Biologia PDF - Cenni di Chimica

Gli operatori ambientali ha l’obiettivo di migliorare le condizioni di vita in cui si vive. Studiare l’ambiente in tutti i suoi aspetti è utile per migliorare l'ambiente e la vita. Ci sono dei fenomeni che destabilizzano gli equilibri ambientali, modificarli è una cosa molto semplice e frequente (no...

Gli operatori ambientali ha l’obiettivo di migliorare le condizioni di vita in cui si vive. Studiare l’ambiente in tutti i suoi aspetti è utile per migliorare l'ambiente e la vita. Ci sono dei fenomeni che destabilizzano gli equilibri ambientali, modificarli è una cosa molto semplice e frequente (non è solamente inquinare). Banalmente basta introdurre un insetto dal centro Africa, inavvertitamente lo importiamo qui; è chiaro che con queste importazioni massive che una volta non esistevano. Quindi in queste grandi importazioni di derrate alimentari fa si che queste grandi navi container che attraverso gli oceani ed è possibile che in mezzo a questi carichi, che vengono controllati, ci possono anche essere qualcosa che sfugge come un insetto che normalmente nel suo abitata che era il Sud est Asiatico e improvvisamente viene liberato e questo cerca di ambientarsi. Se le condizioni climatiche glielo permettono lui sopravvive. Oggi con questo riscaldamento globale e questi lunghi periodi caldi alcuni insetti, specialmente subtropicali che non si sarebbero potuti insediare qui, oggi trovano un ambiente favorevole. Quello che succede quando un insetto si trova in habitat nuovo, se trova le condizioni climatiche giuste sta bene ma in più quello che lui non ha più sono i suoi competitori naturali perché nel suo habitat naturale si era sicuramente instaurato un equilibrio tra le specie e quindi altri insetti controllavo altri insetti o animali. Questo avviene negli sistemi erogeni o ambienti in cui non c’è alterazione, in cui le specie si controllano e si equilibrano tra di loro perché se una specie cresce troppo ci sono dei predatori che la riportano al livello corretto. Ma se io prendo questo insetto dal sud est Asiatico e lo portiamo qua, qui non ci sono i suoi normali competitori e il rischio è che si espanda tantissimo (es.Drosophila Suzukii). Non è solo l’uomo ad alterare l'ambiente ma può avvenire che gli ecosistemi perdono il loro equilibrio anche perché vengono introdotte specie autoctone. =>noi influenziamo pesantemente l’ambiente con l’urbanizzazione cioè la concentrazione nelle aree urbane. ES.Dubai è una grande popolazione, un pezzettino di deserto. 1980: grattaceli quà e là con sterpaglia e gli emirati arabi erano un ambiente naturale poi con il passare del tempo la situazione è cambiata. La popolazione nel 1800 erano mille persone che avevano le capre e si inquinava molto poco ma poi la popolazione è cresciuta e siamo arrivati nel 2021 dove la popolazione è aumentata e si è arrivati a 2.106.000. Nel 2017 le cose sono cambiate molto, la popolazione è aumentata. Noi siamo animali come gli altri che non possiamo eliminarci. =>Il pianeta va cambiato un pezzo alla volta (piece by piece) non tutto in un colpo. Essere vivente: non è abbastanza descrivere come qualcuno che si muove o è caldo. Mario Ageno (fisico) definisce l’essere vivente come un sistema chimico coerente dotato di un programma. Infatti è presente un DNA che codifica per produrre proteine e c’è una precisa sequenza di eventi. Tutti queste hanno in comune e soddisfano almeno una di queste proprietà ma tante volte è facile capire se una cosa è viva, ma non è così facile per definirlo correttamente noi dobbiamo immaginare che un vivente è dotato di tutto un insieme di queste priorità, quindi un vivente ha una sua: -individualità:è la proprietà di ogni essere vivente di possedere caratteristiche che lo distinguono da tutti gli altri, tutti sono diversi anche i gemelli omozigoti (cioè coloro che sono nati da un singolo uovo fecondato, che nella divisione si stacca in due parti e forma vite che derivano dallo stesso genoma) e ci sono delle differenze -specificità:tutti i viventi possono essere raggruppati per delle caratteristiche comuni in categorie di ordine superiore. La specie è proprio quella definita come drosophila vena gastrica è proprio quel moscerino della frutta mentre la drosophila suzukii è la sua cuginetta. Ci sono dei gruppi in cui noi possiamo scrivere tutti quegli organismi che hanno caratteristiche simili fino ad arrivare alle caratteristiche simili in cui due individui possono riprodursi incrociandosi tra di loro -metabolismo specifico:in un organismo vivente ci sono continuamente trasformazioni chimiche, energetiche e fisiche e tutte queste fanno si che si tenga vitale organismo.Noi per tenere la nostra temperatura a 37 gradi facciamo fatica chimicamente ci devono essere delle reazioni esotermiche che producono calore -omeostasi:si intende la capacità di un sistema di modificare comportamento e le proprie funzioni interne con lo scopo di mantenere stabilità nelle condizioni interne del sistema -ciclo biologico:i viventi accrescono la propria massa e sviluppano le strutture adatte a vivere la loro vita adulta. In molti casi il ciclo vitale non è semplice come noi essere umani che ci modifichiamo strutturalmente ma rimaniamo identici, ma ci sono alcuni viventi come le meduse hanno grossi cambiamenti e quando la meduse è natante produce spermatozoi e uova dopo di che queste si fecondano e si forma una larvetta (planula) e questa si va ad attaccare al fondo. Quindi la medusa da organismo plantonico diventa un organismo bentonico cioè si attacca al fondo e si divide in segmenti (dischi) che maturano e si staccano e diventano meduse. -riproduzione:primo o poi, per cause esterne o interne ogni essere vivente va incontro alla morte; quindi all'interno delle specie c’è una mortalità. Questo è uno dei processi più importanti per mantenere lunga la specie. =>ci sono ordini di grandezza diversi, se consideriamo i vegetali l'ordine di grandezza famigliare ma nel momento in cui ci spostiamo sulle cellule allora il discorso cambia perché le cellule normalmente sono visibili a occhio nudo. Cellule si dividono in due grandi famiglie: -procariote (1-10 um):sono tipiche dei batteri (microrganismi), non possiedo un vero e proprio nucleo. Termine le pro- signifca prima e vedremo che le prime cellule che si sono formate sulla Terra erano procarioti. Quindi è una cellula antica. -eucariote (10-100 um):sono cellule che sono negli organismi (mammiferi, animali, vertebrati, insetti, verme); vero cariote=>il nucleo si chiama carion, quindi eucariote vuol dire che sono cellule che possiedono un vero nucleo dove c’è DNA. Ultimamente questa linea di cellule prive di nucleo che oggi chiamiamo batteri si è conservata evolutivamente fino ad oggi. Che poi si sono modificate e perfezionate fino a diventare eucariote. Virus (20-500 nm):sono forme su cui si è disertato infinitamente per decidere se sono vivi, se sono al limite della vita. Generalmente sono un filamento di acido nucleico e intorno è protetto da una sorta di involucro formato da proteine e altre molecole. I virus per loro caratteristica non hanno capacità di replicare da soli e quindi sono parassiti endocellulari, perchè loro entrano nelle cellule eucariote e per farsi duplicare e proliferare utilizzano la macchina sintetica della cellula che hanno infettato (da soli non sono autonomi). Grandezze 1 mm=1x10-3 (millesimo) 1 um=1x10-6 (milionesimo) 1 nm=1x10-9 (miliardesimo) 1 A (Angstrom)=1x10-10 Le cellule eucariote viaggiano tra i 10-100 um ma c’è un'eccezione che è la cellula uovo femminili (gameti) mentre lo spermatozo (gamete maschile). In generale le cellule che si occupano di questi processi produttivi si chiamano cellule germinali. Per definire le cellule del nostro corpo sono un po’ di cellule germinali e il resto somatiche (soma=corpo). Dalle dimensioni/strutture delle uova c’entra molto il tipo di sviluppo dell’embrione. La femmine di un mammifero quando è gravida succede che l'embrione inizia a svilupparsi nella cavità uterina, l’embrione in fase dis viluppo assume i nutrienti, l'ossigeno e gli anticorpi dal corpo della mamma quindi lo sviluppo interno fa sì che l’uovo di un mammifero non ha bisogno di grandi dimensioni perchè appena si sviluppa c’è la mamma che provvede allo sviluppo. Invece l'uccello è diverso perché depone l'uovo fecondato fuori dal corpo non c’è nessuno che gli dà da mangiare e lo protegge, ma subisce tutte le ingiurie della natura. Quando l'embrione viene messo fuori ha bisogno di essere protetto (es.trota depone le uova fuori è ha bisogno di nutrienti per iniziare lo sviluppo finché il pesciolino può nutrirsi da solo). Invece l’uccello depone l’uovo fuori non solo ha bisogno il nutrimento per svilupparsi ma inoltre deve essere anche meccanicamente protetto, ecco perché nei gameti femminili degli uccelli e dei rettili hanno come protezione il guscio. Le uova hanno questo polimorfismo pazzesco sia dimensionale che di strutture che dipende da dove l'embrione si deve sviluppare. =>per lavorare con dimensioni molto piccole abbiamo bisogno di strumenti che in gradiscono le immagini=microscopi e ne esistono di diversi soprattutto partendo da microscopi molto semplice come stereomicroscopio o microscopio oculare che arriva da grandezze molto bassi e serve per vedere piccoli oggetti o animali e poi ci sono microscopi ottici e li riesce a ragionare in micron a vedere le cellule eucariote ma quando vogliamo entrare nelle cellule e quindi vedere le substrutture cioè quelle che noi chiamiamo la ultrastruttura cellulare e così devo utilizzare microscopi elettronici che hanno una differenza fondamentale oltre al fatto che ingrandiscono i più ma molto importante è il fatto che non usano la luce ma utilizza un fascio di elettroni, tutte le immagine ottenute sono in bianco e nero. CENNI DI CHIMICA Macromolecole= sono molecole che costituiscono gli organismi viventi contenenti carbonio e idrogeno, ossigeno, azoto (sono i maggiori costituenti circa 99% della massa di una cellula), fosforo (lo troviamo nel DNA, acidi nucleici) e zolfo (in alcune proteine). ATOMO= è formato da un nucleo in cui ci sono due tipi di particelle i protoni che hanno una massa pari a 1 e i neutroni che hanno una massa pari a 1, la differenza è che i protoni hanno una carica positiva mentre i neutroni sono carichi negativamente. In una zona periferica dell’atomo ci sono degli elettroni che non hanno una massa significativa però hanno carica negativa e girano sugli orbitali atomici. Il numero di protoni quindi il numero di particelle del nucleo che hanno carica positiva ci definisce il numero atomico. Atomi hanno una tendenza a unirsi tra loro se le condizioni sono favorevoli, quando gli atomi si uniscono tra loro formano una MOLECOLA e quando le nostre molecole come quella dell’acqua H2O (ci sono 2 atomi di idrogeno e 2 di ossigeno). La formula bruta non ci dice com'è la struttura. La forma e la funzione sono collegate e fondamentali, ogni forma ha una struttura ad esse. Questo rapporto rapporto e funzione è fondamentale non solo nel macro mondo ma anche funzionare nel miglior modo, le molecole svolgono la loro funzione perché hanno una certa forma perchè altrimenti non funzionerebbero più. Ci sono altri tipo di rappresentazioni ad esempio la formula di struttura: ci fa vedere i legami, poi ci sono le formule, i modelli compatti, modelli a sfera e questi modelli ci danno l’idea di quale potrebbe essere la forma effettiva della molecola. Il fatto che le molecole si formano è perché legandosi con gli atomi raggiungono una stabilità maggiore se la molecole forma (in modo spontaneo) più instabile energicamente dei singoli atomi non si formerà. Le molecole in genere si formano con una reazione chimica che porta a formare dei legami tra i vari legami che tengono la struttura e i principali legami sono quelli covalenti: è un legame che si forma perché gli elettroni degli orbitali esterni degli atomi vengono compartecipati. Se noi dovessimo guardare una molecola con un microscopio magico (es nicotina) vedremo la reale forma della molecola e quello che vediamo è data dalle nuvole si elettroni. La forma è importanto perché definisce la capacità di questa molecola di interagire con il solvente e con altre molecole. Enzima: sono proteine che