Biologie Test 2 gym 3 PDF

Biologie Test 2 gym 3 Methoden der Gentechnik: Restriktionsenzyme: Es handelt sich hierbei um Enzyme, die bestimmte DNA-Sequenzen erkennen (die palindromisch sind → Die Sequenz liest sich auf beiden Strängen gleich, wenn sie von 5’ zu 3’ betrachtet wird) und schneiden können. Das Zerschneiden bezeic...

Biologie Test 2 gym 3 Methoden der Gentechnik: Restriktionsenzyme: Es handelt sich hierbei um Enzyme, die bestimmte DNA-Sequenzen erkennen (die palindromisch sind → Die Sequenz liest sich auf beiden Strängen gleich, wenn sie von 5’ zu 3’ betrachtet wird) und schneiden können. Das Zerschneiden bezeichnet man als Restriktion. Es ist wie eine molekulare Schere, die die DNA ganz gezielt zerschneidet. Restriktionsenzyme sind Abwehrmechanismen von Bakterien, die sie gegen Viren einsetzen. Sie schneiden virale DNA, um eine Infektion zu verhindern. Restriktionsendonuklease: "Endonuklease" bedeutet, dass das Enzym innerhalb der DNA- Stränge schneidet, und zwar in der doppelsträngigen DNA. Im Gegensatz dazu schneidet eine "Exonuklease" von außen her. - HaeIII: Wie jedes andere Enzym besitzt es ein aktives Zentrum, es ist bei einem Restriktionsenzym so ausgestaltet, dass es eine bestimmte Basensequenz in einer DNA erkennt. Das Enzym heftet sich an die DNA und schneidet sie innerhalb der Erkennungssequenz glatt durch. → Glattes Ende - TaqI: 4 Basen Erkennungssequenz aber die Schnittkante sieht anders aus. Es schneidet die DNA jedoch nicht glatt durch, sondern mit einem Überhang von zwei Basen. - EcoRI: 6 Basen Erkennungssequenz, hier bildet sich an der Schnittstelle einen Vierbasen Überhang. Solche Überhänge nennt man auch sticky ends → Kompatible klebrige Enden. Wenn zwei DNA-Stücke von demselben Enzym geschnitten worden sind, dann können ihre sticky ends leicht hybridisieren → lagern sich aneinander. (Sticky ends können sich also später mit anderen komplementären DNA-Stücken verbinden). Mit sticky ends kann man also DNA-Stücke zusammenfügen. Um die DNA- Fragmente dauerhaft zu verbinden, wird das Enzym Ligase verwendet → Es verknüpft die Zucker-Phosphat-Rückgrate und stellt die DNA-Struktur wieder her. Somit entsteht eine Rekombination → Diese Methode erlaubt es, DNA-Stücke aus unterschiedlichen Quellen miteinander zu verbinden. Das nennt man Rekombination. Gelelektrophorese: → Zur Untersuchung eines Gemisches aus verschiedenen DNA-Stücken nutzt man die Methode der Gel-Elektrophorese. Bestandteile: Das Gel besteht aus einem dreidimensionalen molekularen Netz aus Agarose, mit dem sich die DNA-Stücke nach ihrer Grösse auftrennen lassen. Vorgehen: Das Gemisch aus DNA-Stücken wird in Vertiefungen im Gel (Geltaschen) pipettiert. Das Gel befindet sich hierbei in einer Pufferlösung. Es wird nun ein elektrisches Feld angelegt, mithilfe einer Anode und einer Kathode. Hierbei wandern die negativ geladenen DNA-Stücke zur positiven Anode. Auftrennung der Stücke: Es hängt von der angelegten Spannung, der Länge und der Form der Stücke ab, wie sie aufgetrennt werden. → Kleinere Stücke bewegen sich schneller im Gel als grössere Stücke. Wenn die DNA-Stücke gleich gross sind, kann man sie mit einem Farbstoff anfärben, um sie sichtbar zu machen. (Am Ende wird alles eingefärbt und unter UV-Licht sieh man es gut). Um zu