Biochimica II - Lezione 1 PDF

BIOCHIMICA II - LEZIONE 1 SBOBINATRICE: GLORIANA ZACCARDI 03/10/2022 1° ORA REVISORE: MARILENA SEMERARO LEZIONE 0 PRESENTAZIONE DEL DOCENTE Prof.ssa: Barbara Cellini Ufficio: Edificio B, piano 4 E-mail (contatto...

BIOCHIMICA II - LEZIONE 1 SBOBINATRICE: GLORIANA ZACCARDI 03/10/2022 1° ORA REVISORE: MARILENA SEMERARO LEZIONE 0 PRESENTAZIONE DEL DOCENTE Prof.ssa: Barbara Cellini Ufficio: Edificio B, piano 4 E-mail (contatto preferenziale): [email protected] , si è pregati di inviare mail autonomamente in caso di domande personali, se vi sono dubbi tecnici o comuni a più persone si è pregati di raccogliere tali quesiti e porli attraverso i rappresentanti. Scopi del corso Conoscere i processi metabolici e la loro regolazione a livello molecolare Conoscere il ruolo metabolico dei diversi tessuti e la loro integrazione Comprendere le basi molecolari delle malattie Capire il meccanismo di funzionamento dei farmaci Organizzazione del corso Modulo I Modulo II Modulo III - Introduzione al - Metabolismo delle - Ormoni metabolismo proteine e degli - Biochimica di - Metabolismo aminoacidi organi e tessuti terminale - Metabolismo dei - Metabolismo dei nucleotidi glucidi - Metabolismo degli - Metabolismo dei acidi nucleici lipidi - Sintesi e modificazioni post- traduzionali delle proteine Link per il programma dettagliato online: https://www.unipg.it/didattica/corsi-di-laurea-e-laurea-magistrale/archivio/offerta-formativa-2021- 2 2?idins=188201 Sono previste: - Lezioni frontali: hanno lo scopo di fissare i concetti principali, interagire e fare domande. Per studiare è necessario seguire il libro. Le slide delle lezioni frontali saranno caricate su UniStudium dalla professoressa volta per volta al termine della lezione del giorno. - Lezioni DTP (didattica teorico-pratica): permettono di aggiungere materiale di approfondimento mediante l’utilizzo della piattaforma “Unistudium” (non sono programma d’esame). Sono previste anche esercitazioni pratiche, occasioni per chiarire eventuali dubbi (sicuramente ne verrà proposta una prima della prima prova in itinere). Libri consigliati - “Biochimica medica” Siliprandi-Tettamanti ed. Piccin - “I principi di biochimica di Lehninger” Nelson-Cox ed. Zanichelli E’ carente nella parte di biochimica tissutale, integrabile con “Fondamenti di biochimica umana” Maccarrone ed. Zanichelli. Modalità di esame La valutazione del corso è obbligatoria per poter svolgere l’esame. Prova scritta E’ un test con 30 domande a risposta multipla da eseguire sulla piattaforma LibreEOL in presenza; ad ognuno verrà richiesto di portare il proprio dispositivo in aula. Valutazione della prova: 1 punto per ogni risposta corretta - 0,25 punti per ogni risposta errata nessuna penalizzazione per ogni risposta non data (massimo 3) Il superamento della prova scritta con almeno 18/30 dà l’accesso alla prova orale. N.B. il voto del test scritto ha una validità di 12 mesi. Prova orale Colloquio con almeno una domanda per ciascun modulo. Prove in itinere Saranno due prove scritte da svolgere su libreEOL a distanza. Valutazione della prova: 1,5 punti per ogni risposta corretta nessuna penalità per eventuali risposte sbagliate. Gli studenti che ottengono l’idoneità (almeno 18/30) al primo modulo possono accedere al secondo. Coloro che ottengono l’idoneità anche al secondo modulo accedono direttamente alla prova orale negli appelli ufficiali d’esame. Il voto delle prove in itinere non influenza la valutazione finale al termine dell’esame orale. 1^ PROVA : VEN 11/11/2022 ORE 15:00 2^ PROVA : MER 28/12/2022 ORE 10 - Introduzione al metabolismo - Metabolismo dei nucleotidi - Metabolismo terminale - Metabolismo degli acidi nucleici - Metabolismo dei lipidi - Sintesi e modificazioni post- - Metabolismo dei glucidi traduzionali delle proteine - Metabolismo delle proteine e degli - Ormoni aminoacidi - Biochimica di organi e tessuti Quiz Durante la pausa fra le due ore o al termine di un argomento verranno proposte 2-3 domande a cui è possibile rispondere anonimamente da cellulare scannerizzando il relativo qr code che verrà proiettato durante la lezione. LEZIONE 1 INTRODUZIONE AL METABOLISMO Metabolismo: E’ la somma di tutte le trasformazioni chimiche che avvengono nell’organismo. Noi siamo organismi che bruciano molecole contenenti C e H (nutrienti) per ricavare energia e utilizzarla per vivere, crescere e riprodursi. Il nostro cervello consuma 120 g di glucosio al giorno e il consumo è identico sia a riposo che durante la veglia. Così come le nostre macchine hanno bisogno di combustibile, allo stesso modo, anche noi, per pensare, per muoverci ne abbiamo bisogno, tant’è che si parla di combustibile metabolico. Perché si parla di combustioni? Ogni combustione è una reazione di una molecola con l’ossigeno. Le nostre molecole, però, non reagiscono direttamente con esso. Siamo organismi aerobi perché l’ossigeno è l’accettore finale degli elettroni. I nutrienti che assumiamo sono ricchi di elettroni che fluiscono fino all’ossigeno che acquistandoli si riduce ad acqua. Il metabolismo si distingue in:  CATABOLISMO: comprende le vie degradative, con le quali utilizziamo l’energia chimica rilasciata dai nutrienti ridotti (ricchi di energia e di elettroni), che si ossidano (rilasciano elettroni, energia chimica), per vari scopi. Il catabolismo riguarda vie ossidative: si perdono elettroni che vengono ceduti ai coenzimi ossidati (NAD+ NADP+, FAD) che così si riducono (NADH, NADPH, FADH2) e si ricava energia. ANABOLISMO: comprende l’insieme delle reazioni che trasformano, utilizzando potere riducente (elettroni), molecole più semplici nella forma ossidata in componenti più complesse. Sono reazioni di biosintesi riduttive. Dalle reazioni del catabolismo si ricava energia e potere riducente che si utilizza nelle reazioni anaboliche. figura 1 Il metabolismo è una attività altamente regolata, a cui cooperano molti sistemi multienzimatici, che adempie a quattro funzioni specifiche: 1. Ottenere energia chimica da utilizzare per compiere un lavoro 2. Convertire le molecole nutrienti nelle molecole costituenti la cellula che ci servono per l’accrescimento 3. Polimerizzare i monomeri in polimeri (le macromolecole biologiche sono molto complesse ma sintetizzate a partire da componenti semplici la cui sequenza ed interconnessione determina la variabilità) 4. Sintetizzare le molecole necessarie per funzioni specializzate La professoressa espone i tre diversi aspetti del metabolismo che verranno approfonditi nelle prossime lezioni: 1. la spontaneità delle reazioni e le leggi della termodinamica 2. il ruolo fondamentale dei “composti ad alta energia” e delle reazioni di ossidoriduzione nei trasferimenti di energia dei processi metabolici 3. l’importanza della regolazione del metabolismo al fine di evitare dispendio energetico inutile e CICLI FUTILI e rispondere alle esigenze dell’organismo LEGGI DELLA TERMODINAMICA È importante conoscere il ruolo della termodinamica nel metabolismo: la cellula non è un essere pensante ma, nei nostri organi, la comunicazione è mediata da segnali chimici ed è basata sugli equilibri e su come l’organismo risponde agli stimoli esterni. Le reazioni seguono le leggi della termodinamica: sono spontanee solo se il ΔG è minore di zero. ΔG = ΔH - TΔS 1) Le trasformazioni di energia che avvengono negli organismi viventi possono essere descritte con le funzioni di stato che descrivono qualsiasi reazione chimica. Quando parliamo delle reazioni biochimiche non parliamo di ΔG0 perché le condizioni standard viste in chimica non sono quelle che del nostro organismo. Per le reazioni reali si guarda al ΔG0’ che è la misura di come varia l’energia libera delle reazioni nelle condizioni che vengono specificate (25°C; 1atm; [H2O]=55M; [Mg2+]= 1mM; pH = 7 e [reagenti]= 1M). ΔG0’ = -RT ln K’eq ΔG0’ è correlato alla costante di equilibrio (Keq): - Se una reazione, nel verso in cui la stiamo considerando, ha una costante di equilibrio minore dell’unità allora la formazione dei reagenti è favorita rispetto ai prodotti; la reazione non è spontanea perché è favorita la reazione inversa. - Se la costante di equilibrio è molto elevata l’equilibrio è spostato verso i prodotti, quindi la reazione diretta è spontanea (i prodotti hanno meno energia dei reagenti). Molte delle reazioni del nostro organismo hanno spesso dei ΔG prossimi allo zero, né estremamente positivi né estremamente negativi, proprio perché sono controllati da quello che viene definito flusso dei reagenti, un aspetto che approfondiremo dopo. figura 2 In figura 2 vediamo alcune delle reazioni chimiche che affronteremo durante questo corso. Ci sono diversi tipi di reazioni che hanno un ΔG estremamente negativo: una fra tutte è la scissione di un legame anidridico ad alta energia. Quando scindiamo questo tipo di legame in un reazione liberiamo energia chimica quindi la reazione è estremamente favorita. Altre reazioni, come l’idrolisi di un estere o interconversioni o isomerizzazioni, sono scarsamente favorite, l’equilibrio è molto meno spostato verso i prodotti. 2) Il ΔG reale delle reazioni è correlato al ΔG0’ ma dipende dalle concentrazioni di reagenti e prodotti, questo effetto è noto come legge di azione di massa Legge di azione di massa Fondamentale per la comprensione degli argomenti del corso perchè, quando abbiamo a che fare con una reazione la cui variazione di energia libera è molto vicina allo zero, né ΔG0 né ΔG0’ sono particolarmente utili. Ciò che va considerato per capire se una reazione avviene (e in quale verso) sono le concentrazioni dei reagenti e dei prodotti. ΔG = ΔG0’ + RT ln [[𝐴𝐶]] [[𝐷𝐵]] Per la comprensione: metafora del bicchiere e della bottiglietta Immaginiamo di avere in una mano una bottiglia d’acqua e nell’altra un bicchiere. Se la bottiglia è più in alto del bicchiere, nel momento in cui inclino la bottiglia l’acqua cadrà nel bicchiere, a prescindere dalla differenza di altezza fra acqua e bicchiere. Viceversa, se la bottiglia è più bassa del bicchiere, è impossibile che l’acqua vada all’interno di quest’ultimo. Quando bottiglia e bicchiere sono molto vicini, le cose possono cambiare. Questo è il concetto del flusso dei metaboliti. Il flusso dei metaboliti è il flusso dei reagenti e dei prodotti, cioè, se in una certa zona di una cellula aumenta la concentrazione dei reagenti diventa favorito il prodotto (come se io inclino la bottiglia per far scendere l’acqua). 