Chapitre 5 : La réparation de l’ADN - Document PDF

Chapitre 5 La réparation de l’ADN BIOL-G2203 Prof. Xavier Bisteau 1 5. La réparation de l’ADN 1. Généralités 2. Types de mutations 3. Origine des mutations 3.1 Spontanées 3.2 Induites 4. Mécanismes de réparation 5. Systèmes de détection...

Chapitre 5 La réparation de l’ADN BIOL-G2203 Prof. Xavier Bisteau 1 5. La réparation de l’ADN 1. Généralités 2. Types de mutations 3. Origine des mutations 3.1 Spontanées 3.2 Induites 4. Mécanismes de réparation 5. Systèmes de détection 6. Anomalies de réparation: Pathologies 7. Cibles thérapeutiques 2 5.1 Généralités 1 seule mutation dans un génome peut avoir des effets dévastateurs, pas d’effets, voire un effet bénéfique Exemple: anémie falciforme : cause d’une mutation ponctuelle unique mutation dans le gène de la β-globine provoquant un seul changement d’acide aminé Thérapie génique Prélèvement des cellules souches hématopoïétiques Transfert d’un vecteur viral codant pour la β-globine normal Greffe des cellules souches modifiées 3 5.1 Généralités Altération de l’ADN = modification de structure (cassure, conformation) ou de séquence Provoquées par des processus endogènes ou exogènes Mutation de l’ADN = altération de l’ADN qui, en l’absence de réparation, sera transmise au cours des réplications modifiant ainsi l'information génétique de façon permanente Les altérations sont accidentelles et aléatoires et se produisent continuellement dans l’ADN ❖ Fréquence très élevée : 103 à 106 altérations / cellule / jour Il y a donc des mécanismes de surveillance continus de l’ADN assurant la stabilité et l’intégrité du matériel génétique ❖ Certaines lésions sont rapidement réparées et donc temporaires ❖ G) Remplacement d’une pyrimidine par une pyrimidine (C > T) 2. Transversion Remplacement d’une purine par une pyrimidine (A/G > C/T) Remplacement d’une pyrimidine par une purine (C/T > A/G) 10 5.2 Types d’altérations / mutations Mutations géniques : Conséquences des mutations ponctuelles de substitution sur la protéine 1. Silencieuse (= synonyme) 2. Non-sens 3. Faux-sens (= non-synonyme) 4. Conservatrice 11 5.2 Types d’altérations / mutations Mutations géniques : Insertion Mutation par ajout d’au moins un nucléotide Petite insertion ou large insertion Décalage potentiel du cadre de lecture DECALAGE DU CADRE DE LECTURE 12 5.2 Types d’altérations / mutations Mutations géniques : Insertion Mutation par suppression d’au moins un nucléotide Petite insertion ou large délétion Décalage potentiel du cadre de lecture DECALAGE DU CADRE DE LECTURE 13 5.2 Types d’altérations / mutations Mutations chromosomiques Anomalies de la structure du chromosome suite à un remaniement d’un grand fragment d’ADN Visible en microscopie optique 4 types: insertion/délétion, inversion, duplication et translocation 14 5.2 Types d’altérations / mutations Mutations génomiques Anomalies du nombre de chromosomes (variation quantitative) Conséquence d’une mauvaise répartition des chromosomes Caryotype normal (euploïdie) >< caryotype anormal (aneuploïdie) Anomalies constitutionnelles: avant la fécondation ou au cours des 1ères divisions du zygote (ex: Trisomie 21) Anomalies acquises: apparition au cours de la vie, ne touche qu’une partie des cellules (ex: cellules cancéreuses) Anomalies en mosaïque: présence de lignées cellulaires avec un nombre variables de chromosomes au sein d’un même individu 15 5.2 Types d’altérations / mutations Mutations génomiques Trisomie 21 16 5.2 Types d’altérations / mutations Mutations et populations cellulaires Mutation germinale Présente dans les cellules à l’origine des gamètes (cellules germinales) Présente dans toutes les cellules Transmissible à la génération suivante (mutations héréditaires) Mutation somatique Présente dans les cellules somatiques Présente seulement dans certaines cellules (ex: lésions des cellules cancéreuses) Souvent accidentelle (radiations, substances chimiques ou autres) Non transmise à la descendance 17  5.3 Origine des altérations Altérations / Mutations Taille: Géniques Chromosomiques Génomiques Conséquence Silencieuse Délétion Insertion Non-sens Délétion Insertion Faux-sens Duplication Translocation Substitution Conservatrice Types cellulaires: Somatiques Germinales Suite à l’exposition à Origine: Spontanée Induite des agents mutagènes externes Suite à des phénomènes endogènes Erreurs de Chimique Physique réplication Alkylants Dépurination Radiations Intercalants Désamination ionisantes Incorporation Oxydation bases analogues Ultraviolets 18 5.3 Origine des altérations Altérations spontanées Rappel : les tautomères de bases azotées Tautomères = isomères d’une molécule (même formule chimique) qui diffèrent par la position et la liaison de leurs atomes En fonction du pH de la solution, chaque base azotée existe sous 2 isoformes = tautomères de bases → Déplacement d’un atome d’H (proton) avec changement de localisation d’une double liaison → Conditions physiologiques (pH neutre), les tautomères Amino et Céto prédominent 19 5.3 Origine des altérations Altérations spontanées Liaisons non canoniques des tautomères en dehors des appariements A = T et G ≡C 20 5.3 Origine des altérations Altérations spontanées Une tautomérisation provoque une mutation dans le brin complémentaire néosynthétisé au cours de la réplication Exemple: Tautomérisation de l’Adénine dans le brin modèle de l’ADN durant la réplication Altération Mutation A = Adénine sous forme amino = TAUTOMERE 1 A*=Adénine sous forme imino = TAUTOMERE 2 21 5.3 Origine des altérations Altérations spontanées Dépurination de nucléotide = perte d’un résidu adénine (A) ou guanine (G) Hydrolyse de la liaison N-Glycosidique entre la base purique et le désoxyribose Phénomène très fréquent : ~18000 dépurinations réparées/ jour/ cellule Dépurination d’une guanine Dépyrimidination de nucléotide = perte d’un résidu cytosine (C) ou thymine (T) Hydrolyse de la liaison N-Glycosidique entre la base pyrimidique et le désoxyribose Phénomène beaucoup moins fréquent : ~600 dépyrimidinations réparées/ jour/ cellule 22 5.3 Origine des altérations Altérations spontanées Désamination des bases Elimination d’un groupement amine d’une base → Bases désaminées Exemple 1: Désamination de C en U ~100 désaminations / jour / cellule Conséquence: U s’apparie avec A → Remplacement d’un C-G en A-T après réplication s’il n’y a pas de réparation Exemple 2: Désamination de A en hypoxanthine Conséquence: L’hypoxanthine s’apparie avec C → Remplacement d’un A-T en G-C après réplication s’il n’y a pas de réparation 23 5.3 Origine des altérations Altérations spontanées Exemple 3: Désamination de la guanine en Xanthine Conséquence: Pas de changement d’appariement Rem: La thymine est la seule base qui ne subit pas de désamination 24 5.3 Origine des altérations Altérations spontanées Oxydation Le métabolisme cellulaire normal produit des molécules chimiques très réactives de l’oxygène (ROS – reactive oxygen species) comme : Radicaux superoxydés (O2 - ) Radicaux hydroxylés (OH- ) Peroxydes d’hydrogène (H202) Exemple: Oxydation de la guanine en oxoguanine permet un appariement avec l’adénine (GC devient TA après réplication) → Cette oxydation est souvent à l’origine de maladies génétiques 25 5.3 Origine des altérations Altérations induites par des mutagènes chimiques Incorporation de bases analogues Analogues de bases = composés chimiques qui ressemblent aux bases azotées normales et sont incorporées lors de la réplication de l’ADN Conséquence: Ces analogues ont des propriétés d’appariement différentes, ce qui entraine des mutations après réplication Exemples: 5-Bromo-uracile (5-BU) = analogue de la thymine 2-Amino-purine (2-AP) = analogue de l’adénine 26 5.3 Origine des altérations Altérations induites par des mutagènes chimiques Alkylation Les agents alkylants