BIOLOGIJA sve iz knjige podcrtano.docx

BIOLOGIJA -- SVE PODCRTANO U KNJIZI Spontano formiranje organskih molekula prvi je put eksperimentalno dokazano 1950-ih godina, kada je Stanley Miller (tada još student) pokazao da izbijanje električne iskre u mješavini H2, CH4 i NH3, u prisutnosti vode, omogućuje formiranje različitih organskih mo...

BIOLOGIJA -- SVE PODCRTANO U KNJIZI Spontano formiranje organskih molekula prvi je put eksperimentalno dokazano 1950-ih godina, kada je Stanley Miller (tada još student) pokazao da izbijanje električne iskre u mješavini H2, CH4 i NH3, u prisutnosti vode, omogućuje formiranje različitih organskih molekula, uključujući i nekoliko aminokiselina (sl. 1-1). Iako u Millerovim eksperimentima nisu točno reproducirani uvjeti koji su vladali na primitivnoj Zemlji, ipak je jasno pokazana vjerojatnost spontane sinteze organskih molekula kao osnovnih materijala iz kojih su nastali prvi živi organizmi. Idući korak u evoluciji bilo je formiranje makromolekula. Dokazano je da se monomeri, osnovne gradivne jedinice makromolekula, mogu spontano polimerizirati u pretpostavljenim prebiotičkim uvjetima. Zagrijavanje suhe mješavine aminokiselina, primjerice, rezultira njihovom polimerizacijom i formiranjem polipeptida. No, kritična osobina makromolekule iz koje se razvio život morala je biti njezina sposobnost da se samoreplicira. Jedino makromolekula koja je sposobna da upravlja sintezom vlastitih novih kopija mogla bi biti sposobna za samoreprodukciju i daljnju evoluciju. Pretpostavlja se da se prva stanica razvila tako da se samoreplicirajuća RNA okružila membranom izgrađenom od fosfolipida (sl. 1-3). Fosfolipidi su osnovne komponente svih današnjih bioloških membrana, uključujući stanične membrane kako prokariotskih tako i eukariotskih stanica, o čemu će detaljnije biti riječi u sljedećem poglavlju. Ključna osobina fosfolipida koji formiraju membrane je njihova amfipatičnost, što znači da je jedan dio molekule topljiv u vodi, a drugi nije. Fosfolipidi imaju duge, ugljikovodične lance netopljive u vodi (hidrofobne), vezane za u vodi topljive (hidrofilne) glave koje sadržavaju fosfat. Kad se urone u vodu, fosfolipidi spontano stvaraju dvosloj tako da su fosfatne glave orijentirane prema van u vodenu sredinu, a ugljikovodični repovi u unutrašnjost, međusobno se dodirujući. Takav lipidni dvosloj oblikuje stabilnu barijeru između dvaju vodenih odjeljaka -- pa tako, primjerice, odvaja unutrašnjost stanice od vanjskog okoliša. Ograđivanje samoreplicirajuće RNA i pridruženih joj molekula unutar fosfolipidne membrane moglo ih je održati kao jedinicu, sposobnu za samoreprodukciju i daljnju evoluciju. Moguće je da je, u to vrijeme, već evoluirala sinteza proteina ovisna o RNA, pa se u tom slučaju prva stanica mogla sastojati od samoreplicirajuće RNA i proteina koje je ona kodirala Pretpostavlja se da su prve reakcije stvaranja energije u Zemljinoj atmosferi, koja je u početku bila anaerobna, uključivale razlaganje organskih molekula u odsutnosti kisika. Te reakcije vjerojatno predstavljaju oblik današnje glikolize -- anaerobne razgradnje glukoze u mliječnu kiselinu s čistim dobitkom energije od dviju molekula ATP. Sve danas poznate stanice, uz korištenje ATP kao glavnog izvora stanične kemijske energije, obavljaju i glikolizu što je u skladu s idejom da su se te reakcije pojavile vrlo rano tijekom evolucije. Glikoliza je omogućila mehanizam kojim se energija sadržana u već oblikovanim organskim molekulama (primjerice, glukozi) može pretvoriti u ATP koji se tada može iskoristiti kao izvor energije za pokretanje drugih metaboličkih reakcija. Smatra se da je razvoj fotosinteze bio idući veliki evolucijski korak koji je dopustio da stanica iskoristi energiju Sunčeve svjetlosti čime se postigla neovisnost o korištenju već oblikovanih organskih molekula. Prva fotosintetička bakterija, koja se razvila prije više od 3 milijarde godina, vjerojatno je koristila H2S da pretvori CO2 u organske molekule -- poznati oblik fotosinteze koji neke bakterije još uvijek koriste. Oslobađanje O2 kao posljedica fotosinteze promijenilo je okoliš u kojem su se stanice razvijale pa se općenito smatra da je to dovelo do razvoja oksidativnoga metabolizma. S druge strane, moguće je da se oksidativni metabolizam razvio prije fotosinteze kao rezultat porasta atmosferskog O2 što je za posljedicu imalo jaku selektivnu prednost za organizme sposobne za korištenje O2 u reakcijama koje proizvode energiju. U svakom slučaju, O2 je visokoreaktivna molekula, pa je oksidativni metabolizam, koristeći tu reaktivnost, omogućio mehanizam za stvaranje energije iz organskih molekula koji je puno efikasniji od anaerobne glikolize. Primjerice, potpuna oksidativna razgradnja glukoze na CO2 i H2O stvara energetski ekvivalent od 36 do 38 molekula ATP, za razliku od 2 molekule ATP koje nastaju anaerobnom glikolizom. Današnji prokarioti, u koje ubrajamo sve različite tipove bakterija, podijeljeni su u dvije skupine -- arhebakterije i eubakterije -- koje su se razdvojile vrlo rano tijekom evolucije. Neke arhebakterije žive u ekstremnom okolišu koji danas nije uobičajen, ali je vjerojatno prevladavao na primitivnoj Zemlji. Primjerice, termoacidofili žive u vrućim sumpornim vrelima na temperaturama do 80 °C s vrlo niskom pH vrijednošću. Najveći i najsloženiji prokarioti su cijanobakterije -- bakterije u kojima se razvila fotosinteza.. Epitelne stanice tvore slojeve koji pokrivaju površinu tijela i unutarnjih organa. Ima mnogo različitih vrsta epitelnih stanica, a svaka je specijalizirana za određenu funkciju kao što je zaštita (koža), apsorpcija (primjerice, stanice tankoga crijeva) i sekrecija (primjerice, stanice žlijezda slinovnica). U vezivno tkivo ubrajamo kost, hrskavicu i masno tkivo, a svako od njih tvore različite vrste stanica (osteoblasti, hondrociti odnosno adipociti). Rahlo vezivno tkivo koje leži ispod epitelnoga sloja i popunjava prostore između organa i tkiva u tijelu sačinjeno je od druge vrste stanica, fibroblasta. Krv sadržava nekoliko različitih vrsta stanica, koje imaju funkciju u transportu kisika (crvene krvne stanice ili eritrociti), upalnim reakcijama (granulociti, monociti i makrofagi) i imunoodgovoru (limfociti). Živčano je tkivo građeno od živčanih stanica ili neurona Antony van Leeuwenhoek je bio u stanju razlikovati tipove stanica kao što su spermiji, crvene krvne stanice i bakterije. Matthias Schleiden i Theodor Schwann 1838. godine predložili su staničnu teoriju, što se može smatrati rođenjem suvremene stanične biologije. Maksimalna moć razlučivanja svjetlosnoga mikroskopa iznosi približno 0,2 µm; dva objekta udaljena manje od 0,2 µm uočavaju se kao jedan objekt ili slika te se ne mogu međusobno razlikovati jedan od drugoga. Ovakva teoretska granica moći razlučivanja svjetlosnoga mikroskopa određena je dvama faktorima -- valnom duljinom (λ) vidljive svjetlosti i sposobnošću leće mikroskopa da sakuplja svjetlost. U novije vrijeme, fluorescentna mikroskopija je unaprijeđena upotrebom zelenoga fluorescentnog proteina (GFP -- engl. green fluorescent protein), izoliranog iz meduze, u svrhu vizualizacije proteina unutar živih stanica. Standardnim metodama rekombinantne DNA, GFP se može vezati za bilo koji odabrani protein. Protein označen zelenim fluorescentnim proteinom se zatim unese u živu stanicu i vizualizira pomoću fluorescentnog mikroskopa, bez potrebe za fiksacijom i bojenjem stanica (što bi bilo potrebno u slučaju detekcije proteina protutijelima). Zbog svoje svestranosti, GFP je u staničnoj biologiji izuzetno popularan, a primjenjuje se u praćenju položaja i kretanja velikog broja različitih proteina u živim stanicama (sl. 1-27). Daljnja ekspanzija ove tehnike postignuta je uporabom srodnih fluorescentnih proteina plavog, žutog ili crvenog emisijskog spektra. Razvijene su različite metode za praćenje kretanja i interakcija proteina vezanih za GFP unutar živih stanica. Najčešće upotrebljavana metoda za praćenje kretanja proteina vezanih za GFP je metoda oporavka fluorescencije nakon fotoizbjeljivanja (engl. Fluorescence Recovery Afer Photobleaching ili FRAP) (sl. 1-28). Ovom metodom se područje interesa unutar stanice koja eksprimira protein vezan za GFP izblijedi izlaganjem jako intenzivnom svjetlu. Fluorescencija se oporavi nakon nekog vremena zahvaljujući kretanju neizbljedjelih molekula vezanih za GFP u područje koje je bilo izloženo svjetlu, te se na taj način odredi razina kretanja ciljnog proteina unutar stanice. Interakcije između dvaju proteina unutar stanice mogu se analizirati pomoću tehnike nazvane fluorescencijsko rezonantni prijenos energije (engl. Fluorescence Resonance Energy Transfer ili FRET) (sl. 1-29). Tijekom ove metode, svaki od dva ciljna proteina vezana su za dva različita fluorokroma, odnosno dvije varijante GFP proteina. Ove varijante GFP-a apsorbiraju i emitiraju različitu valnu duljinu svjetlosti, tako da svjetlost emitirana s jednom