3) I ΔG di reazioni accoppiate si sommano: una reazione esoergonica può fornire l’energia necessaria per far avvenire una reazione endoergonica. figura 3 Se le due reazioni sono accoppiate, quindi hanno un intermedio in comune, allora i ΔG si sommano: una reazione “traina” l’altra. Questo funziona solo se il ΔG della reazione che traina è talmente negativo da determinare la spontaneità anche della reazione precedente. Questo è uno dei vari modi per fornire l’energia necessaria alla reazione endoergonica. BIOCHIMICA II - LEZIONE 1 SBOBINATRICE: MARILENA SEMERARO 03/10/2022 2° ORA REVISORE:GLORIANA ZACCARDI RUOLO DELL’ATP Il secondo concetto base per comprendere il metabolismo è che ci sono delle molecole che svolgono un ruolo fondamentale e queste sono i nucleotidi fosforilati (ATP, CTP, UTP, GTP…). La molecola di gran lunga più usata è l’ATP (adenosin trifosfato), moneta energetica del metabolismo, perché permette gli scambi di energia. (figura 4) figura 4 Molto spesso nei testi si parla di idrolisi di ATP perché è il modo in cui si misura l’energia contenuta nell’ATP: ha due legami fosfoanidridici il cui ΔG di idrolisi è fortemente negativo. Tuttavia, in quasi tutte le reazioni, l’ATP non è idrolizzato perché in molte reazioni la molecola di acqua non è presente. Un esempio di eccezione è l’idrolisi di ATP sulle teste della miosina che la trasformano in energia meccanica, mentre le proteine G (utilizzate per spegnere determinate reazioni) sono un esempio di idrolisi del GTP. L’ATP può intervenire nelle reazioni biochimiche in diversi modi: Figura 5  1. Trasferimento del gruppo fosforico in gamma al substrato, come nel caso delle chinasi 2. Trasferimento del gruppo pirofosforico (i fosfati in beta e in gamma sono trasferiti sul substrato) 3. Trasferimento del gruppo adenilico (AMP), come nell’attivazione degli acidi grassi. Esiste anche un caso in cui tutti e tre i gruppi fosforici dell’ATP vengono eliminati (verrà approfondito in seguito). Fosforilazione di glucosio a glucosio 6 fosfato Il gruppo alcolico legato al C6 del glucosio esegue un attacco nucleofilo sul fosforo in posizione gamma dell’ATP, con conseguente scissione del legame fosfoanidridico e formazione di un legame fosfoestere. La reazione è catalizzata dall’esochinasi (una transferasi di classe II) ed è normalmente una reazione irreversibile perché si scinde un legame ad alta energia per crearne uno a più bassa energia (il ΔG è minore di zero). Per compiere la reazione inversa viene utilizzata un’altra via. Sintesi della glutammina E’ un caso in cui l’ATP interviene nel meccanismo della reazione ma il suo ruolo non è così evidente: la glutammina sintetasi permette di formare glutammina a partire dal glutammato (le sintetasi usano ATP, le sintasi no). Il gruppo carbossilico del glutammato viene sostituito nella prima tappa dal fosfato in gamma dell’ATP con formazione dell’intermedio glutammil-fosfato. La seguente rottura del legame anidridico misto (acido più acido →anidride mista), durante la seconda tappa, sostiene energeticamente la formazione del legame ammidico tra il carbonio della catena laterale e l’azoto del gruppo amminico. Il processo endoergonico viene reso spontaneo accoppiandolo con ATP: scrivendo la reazione senza intermedio sembra che l’ammina vada a legarsi direttamente al carbonio della catena laterale del glutammato, ma il processo così inteso non sarebbe spontaneo perché non sfavorito termodinamicamente. Sintesi di ATP Può avvenire mediante due meccanismi diversi: Fosforilazione a livello del substrato Metodo più semplice e minoritario, un enzima trasferisce un gruppo fosforico da un substrato ad alta energia all’ADP per formare ATP (figura 7). Es. Fosfoenolpiruvato Nell’ultima reazione della glicolisi abbiamo fosfoenolpiruvato che ha un gruppo fosforico con idrolisi fortemente esoergonica, molto favorita. Tramite un enzima si accoppia questa idrolisi alla reazione di sintesi dell’ATP a partire da ADP e Pi (figura 8). figura 8 figura 7 Il loro accoppiamento fa sì che la reazione globale sia fortemente esoergonica. Il fosfoenolpiruvato è quella molecola a più alto potenziale di trasferimento del gruppo fosforico. E’ la molecola la cui cessione del gruppo fosforico è la più favorita. Fosforilazione ossidativa La fosforilazione ossidativa (figura 9) ha bisogno di ossigeno ed avviene nei mitocondri (gli eritrociti che non hanno mitocondri usano solo fosforilazione a livello del substrato). Durante il metabolismo ossidativo, gli elettroni sono trasferiti dai vari coenzimi ridotti NADH e FADH2 lungo la catena respiratoria nella membrana mitocondriale interna fino all’accettore finale O2. Il flusso degli elettroni è associato al trasferimento di protoni dalla matrice mitocondriale allo spazio intermembrana. L’ATPsintasi sfrutta la forza protonmotrice generata da questo gradiente per sintetizzare ATP. Nonostante la maggioranza di ATP sia sintetizzata mediante la fosforilazione ossidativa esistono altri metodi di formazione dell’ATP. Le ossidoriduzioni in biochimica figura 10 Le principali reazioni che avvengono nel nostro metabolismo dalle quali si ricava energia, o si usa energia, sono ossidoriduzioni: il flusso di energia nel nostro organismo non è altro che il flusso di elettroni. Nel catabolismo andiamo da molecole ridotte ad ossidate e l’atomo ossidato è il carbonio (componente principale delle molecole organiche), infatti, il prodotto finale del metabolismo è l’anidride carbonica. Molecola ossidante: molecola che si riduce acquistando elettroni (il suo n. di ossidazione si riduce). Molecola riducente: molecola che si ossida perdendo elettroni (il suo n. di ossidazione aumenta). Nel nostro organismo la maggior parte delle molecole sono costituite da atomi di carbonio quindi bisogna aver chiari i suoi stati di ossidazione(figura 11). figura 11 Gli alcani, che sono catene idrocarburiche, rappresentano lo stato più ridotto del carbonio. Gli alcoli sono più ossidati degli alcani ma più ridotti degli aldeidi e chetoni. Il gruppo funzionale degli acidi carbossilici presenta l’atomo di carbonio con il numero di ossidazione più alto dopo quello contenuto nell’anidride carbonica (molecola inorganica). Il ciclo di krebs in senso catabolico ossida completamente AcetilCoA (due atomi di carbonio) in anidride carbonica. Solitamente il catabolismo è caratterizzato da reazioni di ossidazione, dove gli elettroni rilasciati sono acquisiti da NAD+ e FAD che si convertono in NADH e FADH2. Il NADP interviene nel catabolismo solamente nella via metabolica per la sua stessa produzione. Al contrario, le vie biosintetiche dell’anabolismo sono solitamente riduttive e comportano l’ossidazione di NADPH per cedere elettroni al substrato (es. biosintesi degli acidi grassi) in cui dobbiamo convertire un gruppo chetonico ad un alcano si usa NADPH che interviene nelle biosintesi riduttive. figura 12 Per questi motivi, I rapporti NAD+/NADH sono a favore della forma ossidata NAD+, mentre nella forma NADPH/NADP sono a favore della forma ridotta NADPH. Il FAD interviene spesso in reazioni specifiche, ad esempio se da un alcano formiamo un alchene perché la variazione di potenziale è bassa tale che permette solo di ridurre una molecola di FAD e non di NAD. Ossidoriduzione lattato-piruvato L’enzima lattatodeidrogenasi ossida il gruppo alcolico del lattato nel gruppo chetonico del piruvato (alpha-chetoacido). Il piruvato è convertibile in lattato per reazione inversa (riduzione del gruppo chetonico in alcolico). figura 13 Ossidasi a funzione mista Le reazioni di ossidoriduzione sono catalizzate da deidrogenasi o ossidasi. Nel fegato avvengono reazioni per la detossificazione dell’alcol o dei farmaci; alcune di queste sono ossidazioni catalizzate da ossidasi a funzione mista. figura 14 In queste reazioni un atomo di carbonio del reagente X si lega covalentemente a un atomo di ossigeno che deriva direttamente dall’ossigeno molecolare, mentre l’altro atomo di ossigeno viene ridotto ad acqua. L’enzima viene detto ossidasi a funzione mista proprio perché il substrato si ossida mentre la specie che si riduce è l’atomo di ossigeno. Viene utilizzato come cofattore il NADPH, nonostante sia una reazione di ossidazione del substrato, perché la molecola di ossigeno interviene direttamente come substrato: - Uno dei suoi due atomi utilizza i protoni provenienti da questo per ridursi ad acqua. - L’atomo restante si idrossila al substrato Quando vengono aggiunti due atomi di ossigeno al substrato l’enzima è detto diossigenasi. - Anabolismo: reazioni biosintetiche (riduttive) Metabolismo - Catabolismo: reazioni degradative (ossidative) BIOCHIMICA II – 2° LEZIONE SBOBINATORE: ILARIA BIGIOLI 04/09/2022 1° ORA REVISORE: ARIANNA PINTI  I METABOLISMI REGOLAZIONE DEI METABOLISMI Iniziamo con la terza parte introduttiva. (La professoressa specifica di non sminuire mai le introduzioni perché spesso danno l'input fondamentale per capire il resto). Parlando di metabolismo, il terzo aspetto su cui poniamo la nostra attenzione è la sua regolazione. Se guardassimo tutte le vie metaboliche (ci sono delle carte complicatissime e database online che mostrano l’interconversione tra i vari metabolismi) vedremmo un groviglio di molecole che si