altèrent les bases en ajoutant des groupements éthyl ou méthyl sur l’atome d’O de la guanine (G) ou de la thymine (T) Les bases modifiées ont des propriétés d’appariement différentes Exemple: O6-méthylguanine (m6G) s’apparie avec T (GC devient AT après réplication) Exemples d’agents alkylants: Ethylméthane sulfate (EMS) Nitrosoguanidine (NG) Diméthylsulfate 27 5.3 Origine des altérations Altérations induites par des mutagènes chimiques Exemples: O6-éthylguanine O4-éthylthymine 28 5.3 Origine des altérations Altérations induites par des mutagènes chimiques Agents intercalants: Composés chimiques caractérisés par plusieurs noyaux aromatiques et ressemblant aux paires de bases S’intercalent entre 2 bases adjacentes de la double hélice d’ADN Conséquences: Distorsion de l’ADN qui empêche la progression des enzymes sur l’ADN (ex: ADN polymérase, ARN polymérases et topoisomérase) → Inhibition de la réplication et de la transcription 29 5.3 Origine des altérations Altérations induites par des mutagènes chimiques Exemples d’agents intercalants: - Bromure d’éthidium - Anthracyclines - Acridine orange - Proflavine 30 5.3 Origine des altérations Altérations induites par des mutagènes physiques Rayonnements ultraviolets (UV) Absorption des UV par l’ADN au niveau de deux pyrimidines adjacentes Altération des liens H Création de liaisons covalentes entre les deux bases Conséquence: → distorsion de la structure de la molécule d’ADN qui va bloquer la réplication et la transcription Exemple: dimères de thymine 31 5.3 Origine des altérations Altérations induites par des mutagènes physiques Radiations ionisantes Les radiations ionisantes provoquent des cassures (lésions) de simple brin ou double brins Exemples: Rayons cosmiques Radioactivité Rayons X (utilisés à fin thérapeutique) Radiothérapie des cancers: cassures non réparables aboutissant à la mort par apoptose des cellules irradiées 32 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN Polymérisation durant la réplication: 1 erreur /104-105 nucléotides incorporés PROOFREADING 1 erreur /106-108 nucléotides incorporés ? Taux d’erreurs observé: 1 erreur /109-1010 nucléotides incorporés 33 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN Buts de ces mécanismes de reparation ? Maintenir l’intégrité du patrimoine génétique Eviter que les altérations de l’ADN deviennent permanentes à mutations Corrige plus de 99.9% des altérations occasionnées à l’ADN Processus extrêmement coûteux en énergie Spécialisation de la réparation selon le type d’altérations Des composantes de la réplication de l'ADN interviennent aussi dans les mécanismes de réparation de l’ADN 34 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN Six systèmes de réparation 1. Réparation directe 2. Réparation par excision de base (Base Excision Repair – BER) 3. Réparation par excision de nucléotide (Nucleotide Excision Repair – NER) 4. Réparation des mésappariements (Mismatch Repair – MMR) 5. Réparation par jonction d’extrémités non-homologues (NHEJ) 6. Réparation par recombinaison homologue (RH) 35 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 1. Réparation directe = Mécanisme associé à des altérations spécifiques A. Réparation de lésions induites par un agent alkylant Exemple: Agents alkylants induisant des mutations O6-méthylguanine (m6G) → réparation se fait par une méthyl-transférase 36 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN B. Réparation des lésions induites par les UV UV induisent des lésions appelées « dimères de pyrimidine » Réparation initiée après activation de la photolyase par la lumière visible Liaison aux dimères de pyrimidines → Retour à deux thymines adjacentes 37 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 2. Réparation par excision de base (Base Excission Repair – BER) = Mécanisme de réparation par cassure simple brin et excision de la base modifiée Permet de corriger une seule