jakob En cérvols i ants (alces) malaltia d’afebliment crònic  Prió (PrP): proteïna de funció desconeguda que es troba normalment al cervell. Té grans regions en hèlix α i poca estructura β. PrPSc: forma de la proteïna present al cervells afectats que té una estructura tridimensional diferent, on algunes hèlix α s’han convertit en cadenes β. Les UNIONS INTERMOLECULARS FORMEN FULLS ß I GENEREN AGREGATS , que maten a les neurones i per això es fan forats (“espongiforme”). Efecte dominó, es generen agregats molt grans. La interacció PrPSc-PrP converteix PrP en PrPSc. transmissió iatrogènica: provocat per alguna intervenció mèdica. SEMINARI: TÈCNIQUES EN LA INVESTIGACIÓ DE PROTEÏNES PURIFICACIÓ DE PROTEÏNES OBJECTIU: obtenir la proteïna aïllada a partir d’una barreja de proteïnes (ex. teixit, cultiu cel·lular) La purificació d’una proteïna és necessària per estudis posteriors sobre la seva estructura i funció. Cal purificar-la, separar-la d’altres components cel·lulars en base a: Solubilitat Propietats d’interacció amb altres molècules Mida (afinitat per un lligand) Càrrega iònica ESTRATÈGIA GENERAL PER LA PURIFICACIÓ DE PROTEÏNES EXTRACCIÓ PER OBTENIR L’HOMOGENAT ELECCIÓ de la font de proteïna Cal obtenir l’homogenat mitjançant el trencament de les (teixit, cultiu, organisme, quantitat) membranes cel·lulars. Homogenat: mescla de tots els components de la cèl·lula en absència de cèl·lules intactes (cèl·lules lisades). EXTRACCIÓ per obtenir l’homogenat Escollirem el MÈTODE segons l’origen del teixit: Cèlꞏlules animals: disrupció mecànica i/o LISI OSMÒTICA: CENTRIFUGACIÓ per obtenir fracció ús d’un buffer de baixa concentració salina/aigua. subcelꞏlular o extracte cru Cèlꞏlules amb paret: disrupció mecànica o per ULTRASONS Escollirem el TAMPÓ D’EXTRACCIÓ (buffer) segons Concentració de l’extracte cru (PRECIPITACIÓ per sal) l’estabilitat de la proteïna: pH, temperatura Inhibidors de proteases PURIFICACIÓ SELECTIVA de la proteïna (precipitació selectiva, diàlisi i cromatografia) Detergents per les proteïnes de membrana CENTRIFUGACIÓ: OBTENCIÓ DE L’EXTRACTE CRU DE LA FRACCIÓ ENRIQUIDA VALORACIÓ de la purificació Hem de tenir en compte la localització subcelꞏlular de la (colorimetria, assaig d’activitat, electroforesi) proteïna d’interès. Podem aïllar l’orgànul per CENTRIFUGACIÓ DIFERENCIAL: segons la densitat que té, cada orgànul sedimenta amb una força de gravetat diferent. Si la proteïna és citoplasmàtica, eliminarem restes cel·lulars i orgànuls. Al precipitat i al sobrenedant se’ls denomina FRACCIONS perquè estem fraccionant l’homogenat. Extracte cru: fracció que s’utilitza com a punt de partida per la seva posterior purificació.  1. Baixa V i poc temps; nucli precipita. 2. Realitzar un assaig per determinar l’activitat (que es realitzi la funció) de la proteïna per determinar si la proteïna d’interès es troba al sobrenedant o el pellet. 3. Augmentem V i T per obtenir un nou homogenat amb un precipitat de menor mida (fracció mitocondrial). 4. Si conservem el sobrenedant, Centrifugar a més V i més temps (fracció microsomal). ULTRACENTRIFUGACIÓ: capaç de separar complexos moleculars més petits que els orgànuls. La velocitat de desplaçament depèn de: - Massa - Densitat - Forma Concentració de l’extracte: PRECIPITACIÓ PER SAL - Concentració amb precipitació per sal: normalment amb SULFAT D’AMONI La solubilitat de les proteïnes disminueix si afegim sals. Les proteïnes precipitades es recuperen per centrifugació i se solubilitzen de nou en solucions tamponades. *També es poden precipitar proteïnes amb canvis de pH o de temperatura o amb solvents orgànics (etanol, acetona,...) La representació gràfica és característica per a cada proteïna i mostra com varia la solubilitat d’aquesta en funció de la concentració de sal a la que es troba. PURIFICACIÓ DE LA PROTEÏNA PRECIPITACIÓ SALINA DIÀLISI CROMATOGRAFIA Podem fer una precipitació selectiva: Líquida Cada proteïna a una [sals] diferent De gel D’intercanvi D’afinitat d’alta - Sulfat amònic 0,8 M precipita el fibrinogen filtració iònic pressió - Sulfat amònic 2,4 M precipita l’albúmina sèrica DIÀLISI “dessalació” Separació de molècules petites (sals) de molècules grans (proteïna) a través d’una membrana semipermeable amb porus (ex: celꞏlulosa). No discrimina entre proteïnes. Les molècules proteiques queden retingudes en l’interior de la bossa de diàlisi mentre que les molècules petites difonen cap al medi. CROMATOGRAFIA Conjunt de tècniques basades en la retenció selectiva per separar els components d’una barreja. La FASE MÒBIL (fluida) es fa passar a través d’una FASE ESTACIONÀRIA (matriu sòlida). La mostra interacciona amb la fase estacionària de manera que els diferents components es van separant. Segons el tipus d’interacció que la mostra estableix amb la fase estacionària podem definir: DE GEL FILTRACIÓ BESCANVI IÒNIC D’AFINITAT DE LÍQUIDS D’ALTA RESOLUCIÓ Exclusió per mida Càrrega Unió a lligands HPLC-UHPLC CROMATOGRAFIA DE GEL FILTRACIÓ: EXCLUSIÓ PER MIDA FASE ESTACIONÀRIA: Matriu de boletes poroses fetes d’un polímer INSOLUBLE ALTAMENT HIDRATAT i esponjós (agarosa, dextrà o poliacrilamida). Molècules petites entren en els espais Molècules grans no poden entrar pels porus del polímer, interiors del polímer i es retarden més segueixen una trajectòria més curta, i per tant surten abans CROMATOGRAFIA DE BESCANVI IÒNIC: EN BASE A LA CÀRREGA Posteriorment: La proteïna unida a la columna pot eluir-se augmentant la concentració de sals de la fase mòbil. (ex: Na+ competirien per unir-se a matrius amb càrregues negatives, desplaçant la proteïna positiva). Las proteïnes carregades positivament s’uneixen a les boles carregades negativament. Les proteïnes carregades negativament flueixen a través de la columna. Aquesta tècnica separa proteïnes fonamentalment en funció de la seva càrrega neta. Matriu sòlida: boletes amb càrrega CROMATOGRAFIA D’AFINITAT: AFINITAT PER GRUPS QUÍMICS Separació molt eficient en funció de les interaccions específiques que la proteïna d'interès estableix amb un lligand concret unit a la matriu sòlida. L'ELUCIÓ s’aconsegueix en afegir lligand lliure a la fase mòbil que arrossega la proteïna unida. La purificació és més efectiva quan més específica és la unió proteïna-lligand. Tipus d’interacció proteïna-lligand Proteïna - Grup químic específic Ez -S Receptor - Lligand Antigen - Anticossos Proteïna - DNA És la tècnica més eficient per obtenir proteïnes pures, però no sempre es pot fer servir. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA D’ALTA PRESSIÓ (HPLC – UHPLC) La columna està feta de materials molt més fins, hi ha més centres d’interacció, i s’aplica pressió per obtenir velocitats de flux adequades. Té més PODER DE RESOLUCIÓ: capacitat de separar proteïnes individuals. Després de la columna es col·loca un detector d’absorbància. Cada pic obtingut correspon a una proteïna (absorció dels enllaços peptídics). VALORACIÓ DE LA PURIFICACIÓ Podem comprovar si el mètode de purificació és eficaç a diferents nivells: Quantificació de la CONCENTRACIÓ de proteïna total: ELECTROFORESI: permet visualitzar el nº i quantitat o Absorbància (280nm, aa aromàtics) de proteïnes o Colorimetria (Biuret, Bradford): La intensitat de o E. en gel (SDS-PAGE amb tinció): mida color és proporcional a la concentració de proteïna o SDS-PAGE amb immunodetecció (Western blot) o Isoelectroenfocament: pI o E. bidimensional: mida i pI ASSAIG D’ACTIVITAT (Ez, activitat específica), FUNCIÓ (transport, hormones, etc.) ESPECTROMETRIA DE MASSES ELECTROFORESI EN GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS-PAGE) Les proteïnes es poden separar i identificar per electroforesi en gel sota l’acció d’un camp elèctric. Ens permet determinar aproximadament el pes molecular de la proteïna. Ens dona una idea del grau de puresa en cada un dels passos de la purificació. Com a matriu sòlida s’utilitza un gel de poliacrilamida (PAGE) - Malla 3D inert formada per co-polimerització. L’SDS (DETERGENT ANIÒNIC) trenca les unions no covalents de les proteïnes i les càrrega negativament. S’uneix a les proteïnes en una quantitat aproximadament proporcional a la seva massa molecular (un anió d’SDS per cada dos residus d’aa: totes les proteïnes tenen mateixa relació càrrega/massa). LA PAGE-SDS SEPARA LES PROTEÏNES GAIREBÉ EXCLUSIVAMENT EN FUNCIÓ DE LA SEVA MASSA (PM). A la mostra també s’afegeix ß-MERCAPTOETANOL per trencar ponts disulfur i fer que siguin totalment lineals. Les proteïnes es poden visualitzar amb tinció (blau de Coomassie, nitrat de plata), o anticossos (Western blot) i autoradiografia. DETERMINACIÓ DEL PES MOLECULAR D’UNA PROTEÏNA: La mobilitat de les proteïnes és inversament proporcional al logaritme del seu PM. Migren més ràpid les proteïnes més petites. IMMUNODETECCIÓ: WESTERN BLOT Les proteïnes es transfereixen a una membrana, s’incuben amb un Ac específic i es revelen (ex: autoradiografia) IMMUNODETECCIÓ quantitativa: ELISA Ús d’anticossos per detectar la proteïna; quan siguin actius, emetran una senyal, que és el que quantificarem. ELISA INDIRECTE: detecta els anticossos 1. Pou recobert d’antígens. 2. L’Ac específic s’uneix a l’Ag. 3. L’Ac unit a l’Ez s’uneix a l’Ac específic. 4. S’afegeix S i l’Ez el converteix en un P amb color; la seva intensitat és ∝ a la quantitat d’Ac específic. ELISA SANDWICH: detecta la proteïna 1. Pou recobert d’Acs monoclonals. 2. Els Ag s’uneixen a l’Ac. 3. Un segon Ac monoclonal, unit a Ez s’uneix a l’Ag immobilitzat. 4. S’afegeix el S i l’Ez el converteix en un P amb color; la seva intensitat és ∝a la quantitat d’Ag. ISOELECTROENFOCAMENT: EN BASE AL CONTINGUT RELATIU DE RESIDUS ÀCIDS I BÀSICS S’estableix un gradient de pH amb un camp elèctric. Cada proteïna es desplaça cap al pH que iguala el seu pI. Permet separar proteïnes amb diferent pI. ELECTROFORESI BIDIMENSIONAL 1ª D: Isoelectroenfocament separació en funció del seu pI 2ª D: SDS-PAGE separació en funció del PM VALORACIÓ DE LA PURIFICACIÓ ACTIVITAT ENZIMÀTICA ACTIVITAT ESPECÍFICA (PURESA) Unitats d’Ez en una Unitats d’Ez per mg de proteïna solució total ASSAIG D’ACTIVITAT Podem mesurar a cada pas: Activitat Total: Unitats d’Ez en una solució (UI). Activitat Específica (A.E.): unitats Ezàtiques per mg o mL de proteïna total. Rendiment: Activitat existent després de cada pas de purificació expressada com a percentatge de l’activitat en l’extracte cru (100%). Durant els passos de purificació de P: quantitat proteïnestotal i activitattotal ↓, però l’activitat específica ↑. Grau de purificació: increment de la puresa. S’obté dividint l’A.E. de cada pas de purificació entre l’A.E. de l’extracte inicial. CAL TENIR EN COMPTE TANT EL GRAU DE PURIFICACIÓ COM EL RENDIMENT: Un baix grau de purificació amb un alt rendiment deixa molts contaminants. Un alt grau de purificació amb baix rendiment proporciona poca proteïna per treballar. E L MÈTODE DE PURIFICACIÓ IDEAL PROPORCIONA MOLTA PROTEÏNA ESPECÍFICA I POCS CONTAMINANTS. IDENTIFICACIÓ DE PROTEÏNES: Raigs X MALDI-TOF Determinació de la seqüència proteica (degradació d’Edman) ESPECTROSCÒPIA DE MASSES Permet una mesura precisa i sensible de la composició atòmica d’una molècula. S’utilitza per determinar amb precisió la massa molecular de proteïnes, o canvis en la massa molecular deguts a la unió de cofactors, modificacions covalents,... Requereix quantitats molt petites de mostra Funciona convertint els analits en formes gasoses carregades (ions en fase gasosa) i mesura la relació massa/càrrega Consta de: - Font d’ ions - Analitzador de masses - Detector Espectroscòpia de masses: MALDI-TOF FONT D’IONS ANALITZADOR DE MASSES MALDI ESI TOF 1. Ionització induïda 2. Ionització per 3. Analitzador de masses per temps de vol, els ions per làser electrosprai s’acceleren sota un potencial electroestàtic fixe. A igual càrrega l’ió més petit anirà més ràpid per la càmera i es registraran les relacions massa/càrrega. ESTRUCTURA 1ÀRIA DE LES PROTEÏNES: SEQÜENCIACIÓ Proteïna purificada ↓ Determinar la seqüència d’amioàcids 1)Trencament de la proteïna mitjançant mètodes químics i/o Ezàtics en posicions ocupades per aminoàcids específics, generant pèptids més petits. 