BIOLOGIJA CELICE PDF

BIOLOGIJA CELICE 1 Plazmalema........................................................................................................................ 1 1.1 Lipidi v plazmalemi..................................................................................................... 2 1.2 Membranski proteini.................................................................................................... 4 1.3 Sladkorni del membrane – glikokaliks........................................................................ 5 1.4 Glikozilacija................................................................................................................. 6 1.5 Membranske domene................................................................................................... 6 2 Membranski transport in signalizacija............................................................................... 7 2.1 Primarni aktivni transport............................................................................................ 8 2.1.1 P-črpalke............................................................................................................... 8 2.1.2 Turbinske oziroma rotacijske črpalke.................................................................. 8 2.1.3 ABC transporter................................................................................................... 9 2.2 Signalizacija............................................................................................................... 10 2.2.1 Signalna transdukcija......................................................................................... 11 2.2.2 Receptorji v membrani....................................................................................... 12 3 Celični stiki...................................................................................................................... 15 3.1 Molekule medceličnih povezav – CAM.................................................................... 16 3.1.1 Integrini.............................................................................................................. 16 3.1.2 Kadherini (od kalcija odvisni adherentni proteini)............................................ 16 3.1.3 Naddružina Ig..................................................................................................... 17 3.1.4 Selektini.............................................................................................................. 17 3.1.5 Migracija levkocitov na območje infekcije........................................................ 17 3.2 Vrste medceličnih stikov........................................................................................... 18 3.3 Dinamika proteinov medceličnih stikov med regeneracijo....................................... 19 4 Medceličnina in bazalna lamina....................................................................................... 20 4.1 Proteoglikani.............................................................................................................. 20 4.2 Bazalna lamina.......................................................................................................... 20 4.3 Kolageni..................................................................................................................... 21 4.4 Elastin........................................................................................................................ 22 5 Citoskelet.......................................................................................................................... 22 5.1 Aktinski filamenti...................................................................................................... 22 5.2 Miozin........................................................................................................................ 26 5.3 Mikrotubuli................................................................................................................ 28 5.3.1 Centrosom.......................................................................................................... 30 5.4 Intermediarni filamenti.............................................................................................. 32 6 Endomembranski sistem in vezikularni transport............................................................ 34 6.1 Endoplazemski retikulum.......................................................................................... 34 6.1.1 Kotranslacijski transport.................................................................................... 35 6.1.2 Glikozilacija....................................................................................................... 36 6.1.3 Kontrola pravilnosti zgradbe proteinov.............................................................. 36 6.1.4 Sinteza membranskih lipidov............................................................................. 37 6.2 Vezikularni transport................................................................................................. 38 6.3 ERGIC....................................................................................................................... 39 6.4 Golgijev aparat.......................................................................................................... 40 7 Eksocitoza in endocitoza.................................................................................................. 42 7.1 Eksocitoza.................................................................................................................. 42 7.2 Endocitoza................................................................................................................. 42 7.2.1 Fagocitoza.......................................................................................................... 43 7.2.2 Receptorska endocitoza – s klatrini posredovana............................................... 43 7.2.3 Transcitoza......................................................................................................... 43 7.2.4 Reciklirajoči endosom........................................................................................ 44 7.2.5 S kaveolini posredovana endocitoza.................................................................. 44 7.2.6 Makropinocitoza................................................................................................. 44 8 Lizosomi in razgradnja snovi........................................................................................... 45 8.1 Avtofagija.................................................................................................................. 45 8.2 Razgradnja citosolnih proteinov v lizosomih............................................................ 46 8.3 Proteasomska razgradnja........................................................................................... 46 8.4 Vstop bakterije v celic............................................................................................... 46 9 Mitohondrij....................................................................................................................... 47 9.1 Vloge mitohondrijev in metabolni procesi v mitohondrijih...................................... 47 9.2 Elektrokemijski protonski gradient........................................................................... 49 9.3 Sinteza ATP............................................................................................................... 49 9.4 Transport metabolitov................................................................................................ 50 9.5 Biogeneza encimov dihalne verige............................................................................ 50 9.6 Zlivanje in delitev mitohondrijev.............................................................................. 50 9.7 Translokacija proteinov v mitohondrij...................................................................... 51 9.8 Vgraditev proteinov v notranjo membrano............................................................... 51 9.9 Vgraditev proteina v zunanjo membrano.................................................................. 52 10 Peroksisomi...................................................................................................................... 52 10.1 Nastanek peroksisomov......................................................................................... 52 10.2 Vstop peroksisomskih proteinov v peroksisom..................................................... 52 11 Določitev spola................................................................................................................. 53 11.1 Razvoj gonad......................................................................................................... 53 11.2 Tipi celic v razvoju gonad...................................................................................... 54 11.3 Trije tipi kanalov.................................................................................................... 54 11.4 Mehanizem primarne določitve spola.................................................................... 54 11.5 Diferenciacija testisov in jajčnikov........................................................................ 55 11.6 Razvoj genitalij...................................................................................................... 55 11.7 Motnje v razvoju spola........................................................................................... 56 11.7.1 Androgen neobčutljivostni sindrom................................................................... 56 11.7.2 Kongenitalna adrenalna hiperplazija.................................................................. 56 11.7.3 Hermafroditizem (mozaicizem – zaradi dveh X kromosomov)......................... 56 11.8 Spolna diferenciacija možganov............................................................................ 56 12 Gametogeneza.................................................................................................................. 57 12.1.1 Spermatogeneza................................................................................................. 57 12.1.2 Oogeneza............................................................................................................ 58 13 Oploditev.......................................................................................................................... 59 14 Jedro................................................................................................................................. 60 14.1 Zgradba jedra......................................................................................................... 61 14.2 Komunikacija......................................................................................................... 62 14.3 Transport skozi poro.............................................................................................. 63 14.4 Območja izražanja in utišanja................................................................................ 