base azotée endommagée par désamination, oxydation, alkylation Des enzymes spécifiques reconnaissant chaque altération 3 étapes clés 1) Reconnaissance de la lésion (ADN glycosylases) 2) Excision de la partie altérée (AP-endonucléase) 3) Réparation de la cassure par réplication Exemple: désamination de C en U 4 types d'AP endonucléases, classées en fonction de leur site d'incision : Classe I et de classe II clivent la liaison phosphodiester en laissant un hydroxyle 3’-OH et un 5’-phosphate du côté du désoxyribose-5-phosphate, Classe III et de classe IV clivent en laissant un 3’- phosphate et un 5’-OH2. 38 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 2. Réparation par excision de base (Base Excission Repair – BER) ADN glycosylases Famille d'enzymes de la famille des hydrolases qui hydrolysent la liaison N-glycosidique entre le désoxyribose et la base azotée Les ADN glycosylases génèrent un site apurinique/apyrimidinique (site AP) en supprimant la base nucléique tout en laissant la structure sucre- phosphate intacte. Ces sites sont reconnus par l'enzyme AP endonucléase qui procède à la réparation Plusieurs ADN glycosylases sont classées en fonction de leurs substrats et de leur vitesse d’action → Chaque glycosylase est spécifique d’une altération: UNG, UDG2 = Uracile glycosylase retire les uraciles résultant de la désamination spontanée des cytosines de l’ADN TDG = Thymine glycosylase impliquée dans les mésappariements T/G et U/G OGG1 = Guanine glycosylase retire les oxo-guanines résultant de l’oxydation des guanines de l’ADN D’autres participent à la réparation d’altérations telles les: ▪ Hypoxanthine résultant de la désamination de A ▪ Bases alkylées telles 3-méthyl-adénine, 7-méthyl-guanine ▪ Dimères de Thymine 39 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN AP-endonucléases 4 types d'AP endonucléases, classées en fonction de leur site d'incision : Classe I et de classe II clivent la liaison phosphodiester en laissant un hydroxyle 3’-OH et un 5’-phosphate du côté du désoxyribose-5-phosphate Classe III et de classe IV clivent en laissant un 3’-phosphate et un 5’-OH. 40 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 3. Réparation par excision de nucléotide (Nucleotide Excision Repair – NER) Mécanisme de réparation par cassure simple brin (même principe que BER) d’altérations impliquant plusieurs nucléotides Capable de réparer des anomalies de structure de l’ADN (distorsion de l’hélice d’ADN) Au moins 30 enzymes impliquées dans les différentes étapes Mécanisme de réparation préférentiellement utilisé pour réparer les dommages causés par les UV (Ex: dimères de thymine) 4 étapes principales: 1. Reconnaissance de la lésion 2. Incision et enlèvement du fragment endommagé 3. Synthèse d’ADN dans la partie incisée 4. Ligation des fragments 41 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 3. Réparation par excision de nucléotide (Nucleotide Excision Repair – NER) Exemple: dimère de pyrimidines C-T 1. Reconnaissance de 2. Incision et enlèvement du la lésion fragment endommagé 3. Synthèse d’ADN dans la partie incisée 4. Ligation 42 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 4. Réparation des mésappariements (Mismatch Repair – MMR) Système de reconnaissance et de réparation des mésappariements de l’ADN Proviennent le plus souvent d’erreurs d’incorporation par les ADN polymérases lors de la réplication Système hautement conservé entre différentes espèces Second système le plus important permettant la correction des mésappariements après l’activité de relecture 3’-5’ des polymérases 43 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 4. Réparation des mésappariements (Mismatch Repair – MMR) 1. Reconnaissance du mésappariement par un duplexe de MSH2/6 2. Recrutement de MLH1-PMS2 qui se lie aux sites hemimethylés de l’ADN néoformé. Il forme une boucle jusqu'au site de méthylation d(CATC) le plus proche du mésappariement (jusqu’à 1kb) pour définir le brin néoformé. 