varijantom ekscitira drugu varijantu. Interakcija između dva ciljna proteina se zatim može odrediti tako da se stanica osvijetli valnom duljinom svjetlosti koja ekscitira prvu GFP varijantu te se analizira valna duljina emitirane svjetlosti. Ako su proteini, vezani za ove GFP varijante, u međusobnoj interakciji unutar stanice, fluorescentne molekule će se naći blizu jedna drugoj te će svjetlost koju emitira jedna varijanta ekscitirati drugu varijantu, rezultirajući emisijom svjetlosti valne duljine karakteristične za drugu GFP varijantu. Dva osnovna tipa elektronskoga mikroskopa, transmisijski (TEM) i pretražni (engl. scanning, SEM), na veliko se primjenjuju u istraživanjima stanica. Princip transmisijske elektronske mikroskopije sličan je mikroskopiji u svijetlom polju. Uzorci se fiksiraju i boje solima teških metala koje omogućuju stvaranje kontrasta jer raspršuju elektrone. Snop elektrona prolazi kroz uzorak i fokusira se na fluorescentnom zaslonu gdje se stvara slika. Elektroni koji nalijeću na ione teških metala prolazeći kroz uzorak skreću i udaljuju se, pa ne pridonose konačnoj slici. Na konačnoj slici obojena područja uzorka tamne su boje. Uzorci koji se analiziraju transmisijskim elektronskim mikroskopom mogu biti pripremljeni pozitivnim ili negativnim bojenjem. U slučaju pozitivnog bojanja, uzorci tkiva režu se u ultratanke rezove koji se boje solima teških metala (osmijev tetraoksid, uranov acetat, olovni citrat), koje pak reagiraju s lipidima, proteinima i nukleinskim kiselinama. Ioni teških metala vežu se na razne stanične strukture, što rezultira tamnim obojenjem na finalnoj slici (sl. 1-33). Alternativne procedure pozitivnog bojenja također se koriste u identifikaciji specifičnih makromolekula u stanici. Na primjer, protutijela označena teškim metalima (česticama zlata) koriste se često u svrhu unutarstanične lokalizacije specifičnih proteina. Ta je metoda slična fluorescentnoj mikroskopiji kod koje se protutijela označuju fluorescentnim bojama. Trodimenzionalne slike struktura, rezolucije 2--10 nm, mogu se također dobiti upotrebom tehnike elektronske tomografije -- računalne analize velikog broja dvodimenzionalnih slika snimljenih iz različitih smjerova gledanja. Procedura negativnog bojanja koristi se za vizualizaciju intaktnih bioloških struktura poput bakterija, izoliranih staničnih organela, i makromolekula (sl. 1-34). Tijekom ove metode, biološki uzorak postavlja se na nosač prekriven tankim filmom te se nanese metalna boja koja se ostavi da se osuši oko površine uzorka. Neobojeni uzorak okružit će se filmom boje, te ćemo pomoću mikroskopa vidjeti sliku u kojoj uzorak izgleda svijetao nasuprot tamno obojenoj pozadini. Sjenčanje metalom još je jedna tehnika koja se koristi u transmisijskoj elektronskoj mikroskopiji za vizualizaciju površine izoliranih staničnih struktura ili makromolekula (sl. 1-35). Uzorak se prekrije tankim slojem metalnih para (primjerice, platine). Metalne se pare rasprše po uzorku pod određenim kutem, pa su površine biološkog uzorka, koje su izravno usmjerene prema izvoru molekula metalnih para, deblje premazane negoli osta tak uzorka. Te razlike u debljini sloja metalnih para stvaraju efekt sjene, dajući uzorku trodimenzionalni izgled na elektronskoj mikrofotografiji. Prepariranje uzoraka metodom smrzavanja i lomljenja (engl. freeze fracture), u kombinaciji s tehnikom sjenčanja metalom, bilo je napose važno u istraživanju strukture membrane. Uzorci se smrznu u tekućem dušiku (na --196 °C), a zatim lome oštricom noža. Taj proces često razdvoji dvostruki lipidni sloj, što omogućuje prikazivanje unutrašnjih površina stanične membrane (sl. 1-36). Uzorak se zatim sjenča platinom, a biološki se materijal otopi kiselinom, čime se stvara metalna replika površine biološkog uzorka. Analizom replika pomoću elektronskog mikroskopa mogu se primijetiti brojna površinska ispupčenja, koja odgovaraju proteinima koji se protežu kroz dvosloj lipida. Varijacija ove tehnike nazvana smrzavanje i jetkanje (engl. freeze etching), osim vizualizacije unutarnjih površina stanične membrane omogućuje i vizualizaciju vanjskih površina. Drugi tip elektronskog mikroskopa, pretražni elektronski mikroskop (engl. scanning electron microscop) koristi se za dobivanje trodimenzionalne slike stanica (sl. 1-37). Tijekom pretražne mikroskopije snop elektrona ne prolazi kroz biološki uzorak. Umjesto toga, površina stanice prekriva se teškim metalom, a snop elektrona koristi se za pretraživanje po uzorku. Elektroni koji se raspršuju ili emitiraju s površine uzorka sakupljaju se kako se snop elektrona pomiče po stanici tako da u konačnici stvore trodimenzionalnu sliku. Budući da je razlučivanje pretražnog elektronskog mikroskopa samo oko 10 nm, njegova je primjena uglavnom ograničena na istraživanje cijelih stanica, a ne na istraživanje unutarstaničnih organela ili makromolekula. Ugljikohidrati obuhvaćaju jednostavne šećere i polisaharide. Jednostavni šećeri poput glukoze glavna su stanična hrana. Kasnije u poglavlju objasnit će se da njihova razgradnja istovremeno osigurava staničnu energiju i ishodne tvari za sintezu drugih staničnih sastojaka. Polisaharidi su skladišni oblici šećera ili osiguravaju strukturnu čvrstoću stanice. Uz to polisaharidi i kraći šećerni polimeri djeluju kao biljezi u raznim procesima staničnog prepoznavanja, uključujući adheziju stanica na susjede i transport proteina do predviđenog unutarstaničnog odredišta. Slika 2-2 prikazuje strukture reprezentativnih jednostavnih šećera (monosaharida). Osnovna formula tih molekula je (CH2O)n i od nje potječe naziv ugljikohidrat (C = »ugljiko« i H2O = »hidrat«). U stanicama je osobito važan 6C-atomni šećer (n = 6) glukoza, jer je glavni izvor stanične energije. Drugi jednostavni šećeri imaju od tri do sedam ugljika. Među njima su najučestaliji 3C-atomni i 5C-atomni šećeri. Šećeri koji sadrže pet ili više ugljikovih atoma mogu ciklizacijom tvoriti prstenaste strukture koje su pretežiti oblici tih molekula u stanici. Slika 2-2 pokazuje da ciklički šećeri mogu postojati u dva oblika (α ili β), ovisno o konfiguraciji na atomu C1. Monosaharidi se mogu povezati reakcijom dehidracije, pri kojoj se odvaja H2O, a šećeri se povezuju glikozidnom vezom između njihova dva ugljika (sl. 2-3). Povežu li se samo nekoliko molekula šećera, nastali oligomer naziva se oligosaharid. Kad se povezuje mnoštvo (stotine i tisuće) šećera, nastali makromolekularni polimeri nazivaju se polisaharidi. Polisaharidi glikogen i škrob dva su skladišna oblika ugljikohidrata, prvi u životinjskim, a drugi u biljnim stanicama. Glikogen i škrob izgrađeni su isključivo od molekula glukoze u α-konfiguraciji (sl. 2-4). Glavna se veza stvara između C1 jedne glukoze i C4 druge glukoze. Uz to glikogen i jedan oblik škroba (amilopektin) sadrže ponegdje veze α(1→6) u kojima je C1 jedne glukoze povezan s C6 druge glukoze. Iz prikaza na slici 2-4 očito je da te veze dovode do grananja, jer povezuju dva zasebna lanca izgrađena vezama α(1→4). Razgranatost postoji samo u glikogenu i amilopektinu, dok drugi oblik škroba (amiloza) nije razgranat. Glikogen i škrob imaju osim načelno slične strukture i sličnu funkciju -- da uskladište glukozu. Nasuprot tome funkcija celuloze bitno je različita. Celuloza je glavni gradbeni sastojak staničnog zida u bilju. Možda iznenađuje da je i celuloza sazdana samo od molekula glukoze. Međutim, celuloza je nerazgranati polisaharid, a glukozne jedinice u celulozi nisu α-, nego su β-konfiguracije. Veza β(1→4) između glukoznih jedinica, za razliku od veza α(1→4), uvjetuje stvaranje ispruženih lanaca celuloze koji se bočno združuju i oblikuju vlakna velike mehaničke čvrstoće. Polisaharidi i oligosaharidi uz energetsku i konstrukcijsku ulogu važni su u brojnim informacijskim procesima. Primjerice, oligosaharidi su često vezani na proteine gdje imaju značajnu ulogu u proteinskom smatanju te obilježavanju i usmjerivanju proteina pri transportu na površinu stanice ili ugradbu u različite stanične organele. Oligosaharidi i polisaharidi također obilježavaju staničnu površinu pa stoga Lipidi imaju tri izrazite uloge u stanicama. 