Appunti di Biochimica 2 PDF

ENZIMI 1. Sono i catalizzatori delle reazioni biochimiche nelle cellule di tutti gli organismo viventi 2. La gran parte degli enzimi sono proteine globulari (caratterizzate strutturalmente diverse combinazioni di eliche-α, foglietti-β e regioni ad ansa). 3. Gli enzimi legano transitoriamente i...

ENZIMI 1. Sono i catalizzatori delle reazioni biochimiche nelle cellule di tutti gli organismo viventi 2. La gran parte degli enzimi sono proteine globulari (caratterizzate strutturalmente diverse combinazioni di eliche-α, foglietti-β e regioni ad ansa). 3. Gli enzimi legano transitoriamente il/i substrato/i (reagente) mediante interazioni non covalenti (legami idrogeno, interazioni di London, interazioni ioniche) formando il complesso enzima-substrato (ES) e promuovono la trasformazione del substrato in prodotto. 4. La regione dell’enzima che lega il substrato e che catalizza la trasformazione del substrato in prodotto di reazione (attraverso la rottura e formazione di nuovi legami chimici) viene denominato sito attivo. 5. Gli amminoacidi localizzati nel sito attivo sono denominati gruppi catalitici. 6. Il sito attivo rappresenta una porzione relativamente piccola del volume totale di un enzima. La maggior parte degli amminoacidi di un enzima hanno funzione strutturale e contribuiscono a mantenere gli amminoacidi del sito attivo nel corretto orientamento. 7. La specificità di un enzima (la capacità di discriminare tra il substrato e molecole simili) dipende dalla disposizione degli atomi degli amminoacidi del sito attivo perché substrato e sito attivo sono geometricamente ed elettricamente complementari. La velocità di una reazione chimica corrisponde alla variazione della concentrazione dei reagenti o dei prodotti di una reazione chimica in un intervallo di tempo dt. La velocità di scomparsa dei reagenti nel tempo (t) è descritta dalla espressione regenti V =− t La velocità di formazione dei prodotti nel tempo (t) è descritta dalla espressione  prodotti  V= t Equazione cinetica La espressione matematica che mette in relazione la velocità di reazione con la concentrazione dei reagenti prende il nome di equazione cinetica Data una generica reazione monomolecolare aA bB la equazione cinetica e ha la forma v = k [A]n Nel caso di una generica reazione bimolecolare aA + bB cC + dD l’equazione cinetica e ha la forma v = k [A]n[B]m Dove: k è una costante di proporzionalità denominata costante di velocità, è specifica Il valore di k e l’ordine di reazione devono essere determinati di ogni reazione. Il valore di k varia con la T. Il valore di k non varia nel corso di sperimentalmente, non possono una reazione a T costante. essere dedotti dalla stechiometria [A] e [B] sono le concentrazioni (moli/L) dei reagenti della reazione. gli esponenti (n e m) sono l’ordine di reazione (0, 1, 2).  Gli enzimi aumentano la velocità di una reazione chimica poiché aumentano il valore della costante di velocità k. v = k [A]n[B]m k = Ae −EaRT L’azione degli enzimi su k si esplica in due punti: 1. sul valore di Ea che diminuisce; 2. sul valore del fattore correttivo sterico A che aumenta. Teoria dello stato di transizione Secondo la teoria dello stato di transizione, affinché una reazione chimica possa avere luogo è necessario che le molecole dei reagenti entrino in contatto e diano origine a una entità intermedia di breve emivita e di elevata energia potenziale, denominata complesso attivato o stato di transizione ( ). La teoria dello stato di transizione costituisce una estensione alle fasi condensate della teoria delle collisioni di Arrhenius che si applica alle reazioni in fase gassosa. La differenza fra l'energia potenziale dei reagenti e l'energia potenziale dello stato di transizione prende il nome di energia di attivazione (Ea) o ΔG (sempre > 0). Fra le cause dell’aumento della energia potenziale del complesso attivato vi è 1. la desolvatazione del substrato; 2. rottura dei legami covalenti del substrato. La formazione dello stato di transizione costituisce lo stadio endoergonico di una reazione (catalizzata o no). stato di transizione , Joule Lo stadio esoergonico costituisce la seconda fase di una reazione. In questa fase la formazione dei nuovi legami covalenti dei prodotti di reazione determina la diminuzione dell’energia reagente potenziale rispetto allo stato di transizione. prodotto Meccanismo d’azione degli enzimi 1. Gli enzimi riconoscono e legano i substrati (termine biochimico per reagenti) e formano con essi un complesso (ES) nel quale le molecole di substrato vengono orientate favorevolmente per la formazione dello stato di transizione della reazione (o complesso attivato). 