64 14.5 Jedrce..................................................................................................................... 65 15 DNA................................................................................................................................. 67 15.1 Kromatin................................................................................................................ 67 15.2 Histoni in nukleosomi............................................................................................ 68 15.3 Semikonzervativno podvojevanje DNA................................................................ 70 16 Kromosom........................................................................................................................ 72 16.1 Evkariontski gen.................................................................................................... 74 16.2 Epigenetika............................................................................................................ 75 16.3 Transkripcija in translacija..................................................................................... 79 17 Imunski sistem.................................................................................................................. 82 17.1 Imunski odziv......................................................................................................... 83 17.2 Imunoglobulini....................................................................................................... 85 17.3 Variabilnost imunoglobulinov............................................................................... 86 18 Celični cikel...................................................................................................................... 87 18.1 Kontrola celičnega cikla......................................................................................... 88 18.2 Regulacija celičnega cikla...................................................................................... 90 18.3 Faza S..................................................................................................................... 94 18.4 Faza M................................................................................................................... 95 19 Mejoza.............................................................................................................................. 99 19.1 Regulacija mejoze................................................................................................ 101 19.2 Homologna rekombinacija................................................................................... 101 20 Genetski kod................................................................................................................... 103 20.1 Mutacije............................................................................................................... 103 20.2 Genske mutacije................................................................................................... 103 20.3 Popravljanje napak in poškodb DNA.................................................................. 104 20.4 Bolezni zaradi napak v popravljanju DNA.......................................................... 106 20.5 Mobilni genetski elementi.................................................................................... 107 20.6 Vloga homologne in nehomologne rekombinacije.............................................. 107 21 Kromosomske mutacije.................................................................................................. 108 21.1 Številčne mutacije................................................................................................ 108 21.1.1 Poliploidije....................................................................................................... 108 21.1.2 Anevploidije..................................................................................................... 108 21.1.3 Miksoploidije................................................................................................... 108 21.1.4 Primeri številčnih mutacij................................................................................ 108 21.2 Strukturne mutacije.............................................................................................. 109 21.2.1 Delecija............................................................................................................ 109 21.2.2 Duplikacija...................................................................................................... 109 21.2.3 Inverzija............................................................................................................ 109 21.2.4 Translokacija.................................................................................................... 111 22 Dedovanje....................................................................................................................... 113 22.1 Mendlovi zakoni.................................................................................................. 113 22.2 Vrste dedovanj..................................................................................................... 113 22.2.1 Avtosomno dominantno dedovanje.................................................................. 113 22.2.2 Avtosomno recesivno dedovanje..................................................................... 114 22.2.3 Kodominantno dedovanje................................................................................ 114 22.2.4 X-vezano dominantno dedovanje..................................................................... 115 22.2.5 X-vezano recesivno dedovanje......................................................................... 115 22.2.6 Y-vezano dedovanje......................................................................................... 115 22.3 Odstopanja od Mendlovih zakonov..................................................................... 116 22.3.1 Vezano dedovanje............................................................................................ 116 22.3.2 Uniparentalna disomija.................................................................................... 116 22.3.3 Starševsko/genomsko vtisnjenje...................................................................... 117 22.3.4 Mitohondrijsko dedovanje................................................................................ 118 22.3.5 Mozaicizem, himerizem in mikrohimerizem................................................... 119 22.3.6 Penetranca in ekspresivnost............................................................................. 120 22.3.7 Anticipacija...................................................................................................... 120 22.3.8 Pleotropizem..................................................................................................... 121 22.3.9 Epistaza............................................................................................................ 121 22.3.10 Letalni aleli................................................................................................... 121 22.3.11 Multipli aleli................................................................................................. 121 22.3.12 Nepopolna dominanca.................................................................................. 121 22.3.13 Kodominanca................................................................................................ 122 22.3.14 Poligeno dedovanje....................................................................................... 122 22.3.15 Multifaktorsko dedovanje............................................................................. 122 22.3.16 Fenokopija.................................................................................................... 123 23 Rakave celice.................................................................................................................. 123 23.1 Onkogeni.............................................................................................................. 124 23.2 Tumorsupresorski geni......................................................................................... 125 23.3 Celično-biološke značilnosti rakavih celic.......................................................... 126 24 Matične celice................................................................................................................ 126 24.1 Inducirane pluripotentne celice (iPS celice)........................................................ 127 24.2 Odrasle matične celice......................................................................................... 127 24.3 Rakave matične celice.......................................................................................... 128 25 Celična smrt.................................................................................................................... 128 25.1 Apoptoza.............................................................................................................. 128 25.1.1 Mehanizmi regulacije apoptoze....................................................................... 129 25.1.2 Ekstrinzična apoptotska pot............................................................................. 129 25.1.3 Intrinzična apoptotska pot................................................................................ 130 26 Celično staranje.............................................................................................................. 131 1 PLAZMALEMA Če se stranica celice poveča 10x, se površina poveča 100x, volumen pa kar 1000x. Zmanjša se torej razmerje med površino in volumnom celice, kar je za celico neugodno, saj je površina membrane (preko katere poteka transport snovi) premajhna za celico. Ta problem lahko celica rešuje na več načinov: - lahko izviha membrano ○ problem: izvihani del membrane je izpostavljen - lahko uviha membrano ○ problem: v uvihek se lahko naselijo paraziti/virusi - lahko ustvari kompartmente Notranjost celičnih organelov oz. kompartmentov je ekvivalentna zunanjosti celice (ekstracelularju), notranjost jedra (nukleoplazma) pa citosolu/citoplazmi. Rast celic nosi več posledic: - relativno zmanjšanje plazmaleme - razdalje med molekulami so večje  nižja hitrost reakcij  koncentriranje molekul v kompartmente - potreba po usmerjenem transportu snovi med organeli  razvije se citoskelet Plazmalemo sestavljajo lipidi, membranski proteini in sladkorji. Delimo E- (ekstracelularno) in P-polovico plazmaleme. Osnovne naloge plazmaleme so: - ovira prehajanje vodotopnih snovi - predeljuje citoplazmo na kompartmente - s pomočjo transportnih proteinov omogoča selektivno propustnost - sprejema signale iz okolja (hormoni) preko receptorskih proteinov - omogoča pritrjanje celice na druge celice oziroma podlago 1 1.1 Lipidi v plazmalemi Membranski lipidi so: - fosfolipidi (hidrofilna glava – fosfat + hidrofoben rep – glicerol in MK  glicerolipid) - sfingolipidi (sfingomielin – daljši in nasičeni, in glikolipidi) - holesterol (iz ogljikovodikovih obročev) Fosfolipidi vsebujejo eno nasičeno in eno nenasičeno maščobno kislino, nenasičena predstavlja tako imenovano koleno, ki vpliva na fluidnost membrane. Lipidi se, glede na to, koliko maščobnih kislin vsebujejo, različno urejajo. Lipidi z eno maščobno kislino imajo koničasto obliko in se zato urejajo v krogelne micele. Lipidi z dvema maščobnima kislinama pa se urejajo v zaključene lipidne dvosloje. Micele in lipidne dvosloje obdaja voda, zato so lipidi obrnjeni s hidrofilnimi glavami navzven. 