interconvertono e di enzimi che catalizzano reazioni nel quale è difficile districarsi. Se è difficile districarsi per noi, la domanda è: come fa la cellula? Quando si parla di metabolismo bisogna tener conto di due aspetti: Non in tutte le cellule avvengono le stesse vie metaboliche, e anche se ci limitassimo ad una singola cellula, non tutte le vie avvengono contemporaneamente. Parlando di signaling cellulare (i cui elementi importanti sono recettori, secondi messaggeri…) il concetto fondamentale è che le cellule devono poter comunicare, per rispondere a segnali che vengono dall’interno e dall’esterno. Qual è il prodotto finale della comunicazione cellulare? Il prodotto finale è la regolazione delle vie metaboliche che avvengono all’interno, che dovranno essere accese o spente a seconda delle esigenze. Oltre a questo bisogno generale di regolazione, quando si fa riferimento al metabolismo in senso stretto è importante considerare che per ciascuna classe di macromolecole (eccetto i nucleotidi) esistono vie anaboliche e cataboliche. Ad esempio per il glucosio esistono vie degradative (cataboliche, come la glicolisi) e vie biosintetiche (anaboliche). Altro esempio è il glicogeno, del quale vedremo sintesi ed utilizzo. Non è difficile capire che uno degli aspetti cruciali sul quale la regolazione del metabolismo deve concentrarsi è proprio quello di fare in modo che in uno stesso momento non avvenga sia la sintesi che la degradazione del componente perché altrimenti si genererebbero dei cicli futili, che semplicemente dissipano energia sotto forma di calore. Come si fa a regolare le vie in sé e evitare che avvengano cicli futili? (figura 1) figura 1 1. Uno degli aspetti fondamentali è che vie anaboliche e cataboliche sono distinte. Non sempre sono completamente distinte, a volte capita che abbiano alcuni passaggi in comune, ma almeno una delle tappe deve essere diversa nelle due vie (catalizzata da enzimi differenti).  Vedremo l’applicazione di questa regola per il glucosio, in cui avviene la regolazione di flussi di metaboliti che devono andare in un senso o in un altro. 2. In alcuni casi le vie anaboliche e cataboliche avvengono in compartimenti cellulari differenti. L’esempio classico è quello della sintesi e degradazione degli acidi grassi: i processi biosintetici avvengono nel citosol, la degradazione avviene all’interno dei mitocondri. 3. Le reazioni chiave delle vie metaboliche sono anche regolate dai metaboliti, cioè vengono accese o spente, e questa regolazione può essere fatta dall’interno o dall’esterno: ○ dall’interno: ad esempio perché un certo metabolita si accumula e inibisce o attiva quella via; ○ dall’esterno: in risposta a segnali come segnali ormonali, segnali sensoriali, i sensi, gli impulsi; ad esempio, vedremo nel dettaglio la visione, che genera una risposta all’interno della cellula. Le vie metaboliche che negli organismi pluricellulari avvengono in tessuti diversi, quindi, sono coordinate da messaggeri extracellulari. Come vengono regolati i processi metabolici? La regolazione avviene a diversi livelli. Quando parleremo degli ormoni, oppure della regolazione del ciclo di Krebs, vedremo come sono regolati. Esistono 3 livelli di regolazione (figura 2): figura 2 1. Possiamo regolare la quantità di enzima: se abbiamo bisogno di promuovere una certa via, sintetizziamo una maggiore quantità dell’enzima chiave di quella via in modo tale che essa vada più velocemente, o viceversa rallentiamo la sintesi in modo che la via vada più lentamente. Questo livello di regolazione si basa principalmente sul bilancio tra velocità di sintesi e velocità di degradazione degli enzimi, tramite la regolazione della velocità di trascrizione del gene che li codifica. Le cellule infatti sono come delle fabbriche in cui entra un qualcosa ed esce un prodotto. Ad esempio per aumentare la velocità con cui un’azienda produce un certo componente, si può assumere un maggior numero di operai o aumentare le macchine. 2. In riferimento all’esempio precedente, per aumentare la velocità di produzione di un certo componente è possibile agire ad un altro livello: possiamo fare lavorare di più gli operai e le macchine già presenti. Per quanto riguarda gli enzimi, questo significa che possiamo regolare l’attivitá catalitica degli enzimi che ci sono, accendendoli o spegnendoli mediante segnali  intracellulari come cAMP, cGMP, in alcuni casi ci sono altri tipi di segnali, come l’inositolo trifosfato. Possiamo regolare l’attività catalitica per esempio attraverso regolazione allosterica, modificazione covalente mediata da ormoni o proteolisi. 3. Disponibilità dei substrati: in questo livello di regolazione è importante la compartimentalizzazione e il controllo del flusso dei substrati da un comparto all’altro della cellula. Questo concetto ci riporta alla legge di azione di massa che governa un po’ tutti questi processi, perché molti enzimi e molte reazioni con cui avremo a che fare lavorano vicino all'equilibrio. Cosa significa lavorare vicino all'equilibrio? Le reazioni sono reversibili, quindi se si accumula substrato la reazione andrà verso destra e l’equilibrio sarà spinto verso i prodotti. Viceversa se aumentano i prodotti la reazione andrà verso sinistra e l'equilibrio potrà essere spinto verso i substrati. Quindi bisogna porre attenzione al fatto che anche gli stessi intermedi di una via metabolica giocano un ruolo nel determinarne la velocità, a seconda del fatto che si accumulino o meno. Noi vedremo un metabolismo alla volta, di una classe di macromolecole alla volta. All’interno di ogni metabolismo vedremo varie vie metaboliche che analizzeremo seguendo un percorso a imbuto: vedremo a cosa servono le varie reazioni, come vengono regolate queste vie in risposta a determinate condizioni e vedremo, quando possibile, se alterazioni a carico di una determinata via metabolica sono associate o meno a malattie o condizioni particolari (non semplicemente malattie, anche particolarità delle persone, intolleranze, etc…). figura 3 Quando parleremo di questo, dovremo sempre distinguere questi due aspetti (figura 3). 1) La regolazione dell’attività enzimatica può avvenire attivando o inibendo un enzima. Se si regola un’attività enzimatica si dice che un enzima è attivato, quindi acceso, oppure inibito, quindi spento. Come facciamo ad attivare o inibire un enzima? In vario modo. Per quanto riguarda la regolazione dell’attività enzimatica, l’enzima può ad esempio rispondere a un segnale allosterico. Per esempio, alcuni enzimi della glicolisi, che produce ATP, sono inibiti dall’ATP: questo costituisce una modalità con cui la cellula comunica che non serve più andare avanti nella glicolisi. Altri enzimi sono regolati per modificazione covalente, di cui la più frequente è la fosforilazione. Modulando l’attività enzimatica possiamo agire sugli enzimi che abbiamo, sul pool che c’è in una cellula; questo può avvenire in risposta sia a segnali che vengono dall’interno sia a segnali che vengono dall’esterno (l’ATP che si accumula, ad esempio, è un segnale che viene dall’interno). 2) Viceversa, possiamo modulare il numero di molecole, quindi agire sulla sintesi e sulla degradazione dell’enzima. In questo caso i segnali che regolano questo processo vengono sempre dall’esterno e possono agire in vario modo. Nella maggior parte dei casi agiscono andando a  influenzare la velocità di trascrizione del gene corrispondente. L’effetto finale è che promuovendo la trascrizione del gene aumenta il numero di enzimi presenti nella cellula, viceversa riducendo la velocità di trascrizione la quantità di enzima diminuisce. In questo caso i termini che si usano sono induzione e repressione. Quando un gene viene indotto ne viene promossa l’espressione, cioè aumenta la quantità dell’enzima trascritto da quel gene; quando un gene viene represso, invece, viene ridotta la velocità di trascrizione, la quantità di enzima che catalizza la reazione diminuisce quindi la reazione stessa si riduce. figura 4 Questo meccanismo non riguarda tutti gli enzimi che incontreremo. Gli enzimi che intervengono nelle vie metaboliche non sono tutti uguali, perché alcuni enzimi si chiamano enzimi chiave (figura 4). Per comprendere cosa significa avere un enzima chiave, consideriamo la metafora dei vasi comunicanti, che mostra il concetto di equilibrio da un contenitore all’altro. Cos’è un enzima chiave? È un enzima che catalizza solitamente una reazione irreversibile; è quella che viene regolata. In questa immagine (parte a sinistra della figura 4), l'enzima chiave è quello indicato con il colore. In questo caso l’enzima viene inibito; qui l’inibizione è rappresentata come se fosse un tubo che diventa più stretto. Nella cellula è l’effettore allosterico che si lega e inibisce l’enzima. Se il tubo diventa più stretto, la portata del flusso diminuisce e l’acqua che esce in fondo è di meno. Attivando invece l’enzima chiave, come è possibile vedere in questa immagine (parte a destra della figura 4), la portata del flusso aumenta e quindi tutta la via metabolica scorre più velocemente. Questa metafora esemplifica esattamente come funziona un enzima chiave, con la differenza che non ci sono molecole di acqua ma metaboliti in equilibrio tra di loro. I segnali di regolazione delle vie metaboliche possono venire anche dall’interno. I più importanti in assoluto sono segnali che indicano la carica energetica. La carica energetica spesso è il rapporto ATP/ ADP. Questo perché il nostro organismo utilizza le vie metaboliche per compiere varie funzioni (i vari tessuti svolgono varie funzioni), ma soprattutto avviene sempre una degradazione dei nutrienti per ricavare energia per compiere un lavoro, oppure per sintetizzare componenti per l’accrescimento, il turnover, la risposta immunitaria, la risposta a un patogeno…. Ecco perché uno dei