hanno come capacità primaria quella di rendere più veloce altre reazioni, sono catalizzatori che sono capaci di prendere il loro substrato cioè la molecola che devono modificare e con una reazione la fanno cambiare velocemente. Gli enzimi quando interagiscono con il loro substrato lo fanno correttamente perché l’enzima ha una certa forma e il substrato ha una forma complementare. Due molecole che hanno una forma complementare potranno interagire correttamente e a quel punto le reazioni avvengono. La forma della molecola cioè quello che gli dice come si deve avvolgere sono legami che sono considerati deboli perché tra gli atomi ci sono le ricariche elettriche più o meno forti. Quindi possono formare legami ionici, idrogeno (atomo di idrogeno porta una parziale carica positiva e se trova un atomo che carico negativamente dente a reagire), forze di Van Der waals. L'avvolgimento che la molecola fa per raggiungere la sua forma finale è dovuto da questi legami, e la forma è in grado di svolgere la sua funzione. Folding (ripiegare): terminologia per definire l'avvolgimento della proteina, è il processo con cui la proteina ripiegandosi assume la sua forma stabile funzionale. Anticorpi: sono molecole molto speciali che sono prodotte dal nostro sistema immunitario e sono proteine e la loro funzione essenziale è quella di riconoscere eventuali agenti estranei che sono penetrati nell'organismo. Essi sostanzialmente riconoscono quello che non è proprio dell'organismo (no self), questo riconoscimento è preciso perchè se dovessero conoscere il self=> avvengono le malattie autoimmune sono malattie in cui c’è una disfunzione immunologica mediata dal fatto che gli anticorpi sbagliamo e riconoscere molecole proprie dell'organismo e lo danneggiano. Anticorpo antigene è la molecola che l’anticorpo riconosce, proprio perché hanno delle forme complementari con le molecole che sono sopra antigene. Le cellule più importanto del sistema si chiamano macromolecole (grande cioè formata da molti atomi) e le 4 più importanti della vita sono:proteine, carboidrati, lipidi (grassi) e acidi nucleici. Se noi prendiamo un vivente e vediamo la sua costituzione vediamo che c’è un rapporto effettivo tra le macromolecole e altre componenti come l’ACQUA. L'uomo contiene circa il 65%di acqua, un neonato 70% mentre l’anziano al 60% quindi c’è una sorta di disidratazione con l’età che comincia subito in più un 27% di macromolecole e una piccola parte di piccole molecole (es. le meduse è diverso contengono una grande quantità di acqua tanto è vero che se la lasciamo sulla battigia si disidratano velocemente). Anche il rapporto tra le macromolecole è differenziale una buona parte di proteine e acidi nucleici DNA e RNA, carboidrati e lipidi. Le macromolecole le possiamo definire come dei polimeri sono formati da monomeri (unità costituente) che sono legati da legami covalenti; ci sono polimeri formati dallo stesso monomero=>omopolimeri oppure da monomeri diversi=>eteropolimeri. In genere le macromolecole hanno una massa molecolare che dipende da quanti atomi ci sono legami, queste dimensioni le definiamo secondo quello che è la massa o peso molecolare deriva dai pesi atomici dei singoli atomi che costituiscono la molecola, le macromolecole hanno una massa molecolare superiore a 10 mila dalton. La massa molecolare è quella della singola molecola (es. actina proteina che abbiamo nei muscoli che ci permette di contrarre i muscoli ha una massa di 42 kilodalton). Il cloruro di sodio (no macromolecola) NaCl per trovare la massa molecolare dobbiamo sommare i pesi atomici dei singoli elementi che la compongono=58,44 dalton. In laboratorio si usano i reagenti e viene spesso indicato il peso molecolare del reagente. Il dalton, il valore approssimato è 1,6 x 10-27 viene definito la dodicesima parte di un atomo di carbonio 12. La formazione di una molecola in genere si formano per una reazione di condensazione: due atomi vicini perdono parte dei loro componenti, i n genere perdono il gruppo H (idrogeno) questa perdita di una molecola d’acqua libera degli elettroni che rimangono spaiati e quindi le componenti compartecipano e formano i legami covalenti. Allo stesso tempo un polimero potrebbe essere rotto con un processo di idrogeni=> idrolisi. Le molecole spesso hanno caratteristiche particolari come gli alcoli portano un gruppo OH (ossidrile) è definito come un gruppo funzionale perchè da la funzione a quella molecola.Poi ci sono gli acidi:quando un a molecola ha un COOH (carbossilico), aldeide COH, gruppi atomici (chetone), aminico azoto più due idrogeni, gruppi fosfati un fosfato al centro e 4 ossigeni intorno. =>PROTEINE=>sono contenuti in tutti gli alimenti. Sono altro che polimeri cioè qualcosa fatto da monomeri cioè unità ripetute all'interno della molecola. Le proteine sono fatte da amminoacidi (AA) e la struttura è=> NH2 è il gruppo aminico (cioè basico) mentre COOH è il gruppo carbossilico (acido) e R è la catena laterale (variabile). Gli amminoacidi (mattoncini) che compongono la proteina tutti hanno questa struttura ma la R è una componente variabile ed è proprio lui che differenzia i diversi amminoacidi. Tutte le proteine sono costituite da 20 amminoacidi, anch se in natura ci sono più di 300 amminoacidi come: alanine, arginine, asparagine, glutamine, leucine, serine, proline ecc. Gli amminoacidi hanno tutti la stessa struttura ma differenziano per i gruppi laterali che sono diversi e questo potrebbe conferire all'amminoacido delle caratteristiche es. un atomo carico positivamente (ione) dell'amminoacido ha una una carica positiva o negativa oppure ci sono amminoacidi neutri o polari che hanno una carica molto debole. Due amminoacidi polari hanno una elettronegatività diversa che è la capacità di attrarre elettroni di un atomo che mi sta vicino. Se io prendo due amminoacidi che sono infilati in una catena dove uno ha una carica più e l'altro una carica meno tenderanno ad attrarsi. Avendo delle reazioni di attrazione o repulsione la proteina si piega mentre quelli neutri non influenzano in modo evidente l'avvolgimento della proteina che è dovuto dalle cariche sulla catena. La caratteristica strutturale comune a tutte le proteine è di essere dei polimeri lineari di amminoacidi; non è lineare quando abbiamo la presenza di ramificazioni. Ciascuna proteina ha però una propria struttura tridimensionale che la rende capace di svolgere specifiche funzioni biologiche. Alcuni amminoacidi li possiamo sintetizzare noi direttamente però ce ne sono alcuni che non riusciamo a produrre noi e quindi dobbiamo assumerli con la dieta come: Lisina, Leucina, Isoleucina, Metionina, Fenilalanina, Treonina, Triptofano e Valina. =>come fa la proteina a formarsi dal singolo amminoacido quello che succede è: l'amminoacido A e l’amminoacido B hanno uno rivolto verso l’altro il gruppo carbossilico (A rivolto verso B) e l’altro il gruppo aminico (B rivolto verso A) e quello che deve succedere è che loro si legano con un legame covalente=> il gruppo carbossilico perde un OH, il gruppo aminico perde un H e OH + H fa una molecola di acqua e questa reazione si chiama di condensazione; tra il carbonio e l’azoto dell'ex gruppo amminico si forma il legame peptidico. Questa unione di amminoacidi continua nella sintesi delle proteine in modo sequenziale fino a formare la proteina. La proteina si differenzia per i diversi tipi di aminoacidi che contiene ma anche per la lunghezza. Se io ho 2 proteine che per funzionare si devono avvolgere (folding) e questa forma è definita dagli amminoacidi che sono dentro formando architettura molecolare. La struttura primaria della proteina che è data dalla sequenza armonica è quella che mi determina la funzione la forma di quella proteina. La proteina peptidica è formata da un sacco di monomeri e alla fine gli ultimi legati proprio per la formazione, uno esporrà il gruppo amminico (N-terminale) e dalla parte opposta la proteina esporrà il gruppo carbossilico (C-terminale). La proteina la estraiamo da un tessuto e per analizzare la riduciamo in questa struttura primaria. La nostra proteina dalla sua struttura primaria che è lineare deve iniziare ad avvolgersi per poi arrivare a una forma definitiva: folding di una proteina=>partendo da sinistra la rima ansa cioè la piegatura che la proteina fa perché lì in mezzo ci sono legami idrogeno però poi ci sono altri legami come forze di van der waals CH2CH(CH3)2 contro un CH CH3 CH3, poi ci sono ponti disolfuro (CH2-S-S-CH2) tra particolari amminoacidi che sono legami forti. Molti studiosi hanno definito che la proteina oltre alla sua struttura primaria può assumere una struttura secondaria sono ben definite perché o fanno delle α-eliche cioè fa dei legami interni deboli e tende ad assumere una forma elicoidale oppure un’altra forma tipica della struttura secondaria è foglietti β sono foglietti un po’ planari. Queste strutture secondarie (foglietti ed eliche) tendono ad avvolgersi tra di loro e quindi si va a formare una struttura terziaria dove la forma è stabilizzata da legami intra-catena (ponti idrogeno e ponti disolfuro). C’è che una struttura quaternaria perchè le proteine non si accontentano di stare da sole e quindi diverse catene di proteine si uniscono fra di loro a formare delle strutture superiori; in questo caso abbiamo 4 proteine che sono unite fra loro a formare un tetramero formato da quattro subunità polipeptidiche. Il Tetramero più importante è l’emoglobina (è una struttura quaternaria): è fondamentale nei nostri eritrociti o globuli rossi perché trasporta l’ossigeno che è fondamentale per le reazioni della cellula. L’ossigeno è necessario alle nostre cellule ovunque noi abbiamo un sistema circolatorio formato da batteri e vene più o meno grandi o sottili per arrivare in tutti gli stretti del corpo perché il sangue deve arrivare a tutti i tessuti. La proteina dopo la sintesi dopo 18 microsecondi inizia ad avvolgersi dopo 18.9 microsecondi ha fatto un altro avvolgimento quindi in 20 microsecondi ha fatto i suoi avvolgimenti finché trova la sua forma finale. Lo stato nativo della proteina: è quello in cui la proteina è biologicamente attiva per funzione mentre lo stato denaturato (unfolded): è lo stato in cui la proteina non funziona. la denaturazione può avvenire per variazioni di pH, alte concentrazioni di sali e variazioni di temperatura. Le cariche che hanno gli amminoacidi sono cariche instabili perché sono stabili in un sistema come quello del citoplasma della cellula dove il pH è 7, ma se io cambio ph il carica diventa instabile e la proteina perde la sua forma. Le proteine sono gli elementi molecolari sia strutturali che funzionali più importanti nei sistemi viventi. Moltissimi processi vitali dipendono da questa classe di molecole come: -Enzimi: catalizzano le reazioni -Anticorpi:coinvolte nelle difese immunitarie -Emoglobina:trasporta ossigeno -Albumina: riserva e trasporto nutrienti -Proteine citoscheletriche: sono responsabili della forma, movimento, contrazione. ENZIMI:proteine particolari è ognuno ha un suo substrato e l’enzima interagendo (catalizza) con il substrato è in grado di modificarlo e creare un prodotto; quindi il prodotto di reazione è qualcosa di diverso dal substrato iniziale. La reazione di modificazione potrebbe anche venire in modo spontaneo e questo avviene perché queste convenzioni del substrato hanno bisogno di energia di attivazione, il problema è che quell'energia è molto alta in assenza dell’enzima, solstlzialemnte l’enzima abbassa questa energia di attivazione e quindi fa in modo che la reazione avvenga in modo spontaneo. I PRINCIPALI GRUPPI DI ENZIMI -ossidoreduttasi:trasferimento di idrogeno e ossigeno o di elettroni da un substrato all’altro -transferasi:trasferimento di un gruppo specifico da un substrato all’altro (transaminasi-chinasi) -idrolasi:idrolisi di un substrato (Esterasi - Enzimi digestivi) -isomerasi:variazione della forma molecolare del substrato -ligasi:unione di due molecole con formazione di nuovi legami (DNA ligasi). I nomi di questi enzimi finiscono in -ASI. Le proteine si dividono in strutturali:rafforzano e proteggono le cellule e dei tessuti (es.collagene). Alcune proteine fanno un lavoro fantastico come le proteine del citoscheletro: partecipano al movimento cellulare; quando noi solleviamo