wissen, wie lange die DNA-Stücke sind, lässt man ein Gemisch aus Stücken bekannter Grösse als Massstab mitlaufen. → Für weitere Untersuchungen ist es möglich, die DNA-Stücke aus dem Gels auszuschneiden, zu reinigen und mit einer PCR zu vervielfältigen. PCR: Sie wird unteranderem für Vaterschaftstests und in der Kriminalistik/Forensik verwendet. → PCR = Polymerase Chain Reaction oder auch Polymerase Kettenreaktion Zutaten: Um die PCR durchführen zu können, braucht man verschiedene «Zutaten». Dazu gehören: - DNA (Probe) → Die zu vervielfältigende DNA - Nukleotide (G, T, C, A) → Die Bausteine für die neuen DNA-Stränge - Hitzestabile Polymerase (z.B. taq oder Pfu) → Ein hitzebeständiges Enzym, das neue DNA-Stränge synthetisiert - Primer aus DNA → Kurze DNA-Stücke, die den Startpunkt markieren Die PCR besteht drei Hauptschritten, die in mehreren Zyklen (30–40-mal) wiederholt werden: Schritt 1: Denaturierung (94 °C) Die doppelsträngige DNA wird durch Erhitzen auf 94 °C in zwei Einzelstränge getrennt. Die Wasserstoffbrücken zwischen den Basenpaaren lösen sich auf. Schritt 2: Primer-Hybridisierung (50–60 °C) Die Temperatur wird gesenkt, damit die Primer an die Einzelstränge binden können. Primer sind spezifisch für die Enden des zu vervielfältigenden DNA-Abschnitts. Schritt 3: Synthese (72 °C) Die Taq-Polymerase beginnt am Primer zu arbeiten und fügt Nukleotide an, die zur Vorlage passen. So entsteht ein neuer, komplementärer DNA-Strang. Wichtige Details und Anwendungen der PCR: - Die PCR wird häufig zur Identifikation von Krankheitserregern oder genetischen Sequenzen verwendet. Beispielsweise können DNA-Sequenzen genutzt werden, um spezifische Gene zu analysieren oder nachzuweisen. - Die ideale Hybridisierungstemperatur für die Primer ist besonders wichtig. Sie hängt von der Länge der Primer und dem Gehalt an G-C-Basen ab, da diese stabiler sind als A-T-Basen. Die Formel für die Berechnung der Schmelztemperatur eines Primers ist: Auswahl der Primer: - Für eine erfolgreiche PCR müssen geeignete Primer ausgewählt werden. Die wichtigsten Regeln sind: 1. Die Primer sollten etwa 18–30 Nukleotide lang sein. 2. Die Primer dürfen nicht komplementär zueinander sein, um eine Haarnadelbildung (Selbstbindung) zu vermeiden. 3. Die Hybridisierungstemperatur der beiden Primer sollte ähnlich sein, damit sie effizient arbeiten. DNA-Fingerprinting: Fingerabdruck eines Menschen ist einzigartig → Daher wird er zur Identifizierung von Personen genutzt. Jedoch sind nicht immer Fingerabrücke an z.B. einem Tatort vorhanden. Genauso individuell ist das genetische Material eines Menschen. → In den meisten Körperzellen enthalten. Aus diesem genetischen Material lässt sich der genetische Fingerabdruck einer Person herstellen. - Nicht geeigneter Ort für Erstellung des genetischen Fingerabdruckes: Bereiche, in denen viel Gene vorhanden sind, da sich dort die DNA der Menschen nur wenig unterscheidet und sich hier auch Krankheiten erkennen lassen, was Datenschutztechnisch problematisch ist.  - Geeigneter Ort für Erstellung des genetischen Fingerabdruckes: Bereiche der Chromosomen, hier befinden sich keine Gene. Hier befinden sich kurze Bereiche, die aus zwei bis fünf Nucleotiden bestehen und sich Sequenzen unterschiedlich oft wiederholen → GGT GGT GGT GGT … → nennt man auch Mikrosateliten oder short tandem repeats (STR). (Anzahl Wiederholungen ist von Mensch zu Mensch unterschiedlich). → Diese Variabilität nennt man auch STR-Polymorphismus Die Mikrosateliten sind über das gesamte Genom verteilt und jeder Mensch hat in seinem genetischen Material ein individuelles Muster von Mikrosateliten. → somit ist eine Identifizierung möglich. Anwendung als Täternachweis: → Täter hinterlassen Spuren in Form von z.B. Haaren, Speichel oder Blut Vorgehen: - Mithilfe einer PCR wird das genetische Material vervielfältigt ➔ Mikrosatellitenmuster als individuelles Erkennungsmerkmal ➔ Je mehr Mikrosatellitenbereiche untersucht werden, desto spezifischer wird der genetische Fingerabdruck. Es werden oft 15 Bereiche der Autosome untersucht, da somit jedes Muster unterschiedlich sein wird. - Mit spezifischen Primern (STR-Markern) werden Mikrosatellitenbereiche mit der PCR-Methode vervielfältigt. Die Primer sind farblich markiert und heften sich an die basenkomplementären Mikrosatellitenabschnitte der DNA an, sodass nur diese Stücke vervielfältigt werden. - Danach werden die DNA-Stücke mithilfe einer Elektrophorese ausgetrennt. - Die Länge der DNA-Stücke wird in der Anzahl Basenpaare (Bp) gemessen und ist ein Mass für die Anzahl der Wiederholungen in den jeweiligen Mikrosatelliten. → Ein spezifisches Bandenmuster, der genetische Fingerabdruck entsteht. - Identifizierung des Täters: DNA, die am Tatort gefunden wurde mit der vom Verdächtigen vergleichen. Vaterschaftsnachweis: - Jeder Mensch hat zwei Chromosomensätze. Einer stammt von der Mutter, der andere vom Vater. → diploider Chromosomensatz - Von jedem Chromosom gibt es zwei Versionen (homologe Chromosomenpaare) eines vom Vater, eines von der Mutter. - Der genetische Fingerabdruck eines Kindes setzt sich zu gleichen Teilen aus dem Erbgut der Mutter und des Vaters zusammen. Das bedeutet, dass jeweils die Hälfte der DNA des Kindes von jedem Elternteil stammt. - Mikrosatellitenbereiche: Auf diesen Chromosomen gibt es spezielle Bereiche, sogenannte Mikrosatelliten, die bestimmte Sequenzen enthalten. Diese sind spezifisch und können zur Identifikation genutzt werden. - Diese Verteilung macht es möglich, durch den Vergleich der DNA des Kindes mit der DNA der potenziellen Väter festzustellen, wer der biologische Vater ist. SNPs und RFLPs: SNPs → Single nucleotide Polymorphisms = Punktmutationen, bei denen sich eine einzelne Base im DNA-Strang zwischen verschiedenen Individuen unterscheidet. Beispiel → Eine Person hat an einer Stelle der DNA die Base A, eine andere Person hat an der gleichen Stelle die Base T. Vorkommen → Sie befinden sich oft im nichtcodierenden Bereich der DNA, in Abschnitten, die nicht direkt für die Bildung von Proteinen verantwortlich sind. Sie spielen eine wichtige Rolle als genetische Marker, um Unterschiede zwischen Individuen zu analysieren. Restriktionsverdau von SNPs führt zu RFLPs: RFLPs → Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismen = Technik, die darauf basiert, dass Restriktionsenzyme spezifische DNA-Sequenzen erkennen und schneiden. Wenn nun durch eine Mutation (z.B. SNP) die Sequenz verändert wird, kann das Enzym nicht mehr an dieser Stelle schneiden. Beispiel → Ohne Mutation schneiden die Enzyme wie erwartet, und