2 Lipidi se v membranah tudi gibljejo. Lahko se: - vrtijo okoli lastne osi - flip flop (prehajanje iz ene polovice dvosloja na drugo) - lateralno premikajo (vzdolž dvosloja) - upogibanjo Za flip flop so potrebni transportni proteini, zato je pogost le v ER in plazmalemi. Število oziroma hitrost premikov pa je odvisna od fluidnosti membrane. Na fluidnost vpliva: - temperatura (višja temperatura  višja fluidnost) - dolžina hidrofobnih repov (daljši rep  več vezi med molekulami  nižja fluidnost) - število dvojnih vezi (več dvojnih vezi  manj vezi med molekulami  višja f) - količina holesterola, ki zapolni prostore (več holesterola  nižja fluidnost, obratno pri sfingomielinu, kjer poveča fluidnost oz. omogoči prehod iz gela v sol) Fazni prehodi membrane: - tekoča neurejena faza – sol: malo holesterola, veliko fosfolipidov, visoka fluidnost - tekoča urejena faza – sol = membranski raft: veliko holesterola, veliko sfingolipidov, nižja fluidnost - trdna faza – gel (praktično ne obstaja) = malo holesterola, veliko sfingolipidov, zelo nizka fluidnost 3 1.2 Membranski proteini Membranski proteini se po teoriji tekočega mozaika lahko prosto gibljejo, vendar v praksi temu ni tako. Proteine v membrani delimo na: - transportne proteine (komunikacija, membranski transport) - vezavne proteine (vezani na molekule izven/v celici) - receptorski proteini (sprejemanje ligandov/signalov) - encimi (omogočajo reakcije) Glede na način vezave pa ločimo: - integralne proteine (vezani neposredno na lipidno plast – α-heliks in β-listič) ○ transmembranske integralne proteine (prebadajo membrano) ○ lipidno vezane (vezani na lipid v membrani) - periferne proteine (nekovalentno vezani na integralne) α-heliks oblika peptidne verige ima navadno nase vezane hidrofobne molekule, vendar lahko oblikuje tudi vodno poro, skozi katero prehaja voda. β-lističi (npr. zunanja membrana mitohondrija) omogočajo dobro prehodnost metabolitov. 4 1.3 Sladkorni del membrane – glikokaliks Glikokaliks je lahko vezan na tri različne stvari: - glikolipidi - glikoproteini - proteoglikani Glikolipidi so sfingolipidi in so zgrajeni iz lipidnega dela in sladkorja. Glikoproteini so proteini, kjer je sladkorni del, ki je manjši v primerjavi s proteinskim, vezan bodisi na dušik (N-vezani oligosaharidi) bodisi na kisik (O-vezani oligosaharidi). N-vezani OS so večinoma bolj razvejani, medtem ko so O-vezani bolj ravninski. N-vezani OS so ponavadi vezani na aminokislino asparagin, medtem ko so O-vezani vezani na serin in treonin. Sladkorni del je pri N-vezanih OS večji od tistega pri O-vezanih. Glikozilacija N- vezanih OS poteka na ER, glikozilacija O-vezanih OS pa na GA. Proteoglikani so večinoma vsi O-vezani, sladkorni del pa je veliko večji od proteinskega. Vsebujejo tudi negativno nabite skupine (COO-, SO42-), zato lahko uravnavajo pH (delujejo kot pufri) in prinašajo vodo preko ionov (Na+, K+...). Primer proteoglikana je sindekan, ki stabilizira in zadržuje rastne faktorje FGF ter jih pripelje do receptorja. S tem jim podaljša življenjsko dobo. 5 1.4 Glikozilacija = dodajanje sladkorjev na proteine. Pomen glikozilacije: - mehanska zaščita celic in proteinov (hidrofilni ovoj) - kemijska zaščita celic in proteinov (pH, pred razgradnimi encimi) - omogoči specifično prepoznavanje (krvna skupina AB0, Rh, spermij  jajčece, vezava levkocitov pri vnetni reakciji – selektini) 1.5 Membranske domene Membranski raft (označen s številko 2) je izoliran del membrane (tekoča urejena faza), ki plava po membrani in omogoča, da so proteini bližje skupaj. Gradijo ga pretežno sfingolipidi in holesterol. Lahko pa vsebuje tudi GPI vezane proteine (6), transmembranske glikoproteine (3), glikolipidi (8), lektin (protein, ki se specifično veže na določene sladkorne skupine na glikoproteinih). 6 2 MEMBRANSKI TRANSPORT IN SIGNALIZACIJA Lipidni dvosloj je prosto prepusten le za majhne nepolarne molekule (npr. kisik, oglijkov dioksid, dušik, benzen), za ostale molekule pa so potrebni proteini, ki omogočajo transport. Transportu brez proteina pravimo difuzija – difundirajo lahko le majhne nepolarne molekule in voda. Pasivni transport oz. pospešeno difuzijo omogočata dva tipa proteinov – kanalčki in prenašalni proteini. Aktivni transport, za katerega je potreben vnos energije pa vršijo črpalke. Najhitrejši je transport po kanalčkih, sledijo mu prenašalci, najpočasnejše so črpalke. Kanalčki omogočajo prenos le v smeri koncentracijskega gradienta. Tudi prenašalci načeloma omogočajo le transport v smeri gradienta, vendar lahko v primeru izmenjave 2 molekul ena prehaja v nasprotni smeri, če druga prehaja v smeri gradienta. Črpalke omogočajo transport v nasprotni smeri gradienta. Velikost ionskih kanalčkov omejuje, katere snovi lahko prehajajo skozi kanalčke, prepustnost pa je še dodatno omejena s ščetkami. V nasprotnem primeru bi skozi K kanalčke lahko prehajali natrijevi ioni, saj so manjši od kalijevih. Pri prehodu K ionov skozi kanalčke se hidratacijski ovoj iona s pomočjo ščetk (ki vsebujejo kisik) odstrani, »očiščen« ion pa potuje preko kanalčka. Pri prehodu Na ionov skozi K kanalčke pa se hidratacijski ovoj zaradi premajhnega iona ne more popolnoma odstraniti in zato Na ion ne more prehajati (tu je pomembno dejstvo, da imajo manjši kationi večji hidratacijski ovoj). Kanalčki tudi ne prepuščajo ionov neprestano  imajo odprto/zaprto stanje. Glede na mehanizem prepustnosti delimo: - napetostne odvisne kanalčke (odvisni od naboja na membrani) - ligandno odvisne kanalčke (odprejo se ob vezavi liganda npr. acetilholina – nevrotransmiter) - mehansko odvisne kanalčke (reagirajo na mehanske dražljaje) Prenašalske proteine pa delimo na 3 tipe: uniport, simport in antiport. Pri uniportu se snov sama prenaša v smeri gradienta. Pri kotransportu (simport oziroma antiport) pa je potreben še kotransportiran ion, ki se prenaša v smeri gradienta, tovor pa lahko prehaja v nasprotni smeri gradienta. Primer uniporterja: glukoza, aminokisline. 7 Primer simporterja: Na+/glukoza, Na+/aminokisline. Primer antiporterja: Na+/H+, Na+/Ca2+. 2.1 Primarni aktivni transport Primarni aktivni transport poteka preko treh različnih tipov proteinov: P-črpalk, turbinskih/rotacijskih črpalk in ABC transporterjev. Vsi porabljajo za delovanje ATP in navadno vršijo transport v nasprotju s koncentracijskim ali elektrokemičnim gradientom. 2.1.1 P-črpalke Najbolj znana P-črpalka je natrij-kalijeva črpalka, ki naenkrat transportira 3 natrijeve ione iz celice in 2 kalijeva iona v celico  ustvarja negativen naboj na zunanjosti membrane. Na začetku je črpalka v konformaciji, ki ustreza vezavi treh natrijevih ionov. Po fosforilaciji s strani ATP se črpalki spremeni konformacija  sprostijo se 3 Na+ ioni, konformacija ustreza vezavi dveh kalijevih ionov. Ko se črpalka defosforilira se konformacija zoper spremeni, sprostita se 2 K+ iona. 2.1.2 Turbinske oziroma rotacijske črpalke Najpogostejši 2 vrsti turbinskih črpalk so V-črpalke, ki s transportom protonov uravnavajo pH okolja (lahko zakisajo vezikel) in F-črpalke v mitohondriju, ki skrbijo za prenos protonov, pri čemer nastaja ATP  ATP sintaza. Turbinska črpalka je sestavljena iz rotorja in statorja. Pri V-črpalkah se ATP defosforilira, pri tem nastalo energijo pa črpalka porabi za transport protonov proti koncentracijskemu gradientu. Pri F-črpalkah pa se ATP fosforilira, pri tem pa protoni potujejo v smeri koncentracijskeg gradienta (v matriks mitohondrija). 8 2.1.3 ABC transporter ABC transporter gradita dve podenoti, zato se pri transportu ene molekule porabita dve molekuli ATP (uporabijo energijo pri hidrolizi za transport). ABC transporterji največkrat transportirajo toksine, včasih pa tudi ione (npr. CFTR, ki transportira Cl- ione, nepravilno delovanje pa povzroča cistično fibrozo). Pri normalnem delovanju CFTR se veliko kloridnih ionov transportira iz celice skozi apikalno membrano. V celico prehaja tudi veliko Na in K ionov preko kotransporterjev in kanalčkov na bazalni membrani, Na ioni pa lahko tudi prehajajo preko apikalne membrane in tako ustvarijo veliko koncentracijo ionov na zunanji strani apikalne membrane. Ta privabi vodo, ki naredi sluz dovolj vodnato. Če je CFTR poškodovan se na zunanji strani apikalne membrane ne nabere dovolj kloridnih ionov, posledično se ne nabere dovolj natrijevih ionov in posledično ni dovolj vode. Zato je sluz viskozna, se kopiči in lahko goji bakterije. 9 2.2 Signalizacija Da preživi, potrebuje celica signale iz okolja. Tudi za rast, delitev in diferenciacijo potrebuje celica zunanje signale, v obliki rastnih faktorjev. Pomanjkanje signalov vodi v apoptotično smrt. Za signale skrbi medcelična signalizacija. Načini signalizacije: - sekrecijsko signaliziranje ○ parakrino in avtokrino (rastni faktorji) ○ endokrino (hormoni) ○ sinaptično (nevrotransmiterji) - signalizacija skozi presledkovne stike - kontaktno odvisna signalizacija 10 Ločimo tri tipe signalnih molekul: - NO (dušikov oksid) - hidrofilne molekule (ne vstopijo v celico, potrebujejo receptor na membrani) - hidrofobne molekule (vstopijo v celico, potrebujejo prenašalce in citosolne ali jedrne receptorje) NO se odcepi od arginina, nato pa potuje do gladkih mišičnih vlaken, kjer omogoči relaksacijo gladkih mišičnih celic. Mehanizem je vezan na GTP, iz katerega lahko dobimo molekulo cGMP (cikličen GMP), ki nastane pri vezavi NO na receptor. NO se lahko odcepi tudi od glicerina, ki je prva pomoč pri infarktu (pride do razširitev koronark). Viagra pa prepreči razgradnjo cGMP (omogoči razširitev žil v penisu in večji pretok krvi). 2.2.1 Signalna transdukcija Večina signalnih molekul ne more prehajati lipidnega dvosloja in ima zato receptorje na membrani. Ti receptorji zaznajo signal in ga prenesejo v celico – ustvarijo nov signal. Ta signal se prenaša od signalne molekule do signalne molekule, dokler se ne aktivira encim, spremeni citoskelet ali vklopi/izklopi geni. Komponente intracelularnega prenosa signala vršijo eno izmed štirih kritičnih funkcij: - prenašajo signal naprej in ga s tem širijo v celici - ojačajo signal, zato da se porabi manj signalnih molekul za močan odziv - prepoznajo signal in ga integrirajo ter nato prenesejo naprej - signal prenesejo na enega ali več efektorskih proteinov Večina signalnih poti je reguliranih s povratnimi zankami. Pozitivna povratna zanka pomeni, da komponente, ki so bolj naprej v signalni poti, spodbujajo komponentne, ki so na začetku poti. Negativna povratna zanka pomeni, da komponenta, ki je bolj naprej, inhibira komponente na začetku. 