1) Osiguravaju važan oblik uskladištene energije, 2) lipidi su glavni sastojci staničnih membrana, što je osobito važno u staničnoj biologiji, i 3) lipidi su vrlo važni u staničnoj signalizaciji, bilo kao steroidni hormoni (npr. estrogen i testosteron), bilo kao glasničke molekule koje prenose signal od receptora na staničnoj površini do odredišta unutar stanice. Najjednostavniji lipidi su masne kiseline. Sastoje se od dugih ugljikovodičnih lanaca, koji na jednom kraju završavaju karboksilnom skupinom (COO-- )(sl. 2-5). Ugljikovodični lanci najčešće sadrže 16 ili 18 ugljikovih atoma. Nezasićene masne kiseline sadrže jednu ili više dvostrukih veza među ugljikovim atomima. U zasićenim masnim kiselinama svi atomi ugljika vežu maksimalni broj vodikovih atoma. Dugi ugljikovodični lanci masnih kiselina sadrže samo nepolarne veze C-H koje ne ulaze u interakciju s vodom. Hidrofobna narav masnokiselinskih lanaca odgovorna je za ključno ponašanje kompleksnih lipida u stvaranju bioloških membrana. Masne se kiseline pohranjuju u obliku triacilglicerola, ili masti. Triacilgliceroli sadrže tri masne kiseline povezane s molekulom glicerola (sl. 2-6). Netopljivi su u vodi pa se u citoplazmi gomilaju kao masne nakupine. Glasnička RNA (mRNA) nosi informaciju od DNA do ribosoma, gdje služi kao kalup za sintezu proteina. Druga dva tipa RNA (ribosomska RNA i transfer-RNA) sudjeluju u sintezi proteina. Ostali tipovi RNA uključeni su u procesuiranje i prijenos ribonukleinskih kiselina i proteina. Osim što djeluje kao informacijska molekula RNA je također sposobna katalizirati neke kemijske reakcije. U današnjim stanicama takve su reakcije uključene u sintezu proteina i procesuiranje RNA. DNA i RNA su nukleotidni polimeri koji sadrže purinske i pirimidinske baze vezane na fosforilirane šećere (sl. 2-10). DNA sadrži dva purina (adenin i gvanin) i dva pirimidina (citozin i timin). Adenin, gvanin i citozin također su prisutni u RNA, ali RNA sadrži uracil umjesto timina. Baze se vežu na šećere (2\'-deoksiribozu u DNA, ili ribozu u RNA) da nastanu nukleozidi. Nukleotidi dodatno sadrže jednu ili više fosfatnih skupina vezanih na 5\'-ugljik nukleozidnog šećera. Polimerizacija nukleotida kojom se oblikuju nukleinske kiseline, uključuje stvaranje fosfodiesterskih veza između 5\'-fosfata jednog nukleotida i 3\'-hidroksila drugog nukleotida (sl. 2-11). Oligonukleotidi su oligomeri koji sadrže samo nekoliko nukleotida. Veliki polinukleotidi koji čine RNA i DNA mogu sadržavati tisuće i milijune nukleotida. Vrijedno je istaknuti da je polinukleotidni lanac usmjerena molekula kojoj je na jednom kraju 5\'-fosfat, a na drugom 3\'-hidroksilna skupina. Polinukleotidi se uvijek sintetiziraju u smjeru od 5\' prema 3\', tako da se slobodni nukleotid dodaje na 3\'-OH-skupinu rastućeg lanca. Dogovorno slijed baza u DNA i RNA također se ispisuje u smjeru od 5\' prema 3\'. Informacija u DNA i RNA prosljeđuje se slijedom baza u polinukleotidu. DNA je dvostrana molekula koja se sastoji od dva polinukleotidna suprotno usmjerena lanca (v. pogl. 3). Informacija u DNA i RNA priopćuje se slijedom baza u polinukleotidu. DNA je dvostruka molekula koja se sastoji od dva suprotno usmjerena polinukleotidna lanca (v. pogl. 3). Baze su u unutrašnjosti molekule i vodikove veze između komplementarnih parova baza povezuju dva lanca. Adenin se sparuje s timinom, a gvanin s citozinom (sl. 2-12). Bitna posljedica takvog komplementarnog povezivanja baza jest da jedan lanac DNA (ili RNA) može djelovati kao kalup koji usmjeruje sintezu komplementarnog lanca. Nukleinske kiseline imaju, dakle jedincatu sposobnost samoreplikacije i zato u stanici djeluju kao osnovne informacijske molekule. Informacijski sadržaj u DNA i RNA usmjeruje sintezu specifičnih proteina koji nadziru većinu staničnih aktivnosti. Osim što su građevne jedinice nukleinskih kiselina, nukleotidi imaju i druge ključne uloge u staničnim procesima. Najistaknutiji primjer je adenozin-5\'-trifosfat (ATP), koji je glavni oblik kemijske energije unutar stanica. Slično djeluju i drugi nukleotidi koji u brojnim metaboličkim reakcijama donose energiju ili aktivirane kemijske skupine. Neki nukleotidi (primjerice ciklički AMP) važne su signalne molekule unutar stanica. Proteini su polimeri sastavljeni od dvadeset različitih aminokiselina. Svaka se aminokiselina sastoji od ugljikovog atoma (nazvanog α-ugljik) povezanog s karboksilnom skupinom (COO-- ), amino-skupinom (NH3+), vodikovim atomom i prepoznatljivim bočnim ogrankom (sl. 2-13). Specifična kemijska svojstva aminokiselinskih bočnih ogranaka određuju uloge svake pojedine aminokiseline u proteinskoj strukturi i funkciji Aminokiseline su međusobno povezane peptidnim vezama između α-amino-skupine jedne aminokiseline i α-karboksilne skupine druge (sl. 2-15). Polipeptidi su dugi linearni lanci koji sadrže stotine ili tisuće aminokiselina. Svaki polipeptidni lanac ima dva različita kraja, jedan koji završava α-amino-skupinom (amino- ili N-kraj ili N-terminus) i drugi, koji završava α-karboksilnom skupinom (karboksi- ili C-terminus ili C-kraj). Polipeptidi se sintetiziraju nizanjem aminokiselina na C-kraju. Općenito se proteinska struktura opisuje na četiri razine. Primarna struktura proteina je slijed aminokiselina u proteinskom lancu. Sekundarna struktura je pravilni lokalni raspored aminokiselina unutar određene regije polipeptida. 1951. Linus Pauling i Robert Corey uočili su dva najčešća tipa sekundarne strukture: α-uzvojnicu i β-ploču. Obje te sekundarne strukture učvršćene su vodikovim vezama između CO i NH skupina peptidnih veza. α-Uzvojnica nastaje kad se dio polipeptidnog lanca ovija oko svoje osi, tako da CO skupina jedne peptidne veze stvori vodikovu vezu s NH-skupinom peptidne veze četvrte aminokiseline u aminokiselinskom nizu polipeptida. Tercijarna struktura je smotanost polipeptidnog lanca koja nastaje kao posljedica interakcija između bočnih ogranaka aminokiselina iz različitih regija u primarnom slijedu (sl. 2-20). U većini proteina α-uzvojnice i β-ploče, povezane regijama petlji smataju se u kompaktne globularne strukture nazvane domenama i čine osnovne jedinice tercijarne strukture. Mali proteini, kao što su ribonukleaza ili mioglobin, sadrže samo jednu domenu; veći proteini mogu sadržavati više različitih domena koje su često povezane s različitim funkcijama. Prema molekularnoj terminologiji gen se može definirati kao dio DNA koji se eksprimira u obliku funkcionalnog produkta i to bilo u obliku RNA (primjerice ribosomske i transportne RNA) bilo u obliku polipeptida. Neke od nekodirajućih DNA u eukariota ubrajaju se u duge DNA-sljedove koji leže u prostorima između gena (razdvojni sljedovi, engl. spacer sequences). Međutim, unutar većine eukariotskih gena također se nalaze velike količine nekodirajuće DNA. Takvi geni imaju podijeljenu strukturu u kojima su segmenti kodirajućih sljedova (egzoni) razdvojeni s pomoću nekodirajućih sljedova (intervenirajuće sekvence ili introni) (sl. 5-2). Prepisivanjem čitavog gena nastaje dugačka molekula RNA (pre-mRNA, op. prev.), a onda se introni uklanjaju procesom prekrajanja (engl. splicing) tako da u molekuli RNA ostaju samo egzoni. Iako većina introna ne određuje sintezu proteinskog proizvoda, oni imaju neke druge važne stanične aktivnosti. Mnogi introni kodiraju funkcionalne RNA, uključujući male nukleolarne RNA koje rade na obradbi ribosomske RNA (v. pogl. 9) i mikroRNA koje predstavljaju značajne regulatore genske ekspresije u eukariotskim stanicama (v. pogl. 7 i 8). Introni sadrže regulacijske sljedove koji kontroliraju transkripciju i obradbu mRNA. Osim toga, prisutnost introna omogućuje egzonima jednog gena spajanje u različitim kombinacijama što rezultira sintezom različitih proteina na temelju jednog te istog gena. Ovaj proces pod imenom alternativno prekrajanje (engl. alternative splicing) (sl. 5-5) zbiva se često u genima složenih eukariota. Na primjer, misli se da većina humanih gena alternativnim prekrajanjem može po prilici dati prosječno pet različitih mRNA, pa alternativno prekrajanje značajno povećava funkcionalni repertoar 20.000 do 25.000 gena humanog genoma. Daljnje analize, koje su svoj vrhunac doživjele sekvenciranjem čitavih genoma, identificirale su nekoliko vrsta ovakvih visokoponavljajućih sljedova (tabl. 5-2). Jedna od tih vrsta nazvana ponavljanja jednostavnih sljedova (engl. simple-sequence repeats), sastoji se od uzastopno ponavljajućih nizova do nekoliko tisuća kopija kratkih sljedova duljine od 1 do 500 nukleotida. Primjerice, jedan tip ponavljanja jednostavnih sljedova u vinske mušice sastoji se od uzastopnih ponavljanja jedinice od sedam nukleotida ACAAACT. Zbog njihova jedinstvenog sastava, mnoge ponovljene jednostavne DNA mogu se izdvojiti iz ostatka genomske DNA ravnotežnim centrifugiranjem u gradijentima gustoće CsCl. Gustoća DNA određena je sastavom baza, pa sljedovi bogati AT-bazama posjeduju manju gustoću negoli sljedovi bogati GC-bazama. Zbog toga, jednostavni slijed bogat AT-bazama smješta se u gradijentima CsCl u području manje gustoće od velike većine genomske DNA vinske mušice (sl. 5-7). Budući da ovakvi ponavljajući sljedovi čine prugu u obliku »satelita« odvojenih od glavne pruge DNA, često se o njima govori kao o satelitnim DNA. Ovi sljedovi ponavljaju se na milijune puta u genomu pa čine oko 10% DNA u većine viših eukariota. Ponavljanja jednostavnih sljedova ne prepisuju se i ne prenose funkcionalnu genetičku informaciju. Neka ipak igraju važnu ulogu u strukturiranju kromosoma, o čemu ćemo raspravljati u sljedećem odlomku ovoga poglavlja. Ostali ponavljajući sljedovi DNA prije su raštrkani po genomu negoli nakupljeni u obliku uzastopnih ponavljanja. Ovi razbacani ponavljajući elementi najviše pridonose veličini