die Fragmente haben eine bestimmte Länge. Mit Mutation verändert sich das Schneidemuster, was zu Fragmenten unterschiedlicher Länge führt. In einem Gel kann dies anschliessend sichtbar gemacht werden. Biotechnologie: → Biotechnologie: Sie nutzt biologische Systeme und lebende Organismen , um technologische Entwicklungen voranzutreiben. Diese Technologie findet Anwendungen in verschiedenen Industrien, darunter Medizin, Landwirtschaft und Umweltschutz. → Transformation und Selektion bei Bakterien, z.B. ermöglicht die Biotechnologie, das für Diabetiker lebensnotwendige Insulin in Bakterien zu produzieren. Insulin: Hierbei handelt es sich um ein Proteinhormon aus der Bauchspeicheldrüse. Es ist der Türöffner für den Blutzucker und sorgt dafür, dass die Glucose aus dem Blut, in unsere Gewebe und Organe gelangt. Diabetes: → Typ 1 = seltener, kann schon früh auftreten, in der Regel lebenslang. Autoimmunkrankheit → Zerstörung der Beta Zellen (Insulinproduzierende Zellen) der Bauchspeicheldrüse, wenig bis gar kein Insulin wird gebildet. Ständiges Insulin spritzen. → Typ 2 = häufig, 90%, tritt später auf. Insulinresistenz → Zellen reagieren schlecht auf Insulin, somit wird der Zucker schlechter aufgenommen. Häufige Ursache → Übergewicht, kann durch Ernährung, Sport & Gewichtsabnahme oft kontrolliert werden. Typ 1 muss ständig Insulin spritzen, dies ist eine sehr grosse Menge. Diese Menge wird heutzutage gentechnisch aus transformierten Bakterien mit der Insulin-Anleitung hergestellt. Ziel: Bakterien mit einem menschlichen Gen (z.B. Insulin-Gen) auszustatten, um dann diese Bakterien dazu zu bringen, Insulin zu produzieren. Man muss nun das Gen, also in unserem Fall das Insulin Gen, ins Bakterium bringen. Dazu brauchen wir ein «Fahrzeug», man nennt es auch Vektor. Dies kann entweder ein Plasmid (zusätzlicher DNA-Ring, der unabhängig vom Bakterienchromosom existiert und genetische Informationen übertragen kann) sein, oder ein umgebauter Virus. Erster Schritt: Das gewünschte Gen, z.B. Insulin-Gen ins Plasmid einbringen. Dies ist der erste Schritt der genetischen Modifikation. Jedoch stellt sich nun die Frage, wie man das Plasmid ins Bakterium kriegt. Hier gibt es verschiedene Möglichkeiten: - Bakterien, die in der Lage sind, fremde DNA, die aus ihrer Umgebung sind, aufzunehmen, und in ihrer eigenen DNA zu integrieren. → Kompetenz. Kompetente Bakterien können DNA-Fragmente in ihr Chromosom insertieren oder auch komplette Plasmide aufnehmen. So erlangen sie an neue genetische Eigenschaften. - Manche Bakterien können fremde Plasmide nicht ohne weiteres aufnehmen. → Inkompetenz. Es kann fremd DNA zwar aufnehmen, aber nur als Nährstoffquelle nutzen. Sie müssen anhand des GENTRANSFER (Übertragung von DNA in eine Zelle), an neue genetische Eigenschaften kommen. Hier gibt es verschiedene Arten: Konjugation: Der F+ Typ bildet eine Plasmabrücke aus, der F- Typ übernimmt ein Plasmid mit neuen Genen vom Nachbarn. → Wen das fertilitätsgen darauf liegt, wird er sogar selbst zum F+ typ. Transduktion: Normalerweise sterben Bakterien, wenn Viren auftreten. ABER → Manchmal geschieht bei der Vermehrung von Viren im Wirz Bakterium, dass zufällig ein Stück Bakteriums DNA in eine Virushülle verpackt wird. Nun überträgt das Virus keine tödliche Fracht auf