2)Degradació d’Edman: mitjançant FENILISOTIOCIANAT, s’elimina per ordre, un a un, el residu ubicat a l’extrem amino d’un pèptid (límit: 50 residus/pèptid), i s’identifica el residu. 3)Solapament de pèptids: permetrà establir l’ordre dels pèptids seqüenciats ESTRUCTURA 3D de les proteïnes: RAIGS X. LES PROTEÏNES PODEN CRISTAL · LITZAR. CRISTALꞏLOGRAFIA DE RAIGS X Permet caracteritzar l’estructura tridimensional de les proteïnes. Cal que la proteïna estigui formant cristalls per tal que totes les molècules tinguin la mateixa orientació. ESTRUCTURA 3D de les proteïnes: RMN (ressonància magnètica nuclear) La proteïna pot estar en solució: poden subministrar informació addicional, com per exemple la identitat d’un lligand endogen unit a la proteïna. 3. RELACIÓ ESTRUCTURA – FUNCIÓ DE LES PROTEÏNES Mioglobina 1ª proteïna en determinar-se la seva estructura 3D Hemoglobina  MIOGLOBINA HEMOGLOBINA Uneix oxigen de forma reversible. Teixit muscular, reserva d’oxigen Eritròcits Estructura 8 hèlixs α (A-H) connectades per girs 4 cadenes polipeptídiques (2α, 2ß) 3ària Parella de dímers idèntics: α1ß1 i α2ß2 GLOBULAR Centre d’unió 1: 1 grup HEMO 4: 4 grups HEMO a O2 La His F8 forma un enllaç de coordinació amb Molt sensible a petits canvis en la Fe2+ d’hemo i la His E7 (imidazole) estabilitza la concentració d'O2 unió del O2 mitjançant un pont d’H. Uneix O2 de manera COOPERATIVA MIOGLOBINA VS. HEMOGLOBINA Les subunitats d’Hb són similars a la Mb - Pocs canvis a l’entorn del grup Hemo - Tot i que les seqüències d’aa dels tres polipèptids són idèntiques en només 27 posicions, les seves estructures són molt similars (els aa iguals deuen ser importants en la distribució estructural) El grup HEMO permet la unió d’O2 Oxigen: poc soluble en H2O. Cadenes laterals aminoàcids no són bones per unió reversible O2. Ús de metalls de transició (Fe ; Cu) amb tendència a unir O 2. Problema: Ferro lliure forma espècies reactives d'oxigen (ROS) (→ dany a DNA). Solució: SEGRESTAR EL FERRO PER FER -LO MENYS REACTIU. GRUP HEMO Anell pirrol ESTRUCTURA DEL GRUP HEMO GRUP PROSTÈTIC: component no aminoacídic unit permanentment a una proteïna i que contribueix a la seva funció. Protoporfirina IX: (orgànic) o Anell tetrapirròlic (o de porfirina) o 4 anells pirròlics units per ponts metilè i amb cadenes laterals: ▪ 4 metils ▪ 2 propionats (ionitzats a pH ▪ 2 vinils fisiològic) Àtom de Fe en estat ferrós (Fe ): 2+ o 6 enllaços de coordinació: ▪ 4 N en el pla de l’anell de ▪ 1 unit a imidazole de His de porfirina la proteïna ▪ 1 lliure, per unir O2 PROPIETATS DEL GRUP HEMO Grup HEMO lliure en H2O Fe2+ queda amb dos enllaços de coordinació oberts O2 & Fe2+: Conversió irreversible a Fe3+. Fe3+ : no uneix O2; uneix l’ió superòxid, que si s’alliberés podria generar ROS. L' ESTRUCTURA PROTEICA EVITA L' OXIDACIÓ IRREVERSIBLE DEL FERRO Grup HEMO lligat a proteïna Segrest del grup hemo en una butxaca d’accés restringit Fe2+: enllaços de coordinació a O2 i a His proximal (HisF8) Oxigen: pont d’H a His distal (HisE7). Aquest pont d’H estabilitza estructures en ressonància que no alliberaran superòxid, sinó dioxigen; l’estructura de la Mb evita la formació de ROS. EL GRUP HEMO ES TROBA ENTRE DUES HISTIDINES Cavitat entre residus apolars, excepte per dues HISTIDINES La unió de l’oxigen provoca canvis conformacionals de Mb i Hb Unió de l’O2: - Reorganització del núvol d'e- del Ferro: es fa més petit (canvi de color sang: porpra fosc a vermell brillant. Dona a múscul i sang el color característic). - Canvisconformacionals de la proteïna. MIOGLOBINA VS HEMOGLOBINA Corbes d’unió a O2: Mb insensible a petits canvis de [pO2] Hb molt sensible a petits canvis de [pO2] Corba sigmoide. L’Hb uneix O2 de manera cooperativa. La forma de la corba revela que la unió a un centre augmenta la probabilitat que l’O2 s’uneixi a la resta de centres desocupats. Les reaccions d’unió en els centres individuals no són independents les unes de les altres. També a l'inrevés, la desunió d’O2 d’un centre facilita la desunió dels altres. p50 : pO2 on el 50% dels centres d'unió a l'O2 estan ocupats (Y=0.5); Mb té més afinitat per O2 que l’Hb LA UNIÓ COOPERATIVA FA DE L’ HEMOGLOBINA UN TRANSPORTADOR FISIOLÒGIC *Amb l’Hb, contribueixen 66% dels centres al transport, la seva afinitat i el cooperativisme permet la càrrega reversible. *Si fos la Mb, contribuiria només 7%, gran afinitat i no cooperativa. Per això s’utilitza com a magatzem i no pel transport. *Si fos una altra proteïna amb l’afinitat evolutivament optimitzada, però igualment no cooperativa, serien només 38%. PER TANT, L ’ALLIBERAMENT COOPERATIU D’ OXIGEN N’AFAVOREIX UNA DESCÀRREGA MÉS COMPLETA ALS TEIXITS. Hb és una proteïna al·lostèrica La substància que s’uneix a una proteïna s’anomena modulador o efector. Alꞏlosterisme: La unió d'un efector modifica les propietats d'unió d’un S a un altre lloc dins la mateixa proteïna (mitjançant canvis conformacionals). Quan la proteïna s’uneix i provoca un canvi en el lloc d’unió del lligand (o S), que s’unirà en un lloc diferent. HOMOTRÒPIC: Efector i S iguals HETEROTRÒPIC: Efector i S diferents La unió d’O2 influeix en la unió d’O2 en La unió d’ O2 està influenciada per: 2,3-BPG (fosfat orgànic) altres centres: COOPERATIVATIVISME Efecte Bohr: H+ (pH) i CO2 La unió d’O 2 modifica molt l’estructura 4ària de l’hemoglobina Unió coop.: la unió en un centre del tetràmer d’Hb afecta les propietats d’unió d’O2 dels altres centres ↓ Canvis en l’estructura quaternària durant la unió d’O2 Típicament, l’al·losterisme es produeix en proteïnes que contenen més d’una subunitat. - Quan s’uneix O2, l’ió ferro esdevé més petit i permet el desplaçament cap al pla de la porfirina. - L’aplanament de l’hemo provoca un canvi en la posició de la His (HisF8) i de l’hèlix F unida. Els canvis estructurals dels hemo es transmeten a la interfície entre dímers α 1 ß 1 i α 2 ß 2. unió O2 → Fe cap al pla de porfirina → His en 5è enllaç coordinació es mou amb ell i, per tant, l`hèlix α on es troba també es mou L’extrem carboxil de l’hèlix α es troba a la interfície entre els dos dímers α1ß1 i α2ß2. La transició estructural en l’ió ferro d’una subunitat influeix en les altres subunitats. La unió d’O2 fa rotar els dímers α 1 ß 1 i α 2 ß 2 15º l’un respecte l’altre L’entrada d’oxigen relaxa la conformació 4 àr i a de la Hb La unió d’O2 a una subunitat afavoreix la transició de l’estat T a R del tetràmer. MODELS D’UNIÓ DE LLIGAND MODEL CONCENTRAT - Existeixen dos estats conformacionals totals T o R pel tetràmer. - La unió del lligand desplaça l’equilibri entre els dos estats. - Conforme s’uneix l’O2 augmenta la probabilitat de l’estat R. Unió de O2 a Hb Concentrat: Hb amb 3 llocs ocupats per O2 té gairebé sempre 4ària R. El lloc obert té >20X afinitat per O2 quan l’Hb és totalment desoxigenada. No del tot concentrat: Hb amb només 1 lloc ocupat per O2 té gairebé sempre 4ària T Tot i això, aquesta Hb uneix O2 3X millor que l’Hb totalment desoxigenada. Això només és consistent en un model seqüencial. MODEL SEQÜENCIAL - La unió a lligand canvia la conformació de la subunitat individual a la qual s’uneix. - Aquest canvi en una subunitat comporta canvis en les subunitats veïnes, que augmenten llur afinitat per l’O2. - Existeixen estats intermedis de conformació entre R i T totals. Per descriure el funcionament de l’Hb caldria un model combinat (concentrat + seqüencial) En el model alꞏlostèric concertat canvien de conformació únicament les subunitats que han unit el lligand. V o F? Fals. 2,3-BISFOSFOGLICERAT DELS ERITRÒCITS ÉS FONAMENTAL PER REGULAR L’AFINITAT DE L’HB PER L’O2 BPG estabilitza l’estat T de l’hemoglobina i redueix l’afinitat per l’O2 - Unió al centre tetràmer en cavitat present només en l’estat T, entre aa positius de subunitats ß: per la transició de T a R, s’han de trencar els enllaços iònics entre Hb i 2,3-BPG (en cas de pO2 elevada, durant la transició de T a R, la cavitat es redueix i s’expulsa el 2,3-BPG). - En presència de 2,3-BPG ha d’haver més pO2 per passar de T a R, per tant 2,3-BPG REDUEIX L ’AFINITAT PER O2.  2,3-BPG ÉS UN EFECTOR AL· LOSTÈRIC 2,3-BPG REDUEIX L ’ AFINITAT PER L ’O2 2,3-BPG: DESENVOLUPAMENT FETAL Hemoglobina Fetal (HbF): α2γ2 γ: 72% ß His143→Ser eliminació de 2 càrregues positives al lloc d'unió de 2,3-BPG menor afinitat per 2,3-BPG Major afinitat per O2 Capta O2 de la curculació placentària: transport d'O2 de la mare al fetus EFECTE BOHR L’ EFECTE BOHR: H+ I CO2 PROMOUEN L’ALLIBERAMENT DE L’O2 L’Hb respon a senyals que indiquen necessitat d’O 2. Teixits metabòlicament actius alliberen H + i CO2. H+ i CO2 són efectors al·lostèrics de l’Hb que promouen l’alliberament d’O2. Efecte Bohr: regulació de la unió d’O2 per H+ i CO2. L’Hemoblogina transporta oxigen, protons i CO2. LA RESPIRACIÓ ALLIBERA H+ Hidratació del CO2. El CO2 provoca un descens del pH perquè produeix H+. E LS H + DISMINUEIXEN L ’AFINITAT DE L ’H B PER L’O2 I AFAVOREIXEN L ’ALLIBERAMENT ALS TEIXITS. ↓pH ↓ Afinitat per O2 ↑ Alliberament O2 als teixits BASE QUÍMICA: ELS H+ ESTABILITZEN LA FORMA DESOXIH B Creació d’unions que estabilitzen la forma T: His ß146 - pont d'H - Aspß94 A pH baix es protonen les cadenes laterals de la His ß146. La protonació a pH baix estableix un pont d’H amb Aspß94. 2 ponts salins: amb Aspß94 i amb Lysα40 de l’altre dímer αß Estabilitza l’estructura 4 ària T Més tendència a alliberar O2. E LS CO2 DISMINUEIXEN L ’AFINITAT DE L’H B PER L’O2 I AFAVOREIXEN L’ ALLIBERAMENT ALS TEIXITS. capacitat de transport ↑CO2 ↓ Afinitat per O2 ↑ Alliberament O2 als teixits Base química: CO2 estabilitza la forma desoxiHb CO2 reacciona amb NH2-terminals formant CARBAMATS (carregats -) → Els carbamats formen ponts salins → estabilitza l’estructura 4ària T → més tendència a alliberar O2. Aquest procés proporciona un mecanisme addicional de transport de CO 2. CO 2 es transporta principalment com a bicarbonat fins als pulmons Teixits: CO2 es transforma en HCO3- i passa a sèrum Pulmons: HCO3- es transforma en CO2 i s’exhala D’ AQUESTA MANERA EL CO2 GENERAT EN ELS TEIXITS EN ACTIVITAT CONTRIBUEIX A DISMINUIR EL P H EN ERITRÒCITS I , PER TANT , A L’ALLIBERAMENT D’ OXIGEN. Resum: 1) Mb és l’emmagatzemador d'O2 en el múscul. 8) CO perd afinitat per la Mb per impediment estèric 2) Hb uneix O2 en els pulmons i el transporta als amb la Histidina distal (HisE7) teixits. 