genoma čineći otprilike 45% ljudske genomske DNA. Dvije najčešće vrste takvih sljedova zovu se SINE (engl. short interspersed elements) tj. kratki razbacani elementi i LINE (engl. long interspersed elements) tj. dugi raspršeni elementi. SINE j fiziologiji. I SINE i LINE su primjeri pokretnih elemenata koji se mogu pomicati na različita mjesta u genomskoj DNA. Kao što se detaljno raspravlja u 6. poglavlju, i SINE i LINE su retrotranspozoni, pa se njihova transpozicija odvija preko reverzne transkripcije (sl. 5-8). RNA-kopija SINE ili LINE u stanici se pretvara u DNA uz pomoć reverzne transkriptaze, pa se ugrađuje na drugom mjestu u genomu. Razbacani repetitivni sljedovi treće vrste također se pomiču unutar genoma uz pomoć reverzne transkriptaze, jako su nalik na retroviruse, pa se stoga i zovu retrovirusu slični elementi Kao što bi se i moglo očekivati, sve mutacije ipak ne poboljšavaju funkciju gena. Neke kopije gena umjesto toga imaju održane mutacije koje rezultiraju gubitkom sposobnosti za proizvodnju funkcionalnoga genskog produkta. Primjerice, svaka od ljudskih α- i β-globinskih genskih porodica sadržava dva gena koji su bili inaktivirani mutacijom. Ovakve nefunkcionalne kopije gena (zvane pseudogeni) predstavljaju evolucijske relikte koji povećavaju veličinu eukariotskih genoma, a ne daju nikakav funkcionalni genetički doprinos. Nedavno je identificirano više od 20.000 pseudogena u humanom genomu. Budući da se općenito pretpostavlja da je to preniska procjena, vjerojatno je da naš genom posjeduje puno više pseudogena negoli funkcionalnih gena. Ne samo da su genomi većine eukariota daleko složeniji od onih u prokariota, nego je također DNA eukariotskih stanica organizirana drugačije od prokariotskih. Genom prokariota sadržan je u jednom kromosomu koji je obično kružna molekula DNA. Za razliku od toga, genom eukariota sastavljen je od više kromosoma od kojih svaki sadržava linearnu molekulu DNA. Iako broj i veličina kromosoma značajno variraju među vrstama (tabl. 5-3), osnovna im je struktura jednaka u svih eukariota. DNA eukariotskih stanica čvrsto je vezana na male bazične proteine (histone) koji u staničnoj jezgri pravilno pakiraju DNA. To je poprilična zadaća s obzirom na količinu DNA većine eukariota. Primjerice, ukupna duljina rastegnute DNA u ljudskoj stanici iznosi skoro 2 m, a mora se uklopiti u jezgru čiji je promjer svega 5 do 10 μm. Kromatin Kompleks između eukariotske DNA i proteina zove se kromatin, a tipično sadržava dvostruko više proteina nego DNA. Glavni proteini kromatina su histoni, mali proteini koji sadržavaju veliku količinu bazičnih aminokiselina (arginin i lizin) koje olakšavaju vezanje na negativno nabijenu molekulu DNA. Postoji pet velikih tipova histona koji se zovu H1, H2A, H2B, H3 i H4, a vrlo su slični u različitih eukariotskih vrsta Osnovnu strukturnu jedinicu kromatina, nukleosom, opisao je 1974. godine Roger Kornberg (sl. 5-11). Dva tipa pokusa dovela su Kornberga do predlaganja nukleosomskog modela. Prvo, djelomična razgradnja kromatina s pomoću mikrokokalne nukleaze (enzim koji razgrađuje DNA) proizvela je fragmente DNA duge oko 200 parova baza. Za razliku od toga, slična razgradnja gole DNA (koja nije bila vezana s proteinima) dala je jednolični razmaz slučajno razgrađenih fragmenata različitih veličina. Ovi rezultati dali su naslutiti da vezanje proteina na DNA štiti određena područja DNA od razgradnje nukleazom tako da enzimi mogu napasti DNA samo na mjestima koja su udaljena oko 200 parova baza. Stupanj kondenzacije kromatina mijenja se tijekom životnog ciklusa stanice te igra značajnu ulogu u regulaciji genske ekspresije o čemu će se raspravljati u poglavlju 7. U interfaznim stanicama (stanicama koje se ne dijele) većina kromatina (nazvanog eukromatin) relativno je dekondenzirana i proširena kroz cijelu jezgru (sl. 5-14). Tijekom ove faze staničnoga ciklusa geni se prepisuju, a DNA se udvostručuje u sklopu pripreme za diobu stanice. Većina kromatina interfazne jezgre prisutna je, izgleda, u obliku vlakana debljine 30 nm ili u nešto kondenziranijem kromatinskom vlaknu od 60 do 130 nm. Geni koji se aktivno prepisuju dekondenziraniji su, što čini molekulu DNA pristupačnijom transkripcijskoj mašineriji. Za razliku od eukromatina, otprilike 10% interfaznog kromatina (nazvanog heterokromatin) nalazi se u vrlo kondenziranom stanju nalik na ono u kojem se nalazi kromatin tijekom mitoze stanice. Heterokromatin je transkripcijski neaktivan i sadržava visokoponavljajuće sljedove DNA poput onih koji su prisutni u centromerama i telomerama Centromere zapravo imaju dvostruku ulogu, prvo kao mjesta udruživanja sestrinskih kromatida i drugo kao mjesta na koja se prihvaćaju mikrotubuli diobenoga vretena. Sastoje se od specifičnih sljedova DNA na koje se veže određeni broj centromeri pridruženih proteina koji formiraju specijaliziranu strukturu koja se zove kinetohora (sl. 5-19). Vezanje mikrotubula na kinetohorne proteine posreduje vezanju kromosoma na mitotičko vreteno. Proteini vezani na kinetohore tada djeluju kao »molekularni motori« koji upravljaju kretanjem kromosoma duž vlakana vretena razdvajajući tako kromosome u jezgre-kćeri. Usprkos velikim naporima, nije se moglo identificirati specifične sekvence DNA koje posreduju centromernu funkciju u eukariota osim u S. cerevisiae. S druge strane, pokazalo se da kromatin na centromerama ima jedinstvenu strukturu. U centromernom kromatinu histon H3 zamijenjen je H3-sličnom varijantom koja se zove centromerni H3 (CenH3) ili CENP-A. U svih proučenih organizama uvijek se u centromerama našao CenH3, a nukleosomi koji sadrže CenH3 potrebni su za sastavljanje ostalih kinetohornih proteina potrebnih za funkciju centromera. Tako izgleda da je prije struktura kromatina negoli specifičan slijed DNA primarna determinanta identiteta i funkcije centromera. Važno je da prisutnost jedinstvene kromatinske strukture dozvoljava centromerama da se stabilno održavaju tijekom stanične diobe čak i u odsutnosti specifičnog centromernog slijeda DNA. To je jedan od primjera epigenetičkog nasljeđivanja tj. prijenosa poruke sa roditelja na potomstvo koja nije zasnovana na slijedu DNA. Telomerni sljedovi DNA različitih eukariota slični su i sadržavaju ponavljajuće jednostavne sljedove DNA s nakupinama G-ostataka u jednom lancu (tabl. 5-5). Primjerice, slijed telomernih ponavljanja u čovjeka i ostalih sisavaca je TTAGGG, a telomerno ponavljanje u Tetrahymeni je TTGGGG. Ovi su sljedovi ponovljeni stotinama ili tisućama puta i završavaju s jednim jednolančanim repom DNA. Ponavljajući sljedovi telomerne DNA nekih organizama (uključujući čovjeka) čine omče na krajevima kromosoma te vežu proteinski kompleks koji čuva kromosomske krajeve od razgradnje (sl. 5-23). polimeraza I je prvenstveno uključena u popravak oštećene DNA; danas znamo da i prokariotske i eukariotske stanice sadržavaju nekoliko DNA-polimeraza koje imaju različite uloge u replikaciji i popravku DNA. Kod prokariotskih stanica polimeraza III je glavna polimeraza odgovorna za replikaciju DNA. Eukariotske stanice imaju tri DNA-polimeraze (α, δ, ε) koje sudjeluju u replikaciji jezgrine DNA. U mitohondriju se nalazi zasebna DNA-polimeraza (γ) koja je odgovorna za replikaciju mitohondrijske DNA. Sve poznate DNA-polimeraze dijele dva osnovna svojstva koja su od presudne važnosti za replikaciju DNA (sl. 6-1). Prvo, sve polimeraze sintetiziraju DNA samo u 5\' → 3\' smjeru dodajući dNTP na 3\' hidroksilnu skupinu rastućeg lanca. Drugo, DNA-polimeraze mogu dodati nove dNTP samo na prethodno formirani lanac početnice koji je vodikovim vezama spojen s kalupom; one nisu u mogućnosti započeti sintezu DNA de novo katalizirajući polimerizaciju slobodnih dNTP.. U nekim slučajevima mogle su se opaziti kompletne kružne molekule u procesu replikacije. Ove molekule DNA sadržavale su dvoje replikacijske rašlje koje predstavljaju područja sinteze DNA. U svakim rašljama roditeljski lanci molekule DNA su se razdvojili i sintetizirala su se dva nova lanca-kćeri. Proces sinteze novih lanaca DNA komplementarnih lancima roditeljske molekule DNA postavio je važno pitanje za razumijevanje biokemijskih procesa uključenih u replikaciju DNA. Budući da lanci dvolančane DNA uzvojnice teku u suprotnim (antiparalelnim) smjerovima, kontinuirana sinteza dvaju novih lanaca u replikacijskim rašljama zahtijevala bi da jedan lanac bude sintetiziran u 5\' → 3\' smjeru, dok se drugi sintetizira u suprotnom (3\' → 5\') smjeru. No, DNA-polimeraza katalizira polimerizaciju dNTP samo u 5\' → 3\' smjeru. Kako se onda vrši sinteza drugog lanca DNA? Ova enigma riješena je eksperimentima koji su pokazali da se samo jedan lanac molekule DNA sintetizira kontinuirano u smjeru sveukupne replikacije DNA dok se drugi formira iz kratkih diskontinuiranih fragmenata DNA (1--3 kb) koji se sintetiziraju unatrag u odnosu na smjer kretanja replikacijskih rašlji (sl. 6-3). Ovi mali fragmenti novosintetizirane DNA (nazvani Okazakijevi fragmenti, prema japanskom biokemičaru Reiji Okazakiju koji ih je otkrio) spajaju se djelovanjem DNA-ligaze stvarajući cjeloviti novi lanac DNA. Kontinuirano sintetizirani lanac naziva se vodeći lanac jer njegovo produljenje u smjeru kretanja replikacijske rašlje izlaže kalup koji se koristi za sintezu Okazakijevih fragmenata (zaostajući ili tromi lanac). Za razliku od sinteze DNA, sinteza RNA može započeti de novo, a enzim nazvan primaza sintetizira kratke fragmente RNA (primjerice dugačke 3--10 nukleotida) komplementarne kalupu tromoga lanca u replikacijskim rašljama. Okazakijevi se fragmenti zatim sintetiziraju produljenjem ovih RNA-početnica djelovanjem DNA-polimeraze. Otkriće RNA-DNA spojeva u novosintetiziranim Okazakijevim fragmentima pružilo je ključni dokaz za ulogu RNA-početnica u replikaciji DNA. Da bi se formirao kontinuirani zaostajući (tromi) lanac DNA, RNA-početnice moraju se na kraju ukloniti iz Okazakijevih fragmenata i zamijeniti sljedovima DNA (sl. 6-5). Kod prokariota, RNA-početnice se uklanjaju djelovanjem polimeraza I. Uz tu njenu DNA-polimeraznu aktivnost, DNApolimeraza djeluje kao egzonukleaza koja može hidrolizirati DNA (ili RNA) bilo u 3\' → 5\' ili u 5\' → 3\' smjeru. 