maggiori segnali che influenzano l’andamento delle vie metaboliche è la carica energetica, il rapporto ATP/ADP. Non sempre sono ATP e ADP i modulatori allosterici: in alcuni casi il modulatore allosterico è l’AMP (ad esempio nel tessuto muscolare). Il motivo per cui l’AMP è un segnale molto forte è perché nella cellula avviene questa reazione (figura 5): figura 5 figura 6 L’ATP viene usato per qualsiasi processo, ad esempio per una contrazione muscolare, e viene convertito in ADP + fosfato (Pi); grazie a un enzima che si chiama adenilato chinasi, però, due molecole di ADP possono scambiarsi il gruppo fosfato e convertirsi in una molecola di ATP e una di AMP. Questa reazione permette di recuperare metà dell’ADP e riportarlo ad ATP a costo zero. Prendiamo l’esempio di una cellula muscolare: le teste della miosina si contraggono quindi idrolizzano ATP. Ammettiamo, utilizzando numeri ipotetici, che per unità di tempo scindano 1000 molecole di ATP ad ADP; se non avvenisse nessun altro processo, servirebbero altre 1000 molecole di ATP nella stessa unità di tempo, per fare continuare la contrazione. Avendo questo enzima, invece, le 1000 molecole di ADP di partenza possono reagire tra di loro e la metà, cioè 500, ritorna in ATP e fa continuare la contrazione. Per questo normalmente l’AMP è presente a livelli bassi, ma quando c’è un intensivo uso di ATP, come durante una contrazione, c’è un accumulo di AMP che segnala fortemente una ridotta carica energetica e induce una serie di risposte tra cui questa mediata dall’AMP chinasi (AMPK). (figura 6) figura 7 Illustrazione di alcuni esempi per rendere questi concetti più concreti. La figura 7 mostra i livelli di regolazione (non sono disposti a seconda della loro importanza). A livello più alto vediamo processi di regolazione genica, quindi induzione e repressione; al di sotto abbiamo la regolazione mediante interconversione, cioè quella regolazione in cui l’enzima viene acceso (attivazione) o spento (inibizione) con un segnale molecolare come la fosforilazione; in fondo vediamo l’ultimo livello di regolazione, ovvero la modulazione allosterica da parte di metaboliti. Regolazione a livello genico figura 8 Questo è un esempio di regolazione a livello genico. L’enzima che vediamo (figura 8) è PEPCK, fosfoenolpiruvato carbossichinasi. Questo è un enzima chiave per un processo detto gluconeogenesi, dalla cui etimologia si deduce il significato di ”sintesi ex novo di glucosio”. È una via che avviene quasi esclusivamente nel fegato; è uno dei modi con i quali il fegato svolge una delle sue funzioni principali, cioè la regolazione della glicemia. Il nostro organismo fa molti sforzi per mantenere la glicemia a livelli “di guardia”, che sono tra 70 a 100 mg/dL; se si scende al di sotto di questi valori si va in coma ipoglicemico perché si spegne il cervello, quindi è possibile comprendere che utilizziamo molti sistemi per mantenere la glicemia. Il principale attore in tutto ciò è il fegato, che regola enzimi chiave. Esempio: Ammettiamo di assumere un pasto costituito da una grigliata con verdure, senza pane. Non si ingeriscono carboidrati, ma ciò non comporta un coma ipoglicemico. Perché? L'organismo è in grado di usare i nutrienti ingeriti e anche qualcosa che è all’interno per sintetizzare glucosio attraverso la gluconeogenesi. Uno degli enzimi chiave della gluconeogenesi è la fosfoenolpiruvato carbossichinasi. Questo enzima viene regolato dal punto di vista trascrizionale, si parla quindi di induzione e repressione. Qui è schematizzata l'induzione da parte dell’ ormone glucagone, che viene prodotto durante il digiuno (durante la notte in realtà produciamo più cortisolo che glucagone). Il glucagone comunica al fegato che siamo a digiuno, facendo sì che il fegato attivi le vie necessarie per mantenere la glicemia. Sono diversi i meccanismi utilizzati, ma uno di questi è l’attivazione della sintesi ex novo di glucosio, la gluconeogenesi. In questa immagine abbiamo la situazione opposta, abbiamo una condizione di iperglicemia. Per esempio, nella situazione precedente supponiamo che anziché la grigliata, abbiamo mangiato la pizza. In queste condizioni non interviene il glucagone, ma un altro ormone che è l’insulina, la quale blocca questo enzima chiave (PEPCK) perché non c’è bisogno di produrre ancora glucosio, visto che è già presente nel sangue. Il malfunzionamento di questa via è alla base di una malattia molto comune, terza causa di morte negli Stati Uniti, che è il diabete. Nel diabete il segnale insulinico per vari motivi non funziona, quindi il fegato non percepisce che fuori c’è il glucosio e quindi lo rilascia, ne sintetizza ancora di più. Questo ci dà la dimensione dell’importanza di questi meccanismi. Regolazione allosterica figura 9 Che cosa vuol dire allosterico? Il termine allosterico fa riferimento a qualunque ligando che si lega all’enzima in un sito allo, cioè distante dal sito attivo. La regolazione allosterica è molto semplice: un enzima si lega al metabolita e questo provoca l’accensione o lo spegnimento dell’enzima. Ci sono infatti due tipi di regolazione allosterica: 1. La prima, più comune (a sinistra nella figura 9), è la regolazione a feed-back. “Feedback” significa tornare indietro. La regolazione a feedback è una inibizione nella quale se una via, come per esempio la glicolisi, sta sintetizzando un componente, come l’ ATP, se l’ATP aumenta va a inibire la via che ne permette la sintesi, in modo da evitare che si accumuli troppo dato che l'esigenza è già stata colmata. Quindi si parla di feed-back quando il prodotto finale di una via metabolica va a inibire l’enzima che catalizza una fase precedente di quella via (generalmente la prima). 2. A destra vediamo un altro meccanismo di regolazione allosterica meno frequente: l’attivazione feed-forward. Questo meccanismo serve ad “anticipare” agli enzimi l’arrivo dei metaboliti; gli enzimi delle vie metaboliche lavorano a catena. La regolazione a feedback può essere spiegata perciò con questa metafora: il feed-forward equivale all’avviso da parte di un soggetto all’inizio di una catena di un qualunque lavoro rivolto a coloro che ne sono alla fine di prepararsi perché la portata in ingresso aumenterà. È come se quando ci si passa i fogli dell’esame: si danno al primo, ma se quello in fondo ha già il foglio dice al primo basta perché lo ha già. Quindi si parla di regolazione feed-forward quando un metabolita prodotto in una via metabolica va ad attivare un enzima che catalizza una fase successiva di quella stessa via. Esempio di regolazione allosterica figura 10 In questa immagine (figura 10) vediamo un enzima chiamato acetilcoA carbossilasi , che carbossila l'acetilcoA. Al di là della reazione che catalizza, è un enzima cruciale della sintesi di acidi grassi. L’ acetilcoA carbossilasi ha sia una regolazione a feedback che una regolazione feed-forward. - A feedback è inibito dagli acidi grassi, dall’acilcoA, ed è inibito perché si segnala che ci sono acidi grassi e non deve andare avanti nella sintesi - A feed-forward da parte del citrato. Il citrato è un componente che è precursore nella sintesi di lipidi, quindi se c’è tanto citrato è necessario spingere verso la sintesi e quindi c’è questa attivazione feed-forward. Modificazione covalente Il terzo livello di regolazione è la modificazione covalente, quella che nella figura 7 veniva chiamata interconversione, perché la modificazione covalente interconverte più forme di un enzima, per esempio da forma attiva a inattiva. La forma più comune di modificazione covalente è la fosforilazione. figura 11 Nella figura 11 vediamo un enzima con un gruppo OH: la fosforilazione avviene infatti a livello di amminoacidi quali serina, treonina e tirosina, che hanno gruppi OH. C’è una forma di un enzima che è cataliticamente attivo, grazie a una chinasi viene aggiunto un gruppo fosforico e viene inibito per esempio; può accadere anche il contrario: enzimi che sono inattivi vengono fosforilati e, una volta fosforilati, diventano attivi. Questo comportamento dipende dagli enzimi e dalla via metabolica. Gli enzimi che aggiungono il gruppo fosforico si chiamano proteina chinasi, gli enzimi che rimuovono il gruppo fosforico si chiamano fosfatasi. Le chinasi appartengono alla classe delle transferasi, perché trasferiscono un gruppo fosforico dall’ATP al substrato. Le fosfatasi sono invece idrolasi. figura 12 Nella figura 12 vediamo l’ acetilcoA carbossilasi, il quale è soggetto non solo a controllo allosterico ma anche a controllo da modificazione covalente. Nella forma fosforilata l’enzima è inattivo, nella forma defosforilata è attivo. Questa interconversione dipende dagli ormoni con una logica analoga a quella già considerata: l’enzima considerato è un enzima chiave per la sintesi dei lipidi; a digiuno utilizziamo i lipidi, non li sintetizziamo. Quando siamo in uno stato alimentato, invece, l’insulina promuove la fosfatasi quindi promuove la rimozione del gruppo fosforico e la sintesi di lipidi. Quando c’è insulina ci sono i precursori quindi vengono spinte le sintesi. Viceversa si ha la situazione opposta quando siamo in presenza di un aumento di AMP (quindi carenza dal punto di vista energetico) e per esempio è attivata la AMP chinasi che segnala  una carenza di energia, oppure sono presenti in circolo ormoni che segnalano una necessità di energia come il glucagone (a digiuno) oppure l’adrenalina (durante un esercizio fisico o in un momento di paura quando si sta facendo uno sforzo). L’adrenalina segnala la necessità di energia nell’immediato essenzialmente, oppure viene stimolata la chinasi e promossa la conversione nella forma attiva. La fosforilazione non è l’unica forma di modificazione covalente (figura 13). Alcuni enzimi sono regolati mediante ossidazione o riduzione dei ponti disolfuro, oppure ADP