sein Opfer, sondern nützliche Gene. ➔ Beide diese Vorgänge laufen natürlich und spontan ab ➔ Es gibt auch künstliche Einflüsse, durch Transformation. Sie ist einfacher und flexibler. Man muss nicht warten, bis die Konjugation oder Transduktion freiwillig abläuft. Hier gibt es 5 Gentechnische Transformationstechniken, mit denen man Kompetenz, kurzfristig auch bei inkompetenten Bakterien herstellen kann. CaCl2-Lösung = Mit einer Calcium-Chlorid Lösung und abkühlen auf 0°C, kann man Zellmembran und Zellwand permeabel (durchlässig) machen. Poren öffnen sich, durch die das Plasmid passiv aufgenommen werden kann. Elektroporation = Behandlung des Bakteriums mit Stromstössen, Poren öffnen sich kurzzeitig, Plasmid kann in die Zelle gelangen. Biolistik = Bakterium wird mit winzigen Metallkügelchen beschossen, die mit rekombinanter DNA beschichtet sind (DNA-Kanone) Lipofektion = Liposomen sind kleine Fettkügelchen, die aus Lipiden (Fettmolekülen) bestehen und eine ähnliche Struktur wie die Zellmembran haben. Sie funktionieren wie Transportbällchen, in ihnen ist die gewünschte DNA eingebettet. Sie verschmelzen mit der Zellmembran, da sie beide aus ähnlichen Lipiden bestehen und nun kann die DNA in die Zelle abgegeben werden. Mikroinjektion = Mit Pipette wird eine isoliere besamte Eizelle fixiert. Rekombinante DNA wird mit einer sehr feinen Kanüle direkt in den Kern injiziert. Nun folgt noch der aufwendigste Schritt in der Gentechnik → SELEKTION Beim Gentransfer kann viel schiefgehen und nur in 1 bis 2% der Fälle ist wirklich das richtige Plasmid im Bakterium. Auch die Fragen, ob das Gen wirklich im Plasmid ist oder ob das Gen am richtigen Ort in der richtigen Orientierung im Plasmid ist, treten auf. Um am Ende die richtigen Bakterien zu finden, zu selektieren, wird das Plasmid mit zwei Markern ausgestattet. Dies sind meistens Antibiotika-Resistenzen. Hier nun ein Beispiel → - ampR → Ampicillin Resistenz - lacZ → Lactose-Abbau (Spaltet normalerweise Lactose, kann aber auch das X-Gal in ein blaues Produkt umwandeln.) «Das gewünschte, goldene Gen» → es wirkt wie ein Schalter. Ist es an der Mcs (kurzer DNA-Abschnitt, der in einem Plasmid oder Vektor vorkommt. Sie enthält mehrere Erkennungsstellen für verschiedene Restriktionsenzyme, die Enzyme schneiden die DNA an bestimmten Zellen) eingebaut, wird das lacZ Gen inaktiviert. Wenn unser gewünschtes Gen jedoch nicht vorhanden ist, ist lacZ aktiv. - Selektion: - Nährboden: Alle Bakterien kommen auf einen Nährboden der X-Gal enthält. Und er ist mit Ampicillin versetzt. Alle Bakterien, die das Plasmid nicht enthalten sterben nun aufgrund des Ampicillins, da sie ja keine Resistenz dagegen haben. Andere Bakterien leben noch und haben also die Ampicillin Resistenz. Jedoch färbt sich bei ihnen der Nährboden blau, was zeigt, dass die das lacZ nicht haben und unser gewünschtes Gen also nicht enthalten. Alle anderen Bakterien überleben und färben nicht blau, diese Bakterien haben also das Plasmid mit dem gewünschten Gen. - Dieses Bakterium wird nun weiter kloniert, damit das genetische Erbgut an die Nachkommen weitergegeben werden kann. GMOs/GVOs: Definition → genetisch veränderte Organismen /genetically modified organisms Man kann hiermit Gene ausschalten, verändern oder hinzufügen. Hierbei gibt