5\' → 3\' egzonukleazna aktivnost polimeraze I uklanja ribonukleotide s 5\' krajeva Okazakijevih fragmenata te se oni zamjenjuju deoksiribonukleotidima kako bi se stvorili fragmenti u potpunosti građeni od sljedova DNA. U eukariotskim stanicama RNApočetnice se uklanjaju kombiniranim djelovanjem RNaze H, enzima koji degradira RNA lanac RNA-DNA hibrida, i 5\' → 3\' egzonukleaza. Pukotine koje pri tom nastaju popunjavaju se zatim polimerazom δ te se fragmenti DNA spajaju DNA-ligazom stvarajući intaktni tromi lanac. Kao što je ranije spomenuto, različite DNA-polimeraze imaju različite uloge u replikacijskim rašljama i kod prokariotskih i kod eukariotskih stanica (sl. 6-6). Glavna replikacijska polimeraza u E. coli je polimeraza III koja sintetizira i vodeći lanac DNA i Okazakijeve fragmente produljivanjem RNA-početnica. U eukariotskim stanicama, u replikaciju jezgrine DNA uključene su tri različite DNA-polimeraze (α, δ i ε). Uloge ovih DNApolimeraza proučavane su putem dva tipa eksperimenata. Drugo, polimeraze α, δ i ε nađene su u kvascima kao i u stanicama sisavaca što je omogućilo ispitivanje njihovih bioloških uloga primjenom različitih pristupa u studijama genetike kvasca (v. pogl. 4). Biokemijske analize utvrdile su da se polimeraza α nalazi u kompleksu s primazom i da zajedno s njom djeluje u sintezi kratkih RNA-DNA fragmenata tijekom sinteze tromog lanca i u ishodištima replikacije (v. sl. 6-12). Polimeraze δ i ε zatim djeluju kao glavne replikacijske polimeraze i smatra se da su odgovorne za sintezu i vodećega i tromoga lanca. I polimeraza III E. coli i eukariotske polimeraze δ i ε združene su s proteinima klizajuće stezaljke (engl. sliding-clamp proteins) (kod eukariota je to jezgreni antigen za proliferaciju stanica, PCNA -- engl. proliferating cell nuclear antigen). Ti proteini postavljaju polimerazu na početnicu i održavaju njezinu stabilnu povezanost s kalupom (sl. 6-7). Pomoću proteina za stavljanje stezaljke (engl. clamp-loading proteins) (kod eukariota je to replikacijski faktor C, RFC -- engl. replication factor C) proteini klizajuće stezaljke se postavljaju na DNA na mjestu spajanja početnice i kalupa. Za otvaranje klizajuće stezaljke proteini za stavljanje stezaljke koriste energiju koja potječe od hidrolize ATP. Proteini za stavljanje stezaljke zatim otpuštaju protein klizajuće stezaljke čime se stvara prsten oko DNA-kalupa. Protein klizajuće stezaljke smješta zatim DNApolimerazu na DNA na mjesto spajanja početnice i kalupa. Prsten stvoren klizajućom stezaljkom održava združenost polimeraze s njezinim kalupom tijekom procesa replikacije i tako omogućuje neometanu ugradnju više tisuća DNA nukleotida Drugi proteini razmotavaju DNA-kalup i stabiliziraju jednolančana područja (sl. 6-8). Helikaze su enzimi koji kataliziraju razmotavanje roditeljske DNA ispred replikacijskih rašlji što je povezano s hidrolizom ATP. Proteini koji vežu jednolančanu DNA (engl. single stranded DNA-binding proteins, primjerice eukariotski replikacijski faktor A, RFA) nakon toga stabiliziraju razmotani DNA-kalup održavajući ga u ispruženom jednolančanom stanju kako bi se mogao kopirati djelovanjem polimeraze. Dok se lanci roditeljske DNA razmataju, DNA ispred replikacijskih rašlji prisiljena je na rotaciju. Nekontrolirana rotacija dovela bi do toga da se kružne molekule DNA (kao što je DNA SV40 ili kromosomi E. coli) omotaju same oko sebe što bi na kraju blokiralo proces replikacije (sl. 6-9). Ovaj problem riješen je djelovanjem topoizomeraza, enzima koji kataliziraju reverzibilno kidanje i ponovno spajanje lanaca DNA. Postoje dvije vrste ovih enzima: topoizomeraze tipa I kidaju samo jedan lanac DNA, dok topoizomeraze tipa II istovremeno kidaju oba lanca. Prekidi nastali djelovanjem topoizomeraza služe kao osi koje omogućuju da se dva lanca DNA-kalupa slobodno rotiraju jedan oko drugoga tako da se replikacija može nastaviti bez uvijanja DNA ispred replikacijskih rašlji (v. sl. 6-9). Premda su eukariotski kromosomi građeni od linearnih, a ne kružnih molekula DNA, njihova replikacija također zahtijeva djelovanje topoizomeraza jer bi se u suprotnom kompletni kromosomi morali kontinuirano rotirati za vrijeme sinteze DNA. Topoizomeraza tipa II potrebna je ne samo za razmotavanje DNA već i za razmotavanje novorepliciranih kružnih molekula DNA koje su postale međusobno isprepletene. Čini se da je topoizomeraza tipa II u eukariotskim stanicama također uključena u kondenzaciju mitotičkih kromosoma Zaostajući lanac stvara petlju u replikacijskim rašljama tako da se podjedinica polimeraze uključena u sintezu tromoga lanca kreće u istom sveukupnom smjeru kao druga podjedinica koja sintetizira vodeći lanac. Polimeraza zaostajućeg lanca disocira sa DNA kada dosegne kraj jednog Okazakijevog fragmenta. Kako je vezana na protein za stavljanje stezaljke, efikasno se može ponovno postaviti na novu klizajuću stezaljku na mjestu spajanja početnice i kalupa kako bi započela sintezu sljedećeg Okazakijevog fragmenta. Preciznost umnažanja DNA kritična je za stanično razmnožavanje, a procjena mutacijskih stopa za različite gene pokazuje da učestalost pogrješaka tijekom replikacije odgovara samo jednoj pogrješno ugrađenoj bazi na svakih 109 do 1010 ugrađenih nukleotida. Ova učestalost pogrješaka znatno je manja od one koja bi se mogla predvidjeti samo na osnovi komplementarnosti sparivanja baza. Konkretno, razlika u slobodnoj energiji koja proistječe iz promjena u sparivanju vodikovim vezama između korektno i nekorektno sparenih baza je tek tolika da favorizira stvaranje komplementarnoga baznog para za svega tisuću puta. Zbog toga bi izbor baza reguliran samo sparivanjem vodikovim vezama na temelju komplementarnosti rezultirao učestalošću pogrješaka koja odgovara ugradnji jedne pogrješne baze na otprilike svakih 100 nukleotida novosintetiziranog lanca DNA. Mnogo veći stupanj vjernosti replikacije koji se u stvari postiže proistječe uglavnom iz aktivnosti DNA-polimeraze. Jedan od mehanizama kojim DNA-polimeraza povećava vjernost replikacije jest taj da pomaže u izboru odgovarajuće baze za ugradnju u novosintetizirani lanac. Polimeraza ne katalizira ugradnju bilo kojeg nukleotida koji je vodikovim vezama povezan s lancem kalupa već se prilagođava konformaciji komplementarnoga baznog para i na taj način aktivno onemogućuje ugradnju pogrješne baze. Nedavna ispitivanja strukture nekoliko DNA-polimeraza upućuju na to da vezanje korektno sparenih dNTP stvara konformacijske promjene u DNA-polimerazi koje dovode do ugradnje nukleotida u DNA. Ova sposobnost DNA-polimeraze da odabere odgovarajuće nukleotide za ugradnju povećava preciznost replikacije za oko tisuću puta smanjujući time očekivanu učestalost pogrješaka na oko 10--5. Drugi glavni mehanizam odgovoran za preciznost replikacije DNA je korektivna (engl. proofreading) aktivnost DNA-polimeraze. Replikacijske polimeraze (eukariotske polimeraze δ i ε te polimeraza III E. coli) posjeduje egzonukleaznu aktivnost koja hidrolizira DNA u 3\'→5\' smjeru. Ova 3\'→5\' egzonukleaza djeluje u suprotnom smjeru od smjera sinteze DNA i sudjeluje u provjeravanju točnosti novosintetiziranog lanca DNA (sl. 6-11). Korektivno odčitavanje je djelotvorno jer DNA-polimeraza zahtijeva početnicu i ne može započeti sintezu de novo. Preferiraju se početnice koje su vodikovim vezama vezane za kalup tako da kada dođe do ugradnje pogrješne baze vrlo je vjerojatno da se ona ne će iskoristiti za nastavak sinteze, već će se ukloniti 3\'→5\' egzonukleaznom aktivnošću DNA-polimeraze. 