ribosilazione, metilazione. Nel nostro corso vedremo esclusivamente la fosforilazione. figura 13 Regolazione mediante proteolisi figura 14 C’è un altro modo per attivare o inibire gli enzimi: alcuni enzimi vengono attivati mediante taglio proteolitico, ovvero le serina proteasi (figura 14). Questi enzimi sono prodotti in forma inattiva perché altrimenti digerirebbero la cellula stessa che li ha prodotti, cioè vengono prodotti sotto forma di zimogeno, precursore dell’enzima, che presenta un piccolo stretch di residui che forma una specie di tappo sul sito attivo, quindi i substrati non ci possono entrare. Bisogna rimuovere questo stretch di residui, indicati in azzurro, in modo da favorire e permettere l’apertura del sito attivo e la catalisi. BIOCHIMICA II – 2° LEZIONE SBOBINATORE: ARIANNA PINTI 04/09/2022 2° ORA REVISORE: ILARIA BIGIOLI I METABOLISMI  IL CICLO DI KREBS Introduzione: le vie metaboliche La figura 1 mostra in modo semplificato le interconnessioni tra le vie metaboliche ed è utile per orientarci tra esse. Non sono indicati tutti i metaboliti e gli intermedi delle vie; le vie metaboliche sono indicate come frecce il cui colore cambia a seconda del loro ruolo: in rosa le vie cataboliche, in azzurro le vie anaboliche; la freccia circolare in viola rappresenta una via anfibolica. Il prefisso anfi si riferisce al verificarsi di due eventi contemporanei, infatti questa via metabolica è sia anabolica che catabolica; corrisponde al ciclo di Krebs. figura 2 La figura 2 illustra il motivo per cui il ciclo di Krebs è trattato come punto di partenza: anche visivamente percepiamo la rilevanza del ciclo di Krebs, tanto che i nostri occhi vengono subito attratti da questa via ciclica e soprattutto dal centro dell’immagine dove si trova l'acetil coA. Quest’ultimo è un metabolita cruciale nel senso stretto del termine, ovvero si trova all’incrocio, è un crocevia del metabolismo tra le vie anaboliche e cataboliche; non è un intermedio di tutte le vie, ma la sua formazione sta al centro del metabolismo. Rispetto alla figura 1, in cui vengono stressate le interconnessioni tra le vie metaboliche, la figura 2 dà una visione d’insieme del metabolismo diversa, che sottolinea una delle differenze tra le vie anaboliche e quelle cataboliche: le vie cataboliche sono convergenti, ovvero sebbene possono partire da nutrienti di tipo diverso – vediamo fosfolipidi e triacilglicerolo (grassi), amido, glicogeno e saccarosio (glucidi),  aminoacidi (proteine) – le varie trasformazioni alle quali vanno incontro convergono su poche molecole; una delle principali è l'acetil coA; viceversa, le vie anaboliche sono divergenti, perché a partire da precursori semplici (come l'acetil coA e altri) sintetizziamo una grande quantità di molecole. Al centro delle interconversioni c’è il ciclo di Krebs, che è una via anfibolica perchè può avere sia un ruolo catabolico che un ruolo anabolico. Per comprendere i meccanismi di catabolismo, è utile descrivere cos’è la respirazione cellulare. La respirazione cellulare Con il termine respirazione chiamiamo due processi apparentemente distinti ma in realtà correlati: il processo con cui immettiamo nel nostro organismo ossigeno ed espelliamo anidride carbonica; la respirazione cellulare, cioè tutti quei processi mediante i quali vengono ossidate le molecole di nutrienti producendo anidride carbonica e utilizzando ossigeno. Questi due processi sono correlati anche fisiologicamente: con la respirazione immettiamo ossigeno che ci serve per la respirazione cellulare e buttiamo fuori anidride carbonica prodotta dalla respirazione cellulare; in generale, la correlazione tra questi due fenomeni è che viene usato ossigeno e come prodotto di scarto si ha anidride carbonica. Una visione semplificata della respirazione cellulare permette di identificare tre fasi, che ritroveremo in tutti e tre i metabolismi che vedremo (consideriamo a parte quello dei molecole di nucleotidi). trigliceridi a 1. In una prima fase della singoli respirazione cellulare abbiamo tutti i processi in cui partenza complesse come i nutrienti vengono degradate a molecole più semplici (per esempio polisaccaridi a monosaccaridi, glicerolo e acidi grassi, proteine a amminoacidi) e questi componenti monomerici vengono catabolizzati e generano un intermedio comune che è l'acetil coA1. 2. In una seconda fase, l’acetilcoA viene ossidato completamente ad anidride carbonica nel ciclo di Krebs. L’energia chimica derivante dall’ossidazione dell'acetil coA viene conservata nella formazione dei nucleotidi ridotti, ovvero gli elettroni provenienti dall’ossidazione dell'acetil coA vengono presi dai coenzimi NAD e FAD, che si convertono rispettivamente a NADH e FADH2. 1 L'acetil coA contiene due atomi di carbonio legati al coenzima A; il termine acetil indica la presenza di due atomi di carbonio, invece metil ne indica uno, etil due, (ma volgarmente si usa il termine acetile quando è presente il gruppo carbossilico), propionil tre.  3. Nella terza e ultima fase, questo potere riducente trasportato da NADH e FADH2 viene ceduto alla catena di trasporto degli elettroni per generare ATP mediante la fosforilazione ossidativa. Origine dell’Acetil CoA figura 4 L'acetil coA è una forma attivata di acetato. (Non è necessario sapere tutta la formula, il coenzima A si può abbreviare coA). Gran parte della molecola è il coenzima A alla quale è legato il gruppo acetilico. Sebbene il coenzima A sia una molecola piuttosto complessa (contiene acido pantotenico, adenosina...) il suo sito reattivo è il gruppo tiolico SH della mercapto etanolammina, a cui si lega il gruppo acetile grazie a un legame tioestere. Ecco perché si dice che l’acetil coA è un acetato attivato: per attivato si intende sollevato energeticamente (espressione usata solo per una migliore comprensione ma non formale). L’attivazione dipende dal fatto che il legame tioestere è un legame ad alta energia: la sua energia libera di idrolisi è -31 kj per mole. La reazione indicata in figura 4 è endoergonica: il contenuto di energia dei prodotti è più alto di quello dei reagenti, quindi non può avvenire spontaneamente. Uno dei modi che la cellula utilizza per far avvenire un processo non spontaneo come questo è quello di generare una forma di substrato attivato, il che vuol dire che il substrato viene spesso preso usando l’atp, attivato aggiungendo un gruppo, inserendo un legame che aumenta la sua energia libera e che quindi lo attiva energeticamente. In questo modo, per generare lo stesso prodotto la reazione diventa esoergonica e alcune reazioni che non avverrebbero mai a partire dal substrato non attivato vengono favorite. La cellula quindi modifica il substrato spesso usando nucleotidi trifosfato e atp e lo attiva come nel caso dell’acetato attivato ad acetil coA, così da favorire le reazioni che proseguono. Nella prima reazione del ciclo di Krebs, in particolare, è importante che sia la forma attivata di substrato, l'acetil coA e non l’acetato, a reagire, altrimenti la reazione non avverrebbe. L'acetil coA, punto cruciale del metabolismo, deriva dal catabolismo di tre classi di macromolecole, che sono i lipidi, i carboidrati e gli aminoacidi, a seconda di ciò che si ha a disposizione. Un acido grasso qualsiasi va incontro ad un processo detto beta ossidazione e genera acetil coA direttamente nella matrice mitocondriale.  Un’altra fonte è il metabolismo dei glucidi. Tutti i monosaccaridi si incanalano nel metabolismo del glucosio, che grazie ad una via metabolica che è la glicolisi viene convertito in due molecole di acido piruvico, una molecola a 3 atomi di carbonio, che va incontro ad una reazione cruciale del metabolismo glucidico catalizzata dalla piruvato deidrogenasi e viene convertito in acetil coA. Le proteine che ingeriamo da legumi, formaggi, carne, vengono scisse negli amminoacidi componenti che possono essere utilizzati per produrre energia e lo scheletro carbonioso di alcuni di essi può essere convertito in acetil coA. Nella reazione della piruvico deidrogenasi il piruvato (alfa chetoacido a 3 atomi di carbonio, con gruppo acido carbossilico e accanto il gruppo chetonico) va incontro a una reazione di decarbossilazione ossidativa, in cui il piruvato viene decarbossilato perdendo un atomo di carbonio e ossidandosi. Il verificarsi di un’ossidazione è deducibile dal fatto che gli elettroni sono stati ceduti al NAD convertito in NADH e dal fatto che l’atomo di carbonio che si perde come CO2 nel piruvato è quello in posizione 1, il gruppo carbossilico. Il carbonio che era in posizione 2, passando dal piruvato all'acetil coA, si è ossidato perché l’atomo di carbonio dell'acetil coA è legato allo zolfo del coenzima A con un legame tioestere, che deriva dalla reazione tra un gruppo tiolico SH e un gruppo acido; quindi quel carbonio non è un carbonio chetonico come era nel substrato, ma è un carbonio acido perché coinvolto in un legame estere. Il ciclo di Krebs Il ciclo di Krebs è una via metabolica ciclica che avviene all’interno dei mitocondri. Essendo ciclica, è difficile individuarne il punto di partenza, ma di solito si fa partire dall'entrata dell'acetil coA e si fa finire quando termina il giro; questa però è una convenzione. Il ciclo di Krebs è una via anfibolica che ha due scopi: Lo scopo catabolico è quello di ossidare completamente i due atomi di carbonio del gruppo acetilico legato al coenzima A ad anidride carbonica. L’energia derivante da queste ossidazioni viene conservata nella sintesi di “ATP”, NADH e FADH2. Gli intermedi del ciclo di Krebs, però, hanno spesso un ruolo importantissimo come precursori biosintetici, infatti sono utilizzabili per sintetizzare prodotti utili. figura 7 Quindi non è solo un ciclo catabolico che degrada l'acetil coA, ma può anche supplire al bisogno di componenti nella cellula, come amminoacidi o il gruppo eme, grazie