11 Večina intracelulalnih signalnih proteinov se obnaša kot molekularna stikala – lahko preklapljajo med inaktivnim in aktivnim stanjem. Ko se aktivirajo, lahko stimulirajo ali supresirajo ostale proteine signalne poti. Molekularnih stikal je večinoma dveh vrst – takšna, ki delujejo na principu fosforilacije/defosforilacije in takšna, ki delujejo na principu GDP/GTP. 2.2.2 Receptorji v membrani Med receptorji v membrani poznamo: - receptorje kot ionske kanalčke - s trimernim G-proteinom vezane receptorje - tirozinske kinazne receptorje (encimski receptor) Na membrani kot receptor lahko deluje ionski kanalček, ki je zaprt. Ob vezavi liganda (npr. neurotransmiterja kot je acetilholin) pa se odpre in omogoča transport ionov. Druga vrsta receptorjev so vezani na trimerne G-proteine. Ob vezavi molekule na receptor ta spremeni konformacijo in omogoči vezavo G-proteina. Ob vezavi se GDP odcepi, na G- protein pa se veže GTP. G-protein razpade na α podenoto in βγ podenoti. Aktivirane podenote se lahko vežejo na kanalčke ali pa se sprostijo v citosol, kjer inhibirajo ali aktivirajo proteine. 12 13 Tretja vrsta membranskih receptorjev so tirozin kinazni receptorji, ki so vrsta receptorjev z encimskim delovanjem. Med tirozin kinazne receptorje spadajo tudi receptorji za epitelijski rastni faktor – EGFR. Vezava liganda na RTK povzroči avtofosforilacijo tirozinskih preostankov v citosolu. Fosforiliran receptor spremeni konformacijo in omogoči vezavo intracelularnih proteinov, kot je npr. Ras-protein. Ras-protein pa je po aktivaciji signal za aktiviranje MAPK (MAP kinaz, ki sprožijo sintezo Myc proteina …) proteinov. Signali pa niso vedno le inhibitorni ali aktivacijski. Isti nevrotransmiter ali hromon – na primer acetilholin – lahko povzroči kontrakcijo skeletne mišice, relaksacijo srca in ekskrecijo celic sluznice. V grobem ločimo hitre in počasne odzive. Za hitri odziv je značilno, da se preko kaskade aktivirajo že obstoječi encimi v citosolu. Tak odziv je na primer odziv na adrenalin, saj je čas potreben za odziv lahko razlika med življenjem in smrtjo. Pri počasnem odzivu pa signal potuje v jedro, kjer sproži sintezo proteina. Tak odziv je na primer odziv na spolne hormone, kjer čas ne igra pomembne vloge. 14 3 CELIČNI STIKI Celice so pripete med seboj in podlago (ekstracelularni matriks) s specifičnimi proteini – celičnimi adhezijskimi molekulami. Celice preko povezav dobivajo signale (npr. za delitev – ima celica sosedo?), stiki pa tudi omogočajo povezovanje celic v tkiva in vzpostavitev celične arhitekture. V grobem delimo dva tipa povezav: - homofilna (celici se povezujeta s proteinoma iste vrste) - heterofilna (celici se povezujeta s proteinoma različne vrste) Vrste povezovalnih molekul – CAM: CAM vrsta povezave odvisnost od Ca2+ način povezave celica-ECM ali DA, nekateri tudi od integrini heterofilna celica-celica Mg2+ kadherini celica-celica DA homofilna selektini celica-celica DA heterofilna homofilna (N-CAM, Ig naddružina celica-celica NE nektin) ali heterofilna (I-CAM) 15 3.1 Molekule medceličnih povezav – CAM 3.1.1 Integrini Integrini spadajo med integralne membranske proteine. Navadno celico pritrjujejo na podalago (ECM), včasih pa tudi na druge celice. Vedno pa se vežejo heterofilno. Integrine gradita dve podenoti α in β. Na β verigo se v citoplazmi preko adapterskih proteinov (talin in vinkulin) vežejo aktinski filamenti. Vezava je na α podenoti odvisna od prisotnosti kalcijevih ali magnezijevih ionov, na β podenoti pa od zaporedja aminokislin na ligandu. Primer integrina so membranski proteini na trombocitih (fibrinogenski in kolagenski receptorji). Ob poškodbi se na kolagen vežejo vedno aktivni kolagenski receptorji. To pa inducira inducibilne fibrinogenske receptorje, kar omogoči vezavo fibrinogena na trombocit, naredi se čep, ki zapolni poškodbo. 3.1.2 Kadherini (od kalcija odvisni adherentni proteini) Kadherini vedno nastopajo v parih in potrebujejo kalcij za pravilno konformacijo. Med kadherine spadajo klasični: epitelijski (E), živčni (N), placentalni (P) in endotelijski (VE) ter neklasični: protokadherini, dezmokolini in dezmogleini. Imajo tudi pomembno vlogo pri celjenju ran po poškodbah in pri razvoju rakavih celic, 16 3.1.3 Naddružina Ig So od kalcija neodvisni in po navadi med seboj povezujejo celici. Proteine imenujemo ICAM (intercelularne CAM) in NCAM (nevronske CAM). NCAM imajo odločilno vlogo pri razvoju živčnih tkiv. Sem spadajo tudi nektini, ki sodelujejo v medceličnih stikih epitelijskih celic. 3.1.4 Selektini Selektini so od kalcija odvisni in se vedno vežejo na sladkorni del glikoproteina. Poznamo E-selektine (endotelij), P-selektine (trombociti in endotelij), L-selektini (levkociti). Selektini običajno sestavljajo šibke in dobro prehodne povezave. 3.1.5 Migracija levkocitov na območje infekcije Pred bakterijsko infekcijo so v celicah endotelija selektini zaprti v vezikle v citosolu. Pri vdoru bakterije pošlje npr. makrofag vnetne mediatorje, ki povzročijo, da se selektini preselijo in predrejo membrano endotelija. Na levkocitih so glikoproteini za selektine in neaktivni integrini. Najprej se povežejo selektini in glikoproteini na levkocitih. Ta vezava je šibka in omogoča kotaljenje levkocita. Po intenzivni vezavi selektinov in glikoproteinov se na levkocitih aktivirajo integrini, ki se povežejo z ICAM molekulami na endotelijskih celicah (ICAM = Ig naddružina). Povezava med ICAM in selektini je močnejša in omogoča trdno povezovanje. Po trdni povezavi pa se levkocit vrine med dvema celicama endotelija in lahko zapusti krvni obtok ter npr. fagocitira bakterije. 17 3.2 Vrste medceličnih stikov - neprehodni stiki = tesni stiki (Tight Junction) - sidriščni stiki: ○ adheretni stiki (Adherent Junction) ○ Dezmosom ○ hemidezmosom ○ fokalni stiki - komunkacijski stiki = presledkovni stiki (Gap Junction) transmembranski vrsta stika adapterski proteini filamenti funkcija proteini aktinski preprečuje paracelični prehod TJ – tesni stik okludini in klavdini ZO 1, 2, 3 filamenti molekul povezujejo aktinske filamente AJ – adherentni kadherini (E, M), katenini (kadherini) aktinski celic, lahko spremenijo obliko stik nektin (Ig) in afadin (nektin) filamenti celice dezmokolin in dezmoplakin, intermediarni povezujejo intermediarne D - dezmosom dezmoglein plakoglobin filamenti filamente celic povezujejo citoplazmi, GJ – presledkovni koneksini (gradijo omogočajo prenos majhnih stik koneksone) molekul in ionov ter signalov intermediarni pritrjuje citoskelet na bazalno hemidezmosom integrini plektin filamenti lamino, pritrjanje na podlago aktinski pritrjuje citoskelet na bazalno fokalni stik integrini talin, vinkulin filamenti lamino 18 Hemidezmosom in fokalni stik sta pravzaprav ista, razlika je le v tem, da fokalni stik sodeluje pri celičnem premikanju. Tesni stik, adherentni stik in dezmosom skupaj tvorita stični kompleks. Stični kompleks je navadno neprehoden, skozenj pa lahko prehajajo nekatere celice, npr. levkociti. Levkociti pred prehodom izdelajo lastne okludine, klavdine, ZO proteine in katenine ter jih izpostavijo na membrani. Ko se stični kompleks razklene se proteini na membranah epitelnih celic povežejo s proteini na levkocitu in levkocit se lahko vrine med celici, brez da bi razgradil stične proteine. Presledkovni stiki povezujejo citosola obeh celic in omogočajo transport ionov, manjših molekul in nekaterih rastnih faktorjev. Konekson je zgrajen iz 6 koneksinov, ki pa so lahko vsi enake vrste (homomerni konekson) ali različnih vrst (heteromerni konekson). Koneksoni so specifični za določen tip molekul/ionov. Kanalčki, ki jih gradijo koneksoni so lahko homotipični (iz homomernih koneksonov in prepuščajo transport le v eno smer) ali heterotipični (iz heteromernih koneksonov, transport v obe smeri). 3.3 Dinamika proteinov medceličnih stikov med regeneracijo Proteini medceličnih stikov med obnovo regulirajo proliferacijo, migracijo in kontaktno inhibicijo celic. Na proliferacijo celic (tj. delitev) vplivajo plaktni proteini tesnih in adherentnih stikov. Med poškodbo se na poškodovani strani prekinejo ti stiki in kadherini razpadejo, saj nimajo soseda. Adapterski proteini (beta-katenini) pa potujejo v jedro, kjer pospešijo sintezo G1 ciklina in pospešijo proliferacijo. Druga stopnja regeneracije je migracija, kjer robne celice spremenijo svoj fenotip in tvorijo regenerativna območja v poškodovanem predelu – otočki. Ti otočki morajo biti gibljivi, zato se v celici hemidezmosom razstavi, iz njegovih sestavin pa se tvorijo fokalni stiki. To poteka pod vplivom rastnih faktorjev. Te celice zato namnožijo receptorje za EFG, da lahko ob isti koncentraciji rastnega faktorja ojačajo odziv. Kontaktna inhibicija je značilnost normalnih (nerakavih) epitelijskih celic. Pri tem sodeluje nektinu podoben protein necl. Ko je necl vezan na nektin in nektin ni vezan na nektin sosednje celice, sta migracija in proliferacija pospešeni. Ko pa se dve celici povežeta (najprej preko nektinov) se necl odcepi od nektina in potuje v jedro, kjer inhibira proliferacijo in migracijo. 19 4 MEDCELIČNINA IN BAZALNA LAMINA Medceličnino gradijo proteoglikani, bazalna lamina in fibrilarni proteini (kolagen, elastin). 4.1 Proteoglikani Proteoglikani so proteinsko polisaharidni kompleksi, kjer je sladkorni del veliko večji od proteinskega. Na proteinsko molekulo so vezane molekule GAG (glikozilaminoglikani). GAG so ponavljajoče verige disaharidnih enot in imajo negativen naboj bodisi na sulfatni bodisi na karboksilni skupini. Zaradi negativnega naboja nase vežejo veliko vode. Vodni ovoj nudi celici mehansko zaščito, poleg tega pa proteoglikani delujejo tudi kot pufri in s tem celico še kemijsko zaščitijo. Poleg tega proteoglikani vzdržujejo razdaljo med celicami, sodelujejo pri vezavi rastnih faktorjev in omogočijo vezavo Ca++. Na hialuron se lahko preko povezovalnih proteinov poveže tudi agrekan – agregat agrekana (hrustanec). 4.2 Bazalna lamina Bazalna lamina je preplet specializiranih sestavin medceličnine, kot so na primer laminini, kolagen ipd. Bazalna lamina ločuje epitel od veziva, je podloga za pritrjevanje celic, omogoča diferenciacijo, je osnova za obnavljanje celic (načrt) in lahko deluje kot makromolekularni filter. Glavni laminin bazalne lamine je laminin I, glavni kolagen pa kolagen IV. Kot makromolekularni filter deluje predvsem v ledvicah, kjer je sestavljena iz dveh delov – polovica je iz endotelija kapilar, polovica pa iz ledvičnih celic. Skozi njo lahko prehajajo le majhne molekule (blokira pa proteine). Pri obnavljanju celic ima bazalna lamina pomembno funkcijo, saj omogoča pritrjevanje celic. Mesta, kjer so določene strukture na stiku med celico in bazalno lamino (npr. motorična plošča pri mišicah), se pri poškodbi ohranijo in po regeneraciji ostanejo na istem mestu. Bazalna lamina vsebuje tudi glikoproteine fibronektine, ki vsebujejo vezavna mesta za različne komponente medceličnine (GAG, kolagen) in vezavna mesta za receptorje ter vezavna mesta za rastne faktorje. Na sliki je shema laminina 1: 20 4.3 Kolageni Pomembnejši kolageni: Vrsta Distribucija kosti, kite, koža, notranji Fibrilarni I (90%) organi II hrustanec, steklovina Mrežni IV bazalna lamina Povezovalni VII koža Transmembranski XVII koža (hemidezmosom) Kolagen nastaja v obliki trimernih α heliksov, ki se nato na koncih povezujejo v kolagenske nitke (tip I, II in III). Kolagen tipa I je napogostejši v celici. Proizvajajo ga fibroblasti in je sekrecijski protein. Nastaja v ER, kjer se nato sprocesira iz prokolagena, kljub temu pa še vedno vsebuje propeptidne konce (nefunkcionalna zaporedja AK). Ko se preko GA in eksocitoze izloči iz celice, zunaj proteolitični encimi razgradijo propeptid. V nasprotnem primeru bi se kolagen lahko povezal v mrežo v celici. Kolagenske bolezni so na primer: Ehlers-Danlosov sindrom (napaka v sintezi kolagena I), skorbut (pomanjkanje C vitamina), osteogenesis imperfecta (napaka pri kolagen I), Alportov sindrom (onemogočeno urejanje kolagena IV v mreže) in prizadanejo vezivna tkiva. Kolagen VII za razliko od kolagena tipa I ni fibrozni in se ne povezuje v nitke. Gradi bazalno lamino in je organiziran v sploščene mreže. Sodeluje pri pripenjanju celic v obliki pritrditvenega kompartmenta. 