3\'→5\' egzonukleaze replikacijskih DNA-polimeraza selektivno uklanjaju nepravilno sparene baze ugrađene na kraj rastućeg lanca DNA i time povećavaju vjernost replikacije za sto do tisuću puta. Važnost korektivnog odčitavanja novosintetiziranog lanca mogla bi objasniti zašto DNA-polimeraze zahtijevaju prisutnost početnica i kataliziraju sintezu lanaca DNA samo u 5\'→3\' smjeru. Kad se DNA sintetizira u 5\'→3\' smjeru energija potrebna za polimerizaciju proistječe iz hidrolize 5\' trifosfatne skupine slobodnog dNTP do koje dolazi kad se isti dodaje na 3\' hidroksilnu skupinu rastućega lanca (v. sl. 6-1). Kad bi se DNA produljivala u 3\'→5\' smjeru, energija polimerizacije morala bi potjecati iz hidrolize 5\' trifosfatne skupine terminalnih nukleotida već ugrađenih u DNA. To bi onemogućilo korektivno odčitavanje zbog toga što bi pri takvoj sintezi uklanjanje nepravilno sparenoga terminalnog nukleotida istovremeno uklonilo 5\' trifosfatnu skupinu potrebnu kao izvor energije za daljnje produljenje lanca. Prema tome, iako sposobnost DNA-polimeraze da produljuje Slika 6-11. Korektivna aktivnost DNApolimeraze. G je ugrađen umjesto A kao rezultat pogrješnog sparivanja s T na lancu kalupa. Zbog toga što je pogrješno sparen G na 3\' kraju novosintetiziranoga lanca nije vezan vodikovom vezom s lancem kalupa. Ovo pogrješno sparivanje na 3\' kraju rastućeg lanca prepoznato je i izrezano 3\'→5\' egzonukleaznom aktivnošću DNA-polimeraze koja, da bi nastavila sintezu, zahtijeva početnicu spojenu vodikovim vezama s lancem kalupa. Nakon izrezivanja pogrješno sparenog G, sinteza DNA može se nastaviti ugradnjom odgovarajućega nukleotida (A). REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 211 početnice samo u 5\'→3\' smjeru čini replikaciju na izgled kompliciranom, ona je nužna da bi osigurala precizno umnažanje genetičkog materijala. Uz sposobnost da razlikuje ugradnju pogrješno sparene baze, korektivna aktivnost DNA-polimeraze dovoljna je da smanji učestalost pogrješaka pri replikaciji na otprilike jednu pogrješno sparenu bazu na svakih 107 --108 ugrađenih nukleotida. Kako bi se uklonile pogrješno sparene baze ugrađene u novosintetiziranu DNA, djeluju dodatni mehanizmi (prikazani u odjeljku Popravak DNA) koji smanjuju stopu pogrješke na manje od 10-9. Ishodište i inicijacija replikacije Umnažanje prokariotskih i eukariotskih DNA započinje na jedinstvenom mjestu zvanom ishodište replikacije koje služi kao specifično vezno mjesto za proteine koji iniciraju proces replikacije. Prvo ishodište replikacije opisano je u E. coli kod koje umnažanje uvijek započinje na jedinstvenom mjestu bakterijskog kromosoma. Detaljnije analize su pokazale da je ishodište replikacije građeno od 245 parova baza čiji dijelovi služe kao vezna mjesta za proteine potrebne za inicijaciju replikacije DNA (sl. 6-12). Ključni korak je vezanje inicijacijskog proteina za specifični slijed nukleotida unutar ishodišta čime započinje razmatanje dvostruke uzvojnice. Osim toga, inicijacijski protein regrutira i druge proteine uključene u sintezu DNA. Nakon toga helikaza i proteini koji vežu jednolančanu DNA djeluju u daljnjem razmotavanju DNA-kalupa, a primaza započinje sintezu vodećih lanaca. Formiraju se dvije replikacijske rašlje u kojima sinteza teče u suprotnim smjerovima uzduž kružnoga kromosoma E. coli. Proučavanje ishodišta replikacije nekoliko animalnih virusa kao što je SV40 poslužilo je kao model za istraživanje započinjanja sinteze DNA u eukariota. SV40 posjeduje jedno ishodište replikacije (građeno od 64 parova baza) koje funkcionira i u inficiranim stanicama i u bestaničnim sustavima. Replikaciju započinje protein kodiran virusnim genomom (T-antigen) koji se veže za ishodište replikacije i istodobno djeluje kao helikaza. Za stabilizaciju razmotanoga kalupa potrebna je prisutnost proteina koji se veže za jednolančanu DNA, a zatim kompleks DNA-polimeraze i α-primaze započinje sintezu DNA. Premda su jednostruka ishodišta dovoljna za replikaciju bakterijskih i virusnih genoma, za replikaciju mnogo većih genoma eukariotskih stanica Slika 6-12. Ishodište replikacije E. coli. Replikacija započinje u jedinstvenom ishodištu na kromosomu E. coli označenom s ori (engl. origin). Prvi korak je vezanje inicijacijskog proteina za ori slijed u molekuli DNA što dovodi do djelomičnog odmotavanja kalupne DNA. Odmotavanje DNA se nastavlja djelovanjem helikaze i proteina koji vežu jednolančanu DNA, a primaza sintetizira RNA-početnice. Dvije replikacijske rašlje stvorene u ishodištu kreću se zatim u suprotnim smjerovima uzduž kružne molekule DNA. 212 POGLAVLJE 6 unutar prihvatljivog vremenskog perioda potrebna je prisutnost višestrukih ishodišta replikacije. Tako se primjerice sveukupni genom E. coli (4 × 106 parova baza) replicira iz jednostrukog ishodišta za otprilike 30 minuta. Kad bi se genom sisavaca (3 × 109 parova baza) replicirao istom brzinom iz jednog ishodišta za replikaciju DNA bilo bi potrebno oko 3 tjedna (30.000 minuta). Također je poznato da je brzina replikacije DNA u stanicama sisavaca u stvari oko deset puta manja nego u E. coli, vjerojatno radi pakiranja eukariotske DNA u kromatin. Unatoč tomu, genomi stanica sisavaca uglavnom se repliciraju unutar nekoliko sati, što zahtijeva korištenje više tisuća ishodišta replikacije. Prisutnost višestrukih ishodišta replikacije u eukariotskim stanicama prvi je put pokazana izlaganjem kulture stanica sisavaca radioaktivnom timidinu unutar različitih vremenskih intervala što je praćeno autoradiografijom kako bi se detektirala novosintetizirana DNA. Rezultati takvih ispitivanja pokazali su da sinteza DNA započinje na više mjesta iz kojih se zatim nastavlja u oba smjera uzduž kromosoma (sl. 6-13). Ishodišta replikacije u stanicama sisavaca međusobno su udaljena za otprilike 50 do 300 kb -- prema tome humani genom ima oko 30.000 ishodišta replikacije. Genomi jednostavnijih eukariota također posjeduju višestruka ishodišta; tako primjerice replikacija u kvascima započinje u ishodištima međusobno udaljenim oko 40 kb. Ishodišta replikacije eukariotskih kromosoma prvi put su proučavana u kvascu S. cerevisiae u kojem su identificirani kao sljedovi koji podupiru replikaciju plazmida u transformiranim stanicama (sl. 6-14). To je ujedno bio funkcionalni test za ove sljedove i do sada je izolirano nekoliko takvih elemenata (nazvani autonomno replicirajući sljedovi ili ARSs -- engl. autonomously replicating sequences). Njihova uloga kao ishodišta replikacije potvrđena je izravnom biokemijskom analizom, ne samo u plazmidima već i u kromosomskoj DNA kvasaca. Funkcionalni ARS elementi obuhvaćaju oko 100 parova baza, uključujući slijed dug 11 parova baza koji je prisutan u mnogim različitim ARS elementima (sl. 6-15). Ovaj središnji slijed nuždan je za funkciju ARS elemenata te predstavlja vezno mjesto za proteinski kompleks od šest podjedinica (nazvan kompleks ishodišta replikacije ili ORC -- engl. origin replication complex) koji je potreban za započinjanje replikacije DNA u ishodištima S. cerevisiae. ORC-kompleks regrutira druge proteine (ukljuSlika 6-13. Ishodišta replikacije u eukariotskim kromosomima. Replikacija započinje u višestrukim ishodištima (ori) od kojih svako stvara dvoje replikacijske rašlje. REPLIKACIJA, ODRŽAVANJE I PRESLAGIVANJE GENOMSKE DNA 213 čujući MCM DNA-helikazu) prema ishodištu što dovodi do započinjanja replikacije. Stoga se čini da je mehanizam započinjanja replikacije DNA u S. cerevisiae sličan onome u prokariotskim i eukariotskim virusima -- inicijacijski protein se veže za specifični slijed DNA u ishodištu replikacije. Daljnja ispitivanja pokazala su da je uloga ORC-proteina kao inicijatora replikacije konzervirana u svim eukariotima od kvasaca do sisavaca. Ipak, ishodišta replikacije drugih eukariota nisu tako dobro definirana kao ARS elementi kvasca S. cerevisiae. Ishodišta replikacije u genomu kvasca S. pombe raspoređena su od 0,5 do 1 kb DNA. Ona nemaju jasno definirano Slika 6-14. Identifikacija ishodišta replikacije u kvascu. Oba plazmida, plazmid I i plazmid II, sadržavaju selektivni biljeg, gen (LEU2) koji transformiranim stanicama omogućuje rast u mediju bez leucina. Ipak, samo plazmid II sadržava ishodište replikacije (ARS). Transformacija stanica kvasca s plazmidom I daje samo rijetke transformante u kojima je plazmid integriran u kromosomsku DNA. Plazmid II je, međutim, sposoban replicirati se bez integracije u kromosom kvasca (autonomna replikacija) tako da njegov unos u stanice kvasca rezultira znatno većim brojem transformiranih stanica. 