9) La unió de l'O2 a l'Hb és coop. (corba de 3) Són proteïnes globulars: dissociació sigmoidal) - ↓afinitat/↑eficàcia - Mb: 1 cadena polipeptídica (hèlix α) transportadora que Mb. - Hb: 4 cadenes pp (HbA α2ß2) (oligomer) 10) L'activitat de l'Hb és modulada per: 4) El lloc d'unió a l'O2 és el grup prostètic HEMO a) O2 (Protoporfirina; grups propionat carregats; Fe2+) b) 2,3-BPG (Q-): 5) Grup Hemo (Fe) o Cavitat entre subunitats ß (estabilitza desoxiHb) - Encaixat en un entorn apolar excepte per les dues o Entorn positiu (Histidines – Lisina- N-terminals) His. o Redueix afinitat Hb per O2 - Unit a Histidina proximal (HisF8): 5ª posició de o BPG és fonamental en el desenvolupament fetal coord. (HbF: Hisß143→Serß143) - Pròxim a Histidina distal (HisE7). c) CO2 – H+ (EFECTE BOHR) 6) Unió O2 - Hemo: Fe 2+ o H+: Histidina ß146 (Q(+)) – Aspàrtic ß49 (Q-)/N- a) En H2O: Oxidació irrev. del Ferro (Fe ): no unió O2 3+ terminals b) En estructura proteica: unió a O2 rev. (6ª posició o CO2: Carbamats en els amino terminals (Q-): de coord; impediment estèric): complex de coord. interaccions iòniques; baixada de pH ANÈMIA FALCIFORME Alteració de la cadena ß de l’Hb (Glu6 → Val): HbS (HbA representa Hb normal) Poca solubilitat de la desoxiHbS: AGREGATS FIBROSOS D’HB que deformen els eritròcits, dificultant el fluz sanguini (menor pO 2), i descens nº d’eritròcits (anèmia). Hb es troba en estat T. Homozigosi (HbS/S): 50% dels eritròcits falciformes, malalts, mala circulació, infeccions. Heteroxigosi (HbA/S): 1% falciforme, gairebé no afectat, “tret falciforme”, resistents a la malària. ACTIVITAT CATALÍTICA I CINÈTICA ENZIMÀTICA ACTIVITAT CATALÍTICA Els Ez acceleren les reaccions varis ordres de magnitud. La majoria dels Ez són PROTEÏNES (versatilitat estructural). Tot i això, alguns Ez són molècules d’RNA (ribozimes, no tots els Ez són proteïnes). Característiques principals: Elevat poder catalític: Capacitat d’acceleració Especificitat: interacció precisa Ez-S - NO ALTEREN L ' EQUILIBRI QUÍMIC; no es gasten en el procés. ESPECIFICITAT DE S Ex: Ez proteolítics: hidròlisi enllaç peptídic PAPAÏNA Qualsevol enllaç peptídic (salses per estovar la carn – digestiu) TRIPSINA Enllaç carboxílic d’Arg o Lys (Ez digestiu) TROMBINA Enllaç carboxílic d’Arg unida a Gly (coagulació sanguínia) CENTRE ACTIU: GRUPS CATALÍTICS - En el centre actiu dels Ez té lloc la catàlisi enzimàtica. - Conté residus directament implicats en la catàlisi enzimàtica: grups catalítics - Hi ha la unió de Ss i, cofactors si calen. Característiques 1. Estructura tridimensional, generalment un solc o cavitat que normalment implica residus allunyats en l’estructura 1ària. 2. Porció petita de la proteïna - El centre actiu és de dimensions petites respecte a tota la proteïna. - Altres residus: centres reguladors, d'interacció amb altres proteïnes, canals,... 3. Microentorns únics - L’estreta relació entre el centre actiu i el S fa que freqüentment l’aigua quedi exclosa, a no ser que sigui un reactant. o Normalment hidrofòbics. o Residus polars al centre actiu: unió S o participació en la catàlisi. 4. La interacció Ez – S és en general mitjançant múltiples forces o enllaços dèbils (no covalents) o Enllaços electrostàtics o Ponts d’H o Forces de VdW o Interaccions hidrofobes INTERACCIÓ EZ - S Atès que l’Ez i el S interaccionen amb forces de curta distància, cal un contacte íntim: l’especificitat de la interacció Ez-S depèn de la disposició dels àtoms al centre actiu. MODEL DE PANY I CLAU Emil Fischer (1890) MODEL DE GUANT I MÀ, AJUST INDUÏT O INSTRUCTIU Daniel E. Koshland Jr. (1958) El centre actiu de l’Ez lliure té una forma El centre actiu adopta una forma complementaria a la complementaria (l’Ez és flexible) a la del del S. S a l’hora d’unir-s’hi. COFACTORS L’activitat catalítica de molts Ez depèn de molècules no proteiques anomenades COFACTORS. APOENZIM + COFACTOR = H OLOENZIM APOENZIM: Classificació COENZIM: molècules orgàniques petites METALLS: inorgànics de cofactors Grups prostètics: unió forta Cosubstras: unió dèbil Ez amb el mateix coenzim tenen normalment un mecanisme de reacció similar COENZIM: molts són derivats de vitamines CLASSIFICACIÓ d’Ez: segons la reacció catalitzada OXIREDUCTASES Transfereixen electrons. Ex: lactat deshidrogenasa TRANSFERASES Transferència de grups Ex: NMP cinasa HIDROLASES Hidròlisi de reaccions, lliberen un aigua. ex: quimotripsina  LIASES Afegeix o treu grups d’enllaços dobles. Ex: Fumarasa ISOMERASES Transferència de grups intramolecular. Ex: isomerasa triosa fosfat LLIAGSES Uneixen dos substractes mitjançant la hidròlisi d’ATP. Ex: Aminoacil-RNAt sintasa Nomenclatura: Nom propi Nom sistemàtic: nom dels Ss i la reacció que catalitzen amb el sufix “asa”. Ex: ATP-sintasa, ATP: glucosa fofotransferasa Numero de quatre dígits de l’Enzyme Comission. EC classe.subclasse.nº de sèrie Ex: EC 2.7.1.1. REACCIONS AMB MÚLTIPLES SS La majoria de reaccions Ezàtiques inclouen més d’un S ( A + B → P + Q) MECANISME DE DOBLE DESPLAÇAMENT O PING-PONG MECANISME SEQÜENCIAL Ordenat A l’atzar Tots els S s'uneixen a l'Ez abans de formar P Un o més P s'alliberen abans que tots els S s'uneixin a l'Ez Intermediari de l’Ez substituït: modificació Sempre en un ordre definit transitòria de l'Ez Molts Ez amb NAD+ o NADH com S L’ordre és aleatori EZ MULTIFUNCIONALS Mecanismes per organitzar una seqüència de reaccions i assegurar l’eficient transferència del P d’una reacció a l’Ez següent on actua de S: Ez multifuncionals: una mateixa cadena pp té diferents activitats Ezàtiques/diferents llocs catalítics. Complexes multiEzàtics: associació no covalent de diferents Ez EZ BIFUNCIONAL EZ MULTIFUNCIONALS REGULACIÓ DE LA GLUCÒLISI: Un Ez bifuncional SINTASA D’ÀCIDS GRASSOS (FAS): 1 Ez amb sintetitza i degrada la fructosa 2,6-bisfosfat múltiples activitats Ezàtiques Fosfofructoquinasa 2 (PFK2) Fructosa bisfosfatasa 2 (FBPasa2) COMPLEXES MULTIEZÀTICS COMPLEX PIRUVAT DESHIDROGENASA (PDH): connecta la glicòlisi amb el cicle de Krebs. 3 Ez integrats per realitzar una reacció bioquímica en sèrie (descarboxilació oxidativa del piruvat) TERMODINÀMICA DE LES REACCIONS Les reaccions es regeixen per les lleis fonamentals de la termodinàmica: 1er: L’energia total de l'univers (sistema + resta del univers) és constant. 