ai suoi intermedi. Considerando la figura 8, possiamo dire che questa via metabolica si fa iniziare normalmente dall’ingresso dell'acetil coA nel ciclo. In questa immagine vengono segnati in rosso i due atomi di carbonio dell'acetil coA. Si può notare che i due atomi di carbonio che escono con le due molecole di anidride carbonica non sono gli stessi che sono entrati con l'acetil coA. Potremmo distinguere teoricamente il ciclo in varie parti, ma normalmente le reazioni che avvengono durante questa via metabolica sono o ossidazioni o reazioni che preparano all’ossidazione (spostamento di un gruppo per farlo ossidare meglio, ad esempio), perché l’evoluzione ha favorito una via strutturata in questo modo. Gli enzimi del ciclo di Krebs sono tutti mitocondriali e si trovano tutti nella matrice mitocondriale tranne uno: la succinato deidrogenasi, che è un enzima localizzato nella membrana mitocondriale interna ed è il complesso 2 della catena di trasporto degli elettroni. Il ciclo inizia con l’ingresso dell'acetil coA che si lega all’ossalacetato. In teoria, possiamo dividere questo ciclo in due parti: 1. nella prima, abbiamo l’ingresso dell'acetil coA e l’eliminazione delle due molecole di CO2; 2. nella seconda parte abbiamo reazioni che, a partire dal succinato, permettono di rigenerare l’ossalacetato, al quale si lega l'acetil coA, per far proseguire il ciclo. Proprio essendo una via ciclica, i suoi intermedi sono presenti a basse concentrazioni nella matrice mitocondriale perché vengono continuamente rigenerati. REAZIONI DEL CICLO DI KREBS Citrato Sintasi La prima reazione è quella in cui entra l'acetil coA ed è catalizzata dalla citrato sintasi, enzima che sintetizza il citrato. La reazione è una reazione di condensazione nella quale il metile dell'acetil coA attacca il gruppo carbonilico dell’ossalacetato. È necessaria come substrato una molecola d’acqua e si genera il citrato, che è un acido tricarbossilico, tant’è che il ciclo di Krebs viene anche chiamato “ciclo dell’acido citrico” dal citrato o “ciclo degli acidi tricarbossilici” proprio per la presenza di questa molecola che è un acido tricarbossilico. Nella figura 9 vediamo il citrato in rosso, l’ossalacetato in nero. Il legame carbonio-carbonio avviene tra il carbonio metile dell'acetil coA e il carbonio carbonilico dell’ossalacetato. È una reazione irreversibile e discretamente esoergonica: non serve atp per generare un legame carbonio carbonio, quando per creare un legame ex novo tra due atomi di solito serve atp. In questo caso la reazione è così esoergonica e non viene utilizzato atp perché il legame carbonio carbonio che si forma è sostenuto energicamente dalla scissione del legame tioestere. Questo spiega il meccanismo della reazione. All’inizio, nel sito attivo dell’enzima si forma un intermedio che non è subito il citrato, ma si chiama citril coA: il carbonio metilico dell'acetil coA attacca il gruppo carbonilico dell’ossalacetato, che per meccanismi di spostamento degli elettroni diventa un gruppo COOH e si forma l’intermedio citril coA, che a questo punto viene idrolizzato in citrato più coenzima A. Per questo, nella reazione è necessario un altro reagente: la molecola d’acqua, che serve a scindere il legame tioestere del citril coA, che è ciò che traina energeticamente la reazione verso destra. Nella figura 9 a sx vediamo la reazione completa con substrati e prodotti (anche il coA è un prodotto); a dx, il meccanismo: la reazione prevede due step. 1. Nel primo passaggio avviene la condensazione vera e propria: si condensano l'acetil coA e l’ossalacetato formando un legame carbonio-carbonio (condensazione classica) quando il metile dell'acetil coA attacca il gruppo carbonilico dell’ossalacetato; si forma il citril coA semplicemente dalla condensazione dei due. 2. Successivamente, entra una molecola d’acqua che idrolizza il legame tioestere tra il coenzima A e quello che sarà il citrato. Il citril coA viene scisso mediante reazione di idrolisi a citrato più coenzima A. Tutto avviene nel sito attivo dell’enzima, sono due passaggi della reazione. La citrato sintasi è un esempio di adattamento indotto perché quando si lega l’ossalacetato e si forma il citril coA l’enzima si chiude; ciò è tipico di enzimi in cui intervengono molecole d’acqua, perché se il sito attivo restasse aperto sarebbe suscettibile di reazioni secondarie oppure il substrato potrebbe uscire, quindi l’enzima si chiude in modo che nel sito attivo avvenga solo la reazione di idrolisi del citril coA a citrato più coenzima A. L’immagine 10 mostra come cambia la conformazione: le due subunità si chiudono. Aconitasi Una volta che si è formato il citrato, interviene un enzima che si chiama aconitasi. Questa reazione è caratterizzata da un ΔG più basso rispetto alla precedente, infatti mentre quella era irreversibile questa è reversibile. È importante ricordare che questa reazione serve a spostare il gruppo OH, perché il citrato ha il gruppo OH centrale; grazie alla reazione dell’aconitasi, il gruppo OH del citrato si sposta di un atomo si carbonio e viene legato al carbonio 2 e non più al carbonio 3. Per spostare questo gruppo OH (processo apparentemente semplice), sono necessarie due diverse fasi, catalizzate dallo stesso enzima: 1. prima il citrato viene deidratato, si perde una molecola d’acqua e si forma un doppio legame tra C2 e C3. L’intermedio che si forma si chiama cis aconitato ed è un intermedio (raffigurato tra parentesi quadre, il che significa che è instabile e non si accumula nel mezzo ma prosegue nella reazione). 2. Una volta che si è formato il doppio legame, a questo doppio legame viene aggiunta una molecola d’acqua legando l’OH al carbonio 2 e l’idrogeno al carbonio 3; si riforma il legame singolo ma il risultato netto è uno spostamento del gruppo OH di un posto. Non c’è consumo netto o produzione di acqua. La reazione dell’aconitasi è una reazione reversibile che converte citrato in isocitrato; le due molecole differiscono per la posizione del gruppo OH. Ricapitolando: Il citrato deriva dall’ unione di una molecola a quattro atomi di carbonio e una a due, quindi ha sei atomi di carbonio. Il citrato è un acido tricarbossilico, quindi tre carboni saranno gruppi carbossilici. Ci sono quindi tre atomi di carbonio e altri tre a fianco, come fosse tridentato; da un lato abbiamo tre gruppi carbossilici, dall’altra gruppi metilenici e il gruppo funzionale ossidrile che nel citrato si trova al centro. La posizione di questo gruppo OH, però, non è funzionale per il ciclo di Krebs, perché il ciclo non andrebbe avanti se restasse lì. È necessario come prima reazione spostare il gruppo OH tra il carbonio 3 e il carbonio 2. Per questo, è necessario un percorso che passa da due diverse reazioni: prima, una reazione di deidratazione nella quale si forma un doppio legame tra c2 e c3, con perdita di una molecola d’acqua e formazione dell’intermedio instabile cisaconitato, che successivamente subisce una reazione di reidratazione e si converte in isocitrato perché il gruppo oh viene aggiunto al carbonio 2. La reazione è reversibile, quindi se il ciclo procede e l’isocitrato procede nel ciclo, la reazione procede verso destra. Un modo di regolazione della via metabolica è il flusso dei substrati, la disponibilità dei metaboliti, quindi se l’ isocitrato viene via via consumato nel ciclo di Krebs e prosegue, la reazione prosegue verso destra, ma se l’isocitrato si accumula la reazione reversibile conduce non dal citrato all’isocitrato , ma dall’ isocitrato indietro verso il citrato. Questo è un punto importante nella sintesi dei lipidi. L'aconitasi è un esempio di catalisi da ioni metallici. Dato che il substrato e il prodotto hanno tre gruppi carbossilici, al sito attivo è presente un centro ferro zolfo che ne permette la stabilizzazione. L’aconitasi è anche un enzima moonlighting, ovvero svolge anche un altro ruolo nel metabolismo del ferro. BIOCHIMICA II – 3^ LEZIONE SBOBINATORE: GABRIELE MANCINELLI 06/10/2022 1° ORA REVISORE: GIULIA MANZO CICLO DI KREBS Nelle lezioni trattate fino ad ora è stato affrontato come inizia il ciclo di Krebs. La prima reazione vede l’ingresso di Acetil-CoA e la sua condensazione con l’ossalacetato. la professoressa pone particolare attenzione sull’ossalacetato poiché l’acetil-CoA per entrare nel ciclo ha bisogno di questa molecola. Una volta ottenuto il citrato (acido tricarbossilico), avviene la seconda reazione catalizzata dall’aconitasi. L’effetto finale visibile e macroscopico della reazione è lo spostamento del gruppo - OH. Quest’ultima prevede una deidratazione che forma il cis-aconitato, costituito da un doppio legame, e una reidratazione con il gruppo ossidrilico inserito all’interno della molecola dell’isocitrato. L’isomerizzazione, catalizzata dall’aconitasi, è prodromica alla reazione successiva, catalizzata dall’enzima Isocitrato deidrogenasi (il nome di questo enzima ci anticipa che tale reazione è una ossidoriduzione). TERZA REAZIONE - DECARBOSSILAZIONE OSSIDATIVA - Isocitrato deidrogenasi Questa reazione è irreversibile e prevede una decarbossilazione e un’ossidazione. Figura 1 La prima tappa prevede l’ossidazione del carbonio 2 della molecola di isocitrato al quale si lega l’ossidrile. Questo carbonio alcolico si ossida e diventa un carbonio chetonico. Inoltre, gli elettroni liberati da questa ossidazione vengono ceduti al NAD che si riduce a NADH. Il coenzima può anche essere NADP poichè risulta un’isoforma citosolica esistente, ma quando si parla di ciclo di Krebs il coenzima che si riduce è NAD. L’ossidazione del carbonio 2 e la stabilizzazione dell’intermedio da parte degli ioni manganese promuovono la decarbossilazione. Si ha la formazione di un intermedio instabile che si riarrangia ad α-chetoglutarato. In questo passaggio abbiamo prodotto la prima molecola di NADH, abbiamo