il penso perchè contraiamo il muscolo e quindi il bicipite si contrae che provoca la distensione del bicipite e così si induce la flessione del braccio Il muscolo è fatto da un sacco di cellule muscolari che prendo il nome di fibre che sono unite uno con l’altra a formare fasci. All’interno del muscolo ci sono i fasci, il tendine e il tubo è la cellula muscolare, all'interno di questa cellula c’è il nucleo ma è un po’ speciale perchè sono presenti fasci di filamenti più grossi e più sottili e sono composti principalmente da actina e miosina. L'accorciamento del muscolo avviene perché questi filamenti spessi e sottili sono capaci di slittare tra di loro. Quando parliamo di macromolecole non parliamo solo di proteine ma anche di: polisaccaridi (costituiti da monosaccaridi)=>carboidrati lipidi=> acidi grassi proteina=> amminoacidi acidi nucleici (DNA-RNA)=> nucleotidi. La colonna di sinistra ci indica i costituenti base delle macromolecole che sono sulla colonna di destra. Moltissime proteine una volta che sono state sintetizzate vengono additivate con dei rami di zuccheri e vengono chiamate glicoproteine anche i lipidi avviene la stessa cosa e vengono chiamati glicolipidi. CARBOIDRATI=> sono importanti nella nostra dieta, però non sono solo utili per il bilancio energetico ma in verità entrano nelle macromolecole come il DNA e RNA nelle due molecole c’è il ribosio e il desossiribosio. -sono costituenti fondamentali degli acidi nucleici -ci sono carboidrati complessi che lubrificano le articolazioni ossee e hanno la caratteristica di essere igroscopici cioè che sono capaci di assimilare molta acqua rendono turginom il tessuto cioè bello ammortizzato (es. cartilagine) -riconoscono ed aderiscono sulla superficie cellulare, quindi gli zuccheri in queste glicoproteine hanno un ruolo fondamentale di recettori. -nelle piante i carboidrati hanno anche funzione strutturale (cellulosa) e questa funzione strutturale costituisce la parte delle cellule vegetali. I carboidrati si suddividono in: -monosaccaridi: uno zucchero singolo -disaccaridi: è formato da 2 zuccheri singoli ed alcuni esempi di disaccaride sono il maltosio (glucosio + glucosio), saccarosio (glucosio + fruttosio) e lattosio (glucosio + galattosio) -polisaccaridi: sono lunghissime catene di zuccheri (cellulosa, amido, glicogeno: che sono zuccheri che accumuliamo nei muscoli) Molti zuccheri hanno gli stessi atomi però nella loro struttura tridimensionale uno è ruotato in modo diverso. I carboidrati immersi nell'acqua assumono una forma di anello e diventato un esoso cioè una struttura a forma di anello con 6 atomi. Il tessuto che è l’epitelio dell’intestino io posso fare con la microscopia una colorazione che mi evidenzi i carboidrati (che è quella rossa) e sembra che queste cellule abbiamo sulla superficie uno strato di carboidrati. Il microscopio ottico mi permette di vedere i colori ma se io uso un microscopio elettronico (le immagini sono più grandi, ed è stata fatta una colorazione per mostrare i carboidrati sulla superficie) con questa foto che è sempre la superficie di una cellula quello che si vede in basso tondeggiante è il nucleo, poi c’è il citoplasma e sopra c’è la membrana, quella superficie li si chiama glicocalice. I rami oligosaccaridici delle glicoproteine e glicolipidi nel glicocalice alla superficie di una cellula endoteliale di ratto. =>Esiste nelle cellule un ambiente intracellulare dove c’è il nucleo, il citoplasma e tutti i componenti che sono dentro la cellula e fuori dalle cellule c’è l'ambiente extracellulare (matrice extracellulare); tutte le cellule vivono immerse in un liquido, quindi in entrambi gli ambienti il massimo esponente è l’acqua. In una membrana cellulare (strisce grigie) e immerse in questa parte della matrice lipidica della membrana ci sono un sacco di proteine che hanno tante funzioni e inoltre hanno dei rametti (con degli esagoni) sono dei monosaccaridi che fanno oligosaccaride. Le proteine soprattutto sulla superficie della cellula hanno degli zuccheri attaccati e si chiamano glicoproteine. Gli organi di senso della membrana sono dei recettori o molecole di superficie sono tutti sopra la superficie della membrana. In alcuni casi le proteine nella cellula vengono modificate, dopo che sono state sintetizzate, perché gli vengono attaccati uno o più rami di zuccheri, ma gli zuccheri non si attaccano su tutte le proteine=> le glicoproteine sono di due tipi principali e sono caratterizzate perchè hanno due precise posizioni cioè gli zuccheri si attaccano solo sull'amminoacido Asparagina, Serina o Treonina. Le glicoproteine si chiamano asparagina o N-linked hanno quindi l’oligossacaride legato all’azoto dell’amminoacido Asparagina mentre le glicoproteine si chiamano Serina/Treonina o O-linked perché hanno l’oligossacaride legato all’ossigeno degli amminoacidi Serina oppure Treonina. LIPIDI=>sono un gruppo ampio e diversificato di composti organici in genere apolari e idrofobici. Sono correlati per la loro insolubilità in acqua e solubilità in solventi organici non polari (es: etere, cloroformio, acetone, benzene), se io in laboratorio devo analizzare dei lipidi li posso sciogliere in dei componenti organici. I lipidi presentano una grande varietà strutturale. RUOLI principali: -forniscono energia; es. gli animali che vanno in letargo non si nutrono ed è per questo che si creano delle riserve di grasso molto cospicue proprio per superare il letargo -fungono da Riserva Energetica -hanno una funzioni Strutturali: partecipano alla formazione delle membrane biologiche, costituiscono il rivestimento mielinico degli assoni delle cellule nervose, che accelera la trasmissione degli impulsi nervosi, per rendere rapide le reazioni. -fungono da isolante termico -hanno un ruolo funzionale e regolatorio:vitamine (come la vitamina D), ormoni steroidei (come testosterone e cortisolo) e precursori di molecole segnale (eicosanoidi, come le prostaglandine). Fosfolipidi:sono i lipidi delle membrane Cere:lunghe catene carboniose (es.le cere del padiglione auricolare ed è utile perché intrappola i batteri che possono entrare, altro esempio le mucose), sono zuccheri (polisaccaride) formano la sostanza mucosa e gelatinosa così i batteri vengono catturati e intrappolati. Hanno in genere una struttura formata da uno scheletro di atomi di Carbonio e Idrogeno. Sono acidi grassi che si suddividono in saturo perché ha tutti legami semplici o monoinsaturo mentre questo ha un doppio legame e qui la molecola ha la possibilità di flettersi e di muoversi. Tutte le cellule hanno una membrana (che è formato da gambette e una testa e dall'altra parte testa e gambette) che circonda le cellule è formata da un doppio strato di lipidi, ma i lipidi sono generalmente Idrofobici e ciò che circonda la membrana è un ambiente acquoso. Quando la cellula si è evoluta ha dovuto creare qualcosa che la delimitano, un sacchettino, e a usato i lipidi speciali che si chiamano fosfolipidi e la testolina è proprio il gruppo fosfato, praticamente utilizzando questo gruppo quale molecola è diventata diversa le due estremità da una parte idrofobica dove ha le zampette ma dalla parte dove c’è la testolina è idrofilica. Da una parte sarebbe stata ben in acqua ma dall’altra c'erano le code degli acidi grassi e non andava bene ancora e quindi ha fatto un doppio strato contrapponendo gli acidi grassi in modo che questa rimanessero protetti all'interno della membrana e quello che era esposto all’esterno sono proprio le teste idrofile. La membrana cellulare è composta da: proteine + carboidrati + lipidi. Ci sono delle componenti che interagiscono tra di loro e ciò che controlla ciò che avviene nelle cellule eucariote sta nascosto nel nucleo cellulare: struttura chiusa ed è fatta da un membro che è simile alla membrana esterna della cellula. Il nostro agente regolatore è dentro nel nucleo e si chiama acido desossiribonucleico o DNA regola le funzioni vitali a monte cioè è responsabile delle proteine che vediamo nella cellula. DNA (come un sistema operativo) ha il codice che serve a produrre tutte le proteine della cellula, esso deve essere protetto perché un danno non fa funzionare più niente. Il DNA sta nel nucleo della cellula e per controllare quello che avviene fuori manda degli operatori secondari che sono gli RNA sono quelli che poi producono le proteine, quindi l'informazione contenuta nel DNA passa attraverso il RNA per arrivare a produrre le proteine. Quando il DNA chiama RNA per far fare actina si attiva un processo di trascrizione, vuol dire che l’RNA è una copia di un pezzo di DNA (codice)=> es. come fare ad aumentare la massa muscolare andando in palestra dobbiamo aumentare actina e miosina (che costituito i fasci che si intrecciano nel muscolo) e per aumentarla il nostro organismo lo fa DNA riceve un'informazione che è quella aumenta le proteine muscolari e quindi il DNA attiva uno di questi codici e comincia a mandare in giro i suoi RNA; quindi io ti produco tanto DNA che è un trascritto del gene dell’actina in modo che ci siano tanti RNA che vadano fuori e nel citoplasma della cellula inizierà la sintesi della miosina e actina per aumentare la massa muscolare. Quando non serve più (periodo di riposo) il DNA spegne questi geni, però non completamente. GENE: pezzetto di DNA cioè una sequenza di codice. Il flusso di informazioni è DNA=>RNA=>PROTEINE e il messaggio che RNA ti porta deve essere interpretato dalla cellula e quindi il passaggio tra RNA e PROTEINE si chiama processo di traduzione. ENZIMI: sono compartimenti cellulari, organuli della cellula, dove avvengono le operazioni che servono alla cellula per vivere. I batteri non hanno un nucleo perché sono cellule procariote e non hanno molti organuli che sono presenti nelle cellule eucariote, e si replicano in 30 minuti (circa 1000 batteri). =>DNA non si è sempre conosciuto fino a che nel 1953, Watson e Crick riuscirono a cristallizzare il DNA e scoprirono che il DNA è formato da due filamenti avvolti a formare una doppia elica. Se prendessimo questa doppia elica e la svolgiamo e quindi la rediamo piatta vedremmo una struttura => DNA=è costituito di polimeri di nucleotidi che sono farti da: 1 zucchero, 1 gruppo fosfato e 1 base azotata che interagiscono in modo ordinato mantenendo la conformazione elicoidale. Quando la doppia elica diventa piatta si vedono dei filamenti (gialli) e in mezzo ci sono le base che vedono rappresentate con delle lettere (C-G-A-T) che nell’elica sono rivolte verso l'interno e interagiscono tra di loro, le due eliche rimangono attaccate tra loro con dei legami deboli che si formano tra le basi e sono sempre complementari perché A si lega a T e C si lega a G. A=adenina T=timina C=citosina G=guanina Le strutture delle basi sono leggermente diverse Citosina e Timina= pirimidina sono fatte con un gruppo ad anello con 6 atomi mentre Adenina e Guanina=purine hanno pentos insieme ad esoso quindi hanno 6 atomi più un'altra molecola. Queste basi sono quelle che formano il codice genetico del DNA. Ci sono molte differenze tra il DNA e l'RNA non sono uguali perché lo zucchero è il desossiribosio nel DNA ma è diverso nel RNA (è un singolo filamento, quindi singola elica) che contiene solo il ribosio (prima differenza). =Accoppiamenti delle basi nel DNA e RNA (altra differenza): DNA: Guanina-Citosina e Adenina-Timina RNA: Guanina-Citosina e Adenina-Uracile DNA: ha una doppia elica che a livello evolutivo è un meccanismo di controllo. Immagino che il DNA sia a singolo filamento e che esso subisca un danno e che distrugga un pezzo, a quel punto il gene o codice genetico che c’era nel singolo filamento non c’è più e quindi non abbiamo più nulla per ricostruire quel pezzo danneggiato. Se invece ho una doppia elica complementare e si danneggia un filamento del DNA c’è l'altro filamento che è quello stampo e quindi i meccanismi riparativi della cellula possono ricostruire il pezzo di DNA danneggiato copainto dall'elica un filamento adiacente. RNA ce ne sono di diversi tipi ma i più importanti sono 3: -mRNA: RNA messaggero=>va nel citoplasma con il messaggio tra tradurre, quindi c’è proprio la sequenza del codice del gene che verrà trasformata in proteine. É una lunga molecola a filamento singolo. Quando un gene deve essere trascritto dalla cellula, il DNA che