es Transgene, dies sind Organismen, die Gen/-e einer fremden Art enthalten. Arten: Selektive Züchtung: Die Voraussetzung hierbei ist eine genetische Variabilität in der Population. Es werden nun Individuen mit bevorzugten Eigenschaften ausgewählt, gekreuzt und weitergezüchtet. Mutagenese: Dies ist eine Methode, bei der durch chemische oder physikalische Mittel (z.B. UV-Strahlung oder Chemikalien) gezielt Mutationen in das Erbgut von Organismen eingeführt werden. Es werden also Pflanzen Strahlen oder Chemikalien ausgesetzt, um zufällig Mutationen hervorzurufen. Anschliessend werden diejenigen Individuen ausgewählt, die die gewünschte Eigenschaft zeigen. Transgene Pflanzen: Es sind genetische veränderte Pflanzen, bei denen ein oder mehrere Gene aus einem anderen Organismus (z.B. Bakterien, andere Pflanze) in das Erbgut eingeführt werden. Hierbei wird ein Fremdgen in die Pflanze eingebracht, welches nun für neue Eigenschaften, z.B. Resistenz gegen Schädlinge, Herbizide oder Krankheiten sorgt. Produkt Was wurde eingesetzt/verändert? Was ist der Nutzen? Wie funktioniert es? Bt-Mais Bestimmte Gene aus anderen Das Ziel: Die Bekämpfung von Schadinsekten Organismen werden in das Mais-Genom zu verbessern und die Unkrautkontrolle zu (Bt -> Bodenbakterien, eingeschleust, es wird ein insektiziden erleichtern, geringere Belastung von Stoff-Bt-Protein eingeführt. Pilzgiften das ein für Frassinsekten giftiges Kristallprotein bildet; wird als biologisches Schädlingsbekämpfungsmittel eingesetzt. Roundup Ready Soja Es wurden artfremde Gene in die Pflanzenzucht wird verändert Sojabohnen eingeschleust. Es produziert ein Enzym, das Glyphosat abbauen kann. - Soja kann wachsen, auch wenn man So sterben die Sojabohnen nicht ab Glyphosat braucht Reduktion des Bodenbearbeitungsaufwands Golden Rice Die Körner enthalten mehr Provitamin A Es bekämpft den häufigen Vitamin-A-Mangel. (β-Carotin). Sie helfen gegen tödliche Mangelernährung. Vorteile Ht und Bt Pflanzen: - Ht-Pflanzen (Herbizid-tolerante Pflanzen) = Vernichten Unkraut → Höherer Ertrag, weniger Herbizid Einsatz, einmal spritzen zum späteren Zeitpunkt reicht, Biodeversität sinkt! → deshalb nicht-störende Blumen etc. für Insekten bieten, z.B. in Form eines Rückzugsstreifens Gylphosat ist umweltfreundlicher als herkömmliche Herbizide → leichter abbaubar, weniger giftig Bodenfreundlicher → Kein Pflügen nötig, weniger Bodenvernichtung durch weniger Maschineneinsatz Rotation, mehr Art Kulturen - Bt-Pflanzen (Schädlingsresistente Pflanzen) = Reduzieren Schädlings-Population → erhöht Ertrag Reduzieren Pestizid-Einsatz → weniger giftig für Menschen, erhöht Biodiversität der Insekten → (nur spezifische Fressfeinde nehmen ab) Weniger Pilzinfektion → Gelangen durch Frassschaden in Pflanzen, → wenn es nun keine Schädlinge mehr gibt, die die Wunden herstellen, können die Pilze auch nicht mehr eindringen und es gibt keine Pilzinfektionen mehr, weniger giftig für Menschen Verhinderung der Resistenzentwicklung! Die Resistenzentwicklung kann problematisch werden. Pflanzenschutzmittel verlieren dadurch ihre Wirkung, Unkräuter, Schädlinge oder Pflanzenkrankheiten, die resistent sind, überleben die Behandlung und können sich unkontrolliert vermehren. Um resistente Schädlinge oder Unkräuter zu bekämpfen, müssen