2n: En un procés espontani, l’entropia total del univers (sistema + resta del univers) incrementa. L’energia lliure (G) representa l’energia útil, capaç de realitzar un treball. La diferència d’energia lliure (ΔG) entre P i Ss ens diu si una reacció serà espontània: o ΔG < 0: Reacció espontània (exergònica, allibera energia) o ΔG > 0: Reacció no espontània (endergònica, per a realitzar-se requereix aportació d’energia*) o UN SISTEMA ESTÀ EN EQUILIBRI QUAN ΔG ÉS IGUAL A 0 ⃰ En BQ: coneixent ΔG d’una reacció sabrem si tindrà lloc espontàniament o necessitarà l'acoblament d’una reacció que proporcioni energia al sistema. ΔG d’una reacció depèn de:  Lanaturalesa dels reactius (Canvi d’energia lliure estàndard: ΔGº) De la [reactius] [𝐶][𝐷] A +B ⇌C+D ∆𝐺 = ∆𝐺º + 𝑅𝑇𝑙𝑛 [𝐴][𝐵] Canvi d’energia lliure estàndard. C.E.: reactius a concentració de 1 M (1 atm per gasos), i 298 K (25ºC) En BQ, a pH 7: ΔGº’ Unitats: kJ i kcal (1 kJ= 0,239 kcal) El criteri d'espontaneïtat d’una reacció depèn de ΔG, no de ΔGº’; per tant, depèn de les condicions (T i [ ]). Reacció en equilibri: quan una reacció reversible evoluciona endavant en la mateixa proporció que a la inversa, i llavors les concentracions dels Ss i els P no tenen canvi net en el temps. ΔG º’ ESTÀ RELACIONAT AMB LA CONSTANT D’EQUILIBRI EN CONDICIONS ESTÀNDARD (K’ EQ) En condicions d’equilibri ΔG=0: [𝐶][𝐷] [𝐶][𝐷] [𝐶][𝐷] 0 = ∆𝐺º + 𝑅𝑇𝑙𝑛 [𝐴][𝐵] ; ∆𝐺º = −𝑅𝑇𝑙𝑛 [𝐴][𝐵] ; 𝐾 ′ 𝑒𝑞 = [𝐴][𝐵] ; ∆𝐺º = − 𝑅𝑇𝑙𝑛(𝐾 ′ 𝑒𝑞) R=8.315·10-3 kJ/mol∙K; T=298 K L’ΔG in vivo ΔG= ΔGº + RT ln [P] / [S] L’Ez HEXOQUINASA catalitza la següent reacció: Glucosa + ATP = Glucosa-6P + ADP (ΔGº= -16,7 kJ /mol) En el cor de rata: [P] / [S] = 0,08 T= 37ºC (310 K) Què pots dir de la reacció? ΔG= - 16,7 + ( 0,0083 x 310 x ln 0,08); ΔG= -23,12 kJ mol-1 A. Aquesta reacció no es produirà mai. B. En condicions estàndard, és espontània, començant amb glucosa. C. La constant d'equilibri augmenta quan augmenta la concentració inicial de glucosa. D. In vivo funcionarà cap a la formació de Glucosa-6P ΔG d’una reacció és independent del camí (o mecanisme molecular) que segueix la transformació dels reactants en P (el mecanisme de reacció no té efecte sobre ΔG). Ex: ΔG per l’oxidació de glucosa a CO2 i H2O és el mateix per combustió que per etapes catalitzades enzimàticament en una cèlꞏlula. ΔG indica si la reacció pot ser espontània, però no proporciona informació sobre la velocitat de la reacció. Una reacció podria ser espontània i tenir una velocitat inapreciable biològicament. Els Ez no poden alterar l’equilibri d’una reacció química, només acceleren l’arribada a l’equilibri. La quantitat de P format és la mateixa quan s’arriba a l’equilibri, en presència i en absència de l’Ez. Tot i això, la quantitat de P format en segons quan l’Ez està present, podria necessitar hores o anys en absència de l’Ez. En una reacció cal tenir en compte: 1. La diferència d’energia lliure (ΔG) entre els P i els Ss. S⇌ P Keq= [P] / [S] Si K1, es forma P 2. L’energia requerida per iniciar la conversió dels S a P, anomenada energia d’activació (ΔG‡) determina la velocitat de la reacció. C12H22O11 + 12 O2 12 CO2 + 11 H2O ΔG< 0: espontània ΔG‡ >> 0: molt lenta ‡ : estat de transició. És molt energètic, de vegades més que el propi P. Una reacció química que transforma un S en P transcorre a través d’un estat de transició X‡. S → X‡ → P L’estat de transició és l'espècie química menys estable i de més elevada energia en una reacció, per això és l’estat limitant de la reacció. La ΔG entre l’estat de transició i el S es denomina energia lliure d'activació (ΔG‡) ΔG‡ = GX‡ - GS o Per això la velocitat de la reacció depèn de ΔG‡ Nota: ΔG ‡ NO ÉS NECESÀRIA PER CALCULAR ΔG. La unió del S a l’Ez origina una forma de reacció en la que ΔG‡ és menor que en la reacció sense Ez. E LS E Z FACILITEN LA FORMACIÓ DE L’ ESTAT DE TRANSICIÓ MITJANÇANT LA DISMINUCIÓ DE L’ ENERGIA D’ ACTIVACIÓ (ΔG‡) Ez i equilibri de reacció: - Els Ez no modifiquen les condicions d’equilibri, només acceleren l’arribada a l’equilibri de la reacció facilitant la formació de l’estat de transició. - Les CONCENTRACIONS DE SS I P en les condicions d’equilibri no depenen de la presència o no d’Ez, sinó de la diferència de l’energia lliure (ΔG) ENTRE LES SS I ELS P. - Els Ez acceleren per un mateix factor els dos sentits de la reacció Els Ez recluten els Ss i faciliten la formació dels estats de transició El poder catalític d’un Ez prové de reclutar Ss i promoure orientacions que afavoreixen la conformació de l’estat de transició mitjançant la formació de complexes Ez-S (ES) Ex: Varasa, Ez imaginari dissenyat per catalitzar el trencament d’una vara: actua millor si és complementari amb l’estat de transició (doblada) que si ho fos amb el S (recta). L’energia alliberada en la unió Ez-S (ENERGIA D’UNIÓ o fixació) és la que s’utilitza per formar l’estat de transició, és a dir, per disminuir l’energia d’activació ΔG‡. Només el S correcte fa totes les interaccions possibles (màxima energia d’unió): ESPECIFICITAT Evidències de la formació de Complexes Ez-S (ES) 1. A una concentració constant d’Ez, la velocitat de reacció augmenta amb la concentració de S fins que s’arriba a un màxima velocitat. En la formació del complex Ez-S ES, a una concentració de S elevada, tots els centres catalítics estan ocupats, i per tant la velocitat de reacció no pot augmentar. És a dir, la CATÀLISI ENZIMÀTICA SEGUEIX UNA CINÈTICA SATURABLE PEL S. 2. Dades de cristalꞏlografia de raigs X 3. La formació de complexes ES fa canviar les propietats espectroscòpiques dels Ez i/o dels Ss CINÈTICA ENZIMÀTICA E LS E Z NO ALTEREN ELS EQUILIBRIS DE LES REACCIONS , ALTEREN LES VELOCITATS. Cinètica: estudi de la velocitat de les reaccions químiques. Cinètica enzimàtica: cinètica de reaccions químiques catalitzades per Ez. Velocitat de reacció: quantitat de P que apareix per unitat de temps (o de S que desapareix en una unitat de temps) S⇋P ∆𝑆 ∆𝑃 𝑣 = = ; 𝑣 = 𝑘 · [𝑆] ∆𝑡 ∆𝑡 Reacció d’ordre 1, V es proporcional a la [S] CINÈTICA ENZIMÀTICA: Estudi de les Vr catalitzades per Ez Si