è avvolto su se stesso viene svolto e la doppia elica si apre per dare spazio agli enzimi e dentro quell'ansa viene copiato il gene per definire la sequenza degli amminoacidi della proteina che verrà sintetizzata durante il processo di traduzione nel citoplasma. È la copia di una delle eliche (templato) del nostro DNA. -rRNA: RNA ribosomiale= è un acido nucleico a singolo filamento e va a creare degli organuli cellulari che si chiamano RIBOSOMI: zona/macchina dove vengono sintetizzate le proteine. Essi sono formati da due subunità una più grossa e una più piccola e quando il ribosoma non è attivo sono staccate mentre quando deve sintetizzare le proteine le due subunità si uniscono a formare il ribosoma completo e tra le due subunità c’è un filamento azzurro che è mRNA dove vengono sintetizzate le proteine. -tRNA: RNA transfer=>RNA che nel citoplasma porta gli amminoacidi al sito di sintesi della proteina. É quello che si porta gli amminoacidi attaccati e li trasferisce al ribosoma dove si leggeranno per creare le proteine. Tutti e 3 questi RNA hanno tutti un ruolo nella sintesi delle proteine. L’informazione passa dal DNA all’mRNA (trascrizione), e viene reinterpretata in una precisa sequenza di amminoacidi legati a formare le proteine (traduzione). Sito di legame degli amminoacidi dove il nostro RNA transfer lega aminoacidi e poi li porta al ribosoma. Chi definisce quando una proteina è definita è il messaggero con il suo codice che afferma quale sarà il primo amminoacidi della catena e quale ultimo=> viene chiamato Stop secret (proteina è terminata). Mediamente nei sistemi biologici tutto vien fatto per una ragione e la ragione del perché la Uracile non c’è nel DNA se entrasse un Uracile nel DNA la cellula se ne accorge e dice che questa è una base sbagliata e la exciderebbe ma in verità quello che succede è che la cellula non potrebbe distinguere gli uracili che sono entrati nella sintesi per sbaglio, da quelli che sono derivati da una mutazione che avviene spontaneamente perché la Citosina del DNA può deaminarsi e diventare Uracile, il problema è che se nel DNA Uracile fosse presente normalmente, la cellula non potrebbe distinguere gli Uracile derivati dalla mutazione da quelli corretti, con conseguenze disastrose per il codice genetico e quindi per la cellula. BIOLOGIA CELLULARE UNITÁ DI MISURA=> metro = m, centimetro (cm)= 10−2 m = 0,01 m, millimetro (mm) = 10−3 m = 0,001 m, micrometro (μm)= micron = 10−6 m = 10-3 mm e nanometro (nm)= 10−9 m. La maggior parte delle cellule ha un diametro compreso tra 1-100 μm. Le cellule non possono quindi essere osservate e studiate a occhio nudo. Però se vogliamo andare a vedere dentro la cellula cioè com’è fatta a occhio nudo non è possibile. Molti anni fa di questa cosa se ne resero conto alcuni scienziati (una volta erano persone nobili) che non avevano nessuna pressione e quindi studiavano quello che gli piacevano. Molti tra quelli che si orientarono verso lo studio di cose piccole capirono che c'era un problema perché senza avere degli strumenti che ingrandivano era difficile vedere oggetti o organismi viventi molto piccoli. Robert Hooke (1665) usò un microscopio usato da altri, molto rudimentale e lui cerca di osservare e si imbatte nel sughero (ci sono dei pori scuri=lacune del sughero) e osservandole fece una enunciazione sbagliato e le chiamò cellule del sughero in verità quei buchini sono ciò che rimane dopo che la cellula è sparita (1^ definizione della parola cellula). Fine ‘600 Antonie van Leeuwenhoek proveniva da una famiglia di commercianti di stoffa e il padre gli disse che gli mandavano le stoffe dalla Cina e dall'Oriente ma secondo il padre gli davano anche delle sole e bisogna capire se i filati erano belli. Antoine osservando queste file, affermò che se avesse qualcosa per ingrandire vedrebbe molto meglio la purezza della seta e quindi iniziò a lavorare con questi microscopi rudimentali prima osservando le stoffe e poi iniziò a osservare tutto ciò che trovava, e fece delle tavole di tutto ciò che osservava. Con i mezzi di allora, le osservazioni dovevano essere riportate graficamente, con disegni a mano libera. Inoltre fino all’800 i limiti imposti dalla limitata tecnologia delle lenti ottiche rallentò i progressi scientifici nella biologia cellulare. 1839 – Theodor Schwann (biologo tedesco):descrisse le cellule della cartilagine e osservandola vide la presenza di un organulo molto grosso rispetto alla cellula e quindi vide e descrisse il nucleo della cellula=>da questi enunciò la “Teoria cellulare" e successivamente vennero scritti quelli che sono i dogmi della biologia cellulare: 1.Le cellule rappresentano la più piccola unità funzionale dei viventi 2.Tutti gli organismi sono costituiti da una o più cellule nucleate Rudolph Virchow (1855):ha potuto osservare la divisione cellulare e conclude affermando che tutte le cellule hanno origine da una cellula preesistente perché le cellule derivano da una cellula madre che si divide in due con un processo chiamato mitosi e successivamente si originano due cellule figlie. Siamo alla fine dell’800 i microscopi sono migliorati molto e questi due scienziati Strasburger e Flemming (1884):riuscirono ad osservare i cromosomi durante la divisione cellulare e videro che le cellule quando iniziava la divisione apparivano nel citoplasma delle strutture organizzate molto particolari e queste strutture quando la cellula si divideva venivano divise nelle cellule figlie. Affermarono che le basi fisiche dell’eredità risiedono nel nucleo. Poco prima (1865) il monaco austriaco Gregor Mendel pubblicava i dati sull'ereditarietà dei caratteri somatici, per mezzo secolo nessuno considerò il lavoro di Mendel. Lui studiava le piante di pisello, e vedeva che c’erano delle trasmissioni dei caratteri delle piante. Fino al 900 molti hanno ripetuto gli studi senza sapere che erano stati fatti da Mendel. Se tutto va bene il lavoro viene pubblicato sull'hard disk e questo lavoro viene letto da altri scienziati nel mondo che si occupano di cose simili al tuo, oggi l'informazione viene diffusa velocemente ed è uno dei temi centrali della ricerca. Nel 1900 Hugo de Vries ed altri botanici tedeschi, arrivarono le stesse conclusioni di Mendel, poi questi esperimenti di Mendel si erano diffusi e capirono che già qualcuno ci aveva pensato 40 anni prima. la trasmissione dei caratteri e la loro correlazione a geni e cromosomi fu definitivamente affermata dagli studi di Thomas H. Morgan studiò il moscerino della frutta quella più famosa è la Drosophila melanogaster da allora divenne uno dei modelli biologici più famosi studi da molti ricercatori ancora oggi. essa era facile da studiare perchè ha un genoma molto semplice perchè ha 4 cromosomi. Morgan riuscì a studiare la trasmissione dei caratteri e si affermò il concetto che esisteva una trasmissione dei caratteri ereditari e che questa arriva dal DNA e dal nucleo. Successivamente gli studi biologici furono supportate dalle ricerche chimiche e Emil Fischer studia il legame peptidico e gli zuccheri e posero le basi per: l’integrazione tra studi chimici e morfologici. Nel 1940-50 Oswald Avery e collaboratori cominciarono a capire come venivano trasmessi i caratteri e lui studiava i procarioti (Streptococcus pneumoniae) : il DNA è il reale depositario dell’informazione genetica. Prima degli studi chimici non sapevano neanche come fosse il DNA e se esistesse ma a questo punto con l'integrazione di queste discipline scientifiche si capì che il DNA era il vero depositario. La svolta definita la darono che: James Watson e Francis Crick affermarono che usando la cristallografia (tecnica chimica) riuscirono a costruire effettivamente immagina della struttura a doppia elica del DNA. =>Qualche eccezione c’è sempre sull’informazione genetica, il processo è sempre lo stesso (DNA,RNA e proteine); e l'informazione genetica risiede nel DNA ma non è sempre così perché l’eccezione sono i virus RNA=> sono semplici, hanno un filamento di RNA chiuso dentro una capsula proteica, non hanno i ribosomi cioè non hanno la macchina di sintesi delle proteine quindi non può fare le proteine. I virus sono parassiti cellulari quindi il virus deve entrare una cellula procariote quindi loro si posano sulla membrana della cellula, si fanno importare nel citoplasma e a questo punto quando sono dentro al citoplasma si fanno replicare e dalla stessa cellula si fanno costruire le proteine dopo si costruiscono la loro capsula con dentro mRNA uccidono la cellula se ne vanno fuori e vanno infettare altre cellule. Il problema che quando il virus entra, lui è fatto di RNA quindi lui deve duplicare RNA anche se la cellula non lo duplica allora lui si fa retrotrascrivere (copiare) in DNA poi questo DNA si integra nel genoma della cellula e quindi la cellula in comicia a trascriverlo come fosse un gene e quindi produce RNA (processo di trascrizione) ma questi RNA che la cellula sta producendo sono virus. MICROSCOPIA l'immagine è ottenuta con un microscopio a fluorescenza, quelle blu sono nuclei, ci sono dei coloranti fluorescenti che quando entrano nella cellula ed entrano in contatto con il nucleo si attaccano al DNA. Il rosso e il verde sono proteine del citoscheletro cellulare, quelle verdi sono fibre da stress e sono fatte di actina (stessa dei muscoli) e la vediamo verde perché possiamo usare un anticorpo che mi riconosca l’actina e quando sono in laboratorio ci attacco una proteina fluorescente (marcature); poi prendo un altro anticorpo che mi riconosce un'altra protein come tubulina però questo anticorpo lo lego con un fluoresce rosso. Questo serve tantissimo perchè la microscopia fluorescente ci ha permesso di vedere effettivamente dove sono localizzate le macromolecole nella cellula. Questo tipo di marcatura cioè la localizzazione di antigeni all'interno della cellula ci permette di vedere lo stato di salute delle cellule o anche dove va una proteina all'interno di una cellula. I microscopi sono formati da una struttura base: innanzitutto ci sono gli oculari sotto di essi ci sono portaobiettivi sotto ci sono gli obiettivi sono montati su uno strumento rotante chiamato revolver che permette di cambiare gli obiettivi con ingrandimenti diversi, al di sotto degli obiettivi c’è il tavolino traslatore dove si mette il vetrino da osservare al di sotto c’è una lampada che è una fonte luminosa che emette luce bianca nello spettro visibile. Con i diversi microscopi si usano diverse tecniche: 1.Microscopia Ottica convenzionale in luce trasmessa: dove è presente una microscopia in campo chiaro, senza colorazioni, si possono osservare cellule vitali ma con poco contrasto e definizione e una microscopia in campo chiaro, con colorazioni elettive per i componenti cellulari, si osservano cellule non vitali. Il problema di queste colorazioni istologiche è il fatto che per colorare le cellule le devo ammazzare ma se io volessi vedere un processo cellulare vivo non potrei farlo. 2. Microscopia Ottica avanzata: ci sono metodi migliori come il contrasto di fase ma qui ho dei sistemi di diaframmi che aumentano il contrasto dell'immagine si vede quindi il perimetro, il nucleo e un pochino di organuli e posso vedere se stanno bene senza colorare le cellule. Poi c’è microscopia in contrasto interferenziale (DIC, Nomarski) genera un'immagine quasi tridimensionale dove le cellule vitali sono in rilievo. 