44 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 4. Réparation des mésappariements (Mismatch Repair – MMR) 3. une endonucléase qui interagit avec MLH –PMS2 coupe le brin non méthylé près du site de méthylation 4. Il y alors recrutement d’une hélicase (UvrD chez E.coli). Les complexes MSH2/6 et MLH21-PMS2 retournent vers le mésappariement en séparant le brins via l’hélicase et en entrainant une exonucléase qui va dégrader l’ADN simple brin néoformé. Des protéines SSB (RPA chez eucaryote) se déposent sur le brin modèle pour le protéger 5. Une fois le complexe a fini d’éliminer le mésappariement, il y aresynthèse par l'ADN polymérase ᵟ et suture du brin par l'ADN ligase. 45 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 5. Réparation des cassures d’ADN double brin Etape cruciale dans la préservation de l’intégrité du génome L’absence de réparation peut générer des altérations chromosomiques (perte de chromosome, duplications, délétions ou translocations) Réparation des cassures d’ADN double brin : Lésions dues aux radiations ionisantes et stress cellulaire endogène Lésions les plus toxiques pour les cellules, entraînant la mort cellulaire ou la transformation néoplasique Deux mécanismes: ❖ Jonction d'extrémités non homologues (Non-Homologous End joining (NHEJ)) ❖ la recombinaison homologue (Homologous Recombination - HR) 46 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN Jonction d'extrémités non Recombinaison Homologues (NHEJ) homologue Mécanisme rapide Ne nécessite pas de séquences homologues à Mécanisme lent réparation directe Utilisation d’une séquence homologue Délétion de quelques nucléotides au niveau de la non endommagée pour assurer une jonction si nucléotides sont endommagés car réparation fidèle de la lésion excisés 47 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 5. Réparation des cassures d’ADN double brin par jonction d’extrémités non homologues (NHEJ) = Mécanisme de réparation de cassures double brins Les extrémités cassées sont juxtaposées et recollées par ligation d’ADN Ne requiert pas de matrice (absence de chromatides sœurs disponibles) Le processus est sujet aux erreurs (plusieurs paires de bases peuvent être perdues dans le processus si endommagées car seront excisées) → NHEJ est potentiellement mutagène au niveau du site de réparation de la cassure double brin Essentiellement utilisée lors de la phase G1 48 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 5. Réparation des cassures d’ADN double brin par jonction d’extrémités non homologues (NHEJ) Recrutement des protéines KU70/80 au site de cassure double brin Recrutement des kinases DNA-PKcs qui phosphorylent les protéines Artemis (nucléase) qui extrudent les extrémités des brins coupés. Recrutement du complexe ligase DNA ligase IV et son cofacteur XRCC4 qui réalise l’étape de reparation de ligation. 49 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 6. Réparation des cassures d’ADN double brin par recombinaison homologue Permet de réparer des cassures double-brin provenant de radiations ionisantes et agents oxydants Utilise une séquence homologue à la région de la cassure comme modèle pour permettre une réparation fidèle des cassures double brin Également un rôle dans la diversité génétique Méiose (création de nouveaux gènes/allèles) Réarrangements somatiques (Ig, récepteurs des cellules T) Principalement active dans les phases S et G2 du cycle cellulaire → copie homologue = chromatide sœur présente et sert de matrice 50 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 6. Réparation des cassures d’ADN double brin par recombinaison homologue 3 phases: 1. Phase présynaptique: reconnaissance du site de cassure dégradation partielle des extrémités assemblage du complexe de recombinaison 2. Phase synaptique: échange de brins avec une séquence d’ADN homologue intacte 