21 4.4 Elastin Elastin je elastičen, hidrofoben, neglikoziliran protein. Izloča se v ekstracelular v obliki topnih tropoelastinskih molekul, ki se ob plazmalemi povežejo s fibrilini v elastične fibrile elastina. Mutacija v 15. genu vpliva na sintezo elastina  Marfanov sindrom. 5 CITOSKELET Citoskelet sestavljajo 3 skupine filamentov: - aktinski filamenti ali mikrofilamenti (5 nm): opora membrane, celični stiki, kontrakcija mišic, delitvena brazda - intermediarni filamenti (10 nm): najstabilnejši, pritrjanje celice na podlago, amortizacija - mikrotubuli (25 nm): transport, niti delitvenega vretena, bički, migetalke Vsi filamenti so sestavljeni iz podenot – torej so polimeri in za njih veljajo lastnosti polimerov. Pri protofilamentu (verigi podenot) porabimo enako energije za cepitev vezi na stranski enoti kot za cepitev vezi v sredini. Pri filamentu iz več protofilamentov pa za cepitev vezi po sredini porabimo več energije kot za cepitev ene stranske enote. Konci so zato bolj fleksibilni, sredina pa bolj stabilna. 5.1 Aktinski filamenti Aktin obstaja v dveh oblikah; kot G-aktin (globularni/kroglasti) in kot F-aktin (fibrilarni/nitasti). Poleg tega poznamo še tri vrste G-aktinov: - α aktin (srčna mišica in prečnoprogaste mišice) - β aktin (nemišične celice) - γ aktin (vse celice) Za aktinski filament pravimo da je polariziran – ima plus in minus konec. Na plus koncu je visoka afiniteta za dodajanje G-aktina, pravimo, da je ta konec hitro rastoči. Na minus koncu je afiniteta visoka za odcepljanje G-aktina, pravimo, da je ta konec počasi rastoči. 22 K polarnosti filamenta prispeva ATP. G-aktin je sposoben nase vezati ATP. G-aktin z vezanim ATP ima visoko afiniteto do vezave in se lahko veže v verigo. Ob odcepitvi anorganskega fosfata je na G-aktinu ADP, tak aktin pa ima manjšo sposobnost vezanja. Na minus koncu je tako več aktinov z ADP in se raje odcepljajo, na plus koncu pa več aktinov z ATP in se raje vežejo. Nastajanje aktinskih filamentov poteka v treh stopnjah: - najprej se G-aktin zbire v kratke oligomere - ko oligomer doseže dolžino ~4 enot, deluje kot jedro, na katerega se dodajajo podenote – nukleacija - sledi elongacija, kjer se monomeri hitro dodajajo na obeh koncih F-aktinski filamenti rastejo, dokler koncentracija monomernih G-aktinov ne doseže kritične koncentracije – to je 0,1 μM. Pri rasti aktina, se zaradi odcepljanja podenot na minus koncu podenote s plus konca pomikajo proti minus koncu – treadmilling. V celici nam rast aktinskih filamentov regulirata dva proteina – timozin in profilin. Večina nepolimeriziranega G-aktina je vezanega s timozinom. Profilin lahko ta aktin s timozina odcepi in ga prenese na filament. Profilin tudi omogoča izmenjavo ADP z ATP v G-aktinu. 23 Aktinski filamenti za opravljanje določenih funkcij potrebujejo različne organizacijske oblike. Te nam omogočajo na aktin vezani proteni: 1. proteini, ki se vežejo na konce – Cap Z, tropomodulin, ARP 2/3 Tropomodulin se veže na minus konec aktina in s tem prepreči razgradnjo, CapZ pa se veže na plus konec. ARP 2/3 protein pa ima pomembno vlogo med rastjo filamenta, saj se veže na minus konec in ga stabilizira. 2. cepitveni proteini – gelsolin in kofilin Gelsolin (gel-sol) ob dvigu koncentracija kalcijevih ionov spremeni konformacijo in cepi filament po sredini. Gelsolin je vezan na vezikle in pri vezikularnem transportu cepi aktinsko mrežo. S tem prehaja tudi citoplazma iz gela v sol (manj gosta/viskozna). Kofilin se ovija okoli aktinskih filamentov in jih z vrtenjem cepi na G-aktinske monomere, spet odvisno od kalcija. Mehanizem spominja na ožemanje mokre krpe. 3. proteini, ki povezujejo filamente v snope ali mreže – fimbrin, α aktinin, filamin - tesni paralelni snopi – fimbrin Fimbrin je dimerni protein in aktinske filamente povezuje v tesne paralelne snope. Razdalje med sosednjimi filamenti so preozki, da bi se mednje vrinil miozin II. V tesnih paralelnih snopih imajo vsi filamenti enako orientirane plus in minus konce. Najdemo jih na primer v mikrovilih in filopodijih. - krčljivi antiparalelni snopi - α aktinin Krčljivi snopi imajo konce orientirane izmenjaje. Razdalje so večje, zato se vmes lahko vrine miozin II, kar omogoča kontrakcijo. Najdemo jih npr. v delitveni brazdi, adherentnem pasu in stresnih nitih - mreža – filamin Filamin povezuje filamente v mreže, ki so elastične in omogočajo upor mehanskim pritiskom. Najdemo jih tik pod plazmalemo. 24 4. proteini, ki vežejo filamente na membrano – distrofin in distroglikan Distroglikan je transmembranski protein, ki se povezuje z distrofinom. Na distrofin je nato vezan aktinski filament, ki je lahko vezan na Z disk sarkomere. Ti proteini omogočajo prilagajanje membrane kontrakciji s tem, da jo uvihajo. 5. neproteinski strupi – citohalazin, latrunkulin in faloidin Citohalazin in latrunkulin oba razgrajujeta aktinske filamente. Citohalazin se veže na plus konec in povzroči razgradnjo s tem, da se na plus koncu ne morejo dodajati nove enote. Latrunkulin se podobno kot timozin veže na G-aktin, a ga ne izpusti. Faloidin pa poveča stabilnost aktinskih filamentov. Pravzaprav vse vrste aktina imajo funkcjo pri premikanju celice. Filopodiji iz aktinskih paralelnih snopov in mizoina I pretipavajo okolico. V smeri gibanja je membrana ojačana in odebeljena s korteksom (aktinsko mrežje). V celici so še stresne niti, vezane na fokalni stik, ki s krčitvijo premaknejo celico. 25 5.2 Miozin Miozini so skupina proteinov, ki z vlečenjem ob aktinu premikajo tovor. Miozini imajo lahko eno (miozin I) ali pa dve (miozin II, miozin V) glavi. Miozin ena in pet sodelujeta pri transportu veziklov v interakciji z plazmalemo. Miozin II pa se nahaja v sarkomerah in povzroči krčenje mišic. Miozin gradijo glava, ki se veže na aktin in ima ATP-azno funkcijo, vrat, ki ga sestavljajo regulatorne molekule »lahkih miozinov« in regulirajo, kdaj in koliko se glava premakne, ter iz repa, na katerega se veže tovor in določa, kakšen tovor se lahko veže. Sarkomera je območje med dvema Z-diskoma. Omogoča krčenje mišičnih vlaken. Razdeljena je na več območji: I pas, A pas, H pas in M linija. I pas je območje od konca miozina ene sarkomere, do začekta mizoina druge. A pas je območje miozina. H pas je območje, kjer se nahaja le miozin. M linija je središčna linija, kjer sta dva miozina povezana skupaj z meromizinom. Poleg meromiozina (miomezin iz drugih virov) so v sarkomeri tudi drugi proteini. Nebulin ovija aktin in ga stabilizira. Tropomodulin in CapZ ščitita konce aktina. Titin drži miozin v pravilni legi. α aktinin stabilizira sarkomero. 26 Krčenje mišic V prvotni fazi je miozin vezan na aktin, na miozinu pa ni ATP. Ko pride do vezave ATP se miozin in aktin ločita. ATP razpade na ADP in anorganski fosfat, miozin je sedaj v visokoenergijski konformaciji. Ob odcepitvi fosfata se miozin zopet veže na aktin. Ko se odcepi še ADP se glava premakne v prvotno nizkoenergetsko lego in aktin se premakne s plusa proti minus koncu. Krčenje mišic regulirajo kalcijevi ioni, troponin in tropomiozin. Tropomiozin prepreči vezavo miozina s tem, da prekrije vezavna mesta na aktinu pri nizki koncentraciji kalcija. Njemu pa nasprotuje troponinski kompleks, ki ob povečanju koncentracije kalcija spremeni obliko in razpre tropomiozin ter s tem izpostavi vezavna mesta na aktinu. Kontrakcija gladkih mišic poteka podobno, le da so tam kontraktilni filamenti in intermediarni filamenti razporejeni v mrežasto strukturo. Regulacija pa pri gladkih mišicah poteka na miozinu in ne na aktinu. Kontrakcijo gladkih mišičnih celic kontrolira kalmodulin, ki se ob vezavi kalcija aktivira in pri tem aktivira še lahko verigo miozina. Lahka veriga se fosforilira, kar tudi aktivira miozin, kontrakcija pa lahko poteče. 27 5.3 Mikrotubuli Osnovni gradnik mikrotubulov je tubulin, ki se deli na tri podvrste: - α-tubulin - β-tubulin - γ-tubulin Alfa in beta tubulin se takoj po nastanku združita v dimer, ki je tudi osnovna enota tubulina. Gama tubulin pa najdemo le na minus koncih mikrotubula, kjer tudi nastaja. Mikrotubul je zgrajen iz 13 protofilamentov (tj. alfa + beta tubulin), znotraj pa je lumen. Kot pri aktinu imamo tudi pri mikrotubulih plus (kjer mikrotubul hitreje nastaja, alfa aktin) in minus (kjer se mikrotubul hitreje razgrajuje, beta aktin) konec. Vsi mikrotubuli se začenjajo na centrosomu z gama tubulinom. Centrosom je struktura z dvema pravokotnima centrioloma, ki ga obdaja mreža gama tubulina. Na mikrotubulih so tudi pomožni proteini, ki omogočajo tvorbo gama tubulin obroča (podobno kot ARP 2/3 pri aktinu). Sama polimerizacija in depolimerizacija mikrotubulov pa nadzira GTP (ne ATP kot pri aktinu). Na plus konec se pripenjajo le alfa+beta dimeri, ki imajo nase vezan GTP. Čez nekaj časa, se na beta in alfa tubulinu od GTP odcepi fosfat in ostane GDP. To povzroča manjšo stabilnost mikrotubula kot celoto. Na koncih pa se GTP kljub temu ohranja, zato je celoten mikrotubul še vedno stabilen (GTP kapa). Da se stabilnost mikrotubula ohranja pa mora biti hitrost dodajanja dimerov večja od cepitve GTP  28 GDP + Pi. Če je koncentracija podenot blizu + konca visoka, se GTP kapa ohranja in mikrotubul je stabilen/raste. Če pa je + konec v območju z nizko koncentracijo dimerov, se GTP hitreje razceplja in GTP kapa se ne ohranja, mikrotubul pa začne razpadati, dokler ne pride zopet v območje z visoko koncentracijo dimerov. S tem mehanizmom celica uravnava smer rasti mikrotubulov. Na mikrotubule so vezani MAP proteini, ki stabilizirajo MT in med seboj povezujejo več podenot (v aksonih so to tau proteini). Poleg tega sodelujejo tudi pri organizaciji mikrotubulov. Na drugi strani imamo proteine, ki mikrotubule destabilizirajo s tem, da odstranjujejo njihove GTP kape – katastrofini. Katastrofini tudi transformirajo MT iz interfazne oblike v niti delitvenega vretena. MAP in katastrofini skrbijo za to, da se mikrotubuli neprestani izgrajujejo in razgrajujejo. Na stabilnost mikrotubulov pa vplivajo tudi neproteinski dejavniki. Povečana koncentracija kalcija (pri nizki konc. kalcija, MT razpade), temperature pod 4°C in alkaloidi (npr. vinblastin, vinkristin in kolhicin) destabilizirajo mikortubule. Citostatik - Taksol pa povzroči stabilizacijo mikrotubulov. 