3.Microscopia in fluorescenza :ci permette di localizzare le cellule all’interno o sulla superficie della cellula possono essere marcate con sostanze fluorescenti che, mediante microscopi ottici opportuni, possono essere localizzate con precisione. Tutte queste sono tecniche che sono basate sulla microscopia ottica cioè vuol dire che l'immagine che osserviamo negli oculari è un’immagine generata dalla luce visibile. -Microscopia in fluorescenza, sostanze fluorescenti nelle cellule vengono eccitate con luci a lunghezza d’onda opportuna -Microscopia Confocale Laser è simile alla fluorescenza, ma usando un raggio laser permette piani di messa a fuoco diversi la sezione di tessuto della Amigdala, le cellule nel tessuto cerebrale sono marcate con diverse sostanze fluorescenti ed osservate con esso. Microscopia elettronica La luce non ci permette di ingrandire, ma dobbiamo avvalerci di fasci di elettroni. Dove il campione viene attraverso non da un fascio di luce visibile ma da un fascio di elettroni che permette di ottenere ingrandimenti molto più grandi e ci permette di osservare l'ultrastruttura della cellula cioè la struttura interna degli organuli. Diversi tipi: -trasmissione (TEM):cioè il campione viene attraversata dal fascio di elettroni -scansione (SEM):in questo caso i campioni vengono bombardati con un fascio di elettroni che però rimbalzano sulla superficie dell’oggetto tornano in dietro e un computer si occupa di integrare queste variazioni dell’angolo di fascio di elettroni di rimbalzo e ricoscrucono l'immagine in 3D. Esiste ancora un microscopio ancora più semplice che è chiamato= Stereomicroscopi (Binoculari) microscopio molto semplice che ha un sistema di obiettivi oculari e al di sotto c’è un piano in cui si posiziona un oggetto che si ingrandisce e si osserva e il vantaggio in questo caso è che si può operare sull’oggetto (piattaforma operativa per osservazione e manipolazione dei campioni). La visione binoculare permette una percezione visiva stereoscopica 3D, essenziale per manipolare i campioni. Esistono molte varianti più moderne degli stereomicroscopi, oltre a qualche modello sofisticato con visualizzazione su schermo LCD e acquisizione dell’immagine video. ACCORGIMENTI PER L’UTILIZZO CORRETTO DI UN MICROSCOPIO -Posizionarsi correttamente nella zona di lavoro -Mantenere una postura ergonomica -regolare la distanza inter-pupillare, è diversa nei diversi individui. I due oculari devono avere una posizione ben precisa che in qualche modo collima con le vostre pupille, se allarghiamo possiamo notare che l'immagine si sdoppia e se ci avviciniamo troppo l'immagine diventa convergente e poi si sdoppia. Quindi regolare la distanza inter-pupillare modificando la distanza tra i due oculari permette di avere l'oggetto e la visuale che è sferica. Ci sono due oculari perché noi abbiamo due occhi e la visione frontale permette di vedere in modo tridimensionale e si ottiene solo con la visione microscopica con due occhi. -regolare la correzione diottrica è importante regolare la distanza degli oculari in modo da avere una visione sferica. -regolare il fuoco in modo preciso. Gli occhi non vedono in modo uguale e questo comporta che quando io guardo negli oculari e metto a fuoco l’osservazione non è uguale. -cambiando ingrandimento, riaggiustare il fuoco Microscopio ottico=>in alto abbiamo gli oculari, poi sotto abbiamo gli obiettivi che si occupano di impostare l'ingrandimento e poi c’è il piano di appoggio e l'illuminazione arriva da sotto. Il flusso luminoso deve attraversare il campione, quindi l'immagine è costruita dalla luce, se la luce deve attraversare il campione e questo vuol dire che il campione deve essere sufficientemente trasparente per far passare la luce. 1.OCULARI: è un semplice sistema di lenti che permette di vedere, esso ingrandisce l’immagine del campione già ingrandita dall’obiettivo. L’oculare può essere unico oppure doppio, per una osservazione più comoda.Inoltre ci sono dei numeri segnati con una X che vuol dire i numeri di gradimento. Questo valore, moltiplicato per l’ingrandimento dell’ obiettivo, dà l’ingrandimento totale del Microscopio nell’osservazione visiva. 2.OBIETTIVI:sono complessi sistemi di lenti che forniscono il primario ingrandimento del campione da osservare; guardano al vetrino e sono attaccati a una torretta girevole (revolver) che ne porta fino a sei con diverso ingrandimento. Gli obiettivi come gli oculari hanno delle scritte, gli obiettivi visibili a destra hanno un potere di ingrandimento 20x, 40x, 60x (vuol dire il numero di ingrandimento). 3.CONDENSATORE e DIAFRAMMA: è un sistema di lenti che invia all’obiettivo la quantità di luce adatta alle sue caratteristiche ottiche. E’ regolabile in altezza e si deve poterlo centrare. Il condensatore è sempre provvisto di un diaframma ad iride (diaframma di apertura) atto a regolare l’ampiezza del cono di luce che entra nell’obiettivo. La perfetta regolazione del diaframma e del condensatore è fondamentale per una buona qualità dell’immagine. L’oculare ha un numero inciso sulla montatura che indica il suo potere di ingrandimento. Questo valore, moltiplicato per l’ingrandimento dell’obiettivo, dà l’ingrandimento totale del microscopio durante l’osservazione=> 10x x 40x = 400x. Il microscopio è uno strumento che permette di ingrandire ma come ogni strumento ottico (lente, cannocchiale) ha un potere risolutivo (PR): è la distanza minima a cui due punti sono distinguibili; se questi due puntini hanno una distanza di 0,1 mm noi non riusciamo più a distinguerli (non li vediamo come due puntini separati) perchè siamo sotto al potere risolutivo. Risoluzione del Micr. Ottico - 0.2 m e Microscopi elettronici (SEM e TEM) 10 nm - 0.2 nm. Se dovessi vedere la struttura della cellula il microscopio ottico non basterebbe e a quel punto l'unica soluzione dovremmo usare i microscopi elettronici. Microscopio ottico rovesciato: in questo tipo di microscopio ottico la fonte di luce è al di sopra del portacampione e gli obiettivi sono al di sotto del campione da osservare. In questo modo è possibile osservare campioni in contenitori diversi dai vetrini (come piastre di Petri per cellule in coltura) e, se richiesto, operare fisicamente sul campione. Le cellule degli insetti sono in grado di difendersi perché hanno questo sistema molto antico ma molto efficace e si riproducono molto velocemente, il colore del loro sangue è color giallo paglierino. Per coltivare la cellula utilizziamo=>colture cellulare cioè le cellule vengono messe in un brodino che si chiama media di cottura poi vengono messe in una stufa. Gli obiettivi sono rovesciati sotto così che se le cellule sono sul fondo della piastra gli obiettivi si possono avvicinare tranquillamente alle cellule e la luce deve attraversare dall’alto e l'immagine che i nostri obiettivi costruiscono deve essere deviata e quindi ci saranno degli specchi a 45 gradi che portano l'immagine dentro nell’oculare. RIEPILOGO USO MICROSCOPIO 1.Per iniziare, regola il microscopio sul minimo ingrandimento, sarà più facile mettere a fuoco i vetrini. 2.Regola gli oculari sia per la loro distanza reciproca, distanza interpupillare 1 che per la correzione diottrica 2. 3.Comincia sempre con l’obiettivo a minore ingrandimento. Dovresti avere 2 o 3 obiettivi su una torretta rotante che puoi selezionare, usa inizialmente quello minore per poi aumentare. Perchè più è alto l'ingrandimento dell’obiettivo più è difficile mettere a fuoco. 4.Esistono due viti per la regolazione del fuoco (macro e micrometrica). Regola inizialmente la messa a fuoco con la vite macrometrica. 5.Quando appoggerai il vetrino sul tavolino portaoggetti, prendilo per i bordi e eviterai impronte. 6. Regola il movimento del piano portaoggetti in modo da spostare il vetrino al centro della lente dell’obiettivo. Le cellule per le loro caratteristiche sono trasparenti, sono molto sottili, piccole e fanno passare la luce, quasi l’immagine è facile da osservare. Però non è sempre così perché se volessimo osservare una sezione istologica, lo spessore che noi osserviamo non può essere elevato per altrimenti la luce non può passare. Quando si usano campioni di uno spessore alto vanno sezionati e vanno create sezioni sottili. Quando un campione non è colorato e quindi ha poco contrasto si può usare il contrasto di fase: si basa sull’indice di rifrazione diverso che c’è tra il campione e il mezzo acquoso circostante. Si basa sul fatto che il campione ha un indice di rifrazione differente dal mezzo circostante e quando la luce lo attraversa viene deviata e ritardata. Ci sono delle specie di anellini condensatori (diaframmi) dentro nel microscopio che quando sono regolati in un certo modo regolano il contrasto aumentato il contrasto di fase. Si parte da osservazione in campo chiaro semplice senza colorazioni le cellule sono prive di contrasto e di dettaglio e regolando il diagramma si arriva a un contrasto di fase dove si vedono in maniera chiara le immagini. Contrasto interferenziale di Nomarski (DIC): si basa su dei filtri polarizzatori esso permette di aumentare il contrasto degli oggetti rendendoli visibili. In questo caso l’immagine che si ottiene sono le cellule come se fossero in 3D e dei bassorilievi. Avviene che una signora o signore non riescono ad avere una fecondazione naturale per diversi motivi, chimici, biologici o fisiologici, cellulari come il flagello che non funziona. Ci sono casi femminili dove non si ha una corretta discesa di un uovo nell’utero e quindi la fecondazione naturale non è possibile. In questo caso esiste IVF avviene prelevando le uova dalla signora e gli spermatozoi dal signore e viene effettuata mediante coincubazione spermatozoi-uovo. La tecnica è manipolativa degli spermatzoi e uova che vengono messe insieme, in questo viene utilizzato quando c’è un problema atomico, successivamente quando l'embrione nasce viene fatto sviluppare e di solito viene rimpiantato nell’utero femminile. Succede però a volte che lo spermatozoo non è in grado di entrare nell’uovo perché magari il flagello che non funziona e quindi lui muore. In questo caso gli spermatozoi si infilando in un capillare sottile di vetro. Dopo la fecodazione è quando lo spermatozo è penetrato l’uovo incomicia una serie di trasformazioni che portano alla prima divisione delle cellule (1 madre che si divide in 2 figlie) e si costruisce una palla di cellule=> Morula si forma gli organi e così si costruisce l’embrione. =>la microscopia in fluorescenza è un campo a se stante e quella che ci permette di localizzare delle componenti molecolari alinterno dei tessuti o delle cellule in modo preciso, infatti definiamo la microscopia cellulare=> Immunocitochimica: chimica perchè usiamo delle sostanze fluorescenti, cito= cellule immuno perchè ci sono gli anticorpi e questa ci permette di localizzare le macromolecole intra ed extra cellulare. Immunocitochimica si basa sulla combinazione immunocitochimica e queste tecniche in particolare sfruttano le capacità degli anticorpi che sono in grado di riconoscere in modo specifico i loro antigeni. Antigene: molecola (proteina tetramerica) ha 4 catene prodotta da cellule del nostro sistema immunitario. Gli anticorpi vengono prodotti dal sistema immunitario in risposta a un'infezione o qualche molecola, microrganismo che può entrare nel nostro organismo e per il nostro organismo è qualcosa di estraneo (self propri dell'organismo, no self che non è proprio dell’organismo). Quello che succede è che nel nostro organismo sono presenti cellule o molecole che fanno parte delle risposte immunitarie, queste molecole che ci sono sono capaci di riconoscere il self dal non self=> cioè è la discriminazione. La risposta immunitaria a sia tempi molto lunghi che tempi brevi, dopo il primo attacco che avviene localmente partono queste informazioni a tutto il sistema immunitario e tra le cellule del sistema immunitario c’è un popolazione che si chiama linfociti B sono le cellule deputate a costruire gli anticorpi specifici contro quelle molecole. Le sostanze fluorescenti negli anticorpi si chiamano sonde fluorescenti. Tutti gli vertebrati possiedono gli anticorpi. Tutti gli invertebrati non possiedono gli anticorpi ma hanno un sistema immunitario che si chiama immunità innata. IMMUNOCITOCHIMICA=>permette mediante l’ausilio di anticorpi, hanno la capacità di legare questa molecola, inoltre si basa sulla combinazione di tecniche immunologiche e citochimiche. Queste tecniche sfruttano principalmente l’interazione specifica tra anticorpi e antigeni (Antibody-Antigen: Ab-Ag). E consentono di identificare il complesso Ab-Ag grazie a molecole (sonde) legate all’anticorpo, che possono essere visualizzate mediante tecniche particolari di microscopia. L’immunocitochimica permette quindi di studiare localizzazione e distribuzione di molecole in cellule e tessuti animali e vegetali. Gli Anticorpi: è una molecola proteica formata da 4 catene di proteine circolanti nel corpo dei vertebrati in grado di riconoscere e legarsi ad agenti estranei (Antigeni), eventualmente penetrati nell’organismo. Gli antigeni (Ag) sono molecole o parti di esse appartenenti a corpi estranei (organismi o microrganismi) che, se penetrati in un