2. Azione sulle energia di attivazione (ΔG /Ea) Gli enzimi diminuiscono l’energia di attivazione delle reazioni che catalizzano attraverso la formazione di legami non covalenti (London / van der Waals) con il complesso attivato. La formazione di questi legami ΔG° porta al rilascio di energia termica e alla stabilizzazione del complesso attivato (diminuisce la energia potenziale) La conseguenza di queste azioni è che un numero maggiore di molecole di substrato viene a possedere una energia sufficiente per raggiungere lo stato di transizione (rispetto a una reazione non catalizzata alla stessa T). Breve commento alle due figure riportate La variazione di energia libera standard di reazione (ΔG°) è un indice della spontaneità di una reazione e permette di calcolare la di Keq (costante di equilibrio) di una reazione. Quando ΔG° < 0, la reazione è spontanea con la trasformazione dei reagenti (substrati) in prodotti (Keq >1). ΔG° non fornisce nessuna informazione sulla velocità della reazione. La velocità di reazione dipende dalla energia libera di attivazione ΔG che è indipendente da ΔG°. Gli enzimi diminuiscono il valore di ΔG‡ ma non modificano il valore di ΔG° e quindi non modificano l’equilibrio di reazione. Gli enzimi sono classificati in base alle caratteristiche della reazione che catalizzano 1. Ossidoreduttasi deidrogenasi (trasferimento di ioni idruro (H─) o atomi di H). ossidasi ossigenasi idrossilasi 2. Transferasi trasferimento di gruppi funzionali chinasi glicosiltransferasi aciltransferasi amminotransferasi 3. Idrolasi reazioni di idrolisi di legami C-O, C-N, C-S 4. Liasi addizione di gruppi a doppi legami o viceversa formazione di doppi legami per rimozione di gruppi (es. Fruttosio 1,6-bisfosfato aldolasi) 5. Isomerasi formazione di isomeri attraverso il trasferimento di gruppi isomerasi catalizzano riarrangiamenti nella struttura dei legami mutasi enzimi che catalizzano lo spostamento di gruppi fosfato fra due atomi di una molecola 6. Ligasi formazione di legami C-C, C-O, C-N e C-S attraverso reazioni di condensazione accoppiate alla scissione di ATP (es. GLN-sintasi; ASN-sintasi; argininosuccinato sintasi; piruvato carbossilasi; acetil-CoA carbossilasi; propionil-Coa carbossilasi) La attività catalitica di numerosi enzimi dipende dalla presenza di componenti chimici di natura non proteica di piccola massa (in rapporto a quella dell’enzima) denominati cofattori. I cofattori si distinguono in: coenzimi (molecole organiche di piccole dimensioni molte delle quali derivate da vitamine) ioni metallici Coenzimi: tiamina pirofosfato FAD FMN NAD+ ioni metallici: NADP+ Zn++ pirodossalfosfato (PLP) Mg++ coenzima A (CoA) Mn++ biotina Cu++ tetraidrfolato (THF) Fe++ coenzima B12 K+ Quando il cofattore è stabilmente legato all’enzima viene definito gruppo prostetico (es FAD, FMN, PLP, biotina, ioni metallici) MECCANISMI CATALITICI Successivamente alla formazione del complesso ES gli enzimi possono utilizzare combinazioni di diversi meccanismi catalitici per facilitare la rottura e la formazione di nuovi legami. 1. Catalisi acido base Il trasferimento di un protone dall’enzima al substrato (catalisi acida generale) oppure la sottrazione di un protone al substrato (catalisi basica generale). Le catene laterali degli amminoacidi ionizzabili Asp, Glu, His, Ser, Cys, Tyr, Arg e Lys nel sito attivo di un enzima possono svolgere la funzione di accettore o donatore di protoni. 2. Catalisi covalente Formazione di un legame covalente transitorio fra l’enzima e il substrato. Tale legame si forma quando un gruppo nucleofilo dell’enzima (catene laterali di Asp, Glu, His, Ser, Arg, Lys e Tyr) un gruppo elettrofilo del substrato formando un legame covalente. Il legame covalente fra enzima e substrato attiva il substrato e promuove la reazione. Al termine della reazione i complessi covalenti vengono allontanati dall’enzima con rigenerazione dell’enzima libero. 