29 Ob mikrotubulih poteka transport snovi (predvsem v veziklih) preko motornih proteinov – kinezinov in dineinov. Kinezini po navadi potujejo od minus proti plus koncu, dineini pa proti minus koncu. Delovanje motornih proteinov spomnija na korakanje: V mirovanju je na obe nogi kinezina vezan ADP – šibka vezava na mikrotubul. Nato se na prvo nogo veže ATP, kar povzroči spremembo konformacije – nastane koleno, in trdnejšo vezavo na mikrotubul. Zadnja noga je pri tem še vedno šibko vezana in se zato lahko premakne naprej ob spremembi konformacije vratu. Nato se ATP defosforilira in zopet je na obeh glavah vezan ADP. 5.3.1 Centrosom Centrosom je celični organel. V njegovem središču je centriolni par, okoli para pa je izoblikovana mreža molekul, ki držijo gama tubuline in omogočajo nastanek obroča 13 gama tubulinov na začetku mikrotubula. Centrosomu identična struktura je bazalno telesce, ki se nahaja na bazi repkov in migetalk. 30 Repki in migetalke spadajo pod gibljive migetalčne organe in so sestavljeni iz 9 parov obodnih in osrednjega para mikrotubulov. Med negibljive migetalčne organe pa spadajo monocilije, ki so zgrajene kot gibljivi migetalčni organi, le brez osrednjega para. Monocilije imajo vlogo kemoreceptorjev in mehanoreceptorjev. Kot kemoreceptorji delujejo z receptorji za rastne faktorje in vplivajo na rast celice. Kot mehanoreceptorji pa delujejo preko kalcijevih kanalčkov. Ko se monocilija upogne, se kalcijev kanalček odpre in kalcij vstopi v celico. S tem se zmanjša proliferacija celic, pospešijo pa se diferenciacija, sinteza in sekrecija proteinov. Če se monocilije v organu odklonijo, to povzroči navpično delitev celic in kanalček, ki ga obdajajo epitelijske celice z monocilijami, raste v dolžino, njegov premer pa ostane enak. Če pa se zaradi npr. mutacije monocilije ne odklonijo, to povzroči horizontalno delitev celic in kanalček se oža – nastajajo ciste. V migetalčnih organih mora potekati interflagelarni transport (IFT) – usmerjen transport, ki v prostoru med membrano in aksonemo skrbi za transport novih proteinov v in starih proteinov iz prostora. Interflagelarni tranposrt uravnavajo proteini: IFT proteini, kinezini, dineini. 31 5.4 Intermediarni filamenti Intermediarni filamenti se od aktinskih filamentov in mikrotubulov razlikujejo po stabilnosti – izgradnja in razgradnja je bistveno manj intenzivna. Preko celičnih stikov (dezmosomi in hemidezmosomi) se intermediarni filamenti povezujejo v mreže v epitelijih in s tem cel epitelij deluje kot celota pri mehanskih dražljajih. IF gradijo nitaste (in ne globularne) podenote. Dve nitasti podenoti se z večjim delom molekule paralelno povezujeta v dvojno vijačnico – dimer. Dva dimera se antiparalelno povežeta v tetramer, kar je tudi osnovni gradnik intermediarnih filamentov. Zaradi antiparalelnosti tetramerov intermediarni filamenti niso polarni. Med seboj se podenote intermediarnih filamentov razlikujejo po kratkih odsek, ki niso vezavna mesta za druge podenote in ki imajo različno elastičnost. IF nastajajo s šibkim povezovanjem aminokislin vzdolž tetramerov. Podenote pa se pri izgradnji prenašajo vzdolž mikrotubulov z motornimi proteini. Intermediarni filamenti so heterogena skupina filamentov. Poznamo več tipov IF: - tip I (kisli) in tip II (bazični & nevtralni): keratini (epitelij) – dimeri vedno iz ene molekule tipa I in ene molekule tipa II - tip III: vimentinski filamenti – vimentin (fibroblasti v razvoju), desmin (Z disk mišičnih celic) in kisli gliaproteini (glia celice) - tip IV: nevrofilamenti (NL-L, NL-M, NL-H) v nevronih - tip V: jedrni lamini (A, B & C) - tip VI: nestin – matične celice Keratinov je več tipov (20). To, katere keratine najdemo v celici je odvisno od tkiva in od stopnje diferenciacije celice. To lastnost uporabljajo v patologiji predvsem za iskanje rakavih sprememb. 32 Vimentinski filamenti se nahajajo predvsem v vezivu (npr. fibroblasti). Nevrofilamenti so ključni za odpornost in elastičnost aksonov v sklepih. Razvrščeni so v tri skupine po molekulski masi. Lamini se od ostalih razlikujejo po tem, da potujejo v jedro. Jedrna lamina nudi jedrni ovojnici oporo, med mitozo pa se lamini preko fosforilacije razgradijo in jedrna ovojnica razpade. Po mitozi se z defosforilacijo zopet formira jedrna lamina in jedrna ovojnica. Keratini se v epitelijih povezujejo v mreže in s tem omogočajo prožnost epitelija. Mutacije keratinov pa vodijo v bolezni imenovane epidermoze: - epidermoliza buloza simplex (EBS) – mutacija keratina 5 & 14 - epidermolitična hiperkeratoza (EH) – mutacija keratina 1 & 10 - epidermolitična plantopalmarna keratoderma (EPPK) – mutacija keratina 9 LASTNOSTI INTERMEDIARNIH LASTNOSTI AKTINSKIH FILAMENTOV FILAMENTOV IN MIKROTUBULOV sestavljajo jih fibrilarne podenote sestavljajo jih globularne podenote kemijsko heterogena skupina kemijsko sorodne podenote nepolarne strukture polarne strukture majhna koncentracija podenot v citosolu velika koncentracija podenot v citosolu stabilna struktura dinamično nestabilne strukture na razgradnjo vpliva fosforilacija destabilizacija po odcepitvi Pi z ATP 33 6 ENDOMEMBRANSKI SISTEM IN VEZIKULARNI TRANSPORT Endomembranski sistem vključuje membranske organele, ki so udeleženi v sintezo, dodelavo in sekrecijo proteinov. Nekatere endomembrane evkariontske celice so: - endoplazemski retikulum - Golgijev aparat - mitohondrij - peroksisom 6.1 Endoplazemski retikulum ER je en celični kompartment, ki pa ga gradijo trije organeli: a) jedrna ovojnica ○ notranja membrana – receptorji za lamin B ○ zunanja membrana – enaka kot GER b) zrnati ER (GER) ○ sinteza membranskih proteinov ○ sinteza vodotopnih proteinov (sekrecijski in lumenski) ○ sinteza glicerofosfolipidov (razen plazmalogena) c) gladki ER (AER) ○ sinteza steroidov (holesterol, steroidni hormoni) ○ detoksifikacija (citokrom P-450) ○ dodajanje lipidne komponente na lipoproteine ○ skladiščenje kalcija Gladki endoplazemski retikulum gradijo cevčice, zrnatega pa cisterne, ki so lepo vidne pod elektronskim mikroskopom. V celici ločimo dva tipa transporta proteinov: - posttranslacijski transport o citosol  jedro o citosol  mitohondrij o citosol  peroksisom - kotranslacijski transport: ○ ER  GA  Ly  plazmalema  sekrecija Proteini (razen tistih, ki ostanejo v citosolu), ki nastanejo v citosolu in se transportirajo posttranslacijsko, morajo vsebovati signalne sekvence, ki določajo, v kater organel bodo proteini potovali. 34 6.1.1 Kotranslacijski transport Vsi proteini, ki potujejo v ER preko kotranslacijskega transporta, se začnejo najprej sintetizirati na citosolnih ribosomih. Ko dosežejo zadostno dolžino, se preko SRP, ki se veže na signalno sekvenco prenesejo na membrano ER, ki vsebuje SRP receptorje. Protein se nato s signalno sekvenco veže na proteinski translokator in se uviha v notranjost ER. SRP se pri tem razcepi, sinteza proteina pa poteka naprej. Ko se sinteza zaključi, se signalna sekvenca preko signalne peptidaze razcepi, protein pa se sprosti v lumen ER. ER pa ima tudi transmembranske proteini. Ti imajo na sebi hidrofobne START-transfer in hidrofobne STOP-transfer sekvence. Ko se ribosom s takim proteinom približa proteinskemu translokatorju na ER, se obe sekvenci vežeta nanj, odsek, ki ga določata, pa se vrine v ER. 35 6.1.2 Glikozilacija Ko se protein usidra v membrano ER, se mora še stabilizirati in preoblikovati. To poteka v ER s kovalentnimi modifikacijami: - disulfidni mostički stabilizirajo protein - glikozilacija preoblikuje protein Glikozilacija se začne na citosolni strani z fosforilacijo dolihola. Ko se na dolihol vežeta dva fosfata (dolihol difosfat), se najprej nanj vežeta dva N-acetilglukozamina, nato pa še pet manoz. Nato se dolihol obrne s sladkornim delom proti lumnu ER, kjer se nanj dodajo še štiri manoze in tri glukoze (tri glukoze so zadnja komponenta pri vseh glikozilacijah). Sladkorni del se z dolihola nato prenese na asparagin na proteinu. Pravimo, da v ER poteka N-vezana glikozilacija na asparagin. Tri glukoze so ključne, saj se po razgradnji glukoz protein lahko sprosti z ER. 6.1.3 Kontrola pravilnosti zgradbe proteinov Po koncu sinteze je ključno, da se preveri, ali je protein pravilen. Če ni, potem se mora hitro razgraditi ali pa preoblikovati. To nalogo opravlja skupina proteinov imenovana šaperoni. Ti lahko: - delujejo kot kalup in omogočijo preoblikovanje proteina - preverjajo strukturo proteina - povzročijo izločanje proteina iz ER in razgradnjo v proteasomu 36 En izmed takih šaperonskih proteinov je kalneksin in kalretikulin, ki preveri, ali je protein pravilno zvit. Če protein ni pravilno zvit, mu da kalneksin še eno možnost, da se preko glukozil transferaze preoblikuje in dobi pravilno obliko. Če pa je protein pravilno zvit, mu je omogočen izhod iz ER. Nepravilno zviti proteini se s šaperoni preko translokatorjev transportirajo iz ER in potujejo v proteasom, kjer se razgradijo. Pred razgradnjo pa se mora s proteina odcepiti sladkorna komponenta, protein pa se mora ubikvitinirati. Če sistem preverjanja ne deluje pravilno, pride do bolezni kopičenja proteinov v ER: - pomanjkanje proteinov zaradi razgradnje (cistična fibroza, LDL receptor defekt, pomanjkanje rastnega hormona) - toksični proteinski agregati (Creutzfeldt-Jacobsova bolezen) Pod vplivom šaperonov pa poteka tudi kontrola velikosti ER. Pri konstantni sintezi proteinov mora biti količina šaperonov enaka hitrosti sinteze. Če pa je nepravilno zvitih proteinov več kot šapernov, se nepravilno zvit protein lahko veže na membranski šaperon. To je signal, ki nato potuje v jedro in povzroči večjo transkripcijo in sintezo šaperonov in strukturnih proteinov ER. To vodi v povečanje ER. 6.1.4 Sinteza membranskih lipidov Membranski lipidi (glicerolni lipidi) se sintetizirajo skoraj izključno na citosolni strani zrnatega endoplazemskega retikuluma. Na citosolni strani je zato več lipidov kot na lumenski, kar bi sicer vodilo v vezikulacijo. To preprečujejo encimi iz družine skremblaz, ki proteine s citosolne strani nespecifično prenesejo na lumensko stran. Skremblazam podobni encimi so flipaze, ki pa so za razliko od skremblaz specifični. Flipaze poskrbijo, da je na eni strani membrane ena vrsta fosfolipido in na drugi strani druga vrsta. 37 6.2 Vezikularni transport Plazmalema in membrane GA, lizosomov in endosomov so del membranskega sistema. Med njimi in endoplazemskim retikulumom poteka komunikacija in transport preko vezikularnega transporta. Vezikli se tvorijo s pomočjo plaščnih proteinov: - klatrin (transport GA → plazmalema/endosom) - COPI (transport cis GA → gER) - COPII (transport gER → GA in transport znotraj GA) DELOVANJE KLATRINA Ko se na receptorje, ki so z vezavnim mestom obrnjeni v GA, veže ligand, spremenijo receptorji konformacijo dela, ki gleda v citoplazmo. S tem se lahko nanje veže adaptin, na katerega se nato lahko veže klatrin. Klatrin je sam po sebi ukrivljen, zato povezovanje klatrinov omogoči nastanek vezikla. Vezikel se odščipne s pomočjo dinamina, plašč klatrinov pa se sprosti. 38 Vezikli pa sami po sebi ne vedo, kam morajo potovati. Zato se na membrani veziklov in na tarčni membrani nahajata dva para proteinov, ki omogočata pravilno pot: - Rab in receptor Rab proteina - v-SNARE in t-SNARE Rab protein in receptor Rab proteina omogočata začetno povezavo in vezavo drugega para. Vezava v-SNARE in t-SNARE proteinov pa omogoči približevanje vezikla in tarčne membrane in posledično prilepitev vezikla na membrano ter zlivanje. 