organismo ospite, inducono una risposta da parte del sistema immunitario dell’ospite. Sono, in altri termini, molecole riconosciute come non self, cioè estranee, dall'organismo ospite. Quindi gli anticorpi che verranno prodotti dalla risposta immunitaria saranno in grado di riconoscere questi antigeni che ci sono sulla superficie. Molecole presenti sulla superficie del non-self, oppure secrete dal non-self, possono essere antigeniche, quindi scatenare la risposta immunitaria. La superficie del corpo del parassita, quindi le molecole presenti, entreranno in contatto con il sistema immunitario dell’ospite, che ne saggerà l’estraneità, cioè deciderà se è self o non self. Potremmo quindi definire antigeni, le molecole o porzioni di esse, presenti sul corpo del parassita Ma il parassita potrebbe rilasciare (secernere) anche altre sue molecole e anch’esse potrebbero essere antigeniche, quindi indurre una risposta immunitaria. Antigene presente sulla superficie del parassita. Porzione dell’antigene (determinante antigenico, interagisce con l’anticorpo) che può essere riconosciuta dagli anticorpi (cuticola è il nome dell'ematoma). La produzione di anticorpi non è qualcosa di istantaneo perchè quando noi ci infettiamo cioè quando qualcosa di estraneo penetra nel nostro corpo (no-self) la prima reazione immunitaria è molto semplice poi arrivano i macrogeni (mangaino i batteri) sono presenti nei tessuti e poi arrivano gli anticorpi specifici. Nel sistema immunitario degli invertebrati (pesci, uccelli, mammiferi) le cellule sono produttori di anticorpi si chiamano linfociti B , entrano in contatto con gli antigeni esposti o rilasciati dall’organismo (o microrganismo) invasore. Questi linfociti B normalmente non sono attivi, m se fosse attivo e incontra qualcosa di estraneo attiva un processo di attivazione e tutta una seria di modificazioni fino a diventare un linfocita prematuro che viene chiamato plasmacellula ha come unico scopo di creare gli anticorpi, quindi sintetizza un sacco di queste proteine e poi le secerne. Quando dei batteri penetrano nell'organismo arrivano queste cellule, macrofago, esso li ingerisce mediante il processo di fagocitosi e poi quando li importa all'interno del citoplasma entrano nei comportamenti degli enzimi. I macrofagi non sono sufficienti e quindi una volta che hanno degradato i batteri all'interno del citoplasma, espongono dei pezzi di batteri sulla loro superficie (APC) a questo punto queste cellule (APC) andranno in contatto con i linfociti B questa interazione scatenno all’attivazione della cellula B che diventa plasmacellula e quindi si metterà a produrre un sacco di anticorpi contro i batteri che lui ha percepito attraverso l'interazione; si ha così una risposta immunitaria. Noi abbiamo o possiamo potenzialmente produrre anticorpi contro qualsiasi antigene possa penetrare nel nostro corpo perché i linfociti B hanno la capacità di produrre ogni tipo di anticorpo e significa che i nostri macrofagi ha messo fuori dei pezzi del batterio quindi quello che succede è che noi nel nostro sistema immunitario abbiamo dei linfociti che hanno dei recettori con forme diverse e quindi se il linfocita B2 incontrasse la antigenico rotondo probabilmente si attiva e prolifera, il linfocita B2 e B3 hanno recettori di forme diverse e il linfocita non si attiverebbe e non potrebbe creare anticorpi in modo corretto. Quindi quello che succede è che noi abbiamo in circolo un sacco di linfociti e recettori di forme diverse e a seconda dell'antigene che hanno ed esso collima bene con una di queste cellule (B2) e iniziano a produrre anticorpi. Le cellule B inoltre proliferano e si divide tante volte e avviene una espansione clonale alcune di queste cellule che sono i ns circolo completeranno la loro attivazione altre resteranno in forma quiescente e queste che rimangono in circolo si chiamano cellule memorie e servono se dovessero rincontrare l’antigene, cioè infettarsi (questo è lo stesso principio del vaccino). =>In genere è possibile reperire anticorpi commerciali specifici per molte proteine, prendo un catalogo e vado sulla ditta produttrice di anticorpi e vado a vedere la percentuale di actina necessaria per produrre il pesticida; ma se avessimo bisogno di una proteina rara, prendo un coniglietto di solito si usano quelli bianchi con il nasino rosso e lo seziono, si preleva il sangue del coniglio devo dopo un po’ di tempo si tolgono i globuli rossi (si chiama siero, dove ci sono le proteine del sangue) e possiamo prepararci gli anticorpi specifici in laboratorio, immunizzando un vertebrato con la proteina (antigene) e purificando gli anticorpi specifici dal sangue del vertebrato. La risposta immunitaria viene subito mentre la risposta microfile viene dopo. Se iniettassi un antigene X in un animale (vertebrato):inietto il primo antigene x e faccio passare un mese in tanto gli do da mangiare lo curo e quì c’è stata l’attivazione di tutte le cellule che hanno l’antigene piccolino, successivamente dopo un mese inietto la stessa proteina quindi con questa seconda le cellule si attivano e ci sono un sacco di cellule memorie in giro e sono pronte a produrre anticorpi quindi aspetto ancora un po’ e dopo circa 50-60 gg si vede il picco dell’IGM (stesso principio delle vaccinazioni). Il vaccino non è altro che prendere la proteina e iniettarla nel mammifero. I linfociti B memoria, quelli già attivi e pronti, fanno parte del processo della memoria immunologica, perché il fatto che un organismo vertebrato è infettato da qualcosa se dovesse rincontrare lo stesso agente reagirebbe in maniera più pronta. La cellula immatura non secerne anticorpi, ma le molecole anticorpali sono esposte sulla membrana plasmatica (linfociti B) mentre quando si attiva è presente più citoplasma e quelle rigine si chiamano reticolo e quando una cellula ha tanto reticolo vuol dire che la cellula produce anticorpi e li secerne (esocitosi) nell’ambiente extracellulare. Attivazione ed espansione clonale dei Linfociti B: il linfocita si attiva e la prima cosa che fa è che si moltiplica per espansione clonale dopo di che alcune cellule vanno verso la via della costruzione degli anticorpi e diventano delle vere e proprie cellule mentre l'altra parte rimane apparentemente crescente anche se è già stata attivata. STRUTTURA ANTICORPO=>sono glicoproteine cioè hanno legato dei rametti di zucchero, la loro conformazione spaziale risulta dal folding (conformazione secondaria, terziaria e quaternaria) della molecola e nel caso di una immunoglobulina di tipo G (IgG) ricorda una ipsilon (Y). La capacità di riconoscere e legare un antigene risiede nella conformazione della zona terminale delle braccia. Una IgG è un tetramero formato da quattro catene proteiche: 2 catene centrali che sono più lunghe e pesanti (50 kDa, 440 aa) mentre 2 catene più esterne, corte e leggere (25 kDa, 220 aa). Le 4 catene proteiche sono legate da ponti disolfuro:sono legami forti che si formano con lo zolfo degli aminoacidi cistina. Le regioni terminali delle catene (leggere e pesanti) formano il sito di legame per l’antigene (Paratopo). Un molecola di IgG può legare due antigeni (uguali) nelle zone delle regioni terminali delle catene e (leggere + pesanti). Epitopo (o determinante antigenico) è la regione dell’antigene che effettivamente interagisce con il Paratopo dell’anticorpo. Gli anticorpi (Ab) sono capaci di riconoscere, in modo specifico, quindi localizzare macromolecole, intracellulari ed extracellulari, ma gli Ab sono comunque glicoproteine come altre migliaia nella cellula, quindi come possiamo vedere dove si sono legati, perchè io vedo la sonda fluorescente e gli anticorpi. Localizzazione di antigeni cellulari-Immunofluorescenza=> Permette, mediante l’uso di un microscopio e di sostanze fluorescenti accoppiate ad anticorpi specifici per un certo antigene, di individuare e localizzare con precisione molecole esposte alla superficie della cellula o intracellulari. Dopo il legame la presenza dell’Immunocomplesso è rilevabile grazie alla presenza della sonda coniugata all’anticorpo. L’anticorpo coniugato con una sonda fluorescente lega un antigene di superficie del batterio e si va a formare Immunocomplessi Antigene-Anticorpo. I problemi più comuni nell’uso di anticorpi: Cross reattività:un anticorpo si suppone riconosca Solo la sua proteina target, talvolta esso lega altre proteine presenti nel campione Variabilità:diversi lotti di anticorpo possono agire differentemente. Questo accade spesso quando viene prodotto in nuovi gruppi di animali Errori sperimentali:esperimenti condotti in condizioni di laboratorio diverse possono cambiare il folding della proteina target, quindi può variare la sua affinità per l’anticorpo. Quindi se l’anticorpo è coniugato con una sonda fluorescente, sarà possibile individuarlo, quindi capire, in modo indiretto, dove è localizzata la proteina (antigene) che stiamo cercando. Nell’immagine sono visibili dei Fibroblasti marcati con diverse sonde, in verde i microtubuli; in rosso i mitocondri e in blu i nuclei si possono vedere 3 localizzazioni temporanee all'interno della cellula. La microscopia in fluorescenza permette di localizzare molecole presenti in cellule o tessuti, utilizzando particolari sostanze dette fluorocromi. I fluorocromi sono sostanze (molecole) che, colpite da una radiazione, in parte lo assorbono, in parte la restituiscono a lunghezza d’onda diversa: la radiazione emessa ha energia minore e lunghezza d’onda (λ) maggiore di quella incidente. Se la radiazione incidente è UV (invisibile) oppure blu, la radiazione emessa è in genere visibile. Tale radiazione, che dura di solito finchè dura l’eccitazione del fluorocromo, è detta Fluorescenza. La porzione di spettro percepibile dagli umani varia da 380 a 710 (nm). Lo spettro visibile può essere suddiviso in intervalli di lunghezza d'onda, ciascuno dei quali corrisponde a ciò che chiamiamo colori. Viola/Indaco 380 - 450 nm Blu/Azzurro 450 - 500 nm Verde 500 - 570 nm Giallo/Arancione 570 - 610 nm Rosso 610 - 710 nm Spettro di eccitazione-emissione della Fluoresceina isotiocianato (FITC) => ha una eccitazione 494 nm emissione 518 nm Esistono in natura altre sonde fluorescenti come pesci che si dividono tra quelli che hanno lo scheletro osseo che vengono chiamati osteiti e quelli che senza scheletro quindi cartaginesi. La Bioluminescenza è comune in una varietà di invertebrati marini. Molti Cnidari emettono luce quando vengono disturbati meccanicamente. La luminescenza emessa dagli cnidari è principalmente verde e l’emissione è dovuta dalla presenza di una classe di proteine chiamate Green Fluorescent Proteins (GFP). La GFP, se colpita ed eccitata da una radiazione ad una specifica lunghezza d'onda, è in grado di riemettere luce di colore verde acceso. Ma, essendo la GFP una proteina, esiste un gene che la codifica. ES. Supponiamo di voler monitorare quando e dove una proteina viene sintetizzata in una cellula; Gene della GFP viene inserito nel genoma. Le cellule sintetizzano la proteina X e contemporaneamente la GFP Quindi, quando rileviamo la fluorescenza verde, sappiamo che la cellula sta attivando il gene X. MICROSCOPIA A FLUORESCENZA=>avendo gli anticorpi fluorescenti come possiamo osservare in cellule e tessuti li possiamo studiare con questo microscopio. È un microscopio ottico sofisticato con sistema di emissione della luce che può emettere anche negli UV. Nel microscopio a fluorescenza sono presenti due sistemi di filtri. -Il filtro di eccitazione lascia passare solo lunghezze d’onda utili per eccitare il fluorescente -il filtro di sbarramento trattiene la radiazione non assorbita e lascia passare solo la luce dovuta alla fluorescenza. Immagini fluorescenti di cellule HeLa colorate per mitocondri, actina e nucleo. Le cellule vive sono state macchiate di rosso. Per F-actina con Phalloidin (verde) e nuclei con colorate nucleare (blu). Esistono altri tipi di sonde usate in Immunocitochimica =>le marcature di macromolecole possono essere effettuate con tipologie di sonde diverse dai fluorocromi: enzimi:sono le proteine che hanno la capacità di catalizzare una reazione. Dati certi enzimi e certi substrati noi usiamo un colorante che fa cambiare il substrato, lo converte e lo fa diventare prodotto di reazioni e diventa cromogeno. I