eliminato il primo atomo di carbonio sotto forma di CO2 e prodotto un α-chetoacido a 5 atomi di carbonio (α-chetoglutarato). Siamo passati da 6 atomi di carbonio (citrato, isocitrato) a 5 con la prima decarbossilazione. L’isocitrato deidrogenasi catalizza la prima decarbossilazione ossidativa irreversibile ed è un enzima finemente regolato da vari effettori allosterici che influenzano l’interconversione tra una forma tetramerica attiva e una forma dimerica inattiva. (vedi Figura2 ) Gli effettori allosterici ATP e NADH favoriscono la forma dimerica dell’enzima e quindi lo inibiscono: se stiamo usando il ciclo in senso catabolico ma nei mitocondri le concentrazioni di NADH e ATP sono alte, il ciclo deve essere fermato o rallentato. Riferimento all'esempio dei vasi comunicanti Le reazioni reversibili non hanno valvole l’una rispetto all’altra, quindi, il flusso cambia a seconda dei livelli reciproci di reagenti e prodotti. Le reazioni regolate, quelle catalizzate dagli enzimi chiave, sono modulate con delle valvole gestite da regolatori esterni. In questo caso la valvola dell’isocitrato deidrogenasi è chiusa quando i livelli di NADH e ATP sono elevati. Viceversa rapporti NADH/NAD bassi e concentrazioni di ADP elevate favoriscono l’attivazione dell’enzima. Se si osserva la Figura 3 a fianco, la reazione presa in considerazione e si ripensa alla metafora dei vasi comunicanti si capisce come mai, quando ci sono elevati livelli di NADH nel mitocondrio, o una carica energetica molto elevata, si accumula citrato. Se i livelli di questi effettori sono elevati, l’isocitrato deidrogenasi viene inibita, l’inibizione corrisponde alla chiusura della valvola, di conseguenza aumenteranno i livelli di isocitrato (substrato dell’enzima che non viene consumato). L’accumulo di isocitrato porta dunque l’enzima aconitasi, che catalizza una reazione reversibile, ad invertire la reazione riproducendo citrato. Ecco perchè ci sono condizioni nelle quali, quando all’interno del mitocondrio si accumula NADH, aumentano i livelli di citrato. Le conseguenze di questo aumento verranno affrontate in seguito. Viene anticipato che il citrato è un intermedio del ciclo di Krebs, precursore della sintesi dei lipidi accumulati nel tessuto adiposo. QUARTA REAZIONE - DECARBOSSILAZIONE OSSIDATIVA - Complesso α-chetoglutarato deidrogenasi L’α-chetoglutarato in questa reazione va incontro ad un’altra decarbossilazione ossidativa (Figura 4), ne consegue che si otterrà un’altra molecola di CO2 con diminuzione di un altro atomo di carbonio nella molecola prodotta. Inoltre, una nuova molecola di NADH accumulerà il potere riducente di tutta la reazione. Rispetto alla reazione precedente cambia, però, il meccanismo. Dall’α-chetoglutarato viene eliminata una molecola di CO2 e viene ossidato il carbonio 2, passando così da un carbonio chetonico ad un tioestere (derivato da un acido). Otteniamo il succinil-CoA (rientra il coenzima-A). Tale reazione è catalizzata dal complesso dell’α-chetoglutarato deidrogenasi, un complesso enzimatico formato da 3 enzimi differenti. Viene inserito questo schema trattato nel corso di Biochimica I perché il meccanismo che segue il complesso dell’α-chetoglutarato deidrogenasi è del tutto analogo all’azione del complesso della piruvato deidrogenasi. La reazione prevede vari step: 1. Intervento della tiamina pirofosfato che fa avvenire la decarbossilazione; 2. L’ipoammidetransuccinilasi fa avvenire l’ossidazione formando il succinil-CoA; 3. Ripristino dell’ipoammide nella sua forma ridotta. (questo meccanismo verrà affrontato con il complesso piruvato deidrogenasi). L’energia chimica di questa ossidoriduzione viene in parte utilizzata per ridurre una seconda molecola di NAD+ e in parte viene conservata nel legame tioestere del succinil-CoA, legame ad alta energia. La presenza di questo legame risulta cruciale per la reazione successiva. QUINTA REAZIONE - FOSFORILAZIONE A LIVELLO DEL SUBSTRATO - Succinil-CoA sintetasi In questa reazione (Figura 5) la presenza del legame tioestere ad alta energia del succinil-CoA viene sfruttata dall’enzima succinil-CoA sintetasi, il quale scinde il legame tioestere utilizzando l’energia prodotta per sintetizzare una molecola di GTP a partire da GDP + Pi. Questa è la prima reazione di fosforilazione a livello del substrato che incontriamo. La reazione non ha un ΔG particolarmente negativo, pertanto viene considerata reversibile. Il meccanismo di questa reazione è il seguente: (Figura 6) viene mostrato il succinil-CoA e un residuo di Istidina coinvolto nella catalisi del sito attivo dell’enzima. Nel primo passaggio della reazione si scinde il legame tioestere e si forma un legame anidridico con un fosfato inorganico (sostituisce il gruppo tiolico del coenzima-A), ottenendo così un intermedio ad alta energia: il succinil-fosfato (anidride mista). Se fosse stato un legame fosfoestere l’energia si sarebbe dissipata. Nel secondo passaggio il succinil-fosfato contenente un gruppo fosfato ad alta energia si trasforma in succinato, generando una molecola di GTP. Nella Figura 7 viene rappresentato il residuo di istidina importante per la catalisi, il substrato (il gruppo fosfato) è stabilizzato dai dipoli di due alfa eliche. Nella reazione la specificità di substrato dell’enzima è tale per cui si può formare solo GTP (non ATP). Analizzando la resa energetica del ciclo, però, il GTP viene considerato come se fosse una molecola di ATP: questo perché all’interno delle cellule esiste un enzima chiamato Nucleoside difosfato chinasi, il quale è in grado di interconvertire ATP e GTP trasferendo un gruppo Pi (quando la reazione è all’equilibrio e ΔG°’ = 0). Il ΔG°’ di tale reazione è uguale a 0 poiché scindo e allo stesso tempo ricreo una stessa tipologia di legame (fosfoanidridico). A questo punto abbiamo completamente ossidato l’acetil-CoA a CO2 ed ottenuto il Succinato a 4 atomi di carbonio. L’altra metà delle reazioni del ciclo di Krebs ha lo scopo di ripristinare l’ossalacetato. Il primo enzima ad iniziare questo processo è la succinato deidrogenasi SESTA REAZIONE - DEIDROGENAZIONE - Succinato deidrogenasi La succinato deidrogenasi ossida il succinato a fumarato, si forma un doppio legame tra C2 e C3 e gli elettroni vengono ceduti al FAD (diventa per riduzione FADH2). In questo caso il coenzima utilizzato è il FAD perché il potere riducente derivante da un’ossidazione in cui si forma un doppio legame non è sufficiente a ridurre una molecola di NAD+, quindi gli elettroni vengono ceduti ad un trasportatore che ha un potenziale di riduzione più basso. La professoressa sottolinea che questo enzima è già stato studiato nel corso precedente, sottolineando però che è l’unico del ciclo di Krebs associato alla membrana mitocondriale interna e in cui avviene una reazione di ossidoriduzione che genera FADH2. Questo coenzima a differenza degli altri è strettamente associato al suo enzima e per questo motivo ossida direttamente a FAD+ cedendo gli elettroni alla catena respiratoria e al coenzima Q. DOMANDA DELLA PROF: “Cos’è che contraddistingue il complesso II da tutti gli altri?” RISPOSTA: "E’ l'unico complesso che non trasporta protoni, di conseguenza la resa energetica del FADH2 è minore rispetto a quella del NADH” SETTIMA REAZIONE - IDRATAZIONE - Fumarasi Sul fumarato agisce l’enzima fumarasi per produrre L-malato. In questa reazione il fumarato come unico reagente non basta, occorre infatti una molecola di acqua che viene utilizzata per effettuare un’addizione al doppio legame (non è una reazione di idrolisi). Questo meccanismo è analogo alla reazione catalizzata dall’aconitasi: deidratazione e addizione al doppio legame. La fumarasi quindi è una liasi e genera L-malato. In questo caso viene specificato lo stereoisomero L perchè è un’addizione stereospecifica che avviene solo in un senso e formando solo lo stereoisomero L. OTTAVA REAZIONE - DEIDROGENAZIONE - Malato deidrogenasi Nell’ultima reazione del ciclo di Krebs interviene un’altra deidrogenasi, la malato deidrogenasi: essa funziona solo sullo stereoisomero L del malato, che viene ossidato rigenerando ossalacetato. Le ultime reazioni del ciclo di Krebs, che comprendono i composti dal succinato a ossalacetato, sono reazioni più semplici rispetto alla prima fase del ciclo. Riassumendo, dal succinato si genera un doppio legame, il quale viene idratato andando a formare L- malato ed infine avviene un’ossidazione in cui il gruppo alcolico in posizione 2 si ossida e diventa un gruppo chetonico. Questa reazione ha un ΔG°’ maggiore di zero (NB Figura 10), quindi, termodinamicamente risulta endoergonica. In realtà la reazione procede ugualmente verso destra. Come precedentemente affrontato, in questo caso si considera il ΔG°’ reale della reazione: sebbene di per sé questa reazione risulti endoergonica, l’equilibrio è spostato verso la sintesi di ossalacetato perché viene continuamente consumato. La malato deidrogenasi esiste in 2 forme isoenzimatiche: una mitocondriale e una citosolica, già incontrate negli shuttle. Il ruolo del ciclo di Krebs Questa via metabolica è una via anfibolica i cui ruoli sono attuati in modo diverso a seconda del tessuto e/o della condizione metabolica. Quando sarà affrontato il metabolismo tissutale si osserverà come le stesse reazioni hanno un ruolo completamente diverso a seconda del tessuto. Ruolo Catabolico Il ciclo di Krebs serve ad ossidare completamente acetil-CoA ad anidride carbonica. L’acetil-CoA all’interno di cellule del sistema nervoso serve ad ossidare completamente il glucosio ad anidride carbonica per ricavare ATP, necessario al funzionamento dei neuroni: questo è un esempio in cui si evidenzia il ruolo catabolico del ciclo. Per ogni molecola di acetil-CoA che entra nel ciclo ottengo: 2 molecole di CO2 3 molecole di NADH 1 molecola di FADH2 1 molecola di GTP/ATP