considerem un sistema amb [Ez] constant i amb variacions de [S] (ex: després de menjar) S⇋P P ↑ amb t fins que arriba a l’equilibri, quan no hi ha canvi net en la [S] i [P], tot i que l’Ez continui convertint S en P i viceversa. Per simplificar, PODEM IGNORAR LA REACCIÓ EN QUÈ P ES CONVERTEIX EN S SI CONSIDEREM T≈0, quan [P] és baixa. S → P Velocitat inicial de catàlisi o velocitat inicial de reacció (V0): mols de P format per segon quan t≈0. - És el pendent de cada corba al principi de la reacció, quan la reacció en el sentit invers és menyspreable. - Varia en funció de [S] En augmentar [S], augmenta V0 de forma lineal, i després desaccelera, arribant a un valor màxim a majors [S] de forma asimptòtica. MODEL DE MICHAELIS MENTEN Les propietats cinètiques de molts Ez s’ajusten al model proposat per Michaelis- Menten: L’ EXISTÈNCIA D’ UN COMPLEX ES específic com intermediari necessari per la catàlisi. L’equació de Michaelis-Menten descriu la variació de l’activitat enzimàtica en funció de [S]. KM ÉS UNA CONCENTRACIÓ, I ÉS INDEPENDENT DE LES [ RELATIVES D’EZ I S] (mol/L = M). Depèn de: S i pH, T i força iònica. Quan KM = [S], V0= Vmàx / 2; [S] on la Vr és ½ de Vmàx i on la ½ dels centres actius de l’Ez estan ocupats. [S]KM V0= Vmàx [S] = KM V0= Vmàx REPRESENTACIÓ DEL DOBLE RECÍPROC Transformació algebraica de l’equació de Michaelis-Menten. EQUACIÓ DE LINEWEAVER-BURK O REPRESENTACIÓ DE DOBLES RECÍPROCS A partir de la gràfica de l’equació dels inversos, on es representa [S]-1, en X, i Vreacció-1, en Y, determinem que Vmàx és l’invers de la intersecció de la recta amb l’eix Y i la KM l’invers de la intersecció de la recta amb l’eix X. KM = (k1 + k2) /k1 Si k1 >> k2 KM = ct de dissociació del complex ES (k 1/k2) KM està inversament relacionada amb l’afinitat pel S. KM elevada: poca afinitat E-S; cal molt S per ½ Vmàx KM baixa: molta afinitat E-S; cal poc S per assolir ½ Vmàx KM és una característica dels Ez. Per la majoria d’Ez KM pels seus S està compresa entre 10-1 i 10-7 M. SENTIT FISIOLÒGIC DE LA KM La KM d’un Ez depèn de cada S particular, i de les condicions de pH, T i força iònica. KM és la [S] on la meitat dels centres actius de l’Ez estan ocupats, així que KM dona una idea de la [S] necessària per a què la reacció tingui lloc de forma significativa. Per a molts Ez, les KM proporcionen valors aproximats a les concentracions in vivo dels seus Ss que es troben normalment disponibles. La majoria dels Ez han evolucionat per tenir una activitat significativa a la concentració de S que normalment es troba disponible, i per ser sensibles als canvis en la concentració de S ([S] ≈ KM) Si [S] in vivo fos > KM: Ez gran activitat, però poca sensibilitat a canvis de [S]. ISOENZIMZS - Ez que, tot i diferir en la seca estructura primària (diferent seqüència d’aa), catalitzen la mateixa reacció. - Són codificats per gens diferents. - En general, els isoenzims difereixen en paràmetres cinètics, com KM pels diferents S, i/o la seva regulació - Permeten un ajust molt fi del metabolisme per satisfer necessitats particulars de teixit o estat de desenvolupament. SENTIT FISIOLÒGIC DE LA KM ALDEHID DESHIDROGENASA (EC 1.2.1.3), sensibilitat a l’etanol. Existeixen dues formes d’aldehid deshidrogenasa: Mitocondrial: Baixa KM (alta afinitat per l’aldehid) Citosòlica: Alta KM (baixa afinitat per l’aldehid) En moltes de les persones sensibles a l’alcohol s’ha descrit una mutació (Gln→Lys) en l’Ez mitocondrial que el fa pràcticament mitocondrial que el fa pràcticament inactiu. En aquest cas, el metabolisme es realitza només a través de l’enzim citosòlic, poc afí a l’aldehid (alta KM). Com a conseqüència, l’acetaldehid passa menys a acetat, doncs només s’arriben a velocitats de catàlisi elevades a molt ↑[aldehid]. L’excés passa a la sang i així s’expliquen els efectes fisiològics observats. HEXOQUINASA VS GLUCOQUINASA, metabolisme de la glucosa Permet l’ús prioritari de la glucosa per part del múscul ALTRES PARÀMETRES CINÈTICS Vmàx: activitat (μmol P/min = UI) (micromols de P format per minut) V quan l’Ez està saturat (la totalitat de l’Ez, ET es troba unit al S) Depèn directament de la concentració de l’Ez (V màx = K2 [E]T) Activitat específica (AE): (UI/mg o UI/mL) (Número d’unitats enzimàtiques per mg o mL de proteïna total) KCAT o k2: NÚMERO DE RECANVI Número de molècules de S convertides en P per unitat de temps quan l’Ez està totalment saturat de S. Vmàx= kcat·[E]T ; kcat = Vmàx/[E]T ; [E]T: concentració total de centres actius Anhidrasa carbònica. Ex: dissolució [E] = 10-6 M catalitza la formació de 0,6 M de H 2CO3 per segon quan està saturada. Per tant, kcat = 6·105 s-1 ; 1 cicle (1/ kcat) = 1,7·106 s = 1,7 μs 5. REGULACIÓ DE L’ACTIVITAT ENZIMÀTICA TEMPERATURA T incrementa la Vr: incrementa el moviment brownià de les molècules, fent que les interaccions E-S siguin més probables. Els Ez tenen una T a partir de la qual hi ha una pèrdua sobtada de l’activitat, ja que comencen a perdre l’estructura 3D (desnaturalització). Animals endotèrmics: mantenen una T ct. Problema: cal consum ct d’energia. Si no hi ha prou aliment o reserves cal canviar el ritme de vida (migració o hivernació) pH I FORÇA IÒNICA L’activitat enzimàtica varia amb el pH (canvis en càrrega elèctrica, canvis en estructura). Els Ez tenen un pH òptim, el d’activitat màxima, que està relacionat amb l’entorn. La força iònica o concentració salina es refereix a la concentració de tots els ions presents. MECANISMES DE REGULACIÓ DELS ENZIMS. Segons la seva regulació: A llarg termini: sobre la A curt termini: sobre L’ACTIVITAT de l’Ez CONCENTRACIÓ de l’Ez Expressió Degradació Per modificació química covalent: Rev i Inhibició enzimàtica Al·lostèrica gènica proteica Irrev (proteòlisi) REGULACIÓ DE L’ACTIVITAT ENZIMÀTICA INHIBICIÓ ENZIMÀTICA PER MOLÈCULES ESPECÍFIQUES