vantaggi degli enzimi è il fatto che sono stabili al microscopio ottico e vanno usati con cautela in presenza di attività endogena. Mentre i fluorocromi non sono stabili ma tendono a decadere ma hanno un'elevata risoluzione. La marcatura è rilevabile in microscopia ottica convenzionale in quanto l’enzima coniugato all’Ab catalizza la conversione di un substrato incolore in un cromogeno visibile (marrone o blu nelle immagini sopra). L’anticorpo convertito con la Fosfatasi alcalina se volessimo usarlo sull’intestino non è possibile usarlo. Ma se il prodotto di reazione è colorato, possiamo usare l’enzima come sonda e il suo prodotto sarà facilmente visualizzabile. Ad esempio usando come sonda l’enzima Perossidasi + substrato 3,3- Diaminobenzidina (DAB) il prodotto finale sarà un precipitato insolubile scuro (cromogeno) Enzima-Perossidasi (HRP) + Substrato-Di-amino-benzidina (DAB) + Ossidante- Perossido di Idrogeno (H2O2 ) = precipitato colorato. =>Marcatura con anticorpi legati a Isotopi radioattivi:l’isotopo (125I, 3H) legato all’anticorpo, è una sonda che emette radiazioni che possono impressionare un supporto fotografico. La marcatura viene rilevata mediante l’applicazione di emulsioni fotosensibili sul campione in esame, esse vengono impressionate dalle emissioni del radioattivo. Il risultato sono immagini in cui le piccole macchie (spot) nere indicano la presenza dell’anticorpo e quindi dell’antigene cercato. Marcatura con anticorpi legati a particelle di Oro colloidale: utilizzata prevalentemente in microscopia elettronica a trasmissione (TEM)  Le particelle d’oro colloidale vengono prodotte con diametri che possono variare da 2 a centinaia di nanometri (nm). MICROSCOPIA ELETTRONICA a trasmissione=>la sorgente nel TEM è un filamento che, ad alto voltaggio, emette un fascio di elettroni, il fascio attraversando il campione, costruisce l’immagine su di uno schermo in base alla elettrondensità delle zone del campione in osservazione. MICROSCOPIA elettronica a Scansione - SEM=>qui il fascio di elettroni non attraversa il campione da osservare, ma viene deflesso dalla sua superficie ricoperta da metalli (metallizzazione con particelle d’oro). =>i Naturalisti prelevano dei campioni in campo e li portano in laboratorio ad analizzarli e questo prevede delle procedure ben precise. Qualunque campione biologico per poterlo separare correttamente dovrebbe stare intatto ma è chiaro che tutti i campioni di tipo biologico rimangono a marcire. Quando i tessuti biologici quando tendono ad andare in necrosi e a putrefarsi perdendo la loro integrità strutturale e le cellule si spaccano e la prima cosa è quella di preservare lo stato del campione che dobbiamo osservare. Quello che bisogna fare è: -preparazione del campione: cioè bisogna stabilizzare la sua morfologia cioè renderla stabile e questo processo si chiama fissazione del campione cioè che si conservare quel campione in uno stato comparabile a quello vitale. Se lo devo osservare al microscopio ogni microscopio ha bisogno di utilizzare delle fettine del campione molto sottili perché il campione deve essere sottile sia alla luce che agli elettroni. Queste sezioni si usano delle affettatrici che permettono di ottenere sezioni molto piccole=> microtoni inoltre devi cercare di ottenere delle sezioni planari cioè se io cerco di mettere a fuoco su un campione questa messa a fuoco dipende dalla distanza del campione dall’obiettivo; quando è planare riesco a mettere a fuoco anche dove non ho decido di mettere a fuoco perchè sono sullo stesso piano ciò non avviene se sono su diversi piani di fuoco. In certi casi possiamo aver bisogno di colorare il campione (non su campione vivo). I processi sono 3 e avvengo su diversi campioni di tessuti, cellule, invertebrato e sono sottoposti a una serie di trattamenti: 1.fissazione: per fissarlo prenderò il mio campione e lo metterò sul liquido in cui ci sono delle sostanze particolari che sono dei derivati degli aldeidi (formalina). Questi aldeidi vanno a limitare tutte le proteine del campione e le legano come se facessero un reticolato e lo bloccano in quella forma. 2.disidratazione: devo togliere l'acqua e quindi prendo il mio campione che contiene acqua e lo metto in delle concentrazioni maggiori di alcol fino ad arrivare al 90% e in questo modo l'alcol penetra nel campione e si sostituisce all’acqua. Devo poi fare una sezione sottile e il campione deve essere sufficientemente duro (altrimenti non è possibile). Si fà perchè altrimenti le resine non penetrano nel campione perché la resina è idrofila. 3.inclusione:gli insetti o comunque alcuni campioni sono morbidi e quindi prendiamo questi campioni biologici e li includono nella resina quella più semplice è la paraffina (cera liquida) essa penetra nel campione e poi lo avvolte e si ottiene un quadratino di paraffina che contiene il campione quando si sarà raffreddata la paraffina è talmente dura da fare delle sezioni. Se andiamo sulla microscopia elettronica abbiamo bisogno di sezioni sottili che la parafifannon va bene perchè è ancora troppo molle e quindi si usano altri tipi di resine che si chiamano epossidiche (colle a doppi componenti con i catalizzatori) dopo un po’ si forma questa colla che si indurisce diventa vetrosa. Dopo possiamo sottoporre ai tagli con microtoni=> le sezioni vengono chiamate fini, semifini (10-30 micron) e ultrafini (50-80 ordine dei micron). quando si va sulla microscopia elettronica le sezioni devono essere ancor più sottili se no il fascio di elettroni non riesce a sorpassarli. Se voglio vedere cosa c’è (mettere a fuoco) in una di queste cavità devo modificare il fuoco ed il campione deve essere planare in modo che il taglio sia fatto bene. Lo spessore deve essere sottile perchè se un campione è spesso la luce non riesce ad attraversarlo e quindi la formazione dell'immagine non avverrà e si vedrà una macchia scura e non il campione. Un altro problema che incontra in microspia è come io taglio il campione, il taglio è diverso e posso fare una sezione longitudinale, trasversale o obliquo o tangenziale e in base al taglio che faccio vedrò cose diverse (orientamento è importante). Microtomo=sono strumenti strani che hanno una zona dell’operatore deve c’è il taglio poi c’è un braccio metallico e la parte giallo è il campione incluso nella paraffina, il braccio metallo sale e scende strisciando su una lama e quindi il braccio che ha attacco il campione salendo e scendendo crea delle fettine, questo vengono usate per la microscopia ottica; mentre per tagliare una sezione sottile con la microscopia ottica (ordine nanometri) non è possibile tagliere su una lama metallica perchè non creerebbe una sezione sottile si danneggerebbe; quindi i microtomi della microscopia elettronica che si chiamano Ultramicrotomi hanno un principio di funzionamento molto simile e in questo caso il braccio sale e scende e produce sezione ma la prima differenza è che la lama, che c’è sotto il braccio metallico, è in vetro che viene ottenuta da stecche di vetro e dove si spezzano si crea una lama sottile che taglia le sezioni. Un altro piccolo dettaglio è che con qualsiasi microtomo io ho il campione, ho la lama una volta che ha fatto la fetta però non taglierebbe pi se torna su quidni il braccio deve avanzare e questo avanzamento nel microtomo è meccanico (lo spessore dipende dall'avanzamento). Quando dobbiamo tagliare una fetta di 10 nanometri non esistono gli ingranaggi meccanici che ci permettono di avanzare il braccio di 10 nanometri, sarebbero imprecisi; quindi hanno messo un sistema di resistenze all'interno del braccio e per fare alzare il braccio viene applicata una corrente che fa scaldare il braccio in modo che si dilati. Il sistema migliore per raccogliere le fettine è usare delle bacchette di vetro in cui viene innestato un pelo, di solito un sopracciglio perché è spesso. I nostri campioni li possiamo colorare con dei coloranti molti sono elettivi quindi ci sono coloranti che colorano i carboidrati e ce n’è una moltitudine. Queste colorazioni sono istologiche e permettono osservazioni vitali, una colazione molto utilizzata è ematossilina eosina sono due coloranti in cui si evidenzia il nucleo (che è viola) e il citoplasma (che è rosa). COLTURE CELLULARI=>spesso capita che in laboratorio dobbiamo tenere le cellule vive e dobbiamo mantenerle in cottura cioè vuol dire le cellule vive in un ambiente che io posso studiare e quello che succede è che se io tolgo le cellule dal loro ambiente naturale immediatamente provano uno shock, perché le cellule sono abituate a vivere in quell'ambiente con un tot di pH, sali sciolti e un sacco fattori proteici e non proteica che le aiutano a vivere io le prendo e le lavo e le metto in una soluzione normale queste cellule muoiono istataneamnte. Il primo problema è che io devo cercare di creare artificialmente un ambiente che sia simile a quello in cui le cellule vivevano e è fondamentale mantenere anche la stessa temperatura (cellule organismo circa 37 gradi) e soprattutto avere una grande stabilità. Quando le cellule sono in cottura sono estremamente sensibili alle infezioni cioè se dei batteri entrano nei nostri capsule dove ci sono le cellule esse muoiono perchè i batteri assorbono tutti i nutrienti.le cellule del mammifero che abbiamo in coltura potrebbe replicarsi con un tempo di circa 24 ore mentre i batteri in 30 minuti si duplicano. Si lavora sulle cellule vive che si trovano sui tessuti del corpo di un animale magari ci serve vedere se i pesticidi fanno danni epatici (al fegato) quindi dobbiamo vedere se le cellule del fegato messe in coltura hanno delle alterazioni e quello che bisogna fare è scegliere ed estrarre dalla fonte da cui estraiamo le cellule. Una cellula quando sta in un contesto di un tessuto anche il sangue viene considerato un tessuto in fase liquida perché le cellule sono dentro al sangue ma tutta la matrice in cui sono immerse le cellule è liquida. Successivamente le cellule le dovremo trasportare e mantenere in un ambiente simulato, sintetico che sia il più possibile simile a quell'ambiente da cui l’abbiamo estratto. Colture cellulari (la sterilità) sono particolarmente sensibili e una cosa fondamentale è che non si devono contaminare perché mentre nell’organismo entrano dei batteri c’è il sistema immunitario che controlla i batteri. Se prendo delle cellule e le metto in coltura e arrivano dei batteri contaminando la coltura le cellule muoiono. In vivo (lavorare sull’organismo)abbiamo il sistema immunitario e mille altri sistemi dell’organismo che potrebbero cambiare i risultati che vediamo quindi sono tipi di sperimentazioni che vanno poi integrati con gli studi in vitro. Vitro: lavorare con le colture cellulari Sono delle tecniche molto utili perché nel momento in cui una casa farmaceutica sviluppa un farmaco nuovo di solito loro partano da una molecola che ha delle proprietà e questo va provato e poi successivamente approvato dal ministero, quindi questo farmaco delle contenere delle indicazioni precise da seguire è una volta rispettate si può vedere il prodotto e dopo una serie di test può essere provvisto sull’uomo. La regolamentazione in Italia come nel resto del mondo prevede che a un certo punto tu faccia dei test sugli animali e li postate è utilizzare meno animali possibili. Prima di fare questo lavoro di andare a provare il prodotto sull’animale si fanno dei test preliminari sulle cellule in vitro. Oltre alla sterilizzazione è molto importante ripetere le condizione fisiologiche in cui la cellula viveva, se una cellula carsica umana la dobbiamo mantenere a 37 gradi. Si possono vedere con il contrasto di fase cioè con la solita microscopia ottica e vederle bene. Ci sono i micro pozzetti in cui si mette un liquido che contiene nutrienti e dentro si mettono le cellule. Condizioni=>sterilità assoluta, pH del terreno di coltura deve rimanere stabile, la temperatura deve essere adeguata e dentro i media di cultura ci devono essere tutti i nutrienti e i metaboliti molto simili a quelli che la cellula aveva nel suo tessuto. Ci sono cellule che fluttuano nel flusso sanguigno cioè non si attaccano alle pareti mentre ci sono altre cellule che per vivere hanno bisogno di attaccarsi al terreno tipo i macrofagi sono cellule che si trovano nei tessuti e si muovono