Landwirte mehr oder stärkere Chemikalien einsetzen. Pflanzen und Schädlinge, die resistent sind, werden zu sogenannten "Superunkräutern" oder "Superschädlingen". Diese Organismen lassen sich kaum noch kontrollieren und bedrohen ganze Ökosysteme und Landwirtschaftsflächen. Lösung → Die 4 Schritte zum transgenen Mais: 1. Ziel DNA finden → Die Ziel DNA enthält das Bt-Toxin-Gen, das aus dem Bakterium Bacillus thuringiensis (Bt) stammt. Dieses Gen kodiert ein Insektengift, das bestimmte Schädlinge tötet 2. Vektor finden → Das Agrobacterium tumefaciens wird als Vektor (Fahrzeug, überträgt bestimmte Zielgene) verwendet, weil es Pflanzen infizieren und DNA in deren Genom einbauen kann. Hierfür wird das Ti-Plasmid (Tumor-induzierendes Plasmid) genutzt. Es ist ein DNA-Element und liegt im Inneren des Agrobacteriums. Es enthält Gene, die für die Infektion und den DNA-Transfer verantwortlich sind. Man kann das Plasmid modifizieren und gewünschte Zielgene einfügen. 3. Ziel-DNA in Vektor einbringen → Die Ziel-DNA (Bt-Toxin-Gen) wird in das Ti- Plasmid eingebaut. Hier können zusätzlich Marker-Gene eingefügt werden, um erfolgreich transformierte Pflanzen zu identifizieren. 4. Vektor in Ziel-Art bringen → Das modifizierte Agrobacterium tumefaciens bringt die Ziel-DNA in die Pflanze. Wie das Agrobacterium tumefaciens funktioniert 1. → Es überträgt ein Stück seiner t-DNA (aus dem Ti-Plasmid) in die Pflanzenzellen, z.B. in den Mais. Es infiziert die Pflanze an bestehenden Wunden und injiziert das Plasmid. Die t-DNA enthält Gene, die dazu führen, dass die infizierte Pflanzenzelle unkontrolliert wächst und Tumore bildet. Diese Tumore stellen Nährstoffe her (z.B. Opine), die das Bakterium als Nahrung nutzt. Das Ti-Plasmid besteht aus verschiedenen funktionellen Bereichen: t-DNA-Region → wird in das Pflanzengenom eingebaut und kodiert die wichtigen Gene. Tumorgene (onc): Bewirken Tumorbildung durch erhöhte Produktion von Wachstumshormonen. Opin-Synthese-Gene (ops): Helfen der Pflanze, Opine zu produzieren, die dem Bakterium als Energiequelle dienen. Virulenz Gene (vir) → sind notwendig, um die t-DNA erfolgreich in das Pflanzengenom einzubauen. Replikationsursprung (ori) → Startpunkt für die Replikation des Plasmids Opin-Katabolismus → Ermöglicht dem Bakterium, Opine abzubauen und als Nahrung zu nutzen. 2. → Forscher können diese tumorbildenden Gene aus der t-DNA entfernen und durch nützliche Zielgene ersetzen (z.B. ein Gen, das Mais resistent gegen Schädlinge macht). Das Bakterium wird dann als Vektor genutzt, um diese Zielgene in die Pflanze einzuschleusen. Nun entstehen keine Tumore mehr, weil die Gene für die Tumorbildung entfernt wurden. Was alles beim Ti-Plasmid verändert werden muss: - Tumorgene bzw. t-DNA muss durch das Bt-Gen ersetzt werden - Restriktionsenzyme, wie beim Einbau vom Insulin-Gen - Virulenzgene sind wichtig, sie erlauben das Einbauen des Bt-Gens ins Pflanzengenom. CRISPR/Cas 9 CRISPR → Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats Eine neue Methode, um die DNA ganz gezielt wie mit einer Schere zu zerschneiden, ist das CRISPR/Cas-System. CRISPR beschreibt ursprünglich DNA-Abschnitte im Erbgut von Bakterien. Als Teil von CRISPR/Cas bilden die Abschnitte das Immunsystem der Bakterien und helfen ihnen, sich gegen