214 POGLAVLJE 6 vezno mjesto za ORC kao što su ARS elementi S. cerevisiae, ali sadržavaju ponavljajuće sljedove bogate AT-bazama koji služe kao vezno mjesto za ORC-kompleks. Kod vinske mušice i stanica sisavaca ORC-proteini ne prepoznaju specifične sljedove DNA. Umjesto toga moguće je da mjesta vezanja ORC i započinjanje replikacije DNA kod viših eukariota mogu biti određena izgledom strukture kromatina što tek preostaje za razjasniti tijekom budućih istraživanja. Telomere i telomeraze: održavanje krajeva kromosoma Budući da DNA-polimeraze produljuju početnice samo u 5\'→3\' smjeru, one ne mogu kopirati krajnje 5\' dijelove linearnih molekula DNA. Zbog toga su za replikaciju krajnjih sljedova linearnih eukariotskih kromosoma potrebni posebni mehanizmi. Krajnji sljedovi kromosoma (telomere) sastoje se od uzastopnih ponavljanja jednostavnih sljedova DNA (v. pogl. 5). Telomere se održavaju djelovanjem posebnog enzima, nazvanog telomeraza, koji je sposoban katalizirati sintezu telomera u odsutnosti DNA-kalupa. Telomeraza je reverzna transkriptaza, tip DNA-polimeraze koji sintetizira DNA na osnovi RNA-kalupa, a prvi je put otkrivena u retrovirusima (v. pogl. 4). Važno je napomenuti da je telomeraza enzimski kompleks koji sadržava svoj vlastiti RNA-kalup komplementaran s ponavljajućim telomernim sljedovima kromosoma. Korištenje RNA-kalupa omogućuje telomerazi da stvori višestruke kopije ponavljajućih sljedova telomera održavajući ih na taj način i u odsutnosti konvencionalnoga DNA-kalupa. Mehanizam aktivnosti telomeraze objasnili su Carol Greider i Elizabeth Blackburn 1985. godine proučavajući praživotinju Tetrahymena (sl. 6-16). Telomeraza Tetrahymene nalazi se u kompleksu sa 159 nukleotida dugom RNA koja sadržava slijed 3\'-AACCCCAAC-5\'. Većina oštećenja DNA popravlja se uklanjanjem oštećene baze nakon čega slijedi ponovna sinteza uklonjenog područja. Neka se oštećenja ipak mogu popraviti izravnim obratom oštećenja što može biti znatno učinkovitiji način borbe sa specifičnim tipovima oštećenja DNA koji se učestalo događaju. Samo nekoliko tipova oštećenja DNA popravlja se na ovaj način -- pirimidinski dimeri nastali kao rezultat izlaganja ultraljubičastom (UV) svjetlu i alkilirani gvaninski ostatci, modificirani dodatkom metilne ili etilne skupine na O6 poziciju purinskog prstena. UV-svjetlo jedno je od glavnih izvora oštećenja DNA, a također je najviše proučeni tip oštećenja u smislu mehanizama popravka. Na njegovu važnost upućuje činjenica da izlaganje Sunčevu UV-zračenju predstavljauzrok gotovo svih karcinoma kože u ljudi. Glavni tip oštećenja induciran UV-svjetlom jest formiranje pirimidinskih dimera u kojima su susjedni pirimidini na istom lancu DNA spojeni ciklobutanskim prstenom nastalim zasićenjem dvostruke veze između petoga i šestoga atoma ugljika (v. sl. 6-18A). Stvaranje ovakvih dimera narušava strukturu DNA i blokira transkripciju ili replikaciju nizvodno od mjesta oštećenja pa je njihov popravak usko povezan sa sposobnošću stanica da prežive UV-zračenje. Jedan od mehanizama za popravljanje pirimidinskih dimera induciranih UV-svjetlom je izravni obrat dimerizacijske reakcije. Proces se naziva fotoreaktivacija jer se za kidanje strukture ciklobutanskog prstena koristi energija vidljive svjetlosti (sl. 6-19). Fotoreaktivacijom se izvorne pirimidinske baze vraćaju u normalno stanje i ostaju u molekuli DNA. Kako je Sunčevo UVzračenje glavni izvor oštećenja molekule DNA u različitim tipovima stanica, logično je očekivati da je popravak pirimidinskih dimera fotoreaktivacijom zajedničko različitim prokariotskim i eukariotskim stanicama, uključujući E. coli, kvasce i neke vrste biljaka i životinja. Zanimljivo je, ipak, da fotoreaktivacija nije univerzalna; placentalni sisavci (uključujući čovjeka) nemaju ovaj mehanizam popravka DNA. Premda je izravni popravak učinkovit za određeni tip oštećenja DNA, popravak izrezivanjem je općenitiji način popravka široke skupine kemijskih promjena molekule DNA. Prema tome, različiti tipovi popravka izrezivanjem predstavljaju najvažnije mehanizme popravka DNA kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama. U popravku izrezivanjem, oštećena DNA biva prepoznata i uklonjena bilo u obliku slobodnih baza ili nukleotida. Nastala pukotina se zatim popunjava sintezom novog lanca DNA korištenjem neoštećenoga komplementarnog lanca kao kalupa. Tri tipa popravka izrezivanjem -- izrezivanje baza, izrezivanje nukleotida i poSlika 6-19. Izravni popravak timinskih dimera. Timinski dimeri inducirani UVsvjetlom mogu se popraviti fotoreaktivacijom, pri čemu energija vidljive svjetlosti služi za kidanje veza koje tvore ciklobutanski prsten. Slika 6-20. Popravak O6-metilgvanina. O6-metilgvanin-metiltransferaza prenosi metilnu skupinu s O6 -metilgvanina na cisteinski ostatak u aktivnom mjestu enzima. 220 POGLAVLJE 6 pravak pogrešno sparenih baza (engl. mismatch repair) -- omogućuju stanicama da se bore sa širokim spektrom različitih oštećenja DNA. Popravak molekule DNA koja sadržava uracil predstavlja dobar primjer popravka izrezivanjem baza, u kojem jedna oštećena baza biva prepoznana i uklonjena iz molekule DNA (sl. 6-21). Uracil se može pojaviti u DNA na dva načina: 1) Uracil (kao dUTP -- deoksiuridin-trifosfat) povremeno se ugrađuje na mjestu timina za vrijeme sinteze DNA; i 2) uracil se može pojaviti u DNA deaminacijom citozina (v. sl. 6-17A). Drugi mehanizam ima mnogo veći biološki značaj budući da mijenja normalni obrazac komplementarnog sparivanja baza i time predstavlja mutageni događaj. Izrezivanje uracila katalizirano je djelovanjem DNA-glikozilaze, enzima koji kida vezu između baze (uracila) i deoksiriboze u okosnici DNA. Ova reakcija stvara slobodni uracil i apirimidinsko mjesto -- šećer bez pridružene baze. DNA-glikozilaze također prepoznaju i uklanjaju druge nepravilne baze uključujući hipoksantin stvoren deaminacijom adenina, alkilirane purine (osim O6 -alkilgvanina) i baze oštećene oksidacijom ili ionizirajućim zračenjem. Rezultat aktivnosti DNA-glikozilaze jest formiranje apirimidinskog ili apurinskog mjesta (uobičajeno zvanim AP mjestom) u DNA. Slična AP mjesta nastaju kao rezultat spontanoga gubitka purinskih baza (v. sl. 6-17B), što se događa sa značajnom učestalošću u normalnim staničnim uvjetima. Procjenjuje se da na taj način svaka stanica u ljudskom tijelu dnevno gubi nekoliko tisuća purinskih baza. Ta se mjesta popravljaju djelovanjem AP-endonukleaze koja kida lanac DNA uz AP mjesto (v. sl. 6-21). Preostali se deoksiribozni ostatak zatim ukloni, a nastala pukotina od jedne baze popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze i ligaze. Dok DNA-glikozilaze prepoznaju samo specifične oblike oštećenih baza, drugi sustavi popravka izrezivanjem prepoznaju široku skupinu oštećenih baza koje narušavaju strukturu molekule DNA, uključujući pirimidinske dimere inducirane UV-zračenjem i velike skupine dodane bazama DNA kao rezultat interakcije različitih karcinogena s DNA (v. sl. 6-18C). Ovaj široko rasprostranjeni oblik popravka DNA poznat je kao popravak izrezivanjem nukleotida jer se oštećene baze (primjerice dimeri timina) uklanjaju kao dio oligonukleotida u kojem je došlo do oštećenja (sl. 6-22). Početni korak popravka izrezivanjem nukleotida u stanicama sisavaca uključuje prepoznavanje pogrješno sparenih baza s pomoću XPC proteina nakon kojeg slijedi kooperativno vezanje XPA, proteina koji se veže za jednolančanu DNA i replikacijski protein A (RPA) o kojemu je bilo riječi ranije u ovom poglavlju (v. sl. 6-8) te transkripcijskog faktora TFIIH koji se sastoji od više podjedinica i koji je potreban za početak transkripcije eukariotskih gena (v. pogl. 7). U nekim slučajevima, XPE može također imati ulogu u prepoznavanju oštećenja. XPB i XPD proteini su dvije podjedinice TFIIH, a djeluju kao helikaze koje odmotavaju oko 25 parova baza DNA oko mjesta oštećenja. Zatim se do tog kompleksa regrutira protein XPG, a odmah zatim i XPF kao heterodimer sa ERCC1 (protein popravka identificiran u staničnim linijama glodavaca osjetljivim na UV-zračenje). XPF/ERCC1 i XPG su endonukleaze koje kidaju DNA na 5\' i 3\' krajevima oštećenog mjesta. Tim se kidanjem izrezuje oligonukleotid duljine od otprilike 30 baza. Nastala pukotina popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze δ ili (uz suradnju RFC i PCNA) i ligaze. Iako oštećenja DNA mogu biti prepoznata bilo gdje u genomu, alternativni oblik popravka izrezivanjem nukleotida, zvan popravak udružen s transkripcijom, specifičan je za popravak oštećenja unutar gena koji se prepisuju (sl. 6-24). Veza između transkripcije i popravka gena prvi put je dokazana eksperimentima koji su pokazali da se lanac DNA koji se prepisuje popravlja znatno brže od lanca koji se ne prepisuje, kako u E. coli tako i u stanicama sisavaca. Budući da oštećenje DNA blokira transkripciju, stanica favorizira popravak za vrijeme transkripcije jer joj omogućuje da poglavito popravi oštećenja onih gena koji su aktivno eksprimirani. I kod E. coli i kod stanica sisavaca mehanizam povezanosti transkripcije i popravka uključuje prepoznavanje RNA-polimeraze zakočene pri oštećenju lanca DNA koji se prepisuje. Treći mehanizam popravka izrezivanjem prepoznaje pogrješno sparene baze ugrađene za vrijeme replikacije DNA. Mnoge od tih pogrješno sparenih baza uklanjaju se korektivnom aktivnošću DNA-polimeraze. Preostale pogrješno sparene baze objekt su kasnijeg korektivnog mehanizma zvanog popravak pogrješno sparenih baza (engl. mismatch repair system) koji provjerava