camminando stando attaccati al tessuto; se vengono messe in un contenitore che gli impedisce di attuarsi alle pareti queste cellule muoiono. Esistono tanti metodi a caldo e a freddo e in base al materiale che dobbiamo sterilizzare=>si può utilizzare un'autoclave e la sua prerogativa è che potendo innalzare la temperatura dentro fa aumentare la temperatura dell’acqua fino a 120 gradi e uccide batteri che resistono fino a 120 gradi che se facessimo solo bollire non li debelleremo. Poi se ho delle cose in vetro quello le posso utilizzare in una stufa normale e raggiunge anche i 180 gradi. Però io posso in certi casi quando devo sterilizzare un liquido si utilizzano delle provette (eppendorf) di plastica ha due camerette una sotto e una sopra e quello in esso è un filtro di cellulosa che ha una porosità di 0,22 um e i batteri che sono nell’ordine dei circa 7 um non possono passare sul quel filtro e quindi se prendo questa provetta metto il liquidò con dentro il pesticida all’estremità della provetta e lo metto in una centrifuga, applico una forza centrifuga e il liquidò scende e passa verso il fondo della provetta e i batteri si bloccano sulla membrana e quindi sotto ho un qualcosa di sterile. Dopo aver preparato tutto successivamente si devono manipolare le cellule non è però possibile farlo sul banco di laboratorio ma hanno inventato le cappe sterili: che sono degli strumenti in cui si lavora mantengono tutti i materiali all’interno della cappa, che hanno un vetro scorrevole anteriore. Non è un solo ambiente chiuso da un vetro ma le cappe serie hanno delle pompe che fanno defluire l’aria (flusso d’aria verso l’operatore invece poi ci sono delle cappelle con flussi più complicati uno verso l’operatore, flusso barriera altre ancora sono fatte per non far uscire le cose comunque questo strumento è fondamentale perché altrimenti si contaminerebbero le cellule. Ogni tipo di tessuto/cellula a un tipo di terreno specifico mentre mogli hanno fa i terreni i primi i ricercatori se li creavano loro e devono avere dei fattori di crescita perché le cellule quando sono nel loro ambiente naturale ci sono molti fattori di crescita come organi, molecole che dicono alle cellule replicatevi/dividiti/vivi/muori e tutte queste molecole segnali sono presenti nel tessuto. Fattori di adesione: adsorbiti al fondo della palestra di coltura (fibronectina, vitronectina, collagene). Un esempio di medium di coltura reperibile commercialmente. I media di coltura contengono componenti essenziali per la vita delle cellule: Sali inorganici Amminoacidi Vitamine + Carboidrati Tamponi Indicatori di pH A questi vengono aggiunti Sieri Fetali Animale come fonte di Fattori di crescita. Principali tipologie di colture cellulari: -Colture Cellulari aderenti: cellule che in vivo fanno parte di tessuti solidi crescono, in vitro, aderendo a superfici. L’adesione al substrato (in piastre di crescita) è una condizione essenziale per la coltura -Colture Cellulari in sospensione:un esempio sono alcune cellule del sangue, o presenti in fluidi corporei crescono in vitro senza aderire, fluttuando nel medium di coltura => per cellule in sospensione possono essere utilizzati contenitori tipo fiasche (flask) =>per crescite di notevoli volumi di cellule, bottiglie utilizzate con sistemi di agitazione motorizzati Capsule di Petri:si mettono le colture e si seminano cellule. Le cellule coltivate aderiscono al fondo della piastra immerse nel medium di coltura. Dopo il prelievo/espianto le cellule, messe in coltura nei contenitori e immerse nel corretto medium di coltura, vengono mantenute in condizioni vitali in Incubatori in grado di controllare i parametri ambientali ottimali per la crescita e mantenimento delle cellule. Incubatori per cellule: che sono come delle stufette e all'interno di questi incubatori viene mantenuta la temperatura ottimale e ricreano i parametri fisici ideali per la crescita delle cellule. Sono incubatori molto speciali che ci permettono di controllare molti parametri come la quantità di ossigeno e Co2 ottimali ed un’alta percentuale di umidità relativa. Dopo ogni operazione effettuata sulle cellule i contenitori vengono riposti negli incubatori. Il display digitale permette di impostare i parametri di funzionamento e monitorare le corrette condizioni interne. Spesso capita che dobbiamo capire quante cellule ci sono all'interno della coltura e il calcolo viene effettuato in un dispositivo chiamato camera di Bürker. Posizionando un aliquote di 20 ml della coltura in una zona si questo speciale vetrino è possibile contare le cellule presenti in un reticolo calibrato visibile al microscopio. Il vetrino è incluso in un reticolato dove vengono scelti alcuni quadranti e se ne contano una decina, si ricava il numero medio di cellule per quadrante e si applica una formula il valore ottenuto rappresenta il numero di cells/ mL di coltura. La crescita delle cellule in vitro=>nel mettiamo nel vitro solo se sono quelle che sono capaci di dividersi. Cellule aderenti proliferano fino ad occupare l'intera superficie della piastra di coltura (confluenza). Quindi, in opportune condizioni (medium, bassa densità cellulare) le cellule crescono in modo esponenziale mediante divisioni mitotiche. Il tempo di duplicazione è tipico di ogni linea cellulare (es.20-24 ore per cellule animali; 24-30 ore per cellule umane). Nel grafico sono schematizzate tre cicli di duplicazione, con tempo di duplicazione di 24 ore, in 72 ore si arriva ad una densità di quasi 105 cells/cm2; da 96 a 120 ore le cellule vanno in arresto in confluenza quindi smettono di crescere e questo succede perché le cellule hanno delle capacità e una di queste si chiama inibizione da contatto cioè quando le cellule sentono di essere attaccate alle altre ricevono dei segnali inibitori per cui smettono di fare mitosi. Questa proprietà che hanno le cellule in alcune alcune patologie viene persa cioè le cellule trasformate (tumorali) non solo nascono e crescono in modo indefinito quindi arrivano a un certo numero vanno avanti a crescere e questo provoca la patologia associata ai tumori. Alcune di queste cellule si staccano dal tumore primario e vanno in giro con il circolo linfatico finché arrivano in un altro organo e cominciano a proliferare lì (metastasi tumorali). Nell’organismo umano c’è continua insorgenza di cellule tumorali, però in molti casi vengono riconosciute dal sistema immunitario, le cellule non sono tutte uguali perché cambiano faccia in continuazione e producono cose che ingannano il sistema immunitario. Quando osserviamo le cellule in coltura usiamo il microscopio ottico in contrasto di fase me se io volessi vedere se queste cellule stanno bene non si possono usare i coloranti perchè altrimenti muoiono, ma esiste un colorante Trypan Blue è un colorante anionico idrofilo di grandi dimensioni. È noto come blu diammina 3B. Il blu di Trypan è utilizzato come colorante nel test di esclusione di vitalità cellulare per rilevare cellule morte. Quando una cellula sta male una delle prime cose che succede è che si danneggia la membrana cioè perde le sue capacità di discriminare (far entrare e uscire le cose). Nell’ uso comune viene impiegato il termine colorazione vitale quando il colorante è somministrato ad un campione di cellule o tessuto che deve essere mantenuto in vita. Queste colorazioni si basano su alterazioni della membrana delle cellule morte, che permettono l’assunzione del colorante all’interno di cellule. Un esempio e’ il Trypan Blue, molto usato nei saggi di vitalità cellulare (test di esclusione).  In blu le cellule non vitali Se la cellula è vitale la sua membrana Se la cellula non è vitale è intatta ed impedisce l’accesso (esclude) la sua membrana si deteriora il Trypan blue. e il Trypan blue penetra nel citoplasma cellulare. Microscopi rovesciati per colture=>i rovesciati hanno l’illuminazione dall’alto e gli obiettivi posizionati al di sotto del campione. Questo permette di mettere a fuoco correttamente il fondo della piastra (dove sono localizzate le cellule). Sulla slitta del microscopio possono essere posizionate: capsule Petri singole, flasks e capsule multi-pozzetto.Per osservare le cellule, in teoria, potremmo usare anche un microscopio convenzionale (dritto), ma in tal caso l’immagine formata dalla luce dovrebbe attraversare il volume del Medium di coltura, quindi perderebbe di nitidezza. Microscopia accoppiata a sistemi digitali per acquisizione ed elaborazione delle immagini Un sistema di acquisizione di immagini digitale Microscopio Videocamera Computer Software dedicato Analisi morfometriche computerizzate: permettono di calcolare dimensioni lineari e aree in campioni di tessuti e cellule. Sistemi computerizzati sofisticati che sfruttano la ricostruzione olografica delle immagini per osservare fenomeni biologici in vivo in modo dinamico. Cellule in divisione sono osservate e analizzate con ricostruzione di immagini olografiche dinamica. ORIGINE DELLA VITA​ Quello che gli scienziati dicono è che 13,7 miliardi di anni fa non c'era l'universo, c'era una massa di energia che successivamente ha iniziato un'espansione e questa espansione dell’universo ha creato la materia come la conosciamo oggi. L’universo era ed è in espansione continua e sono nati tutti questi pianeti, galassie e tutto si è formato. Le prime forme di vita primordiali (lorigne di quello che sarebbe potuto essere il seme che ha creato tutti i viventi) per questo sono passati altri 10 miliardi di anni quindi dal Big Ben 14 miliardi di anni e prima di vedere qualcosa sulla terra che assomigliasse alla vita ne sono passati altri 10 e quindi l'origine della vita sulla terra è avvenuta circa 4 miliardi di anni fa quando qualcosa assomigliava a qualcosa di vivo è comparso sulla Terra. Ci sono due tipi di cellule: -eucarioti: cioè le cellule dotate di nucleo in cui c’è il DNA -procarioti: che sono sostanzialmente i batteri e sono più semplici; questi sono due tipi di vita che si sono affermate e che sono rimaste. L'evoluzione non ha premiato. Nel grafico in basso c’è scritto miliardi di anni che ci separano dal nostro passato fino ad arrivare in basso a destra ai primati che sono l'uomo, le scimmie e siamo comparsi sulla terra 60 milioni di anni fa. Sull'ordinata viene indicato il livello di ossigeno perché la comparsa dell'ossigeno nell'atmosfera è stata importante per l’evoluzione della vita perché gli organismi che utilizzano l'ossigeno li chiamiamo aerobi è un organismo che è capace ad utilizzare l'ossigeno nel suo metabolismo mentre un organismo anaerobico è un organismo che è capace di non utilizzare ossigeno. All’inizio la vita sulla Terra l'ossigeno era zero nell'atmosfera, infatti le prime forme di vita non utilizzano l'ossigeno; poi comparvero i primi batteri fotosintetici (circa 2 miliardi mezzo di anni fa) che non utilizzavano l'ossigeno ma anzi riuscivano a produrre ossigeno così aumentato il livello di ossigeno nell’atmosfera. E con l'aumento dell'ossigeno comparvero i primi batteri aerobi; per avere i primi eucarioti bisogna aspettare ancora 500 milioni di anni e questo ci fa capire che le prime cellule eucariote derivarono da dei batteri e inoltre ci fa capire che i batteri sono comparsi molto prima. Come primi eucarioti si intendono cellule dotate di nucleo che vivono come singole cellule (protozoi), poi ci fu un lungo periodo (6-700 milioni di anni) per arrivare agli organismi pluricellulari. Nell'evoluzione ci sono state una serie di conquiste come l'aumento dell'ossigeno, un altro dei punti di transizione importanti fu quello in cui cellule singole decisero di associarsi e formare gli organismi pluricellulari e da questi rogasmi ci fu un problema perchè se prendo delle cellule singole e queste si organismo in un organismo fatto da tante cellule per evolversi in modo positivo e avere una struttura che funzioni bene a un certo punto dobbiamo immaginare che compaia uno scheletro; però i primi scheletri non erano interni (endoscheletro) ma quello che compare per primo fu esoscheletro cioè uno scheletro esterno agli organi del corpo come quello degli invertebrati come gli artropodi che sono invertebrati dotati di esoscheletro struttura nuova che permise un accrescimento della struttura del corpo e locomozione. La prima forma di endoscheletro sono i pr