Viren zu verteidigen. Es kann jedoch in der Gentechnik auch verwendet werden, um die DNA an bestimmten Stellen zu durchtrennen. Somit kann man Gene verändern, entfernen oder neu einfügen. CRISPR ist viel billiger und dauert nur ein paar Wochen. Die CRISPR-RNA bestimmt, wo die Cas9 die Viren-DNA schneidet. CRISPR Genort besteht aus drei verschiedenen Bauteilen: CRISPR-Array → Es besteht aus abwechselnden Spacern und Repeats. Die Repeat- Sequenzen bestehen aus kurzen DNA-Abschnitten, die eine palindromische Struktur haben. → Sie sind von vorne wie hinten gleich gelesen (z.B. Otto). Sie werden unterbrochen durch etwa gleich lange, variable Abschnitte → Spacer. Die Spacer stammen aus dem Erbgut der Viren, die in die Bakterien eingedrungen sind. Somit kommt auch der Name CRISPR zustande, er beschreibt die kurzen sich wiederholenden Palindrome, die durch die Viren-DNA unterbrochen werden. Leader-Sequenz → DNA-Abschnitt, der Basen (vor allem A und T) enthält. Er wirkt als Promotor, um das Ablesen des CRISPR zu ermöglichen. Cas-Gene → Eine Gruppe von Genen, die notwendig sind, damit das Zerschneiden der DNA funktioniert. Sie enthalten die Bauanleitung für Enzyme, die für das Viren- Abwehrsystem wichtig sind. Wenn Bakterien durch ein Virus infiziert wurden, und den Angriff überleben, bewahren sie einen Teil der Virus-DNS in ihrem eigenen genetischen Code auf → in einem DNS-Archiv das CRISPR genannt wird. Wenn nun das Virus erneut angreift, macht das Bakterium eine RNS-Kopie der Viren-DNS und setzt sie in das Protein Cas9 ein. Das Protein sucht nun das 100% Gegenstück, wird es aktiviert und schneidet die Virus-DNS heraus. Nun ist das Virus nutzlos und das Bakterium sicher. Cas9 arbeitet sehr gründlich. ➔ Das Enzym schneidet also ein Stück der Viren DNA heraus und baut es in den CRISPR Abschnitt ein. Die Zelle übersetzt dies nun in ein RNA-Molekül → CRISPR-RNA (crRNA). Sie enthält Informationen aus dem Erbgut des Virus und des Bakteriums. Nun kommt die Tracer-RNA (tracr-RNA) ins Spiel. Gemeinsam binden sie an das Enzym Cas9 (crRNA und tracrRNA werden zur guide-RNA / gRNA, es führt uns zu der Stelle, wo es schneiden soll) → Es schützt nun gegen genau dieses Virus, denn seine CRISPR-RNA kann nun an die Virus-DNA binden. Das Cas9 Protein zerschneidet daraufhin den DNA-Strang → Macht ihn unschädlich.  Die Tracer und CRISPR-RNA lassen sich zu einem einzigen Molekül fusionieren. Somit kann man sie leichter herstellen. Forscher können die Sequenz der fusionierter RNA-Moleküle einfach variieren, somit können sie bestimmen, wo das Cas9 einen DNA-Strang zerschneidet → Bestimmte Gene können ganz gezielt ausgeschalten werden. Die Zelle versucht das Gen wieder herzustellen, was jedoch nicht fehlerfrei geschieht. Das Gen kann nicht mehr abgelesen werden. ➔ Es können auch komplette Gene ausgetauscht werden, sehr preiswert und effizient. Es muss hierbei nur ein RNA-Molekül verändert werden. Die DNA sucht sich ein komplementäres Ende zum Doppelstrangbruch. Nur die Enden von der DNA (Gelb umkreist) sind gleich wie beim violetten, neuen Gen, das eingefügt werden soll. Da die Enden gleich sind, kann nun das Zielgen angedoggt werden und nun hat man die DNA verändert. Zelleigene Polymerase und Ligase komplettieren den Einbau. → neues oder verändertes Gen!