novorepliciranu DNA. Mehanizmi ovog popravka sposobni su otkriti i specifično izrezati pogrješno sparenu bazu iz novosintetiziranoga lanca DNA omogućivši time popravak pogrješke i ponovno uspostavljanje izvornoga slijeda nukleotida. Obzirom da dvolančani lomovi djeluju na oba lanca DNA, oni se ne mogu popraviti mehanizmima koji zahtijevaju sintezu DNA preko oštećenog mjesta. Umjesto toga, dvolančani lomovi popravljaju se zasebnim mehanizmom, rekombinacijskim popravkom, koji ponovno spaja pocijepane lance. Stanice koriste dva osnovna puta rekombinacijskog popravka (v. sl. 6-28). Rekombinacija s homolognim sljedovima DNA na neoštećenom kromosomu (detaljnije opisano u sljedećem odjeljku ovog poglavlja) mehanizam je za popravak takvih oštećenja i obnavljanje normalnog slijeda DNA. Kod eukariotskih stanica ovaj mehanizam popravka operativan je jedino nakon replikacije DNA kada novostvorene sestrinske kromatide ostaju združene jedna s drugom (v. sl. 5-18). Alternativno, dvolančani lomovi se mogu popraviti ponovnim spajanjem pocijepanih krajeva jedne molekule DNA no to dovodi do vrlo učestalih pogrješaka koje su rezultat delecije baza oko mjesta oštećenja. Rekombinacija je rezultat cijepanja i ponovnog spajanja dviju roditeljskih molekula DNA što dovodi do preraspodjele genetičke informacije dvaju roditeljskih kromosoma. Tijekom homologne rekombinacije to se događa bez neke druge promjene genetičke informacije. Stoga, ključno pitanje je: kako dvije roditeljske molekule DNA mogu biti prekinute točno na istom mjestu tako da se mogu ponovo spojiti, a da pri tome ne nastanu mutacije zbog delecija odnosno adicija nukleotida u mjestu loma? Za vrijeme rekombinacije između homolognih molekula DNA takvo poravnavanje omogućeno je sparivanjem baza komplementarnih lanaca DNA (sl. 6-29). Preklapajući jednolančani krajevi izmjenjuju se između homolognih molekula DNA dovodeći do stvaranja heterodupleksa u kojem dva lanca rekombinantne dvolančane uzvojnice potječu od različitih roditelja. Kad se molekule DNA heterodupleksa genetički razlikuju, molekula DNA koja nastaje sadržava dva različita genetička biljega. U nekim slučajevima pogrješno sparene baze u heterodupleksu mogu biti prepoznate i ispravljene mehanizmom popravka pogrješno sparenih baza na način koji je opisan ranije u ovom poglavlju. Genetički dokaz za stvaranje i popravak takvih heterodupleksnih područja, dobiven proučavanjem rekombinacije kod gljiva i bakterija, doveo je 1964. godine do razvoja molekularnog modela rekombinacije. Premda modificiran stjecanjem novih spoznaja, ovaj model, poznat kao Hollidayev model (nazvan prema istraživaču Robinu Hollidayu), nastavio je pružati osnovu za današnje poimanje mehanizama rekombinacije. Izvorna verzija Hollidayeva modela predlaže da rekombinacija započinje uvođenjem ureza (engl. nick) u istom mjestu obiju roditeljskih molekula (sl. 6-30). Zarezani lanci DNA djelomično se razmotaju i svaki zalazi u drugu molekulu na taj način da se spari s komplementarnim neprekinutim lancem. Spajanje prekinutih lanaca stvara zatim ukriženje poznato kao Hollidayeva veza koja predstavlja glavni međuprodukt u rekombinaciji. Izravni prikaz Hollidayeve veze dobiven elektronskim mikroskopom dao je jasnu potporu za ovaj model rekombinacije (sl. 6-31). Za razliku od uobičajene homologne rekombinacije, koja se događa na svakom većem području homologije nukleotidnih sljedova, mjesnospecifična rekombinacija odvija se između specifičnih sljedova u područjima DNA manje homolognosti. Glavna interakcija u ovom procesu nije posredovana komplementarnim sparivanjem baza već aktivnošću proteina koji prepoznaju specifični ciljni slijed nukleotida. Mjesnospecifična rekombinacija stoga vodi do programiranih preslagivanja DNA koja igraju važne uloge u razvoju i regulaciji ekspresije gena. Razvoj imunološkog sustava kralješnjaka, koji prepoznaje strane supstance (antigene) i pruža zaštitu protiv infektivnih agensa, prvi je primjer mjesnospecifične rekombinacije kod viših eukariota. Dvije su glavne skupine imunoodgovora posredovane B i T-limfocitima. B-limfociti izlučuju protutijela (imunoglobulini) koja reagiraju s topljivim antigenima dok T­limfociti izlučuju proteine stanične površine (receptori T-stanica) koji reagiraju s antigenima prisutnim na površini drugih stanica. Ključna osobina imunoglobulina i receptora T-stanica jest njihova iznimno velika raznolikost koja omogućuje prepoznavanje širokoga spektra stranih antigena. Tako je primjerice svaka osoba sposobna stvoriti više od 1011 različitih protutijela, što je znatno više od ukupnog broja gena u genomima sisavaca (20.000--25.000). Ta različita imunoglobulinska protutijela (kao i receptori T-stanica) nisu kodirana genima germinativnih stanica, već jedinstvenim limfocitnim genima koji nastaju tijekom razvoja imunološkog sustava kao rezultat mjesnospecifične rekombinacije između različitih segmenata imunoglobulina i gena za receptore T-stanica. Slično su građeni receptori T-limfocita koji imaju dva lanca (nazvana α i β), a svaki od njih sadržava varijabilna i konstantna područja (sl. 6-40). Geni koji kodiraju ove polipeptide stvaraju se rekombinacijom između V i J-područja (α-lanac) ili između V, D i J-područja (β-lanac), analogno stvaranju imunoglobulinskih gena. Mjesnospecifična rekombinacija između tih različitih područja DNA, a također i mutacije koje su se dogodile tijekom rekombinacije, stvaraju stupanj raznolikosti receptora T-stanica sličan onome imunoglobulina IgM aktivira komplement (skupina serumskih proteina koji uništavaju stanice koje napadaju ili viruse, tako da su protutijela IgM efektna prva linija obrane protiv bakterijskih ili virusnih infekcija. Protutijela IgG, najbrojniji imunoglobulini u serumu, ne samo da aktiviraju komplement već također vežu receptore na fagocitičnim stanicama. Uz to, protutijela IgG iz majčine cirkulacije mogu proći kroz placentu i tako fetusu pružiti imunološku zaštitu. Protutijela IgA se izlučuju u različite tjelesne tekućine kao što su sluz iz nosa i slina gdje se mogu vezati i ukloniti bakterije i viruse kako bi spriječili infekciju. Protutijela IgA se također izlučuju u mlijeko majki koje doje pa tako pružaju imunološku zaštitu novorođenčadi. Protutijela IgE su učinkovita u zaštiti protiv parazitskih infekcija te su također klasa protutijela odgovornih za alergije. Mjesnospecifična rekombinacija odvija se između dva specifična slijeda koji posjeduju barem malo homologije. Za razliku od toga, transpozicija uključuje premještanje sljedova unutar genoma i ne zahtijeva homologiju nukleotidnih sljedova. Elementi koji se premještaju transpozicijom, poput onih koje je prva opisala McClintock, zovu se pokretni elementi (engl. transposable elements) ili transpozoni. Oni se dijele u dvije opće skupine ovisno o tome premještaju li se putem DNA ili RNA intermedijara. Prvi detaljno opisani transpozoni koji se premještaju putem DNA intermedijara nađeni su u bakterijama (sl. 6-44). Najjednostavniji od tih elemenata su insercijski sljedovi čija se veličina kreće u rasponu od oko 800 do 2.000 nukleotida. Insercijski sljedovi kodiraju gen za enzim uključen u transpoziciju (transpozaza) omeđen kratkim obrnutim ponavljanjima koja su mjesta djelovanja transpozaze. Drugi tip retrotranspozona su retrotranspozoni bez LTR-sljedova, a od retrovirusa se razlikuju po tome što nemaju LTR-sljedove iako kodiraju za svoju reverznu transkriptazu i endonukleazu uključenu u proces premještanja. Glavnu skupinu ovih retrotranspozona u sisavaca čine visokoponavljajući dugi raspršeni elementi (engl. highly repetitive long interspersed elements -- LINE) koji se u genomu ponavljaju oko 850.000 puta i čine oko 21% genomske DNA (v. tabl. 5-2). Cijeli LINE-element dug je oko 6 kb, iako je većina članova ove obitelji skraćena na svom 5\' kraju (sl. 6-46). Na svojim 3\' krajevima LINE imaju sljedove bogate adeninom za koji se smatra da je nastao reverznom transkripcijom poli-A repova koji su dodani molekulama mRNA nakon transkripcije (v. pogl. 7). Kao i drugi pokretni elementi, LINE su omeđeni kratkim direktnim ponavljanjima ciljnih mjesta DNA, što ukazuje da integracija uključuje stvaranje stepenastih jednolančanih krajeva i popravak sintezom. Kako LINE ne sadržavaju LTR-sljedove, mehanizam njihove reverzne transkripcije i ugradnje u kromosomsku DNA razlikuje se od onog koji koriste retrovirusi i retrotranspozoni koji sadržavaju LTR-sljedove. Konkretno, reverzna transkripcija kao početnicu koristi prekinute krajeve kromosomske DNA na ciljnim mjestima za ugradnju retrotranspozona, a koji su rezultat cijepanja nukleazom koju je kodirao retrotranspozon (sl. 6-47). Reverzna transkripcija tada započinje unutar poli-A slijeda na 3\' kraju transpozonske RNA i nastavlja se duž molekule. Suprotni lanac DNA sintetizira se korištenjem drugoga prekinutog kraja ciljne DNA kao početnice, što rezultira istovremenom sintezom i ugradnjom retrotranspozonske DNA.