6.3 ERGIC ERGIC je vmesni kompartment med ER in GA, ki omogoča vračanje proteinov, ki so pomotoma zašli v GA, nazaj v ER. Pri tem sodelujejo receptorju, ki se vežejo na rezidualne proteine ER, ki imajo vsi KDEL sekvenco. Ob vezavi proteina na receptor, se na receptor veže COPI in ustvari se vezikel. Receptorji pa ne smejo imeti afinitete do proteinov, ki so že v ER, zato je afiniteta odvisna od lokacija; visoka v GA in ERGIC in nizka v ER. 39 6.4 Golgijev aparat Golgijev aparat je en organel iz petih kompartmentov: cis mrežja, cis cistern, medialnih cistern, trans cistern in trans mrežja. Razlika med cisternami in mrežjem je v tem, da je v cisternah manj zaobljenih oken, na katerih se ustvarjajo vezikli, medtem ko je v mrežju teh oken veliko. V cis mrežju GA pride do fosforilacije manoz na lizosomskih proteinih. V cis cisternah se nekatere terminalne manoze odcepijo. V medialnih cisternah se manoze še vedno malo odcepljajo, pride pa tudi do dodajanja ostalih sladkorjev. Največ sladkorjev se doda v trans cisternah. V trans mrežju se produktu sortirajo in odcepljajo v obliko veziklov, poteka tudi sulfatacija. V GA poteka O-vezana glikozilacija Glikozilirani proteini, ki pridejo iz ER v GA, imajo nase vezane N-vezane oligosaharide. Delimo dve vrste: visokomanozni oligosaharidi in kompleksni oligosaharidi. Kompleksni nastajajo z odstranjevanjem posameznih monosaharidnih enot in nato dodajanjem novih sladkorjev v GA. Visokomanoznim oligosaharidom pa se v GA ne dodaja novih sladkorjev in zato vsebujejo dva N-acetilglukozamina in veliko manoz še iz ER. Poznamo dva modela transporta skozi Golgijev aparat: a) model transportnih veziklov Po tem modelu je GA statična struktura, ki ima encime na določenih mesti, produkti pa se med predelki GA prenašajo z vezikli. b) model zorenja cistern Ta model pa predvideva, da se cisterne kot celota premikajo v smeri cis  trans, produkti pa se ne prenašajo in zorijo v cisternah. Po temu modelu se prenašajo le encimi. Ločimo tudi tri smeri izločanja iz GA: 1.) s klaritini posredovana pot do lizosoma 2.) konstituitivna eksocitoza – konstanto odcepljanje veziklov 3.) regulirana eksocitoza – vezikel se odcepi, a se ne izloči, ampak čaka na signal 40 POT IZ GOLGIJEVEGA APARATA DO ZGODNJEGA ENDOSOMA Encimi, namenjeni lizosomom, se najprej sortirajo v cis mrežju, kjer se vežejo na fosfotransferazo, ki fosforilira manoze (ta encim prepoznava lizosomske encime prek njihove signalne domene, ki je določena iz zgradbe in je enaka za vse te encime). V trans mrežju se nato manoza-6-fosfat veže na receptor, kar omogoči vezavo klaritinskega plašča in nastanek vezikla. Vezikel se odcepi in potuje v zgodnji endosom. Pod vplivom nizkega pH in kisle fosfataze se encim najprej odcepi od receptorja, nato pa se odcepi še fosfat. Receptorji se nato odcepijo v vezikel in vrnejo v trans mrežje. 41 7 EKSOCITOZA IN ENDOCITOZA 7.1 Eksocitoza Vse celice so sposobne vršiti konstitutivno (neselektivno, stalno) eksocitozo. Nekatere celice pa lahko vršijo regulirano eksocitozo – vezikli s produkti se odcepljajo s trans Golgijevega mrežja in se nabirajo pod plazmalemo. Ko do celice prispe signal se produkt sprosti iz celice. Sprostitev sekrecijskih produktov povzročijo znotrajcelični sporočevalci, med katere spadajo tudi kalcijevi ioni, ki se sproščajo zaradi hormona, dražljaja (nevroni) ipd. Vezikli, ki vsebujejo sekrecijske produkte se lahko zlijejo s plazmalemo, lahko pa delujejo po principu »kiss and run«, kjer se dotaknejo plazmaleme, odpre se kanal, sekrecijski produkti se sprostijo in vezikel se odcepi. 7.2 Endocitoza Z endocitozo celica sprejme makromulekule in ostale celice iz medceličnine. Pri tem se oblikuje endocitotski vezikel. Ločimo štiri vrste endocitoze: - fagocitoza (>300 nm  bakterije, vezikli) vnos je selektiven in poteka preko receptorjev - s klatrini posredovana endocitoza (100-150 nm) vnos je selektiven preko receptorjev - s kaveolini posredovana endocitoza (50-80 nm) vnos raftnih membran, virusov - makropinocitoza (100 nm – 1 μm) 42 7.2.1 Fagocitoza Fagocitozo vršijo tri vrste celic – fagocitov: makrofagi, nevtrofilci in dendritične celice. Velikost vezikla (fagosoma), ki nastane pri fagocitozi, je odvisna od velikosti delca. Fagosomi se zlivajo z lizosomi preko endosomov. Fagocitoza je specifična in poteka preko receptorjev, ki so po navadi Fc-receptorji (IgG) za protitelesa. Receptorji sprožijo nastanek psevdopodijev, ki obdajo mikroorganizem. 7.2.2 Receptorska endocitoza – s klatrini posredovana Primer receptorske endocitoze je endocitoza LDL (Low-Density Lipoproteins) delcev. LDL delci so zgrajeni iz površine iz fosfolipidov in notranjosti iz trigliceridov ter holesterola. Ovija jih apoprotein. Sprejem LDL delcev se začne s sintezo transmembranskih receptorjev za LDL, na katere se LDL delec veže. Z vezavo nastane klatrinski obroč in odcepi se vezikel. Vezikli potujejo v endosom, kjer se zaradi nizkega pH ločijo LDL delci in receptorji. Receptorji se vrnejo na plazmalemo, LDL delci pa se razgradijo (preko poznega endosoma in na koncu lizosoma), s čimer celica dobi holesterol. Če je mutiran gen za LDL-receptorj, se LDL delci ne morejo prenesti v celico in se nabirajo na membrani. S tem nastajajo LDL plaki, ki povzročajo zmanjšanje lumna žile. V endosomu se receptorji po navadi odcepijo od liganda in vrnejo na plazmalemo, vendar temu ni vedno tako. Včasih se skupaj z receptorjem vrne tudi del liganda (npr. transferin za železo ostane vezan na receptorju). Lahko pa se receptorji skupaj s tovorom razgradijo v lizosomu, s čimer se zmanjša količina receptorjev in s tem odziv celice na na primer rastne faktorje. 7.2.3 Transcitoza S transcitozo se preko epitelijskih celic prenašajo molekule (npr. materina protitelesa iz tankega črevesa novorojenčka v kri). To poteka preko reciklirajočega endosoma. Celice endocitirajo protitelesa preko Fc receptorjev. Vezikli z receptorjem in protitelesi se zlivajo z endosomi, nato pa se od njih odcepljajo in potujejo v reciklirajoče endosome. Iz reciklirajočih endosomov potujejo do bazolateralne membrane in preidejo v krvni obtok. 43 7.2.4 Reciklirajoči endosom Reciklirajoči endosomi imajo pomembno vlogo pri recikliranju receptorjev in transcitozi. Primer recikliranja receptorja je inzulinska stimulacija. V celici so v reciklirajočemu endosomu zbrani glukozni transporterji, ki so prišli iz endosomov. Ob vezavi inzulina na receptor, pride signal do reciklirajočega endosoma, iz katerega se sprostijo glukozni transporterji, ki potujejo do plazmaleme. V celico lahko tako vstopi velika količina glukoze. 7.2.5 S kaveolini posredovana endocitoza Preko kaveolinov poteka endocitoza membranskih raftov, ki omogoča recikliranje in obnavljanje raftnih proteinov plazmaleme preko kaveol. Kaveole se po cepitvi od plazmaleme lahko združijo z endosomi ali pa potujejo v GA. V kaveolinski jamici se zberejo raftni proteini, brstenje vezikla omogočajo proteini že v samih raftih. Vezikel v končni fazi dinamin loči od membrane. 7.2.6 Makropinocitoza Z makropinocitozo celice sprejmejo raztopljene delce. Začne se z oblikovanjem psevdopodijev, ki se združita in nastane vakuola. Makropinocitozo regulirajo rastni faktorji, ki spodbujajo internalizacijo snovi. 44 8 LIZOSOMI IN RAZGRADNJA SNOVI Lizosomi so organeli, v katerih poteka razgradnja. Zato vsebujejo veliko encimov, ki spadajo v skupino kislih hidrolaz (proteaze, lipaze, nukleaze …) in potrebujejo kisel pH, ki ga vzdržujejo protonske črpalke. Glavni namen razgradnje je pridobitev gradnikov, ki jih bo celica nato znova uporabila za izgradnjo. Kisel pH ima tudi zaščitno funkcijo, saj se ob sprostitvi lizosomskih encimov zaradi prenizkega pH (~7) ne bi zgodilo nič. Zaščitena je tudi membrana lizosoma, ki je intenzivno glikozilirana na ekstraplazemski strani. Sinteza lizosomskih encimov poteka v zrnatem ER. Proteini nato potujejo v GA, kjer se v cis Golgijevem mrežju nanje doda manoza-6-fosfat (M6P). M6P v trans Golgijevem mrežju prepoznajo receptorji, ki proteine nato prenesejo do endosomov in lizosomov. Razgradnja se začne z endocitozo in formacijo zgodnjega endosoma. Od zgodnjega endosoma se v notranjost odcepljajo vakuole, ki vsebujejo encime in makromolekule. Z odcepljanjem vakuol nastaje multivezikularno telo – MVB, v katerem že poteka razgradnja. Zadnja stopnja je pozni endosom, ki se združuje z vezikli, ki vsebujejo lizosomske encime. Zadnja stopnja razgradnje je lizosom, ki vsebuje praktično le še encime in pa snovi, ki jih celica ni sposobna razgraditi. Lizosomske bolezni: - I-celična bolezen ○ lizosomi vseh celic razen celičnih so brez encimov ○ mutiran je gen za GlcNAc fosfotransferazo, ki na encime veže M6P - Tay-Sachsova bolezen ○ mutirana je heksozaminidaza A, posledičnost odsotnost tega encima, ki razgrajuje gangliozid GM2, pomembne sestavine živčevja, nepravilno delovanje možganov ○ kopiči se gangliozidaza GM2 v živčevju in jetrih - Gaucherjeva bolezen ○ mutirana je glukocerebrozidaza in posledično odsotnost tega encima v lizosomih ○ povečana so jetra, ledvice, snovi se kopičijo v živčevju in makrofagih, nevrološke težave Razgradnja snovi poteka po več poteh: - makro- in mikroavtofagija - selektivna lizosomska proteoliza - razgradnja v proteasomih 8.1 Avtofagija Z avtofagijo celica reciklira lastne organele in molekule. Začne se s formacijo izolacijske membrane – fagoforja. Ko fagofor obda del citoplazme, namenjen razgradnji, nastane 45 avtofagosom. Ta se zliva s poznimi endosomi in lizosomi, s čimer nastane amfisom, v katerem poteka avtofagija. Zadnje stopnje potekajo v lizosomu. Avtofagijo regulira več proteinov: - beclin 1 aktivira avtofagijo - mTOR je kinaza, ki zavira avtofagijo - ATG9 je transmembranski protein, ki omogoča nastanek fagoforja V zgodnji fazi rakastih transformacij lahko s spodbujanjem beclina 1 zaviramo rast raka, saj se celica nima časa deliti, ker razgrajuje snovi. V poznih fazah pa pospešena avtofagija povzroča pospešeno ožiljenje, kar škoduje. 8.2 Razgradnja citosolnih proteinov v lizosomih V lizosomih se proteini razgradijo po dveh poteh: - preko šaperonov – proteini s KFERQ sekvenco - z mikroavtofagijo preko proteinov ESCRT Razgradnja se začne v MVB, kjer pa se ne nujno konča. MVB pa se lahko tudi zliva s plazmalemo, pri čemer se sproščajo ekstracelularni vezikli, kar omogoča komunikacijo med celicami. 8.3 Proteasomska razgradnja Razgradnja v proteasomih poteka pod množico proteolitičnih encimov, ki jih proteasom vsebuje. Pred razgradnjo v proteasomu se mora od proteina odcepiti sladkorni del, protein pa se mora ubikvitinirati. Z razgradnjo v proteasomih dobi celica aminokisline, ki jih nato znova uporabi. 8.4 Vstop bakterije v celic Preko avtofagne poti pa lahko v celico vstopijo tudi različne bakterije. Ko bakterija pride v celico in pristane v fagosomu, ima tri možnosti za preživetje: - bakterija lahko razgradi fagosomsko membrano in s tem pobegne v celico - bakterija lahko prepreči zlivanje fagosoma z lizosomi in endosomi ter se v fagosomu razmnožuje - bakterija ima lahko inhibitorne proteine, ki inhibirajo lizosomske encime. 