Inhibidors: compostos que disminueixen l’activitat enzimàtica. - Químicament poden ser proteïnes molècules petites (small molecules) o ions. - Són útils en l’estudi dels centres actius i els mecanismes d’acció i per la INDÚSTRIA FARMACÈUTICA COM A AGENTS TERAPÈUTICS. Inhibició IRREVERSIBLE Inhibició REVERSIBLE L’inhibidor es dissocia molt lentament de l’Ez, perquè s’hi uneix amb molt afinitat (associació no-covalent molt estable) o Dissociació ràpida del complex covalentment. L’E Z QUEDA MODIFICAT. inhibidor-Ez. S’estableix un equilibri: E + I → E’ E + I ⇌ EI ; ES + I ⇌ ESI És el mecanisme d’inhibició de moltes toxines i verins Anàlegs de Acompetitiu Reactius específics Anàlegs de Inhibidors No l’estat de Competitiu o de grup funcional substrat suïcides competitiu transició incompetitiu INHIBICIÓ IRREVERSIBLE Se’ls anomena inhibidors irreversibles perquè difícilment un cop associats deixaran d’inhibir l’Ez. REACTIUS ESPECÍFICS DE GRUPS FUNCIONALS Reaccionen amb grups R específics dels aminoàcids. Ex: Diisopropilfosfofluoridat (DIPF) modifica una Ser necessària per l’activitat enzimàtica de quimotripsina o d’acetilcolinesterasa (DPIF és un gas nerviós). La pèrdua d’activitat denota que l’aa modificat (Ser) és especialment reactiu. De fet, es troba al centre actiu en quimotripsina o acetilcolinesterasa. E LS INHIBIDORS IRREVERSIBLES ES PODEN UTILITZAR PER MAPAR CENTRES ACTIUS, DONCS MODIFIQUEN ELS GRUPS FUNCIONALS FONAMENTALS PER L’ACTIVITAT I QUE PODEN, POSTERIORMENT , SER IDENTIFICATS.  ANÀLEGS DEL SUBSTRAT Molècules estructuralment similars al S de l’Ez que modifiquen covalentment els residus del centre actiu. Són més específics que els reactius específics de grup. Ex: Tosil-L-fenilalanina clorometilcetona (TPCK) és un anàleg del S natural de la quimiotripsina que modifica covalentment una His essencial per l’activitat. ANÀLEGS DE L’ESTAT DE TRANSICIÓ Potents inhibidors enzimàtics. Ex: àcid pirrol 2-carboxílic és un anàleg de l’estat de transició de la racemització de la L-Pro per l’Ez bacterià prolina racemasa. Aquest inhibidor s’uneix 160 vegades millor que la pròpia Pro. INHIBIDORS SUÏCIDES O BASATS EN EL MECANISME Són S modificats químicament. L’inhibidor s’uneiz a l’Ez com a S, i al principi, és processat normalment pel mecanisme catalític; però es genera un intermediari que inactiva l’Ez mitjançant inhibició covalent. Per tant, L ’EZ PARTICIPA EN LA SEVA PRÒPIA INHIBICIÓ IRREVERSIBLE. Ex: penicil·lina interfereix en la síntesi de la paret bacteriana (peptidoglicà) mitjançant la inhibició suïcida de la glicopeptid transpeptidasa (Ez que catalitza la formació d’encreuaments que estabilitzen el peptidoglicà). INHIBICIÓ REVERSIBLE COMPETITIVA NO COMPETITIVA Acompetitiva/incompetitiva S i inhibidor s’uneixen al centre L’inhibidor s’uneix a l’Ez en un lloc diferent al L’inhibidor s’uneix actiu de l’Ez únicament al complex Ez- del S independentment de si n’hi ha o no. Per S (ES), impedint l’acció Inhibidor impedeix la unió del S tant, no en bloqueja la unió però sí la catàlisi. catalítica. (unions mútuament exclusives) INHIBICIÓ COMPETITIVA - L’Ez pot unir el S o l’inhibidor, però no ambdós alhora. - Els inhibidors competitius s’assemblen als S i s’uneixen al centre actiu, impedint l’entrada del S. - Redueixen el nombre de molècules de S unides a l’Ez (ES). - S’ATENUA AUGMENTANT LA [S] o Ex: metotrexat inhibint la DHFR: ibuprofè inhibint ciclooxigenasa en la resposta inflamatòria; estatines inhibint la HMGR en la síntesi de colesterol. El metotrexat (fàrmac anticancerigen) inhibeix la DHFR (dihidrofolat), n’és un anàleg estructual i actua com a inhibidor competitu (síntesi de purines i algun aa). Té 1000x més afinitat d’unió respecte DHFR. INHIBICIÓ NO COMPETITIVA - Inhibidor s’uneix a l’Ez en un lloc diferent al del S. - S’uneix tant a l’Ez com al complex Ez-S. - Disminueix [Ez funcional] i número de recanvi de l’Ez (VMÀX DISMINUEIX ). - N O S’ ATENUA PER ↑[S] o Ex: Dioxicilina, antibiòtic que inhibeix col·lagenasa bacteriana (periodontitis). CINÈTICA DE LA INHIBICIÓ COMPETITIVA NO COMPETITIVA Vmàx no varia, només augmenta KM KM no varia, només disminueix Vmàx NOMÉS LA INHIBICIÓ COMPETITIVA POT SER SOBREPASSADA AUGMENTANT CONVENIENTMENT [S]. MECANISMES DE REGULACIÓ Control al·lostèric Modificacions covalents Activitat proteolítica (Zimogen) Quantitat d’Ez: Síntesi/Degradació ENZIMS AL·LOSTÈRICS A les cèl·lules la majoria del Ez segueixen la cinètica de Michaelis – Menten i no estan subjectes a regulació. La seva activitat està governada per la llei d’acció de masses: si hi ha S present, catalitzen. E LS E Z AL· LOSTÈRICS NO SEGUEIXEN LA CINÈTICA DE M ICHAELIS – MENTEN. - Corbes sigmoidals - Generalment tenen múltibles subunitats (estructrua 4ària) i múltiples centres actius. - La unió del S a un centre actiu pot afectar les propietats d’un altre centre aciut en el mateix Ez: COOPERATIVISME. - L’activitat dels Ez al·lostèrics pot ser regulada de forma reversible per molècules que s’uneixen reversiblement a llocs diferents del centre actiu. ENZIMS AL·LOSTÈRICS: MODULADORS L’activitat dels Ez al·lostèrics pot ser regulada de forma reversible per molècules que s’uneixen reversiblement a llocs diferents del centre actiu. Substrat, Modulador positiu ENZIMS AL·LOSTÈRICS: REGULADORS DE RUTES Retroinhibició Regulació entre rutes Dues rutes cooperen per formar un únic producte. Ex: aspartat transcarbamilasa (ATCasa), enzim al·lostèric que catalitza la 1ª reacció de la síntesi de pirimidines. CTP, un P final de la síntesi de pirimidines, inhibeix la ATCasa, tot i no tenir semblança estructural amb el S ni el P.  La ATCasa té 12 subunitats: 2 trímers catalítics i 3 dímers reguladors Pot estar en dues conformacions: T (compacta i inactiva) o R (relaxada i activa). La interacció amb CTP estabilitza la