3. Phase post-synaptique: synthèse d'ADN au site d'échange de brin résolution des intermédiaires d'échange de brins 51 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN Phase 1: Phase présynaptique Etape de reconnaissance et résection de la cassure double brin Cassure double brin (CDB) reconnue par le complexe RMN (Mre11, Nbs1, Rad50) → activité nucléase + hélicase Dégradation des extrémités 5’ de part et d’autre de la cassure double du brin d’ADN → génération d’ADN simple brin Extrémités simple brin reconnues par le complexe RPA (= protéines SSB) → Stabilisation de l’ADN simple brin 52 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN Assemblage du nucléofilament RAD51 Remplacement des protéines RPA par un filament de recombinase RAD51 grâce à RAD52 et BRCA2 Formation du filament RAD51 sur l’ADN simple brin 53 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN Phase 2: Phase synaptique → Recherche d’homologie Filament RAD51 recherche une homologie de séquence dans les alentours (chromatide sœur) Invasion de brin Invasion de la séquence homologue d’une chromatide sœur et génération de la D-loop Phase 3: Phase post-synaptique → Synthèse d’ADN L'extrémité 3' de la molécule cassée se retrouve hybridé à son homologue intact au sein de la D- loop Synthétise d’ADN en prenant comme modèle la molécule envahie par ADN polymérase 54 5.4 Mécanismes de réparation de l’ADN 6. Réparation des cassures d’ADN double brin par recombinaison homologue Deux types de clivages pour résoudre la jonction de Holliday au niveau de la D-loop par des nucléases et résolvases 55 5.5 Systèmes de détection Protéines impliquées dans la détection de différents types d’altérations 1. ADN glycosylase (réparation par excision de base - BER) 2. PARP1 (réparation par excision de base - BER) 3. XPC/HR23B (réparation par excision de nucléotides - NER) 4. Complexe MSH2/MSH6 (DNA mismatch repair- MMR) 5. ATM (NHEJ et recombinaison homologue) 6. MRN (recombinaison homologue) 7. RPA (recombinaison homologue) 56 5.6 Anomalies de reparation ; Pathologies Xeroderma pigmentosum (enfant de la lune) Mutations dans les gènes codant pour les protéines XPA à XPG Système de répara5on par excision de nucléo5des (« NER ») altéré → incapacité à réparer les dimères de thymines Sujets hypersensibles aux UV à risque élevé de développement de cancer de la peau 57 5.6 Anomalies de reparation ; Pathologies Syndrome de Lynch Maladie autosomique dominante associée à un risque élevé de développer un cancer colorectal ou de l'endomètre (prédisposition familiale à développer des cancers) 4% des cancers colorectaux sont liés à un syndrome de Lynch Mutations dans les gènes MSH2,3,6 – MLH1 – PMS2 impliqués dans la réparation des mésappariements (MMR) Hypermutation dans 16% des cancers du colon et 35% des cancers de l’endomètre associée à une instabilité des microsatellites et défaut de réparation MMR L'absence de ce système — syndrome de Lynch II ou HNPCC (Hereditary Non Polyposis Colon Carcinoma) — engendre, entre autres, une instabilité des séquences microsatellites de l'ADN. Ceci est impliqué dans les formes familiales de cancers colorectaux, de l'endomètre, des ovaires, des voies urinaires et des voies biliaires. 58 5.6 Anomalies de reparation ; Pathologies Cancers du sein associés à une mutation germinale BRCA1 et BRCA2 Protéines BRCA1/2 impliquées dans la réparation par recombinaison homologue Risque ↑ de développer un cancer du sein avant 70 ans: - Sein : de 40 à 85% contre 10% dans la popula1on générale - Ovaire : de 10 à 63 % contre 1% dans la popula1on générale Prévention: mastectomie et ovariectomie 59 5.7 Cibles thérapeutiques Inhibiteur de PARP = Stratégie thérapeutique pour les patientes avec un cancer du sein ou de l’ovaire BRCA 1 ou 2 muté - PARP = réparation des cassures simple brin (BER) - BRCA1/2 = réparation des cassures double brin par RH 60 5.8 Résumé 61 5.8 Résumé 62