46 9 MITOHONDRIJ Mitohondriji so membranski organeli različnih oblik. Mitohondrijska membrana in membrana ER sta lahko v tesnem stiku, kar omogoča izmenjavo lipidov. Mitohondrij je zgrajen iz zunanje mitohondrijske membrane, notranje mitohondrijske membrane, ki je uvihana v kriste in matriksa (notranjost). Zunanja mitohondrijska membrana (ZMM) je po zgradbi podobna plazmalemi (razmerje med lipidi in proteini je približno 1:1). Je bolj prepustna, preko proteinov porinov lahko skozi njo prehajajo ioni in molekule manjše od 5 kD (1 dalton = 1 masna enota). Notranja mitohondrijska membrana (NMM) pa je po sestavi bolj podobna prokariontski (razmerje med lipidi in proteini je približno 1:3; veliko več proteinov) in je slabo prepustna. Vsebuje poseben lipid kardiolipin (4 maščobne kisline), ki omogoča slabo prepustnost in s tem omogoča nastanek protonskega gradienta. V mitohondrijih poteka glavnina nastanka ATP v dveh metabolnih procesih: Krebsov cikel (v matriksu) in dihalna veriga (kriste). 9.1 Vloge mitohondrijev in metabolni procesi v mitohondrijih Poglavitne vloge mitohondrijev so: - vzdrževanje redoks potenciala citosola (razmerje med NADH in NAD+ - shuttle system) - sproščanje citrata v citosol za metabolne procese med stradanjem - oksidiranje aminokislin ob stradanju - nastajanje sečnine v jetrih, biosinteza skupine hem - sinteza lipidov (kardiolipin, fosfolipidi) - prevzemanje kalcija iz ER/SR - sodelovanje pri apoptozi V naravi je najpogostejši oksidacijski proces gorenje, pri katerem pa se veliko energije sprosti kot toplota, kar je za celico neugodno (previsoke temperature, neuporabna energija). Zato biološke oksidacije potekajo postopoma, postopoma pa se sprošča tudi energija. V metabolnih procesih v mitohondrijih so ključni vodikovi ioni, ki vsebujejo visoko energetske elektrone. Z elektronov se od akceptorja do akceptorja sprošča del energije, ki se porabi za nastanek protonskega gradienta. Protonski gradient nosi potencialno energijo, ki poganja protonsko črpalko in omogoča fosforilacijo ADP do ATP. Glavni viri energije za celice so ogljikovi hidrati in maščobne kisline. V ogljikovih hidratih so vodikovi atomi že deloma oksidirani v OH skupinah, v maščobnih kislinah pa ne, zato so maščobne kisline bolj energetsko bogate. 47 Celica večino energije pridobi s celičnim dihanjem. Celično dihanje se začne z glikolizo, pri čemer iz ene molekule glukoze, z energijo dveh molekul ATP, nastaneta dve molekuli piruvata, dve molekuli NADH in štiri molekule ATP. 𝐶6 𝐻12 𝑂6 + 2𝐴𝑇𝑃 → 2𝐶3 𝐻3 𝑂3 + 2𝑁𝐴𝐷𝐻 + 4𝐴𝑇𝑃 Začetna stopnja prebave maščobnih kislin pa se imenuje β- oksidacija in poteka drugače: 𝑀𝐾 → 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐹𝐴𝐷𝐻2 + 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑖𝑙 𝐶𝑜𝐴 V obeh primerih pa dobimo acetil CoA (pri ogljikovih hidratih se v acetil CoA pretvori piruvat), ki vstopi v Krebsov cikel. V Krebsovem ciklu poteka oksidacija (dehidrogenacija) acetila CoA, pri čemer nastaja ogljikov dioksid, NADH, FADH2 in GTP, ki se pretvori v ATP 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑖𝑙 𝐶𝑜𝐴 → 2𝐶𝑂2 + 3𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐹𝐴𝐷𝐻2 + 𝐺𝑇𝑃 Prek prenašalcev NAD+ in FAD se hidridni ion (𝐻 − → 𝐻 + + 2𝑒 − ) prenese do notranje mitohondrijske membrane, kjer poteka dihalna veriga. V dihalni verigi poteka oksidacija encimov dihalne verige in fosforilacija ADP, zato procesu pravimo oksidativna fosforilacija. Kočni sprejemnik elektronov je v dihalni verigi kisik. Pri NADH: Elektroni se odcepijo od prenašalcev in oddajo energijo na kompleks I. Pri tem kompleks I spremeni konformacijo in skozenj se prečrpajo vodikovi protoni. Elektroni se nato vežejo na ubikinon (koencim Q10) in prenesejo na kompleks III, ki zopet spremeni konformacijo. Iz kompleksa III se prenesejo na citokrom c in na kompleks IV, ki spremeni konformacijo. Kočni sprejemnik elektronov je kisik, ki se pretvori v vodo. 4𝐻 + + 4𝑒 − + 𝑂2 → 2𝐻2 𝑂 48 Pri maščobnih kislinah proces poteka malo drugače, v dihalno verigo so vključeni le FADH2, CoQ10, kompleks II, III in IV. sladkorji: 𝑁𝐴𝐷𝐻 → 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑘𝑠 𝐼 → 𝐶𝑜𝑄10 → 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑘𝑠 𝐼𝐼𝐼 → 𝐶𝑦𝑡 𝑐 → 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑘𝑠 𝐼𝑉 MK: 𝐹𝐴𝐷𝐻2 → 𝐶𝑜𝑄10 → 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑘𝑠 𝐼𝐼 → 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑘𝑠 𝐼𝐼𝐼 → 𝑘𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑘𝑠 𝐼𝑉 Skozi dihalno verigo po kompleksih narašča afiniteta do vezave elektronov; NAD+ ima v verigi najmanjšo afiniteto, kisik pa največjo. V obratni smeri pa raste energija elektronov, elektroni, ki se vežejo s kisikom, imajo najnižjo energijo. 9.2 Elektrokemijski protonski gradient S prečrpavanjem protonov se koncentracija protonov v medmembranskem prostoru močno poveča v primerjavi z matriksom. Na zunanji strani NMM se nabere tudi pozitivni naboj, na notranjosti pa negativni naboj. Večino energije gradienta prispeva razlika v membranskih potencialih (ΔV), manjši del pa prispeva razlika v koncentracijah protonov (ΔpH). 9.3 Sinteza ATP V procesu celičnega dihanja velika večina ATP nastane v procesu oksidativne fosforilacije (30 molekul ATP na molekulo glukoze). ATP nastaja s pomočjo F-črpalke imenovane sintaza ATP. Sintaza ATP se nahaja v vrhih krist in sicer v obliki dimerov. Uporablja energijo elektrokemijskega protonskega gradienta za fosforilacijo ADP do ATP. V primeru, da je razmerje med ADP in ATP prenizko (premalo ADP) pa lahko sintaza ATP uporablja energijo ATP za prečrpavanje protonov v medmembranski prostor. 49 9.4 Transport metabolitov Notranja mitohondrijska membrana je slabo prepustna, zato so za prehanjanje potrebni proteinski translokatorji. Glavni metaboliti, ki prehajajo iz/v mitohondrij so piruvat, ADP in ATP. ADP in ATP prehajata z antiportom (ADP v mitohondrij in ATP ven), za kar je potrebna razlika membranskih potencialov. Piruvat pa prehaja s simportom, za kar je potrebna razlika koncentracij protonov. V rjavem maščevju mitohondriji ne proizvajajo ATP, pač pa toploto. 9.5 Biogeneza encimov dihalne verige Večina proteinov mitohondrijev je zapisana v jedrni DNA, sintetizirajo se torej v citosolu in v mitohondrij prehajajo posttranslacijsko. mtDNA nosi zapis le za 13 proteinov, ki so večinoma transmembranski in so sestavni del kompleksov dihalne verige. Tudi transkripcija in translacija v mitohondriju potekata drugače kot v evkariontski celici in sta podobna prokariontski. citosol mitohondrij membranski proteini tRNA, mRNA, rRNA membranski proteini za komplekse I, III in topni encimi za Krebsov cikel in β-oksidacijo IV, ATP sintaza mitohondrijska sintaza tRNA mitohondrijski ribosomski proteini 9.6 Zlivanje in delitev mitohondrijev Mitohondriji se lahko delijo, lahko pa se tudi zlivajo skupaj. Zlivanje in delitev zahtevata: - energijo iz GTP - dinamine (dinamin 1), adapterske proteine, GTP-aze - elektrokemijski protonski gradient - natančno regulacijo 50 9.7 Translokacija proteinov v mitohondrij Proteini, namenjeni za mitohondrije, imajo na sebi signalno sekvenco na aminokoncu (N- konec), na njih pa so vezani šaperoni (Hsp70), ki prekurzorski mitohondrijski protein držijo v nezviti konformaciji. Protein se s signalno sekvenco pripne na protein TOM, translokatorski del TOM pa ga prenese v medmembranski prostor. Tam se s signalno sekvenco vpne v protein TIM23 in se prenese v matriks. V matriksu signalna peptidaza odstrani signalno sekvenco in protein se lahko zvije v zrel mitohondrijski protein. 9.8 Vgraditev proteinov v notranjo membrano Vgraditev proteinov v notranjo membrano poteka po dveh poteh. Prva je zelo podobna translokaciji proteinov v matriks, vendar imamo tu protein, ki ima signalno sekvenco in stop-transfer sekvenco. Ko se protein s signalno sekvenco vgradi v TIM23, se translokacija zaradi stop-transfer sekvence ustavi, signalna peptidaza odščipne signalno sekvenci in protein ostane v membrani, kjer se lahko zvije. Pri drugi poti pa sodeluje kompleks OXA. Protein ima nase vezano signalno sekvenco in sekundarno signalno sekvecno. Preko TOM in TIM23 se translocira v matriks, nato pa se signalna sekvenca odcepi. S sekundarno signalno sekvenco se protein vgradi v kompleks OXA in prenese v transmembranski prostor, kjer se lahko zvije. Tako se vgrajujejo tudi proteini, sintetizirani v mitohondriju. 51 9.9 Vgraditev proteina v zunanjo membrano V zunanjo membrano se morajo vgraditi porini, ki omogočajo transport snovi v medmembranski prostor. Pri vgrajevanju sodeluje kompleks SAM. Preko kompleksa TOM se porin najprej prenese v medmembranski prostor, nato pa se odcepijo šaperoni in protein se veže na kompleks SAM. Kompleks SAM ga vgradi v membrano, kjer se porin zvije in oblikuje pore. 10 PEROKSISOMI Peroksisomi so membranski organeli, v katerih potekajo β-oksidacije. Poleg mitohondrijev so edini organel, ki porablja kisik. Naloge peroksisomov so: - oksidacije organskih molekul 𝑅𝐻2 + 𝑂2 → 𝑅 + 𝐻2 𝑂2 - oksidacije alkoholov, fenolov in formaldehida 𝑅𝐻2 + 𝐻2 𝑂2 → 𝑅 + 𝐻2 𝑂 - razgradnja vodikovega peroksida s katalazo 𝑘𝑎𝑡𝑎𝑙𝑎𝑧𝑎 2𝐻2 𝑂2 → 2𝐻2 𝑂 + 𝑂2 - β-oksidacije maščobnih kislin do acetil CoA - začetne stopnje sinteze plazmalogena (fosfolipid v mielinu) - začetne stopnje sinteze holesterola 10.1 Nastanek peroksisomov Peroksisomi nastajajo z odcepljanjem peroksisomskih prekurzorskih veziklov od ER, s katerimi se nato združujejo že zviti peroksisomski proteini s pomočjo Pex5 (prenašalni protein peroksin), ki jih potem pripelje do translokatorjev peroksinov na membrani peroksisoma. Če je peroksisom prevelik, se lahko deli na manjše peroksisome. 10.2 Vstop peroksisomskih proteinov v peroksisom Peroksisomski proteini morajo za vstop v peroksisom imeti pravilno signalno sekvenco. Ločimo dve signalni sekvenci za peroksisomske proteine: - PTS1 – zaporedje 3 aminokislin na C-koncu - PTS2 – zaporedje 9 aminokislin na N-koncu PTS1 ali PTS2 prepozna peroksin Pex5, ki kroži med citosolom in peroksisomom. Na membranah peroksisomov so membranski translokatorji iz vsaj 6 peroksinov, ki omogočajo vstop proteinov v peroksisom. 52 11 DOLOČITEV SPOLA Pri sesalcih se spol določa na dveh ravneh: 1. primarna določitev spola - genotipična/kromosomska (določa Y kromosom) - genska/gonadalna (SRY gen  Sertolijeve celice, ni SRY gena  jajčni folikel) 2. sekundarna določitev spola - fenotipična (spolni hormoni) 11.1 Razvoj gonad Razvoj gonad se začne v 4. tednu fetalnega razvoja. Takrat se pojavijo primordialne klične celice (PKC), ki so totipotente, kar pomeni, da se lahko diferencirajo v katerikoli tip celic, tudi v nov embrio ali v celice ekstraembrionalnih tkiv (npr. posteljico). Primoridalne klične celice migrirajo na genitalni greben, kar omogočajo zunajcelični signalni proteini (npr. kemokini). Iz njih se razvijejo spermiji ali jajčeca, kar uravnava usmeritev genitalnega grebena. Po migraciji se celice začnejo deliti do 8. tedna, po 8. tednu pa se začne diferenciacija pod vplivom genov (najpomembnejši je SRY gen na Y kromosomu). SRY gen spodbuja diferenciacijo somatskih celic v Sertolijeve celice in zavira nastanek ovarijev. Sertolijeve celice spodbujajo usmeritev razvoja spola v moško smer na štiri načine: - spodbujajo novonastale PKC v smer nastanka semenčic, z zaviranjem mejotskih delitev v celicah, ki bi se razvile v jajčne celice - izločajo anti-Müllerjev hormon (AMH),

BIOLOGIJA CELICE PDF

Document Details

Tags

Related

Summary

Full Transcript

Upgrade to continue