3. Catalisi da ioni metallici Numerosi enzimi (circa 1/3) richiedono la presenza di ioni metallici per la loro attività. Nei mammiferi gli ioni più frequentemente utilizzati dal punto di vista catalitico sono quelli dei metalli di transizione (Cu 2+, Mn2+, Zn2+, Co2+) che formano complessi di coordinazione con la proteina. I metalli delle serie principali (Ca 2+, Mg2+, Na+ e K+) svolgono prevalentemente ruoli strutturali (a parte Mg2+ che svolge importanti ruoli catalitici) Gli ioni metallici partecipano ai meccanismi catalitici svolgendo molteplici ruoli: 1. legame e orientamento dei substrati 2. stabilizzazione di cariche di segno opposto. Regolazione della attività enzimatica La attività degli enzimi (la velocità con la quale un enzima catalizza una reazione) è regolata da numerosi fattori: concentrazione del substrato (e cofattori): tutti gli enzimi di tutti gli organismi viventi rispondono a una variazione della concentrazione di substrato modificando la velocità di catalisi. Due equazioni matematiche descrivono la variazione della velocità di una reazione enzimatica in funzione della concentrazione di substrato: la equazione di Michaelis-Menten (descrive il comportamento della maggior parte degli enzimi) e la equazione di Hill (enzimi soggetti a regolazione allosterica). modificazioni covalenti promosse da ormoni e fattori di crescita: negli organismi multicellulari più complessi (mammiferi ma non solo) gli enzimi sono soggetti a regolazione da parte di segnali extracellulari: ormoni e fattori di crescita. Gli ormoni sono in grado di modificare lo stato di fosforilazione di alcuni enzimi (denominati enzimi di regolazione) e attraverso questi la velocità di intere vie metaboliche (es. glicolisi, gluconeogenesi, glicogeno sintesi, glicogenolisi, sintesi acido grasso, sintesi colesterolo). inibitori - farmaci pH temperatura Effetto dalla concentrazione di substrato sulla attività enzimatica Enzimi a substrato singolo non soggetti a regolazione allosterica A→B se si riporta in un piano cartesiano il valore della velocità iniziale di una reazione (V0) catalizzata da un enzima in funzione della concentrazione del suo substrato si ricava una curva iperbolica (iperbole rettangolare) L’espressione matematica che descrive l’andamento iperbolico della velocità iniziale di reazione in funzione della concentrazione di substrato è la equazione di Michaelis-Menten 𝑆 𝑉0 = 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝐾𝑀 + 𝑆 corrisponde a una equazione generica 𝑎× 𝑥 𝑦= 𝑏+𝑥 𝑦 = 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑒 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑛𝑑𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑥 = 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑒 𝑖𝑛𝑑𝑖𝑝𝑒𝑛𝑑𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎 = 𝑎𝑠𝑖𝑛𝑡𝑜𝑡𝑒 𝑏 = 𝑝𝑎𝑟𝑎𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑐ℎ𝑒 𝑑𝑒𝑓𝑖𝑛𝑖𝑠𝑐𝑒 𝑙𝑎 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑡à 𝑑𝑖 𝑎𝑣𝑣𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑎𝑙𝑙′ 𝑎𝑠𝑖𝑛𝑡𝑜𝑡𝑒  quando la concentrazione del substrato è inferiore alla KM, [S] < KM la maggior parte degli enzimi sono in forma libera, non legati al substrato; la velocità iniziale di reazione aumenta linearmente con l’aumento della concentrazione del substrato (la reazione è di ordine 1) perché con l’aumentare della concentrazione di substrato aumenta la frazione di enzimi legati al substrato e quindi in grado si catalizzare la reazione; quando la concentrazione del substrato è maggiore della KM, [S] > KM la frazione degli enzimi legati al substrato diviene predominante; la velocità di reazione diviene progressivamente indipendente dalla concentrazione di substrato; quando [S] >> KM tutti gli enzimi sono legati al substrato (sono saturati dal substrato): V0 = Vmax (la reazione è di ordine 0) ulteriori aumenti della concentrazione di substrato non determinano alcuna variazione della velocità di reazione. V0 = velocità iniziale di reazione (𝒎𝒐𝒍𝒊 × 𝑳−𝟏 × 𝒔−𝟏 ). Vmax = velocità massimale: è la velocità iniziale di reazione quando l’enzima è saturato dal substrato (𝒎𝒐𝒍𝒊 × 𝑳−𝟏 × 𝒔−𝟏 ). KM = costante di Michaelis-Menten: è la concentrazione di substrato [S] in corrispondenza della quale la velocità iniziale di reazione è pari a ½ di Vmax (𝒎𝒐𝒍𝒊 × 𝑳−𝟏 ).  quando KM >> [S] quando KM