Se il ciclo ha uno scopo catabolico, le tre molecole di NADH e la molecola di FADH2 cederanno i loro elettroni alla catena respiratoria generando 7,5 molecole di ATP dal NADH, 1,5 molecole di ATP dal FADH2 per un totale di 10 molecole di ATP considerando la molecola di ATP ottenuta dalla fosforilazione del substrato. Questo avviene nel tessuto nervoso anche durante la veglia, nel tessuto muscolare scheletrico, durante un lavoro aerobico (prolungato a bassa intensità), e nel tessuto muscolare cardiaco. Ruolo Anabolico Gli intermedi del ciclo sono utilizzati come molecole di partenza per la biosintesi. (Immagine a fianco) Precursori del Glucosio → A partire dall’ossalacetato i tessuti che compiono la gluconeogenesi (fegato e rene) possono sintetizzare glucosio. Porfirine → Classe di molecole presenti nei gruppi eme che possono essere sintetizzate a partire dalla molecola di succinil-CoA. Amminoacidi → L’α-chetoglutarato si converte in glutammato, l’ossalacetato in aspartato. Acidi grassi e isoprenoidi → Quando ci si trova in una situazione di elevati livelli di ATP o di NADH (es. dopo un pasto), la reazione dell’isocitrato deidrogenasi si blocca portando  all'accumulo di citrato che viene trasportato dai mitocondri al citosol e utilizzato per la sintesi di acidi grassi e triacilgliceroli. Gli intermedi del ciclo di Krebs non sono presenti ad elevate concentrazioni all’interno della cellula. Solitamente vengono tenuti a concentrazioni piuttosto basse perché si rigenerano continuamente. Esistono alcune condizioni nelle quali questi intermedi possono essere consumati e quindi il metabolismo reagisce rigenerandoli. Le reazioni che sottraggono intermedi al ciclo di Krebs per fini biosintetici vengono chiamate reazioni cataplerotiche (es. la sintesi di ossalacetato in aspartato) Le cellule hanno varie modalità (principalmente una) per ripristinare i giusti livelli di concentrazione degli intermedi sottratti per le reazioni anaboliche. Queste reazioni che permettono la sintesi degli intermedi vengono chiamate reazioni anaplerotiche. Non tutte le reazioni mostrate in tabella sono disponibili per l’uomo. La reazione anaplerotica per eccellenza nel metabolismo umano è la reazione della piruvato carbossilasi. Questo enzima, a partire da piruvato (3 atomi di C), aggiunge un atomo di carbonio sotto forma di anidride carbonica producendo ossalacetato (4 atomi di C). Il meccanismo di questo enzima è un meccanismo dipendente da biotina (già affrontato). E’ importante sottolineare che questo enzima biotina-dipendente necessità di ATP per il suo funzionamento: la molecola di ATP negli enzimi biotina-dipendenti serve per attivare la CO2 producendo l’intermedio attivo Carbossi-fosfato, che trasferito sul coenzima genera carbossi-biotina. A questo punto la carbossi-biotina è in grado di carbossilare il piruvato generando ossalacetato. L’ATP non viene idrolizzato ma la reazione è sostenuta dall’energia libera proveniente dall’ATP. La piruvato carbossilasi è soggetta ad una regolazione ed è attivata dall’acetil-CoA. Se in un mitocondrio l’acetil-CoA raggiunge alte concentrazioni la sintesi di ossalacetato deve essere promossa poiché alla cellula occorre la molecola a cui legare l’acetil-CoA in eccesso. Questo avviene ad esempio nel fegato in condizioni di iperglicemia dopo un pasto ricco di carboidrati.  La Figura 11 mostra i principali punti di regolazione del ciclo di krebs. Disponibilità di substrati: La reazione dell’aconitasi non è regolata da un modulatore allosterico bensì dalle concentrazioni stesse dei reagenti o dei prodotti e quindi dei substrati di questo enzima. Se è presente molto citrato l'enzima viene stimolato a produrre isocitrato e viceversa. Regolazioni a feed-back da parte dei prodotti: questo tipo di regolazione viene esercitata nei punti in cui le reazioni sono reversibili. Questo permette di regolare l'attività di quell’enzima che determina l’eventuale continuazione del ciclo. Questi punti di controllo sono regolati da due importanti rapporti: - Rapporto NADH/NAD, inibisce isocitrato deidrogenasi; - Rapporto ATP/ADP, inibisce isocitrato deidrogenasi e α- chetoglutarato deidrogenasi; Regolazione da parte di ioni Calcio e AMP: quando nella regolazione intervengono queste molecole parliamo di attività metabolica del tessuto muscolare: alte concentrazioni di calcio, impegnato nel processo di contrazione, e alte concentrazioni di AMP segnalano alle cellule muscolari la necessità di ATP. Parliamo di adenosina monofosfato poiché nel muscolo è particolarmente attivo un enzima: l’adenilato chinasi, esso recupera da 2 molecole di ADP una molecola di ATP e una di AMP. Questo è un segnale molto forte della bassa carica energetica. Diapositiva fuori dal programma d’esame. Alcuni intermedi del ciclo hanno un ruolo importante in varie patologie, al di là delle patologie per deficit o eccessi metabolici. L’ itaconato è una molecola importante nella modulazione della risposta immunitaria e viene prodotto a partire dal cis-aconitato (intermedio dell’interconverisione tra citrato e isocitrato). Un altro esempio è L2-idrossiglutammato, un intermedio che si forma a partire dall’α-chetoglutarato e sembra essere importante per la genesi dei tumori. L’osservazione riguardo all’argomento verge sull’evoluzione della medicina che negli anni ha fondato la pratica diagnostica sempre più sulla ricerca molecolare che accompagnata alla vecchia ricerca morfologica della malattia rende sempre più specifico e funzionale il percorso diagnostico. BIOCHIMICA II – 3^ LEZIONE SBOBINATORE: GIULIA MANZO 06/10/2022 2° ORA REVISORE: GABRIELE MANCINELLI METABOLISMO DELLE MACROMOLECOLE Nota del corso Durante il corso verranno trattati: Il metabolismo glucidico Il metabolismo lipidico Il metabolismo degli amminoacidi Il metabolismo dei nucleotidi (in minor parte) Anche se il programma del corso di Biochimica II non comprende le strutture delle macromolecole, in quanto già studiate con il corso di Biochimica I, queste verranno brevemente ripassate. METABOLISMO GLUCIDICO I carboidrati I Carboidrati sono le molecole più abbondanti in natura e rappresentano la base della dieta di moltissime culture, in particolar modo di quella mediterranea dove dai carboidrati provengono circa il 60% delle calorie totali. Dal punto di vista chimico i carboidrati sono aldeidi o chetoni poliossidrilici: presentano un gruppo aldeidico o chetonico ed un numero variabile di atomi di carbonio, ai quali sono legati gruppi ossidrilici. Possono essere classificati in base al numero/residui di unità saccaridiche (sia per i carboidrati che per le proteine si usa anche il termine “residui” in quanto durante le reazioni di condensazione per la loro sintesi si elimina una molecola di acqua). In base a questa divisione si hanno monosaccaridi oppure disaccaridi ed oligosaccaridi (questi ultimi hanno meno di 10 residui), nelle quali più unità saccaridiche sono unite tra loro da legami glicosidici. I polisaccaridi sono catene molto lunghe (da 10 a migliaia di residui). Monosaccaridi Dal punto di vista della stereochimica i monosaccaridi più diffusi appartengono alla serie D e chimicamente hanno 2 capostipiti: la gliceraldeide, precursore degli aldosi (ad esempio il glucosio) e diidrossiacetone, precursore dei chetosi (ad esempio il fruttosio). Ribosio e desossiribosio sono aldosi a 5 atomi di carbonio, costituenti degli acidi nucleici. I monosaccaridi possono quindi essere classificati: In base alla presenza di un gruppo aldeidico o chetonico (aldosi, chetosi)  In base al numero di atomi di carbonio (triosi, tetrosi, pentosi, esosi ecc.) Riguardo la loro stereochimica, esistono monosaccaridi correlati dalla stessa formula bruta e di struttura, eccetto che per la configurazione attorno ad un atomo di carbonio: quando ciò avviene i due monosaccaridi sono epimeri. Il glucosio, ad esempio, ha 2 epimeri: Mannosio → epimero in C2 (gruppo -OH a sinistra del C, nel glucosio si trova a destra) Galattosio → epimero in C4 (gruppo -OH a sinistra del C). Questo è uno dei componenti del lattosio, di cui ne sarà studiato il metabolismo; la presenza del gruppo -OH in una diversa configurazione implica anche una diversa posizione, sopra o sotto, il piano dell’anello. Sia questa differenza che la possibile interconversione dei due epimeri sono importanti nel metabolismo. Oltre alle formule di struttura aperte dei monosaccaridi, sono presenti le forme cicliche, nelle quali i monosaccaridi con più di 4 atomi di carbonio si presentano in soluzione. Glucosio in forma ciclica → glucopiranosio Fruttosio in forma ciclica → fruttofuranosio Come avviene la ciclizzazione? Prendendo in considerazione il glucosio è importante ricordare che la forma ciclica, che presenta il carbonio anomerico, è in equilibrio con la forma aperta, che presenta il carbonio aldeidico. Ciò è importante per alcuni aspetti metabolici. Durante la ciclizzazione del glucosio avviene l’attacco del gruppo OH (in posizione 5) sul carbonio carbonilico (in posizione 1) a formare un emiacetale; si ottiene una struttura ciclica in cui il carbonio a cui è legato il gruppo OH deriva da un carbonio aldeidico. Con il fruttosio avviene un processo analogo in cui il carbonio in posizione 5 attacca il carbonio in posizione 2: per questo la struttura ciclica più comune del fruttosio è a 5 atomi. La ciclizzazione dei monosaccaridi fa sì che a partire da quello che era il carbonio carbonilico (aldeidico nel glucosio e chetonico nel fruttosio) si possano avere 2 diverse configurazioni e forme anomeriche: alfa (con gruppo -OH al di sotto del piano dell’anello) beta (con gruppo -OH al di sopra del piano dell’anello) Ciò è importante in quanto determina il tipo di legame glicosidico a valle nella formazione di oligoo poli- saccaridi. Figura 4: derivati del glucosio e fruttosio più comuni, in azzurro esteri