Zellbiologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen PDF - Praktikumsskript

Basismodul Biologie Praxis I (Module 200201-200204) Kursteil Zellbiologie Von der Zelle zu Makromolekülen Kaltschmidt / Kaltschmidt / Storm / Schulten Praktikum: Raum ZW1-250 / 300 / 302; 13:15-18:00 Uhr Bilder von oben nach unten: Heliumionenmikroskopische Aufnahme einer humanen Nervenzelle; Model der DNA-Doppelhelix (CC0 1.0 Universal (CC0 1.0) Public Domain Dedication); Strukturmodell der humanen muskulären Lactatdehydrogenase (Read JA, Winter VJ, Eszes CM, Sessions RB, Brady RL (May 2001). "Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase". Proteins 43 (2): 175–85.) Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Theoretischer Hintergrund Kurstage 1-2: Zellbiologie Lehrende: Christian Kaltschmidt / Barbara Kaltschmidt / Jonathan Storm / Wiebke Schulten Kontakt: [email protected] & [email protected] Lernziele: Im Kurs werden Sie mit verschiedenen Standardtechniken der Zell- und Molekularbiologie arbeiten. Hierzu gehören grundlegende Methoden wie Lichtmikroskopie, Spektroskopie, sowie die Extraktion von DNA und Proteinen. Weiterhin werden Sie Zelltypen unterschiedlicher Spezies kennenlernen und eine erste Möglichkeit haben Ihr Wissen aus der Vorlesung mit praktischen Beobachtungen zu vergleichen. Anhand ihrer eigenen Skizzen von mikroskopischen Präparaten wird hierbei insbesondere Ihr Abstraktionsvermögen geschult. Dies dient nicht nur der Dokumentation Ihrer eigenen Ergebnisse, sondern hilft Ihnen auch dabei, Skizzen anderer, etwa in Lehrbüchern, besser zu verstehen und einzuordnen. Bei verschiedenen Berechnungen erhalten Sie einen ersten Eindruck vom alltäglichen Rechnen in der biologischen Forschung. Kurstag 1: Einführung in die Mikroskopie, mikroskopische Größenbestimmung und Mikroskopie von verschiedenen Zelltypen Verstehen und Beherrschen des Aufbaus und der Funktionsweise eines Lichtmikroskops Vorbereitung und Handhabung von mikroskopischen Präparaten Identifizieren und Unterscheiden von verschiedenen Zelltypen anhand ihrer morphologischen Merkmale Erkennen und Erklären des Unterschieds zwischen verschiedenen Zelltypen, einschließlich tierischer, pflanzlicher und bakterieller Zellen Verständnis und Durchführung der Eichung von Okularmikrometern zur Größenbestimmung Bestimmen und Berechnen der Größe von mikroskopischen Präparaten unter Verwendung eines Mikroskops Bestimmung der Größe und des Volumens unterschiedlicher Zelltypen Abstraktion und Dokumentation mikroskopischer Beobachtungen durch Skizzen Kurstag 2: Extraktion und Analyse von Makromolekülen Anwendung von Methoden zur Extraktion von DNA und Proteinen Bestimmung der Konzentration von DNA und Proteinen durch spektrophotometrische Messungen Durchführung von Experimenten zur Stabilität und biologischen Aktivität von Proteinen bei verschiedenen Temperaturen und Interpretation der Ergebnisse Durchführung von Experimenten zur Untersuchung der Löslichkeit von Farbstoffen und Analyse der Ergebnisse II Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Theoretischer Hintergrund Teilnahmevoraussetzung: Bereiten Sie sich gründlich auf beide Kurstage vor, indem Sie die entsprechenden Abschnitte des Skripts sorgfältig lesen und sich in die theoretischen Grundlagen vertiefen. Sowohl organisatorische Maßnahen, die experimentellen Verfahren, als auch das Verständnis der theoretischen Hintergründe, werden vor Beginn des Praktikumstages im Rahmen von digitalen Antestaten überprüft. Sie müssen diese Antestate bis 11 Uhr des jeweiligen Kurstagtes betanden haben und in der Lage sein, die Aufgaben und Experimente in Ihren eigenen Worten zu beschreiben, wenn Ihre Tischtutor*innen oder die Veranstalter*innen Sie danach fragen. Insbesondere legen wir gesteigerten Wert darauf, dass Sie sich organisatorische Ansagen der Betreuer*innen merken. Für Kurstag 2 sollten Sie außerdem ein Verständnis für die folgenden Begriffe und Konzepte entwickeln: Lambert-Beer'sches Gesetz, Absorption, Extinktion und Lichtspektrum. Allgemeine online-Vorbesprechung: Am Freitag vor dem jeweiligen Praktikumstag werden Sie zusätzlich in einer online Vorbesprechung über den Kurstag aufgeklärt. In dieser wird es in einem ersten Teil insbesondere um die Durchführung und Dokumentation der Experimente gehen. Hierbei soll auch der organisatorische Ablauf vermittelt werden. Fragen welche zum reibungslosen Ablauf des Praktikums beitragen könnten sind ausdrücklich erwünscht! In einem zweiten Teil geht es um die thematische Signifikanz und wie die gewonnenen Erkenntnisse Ihnen helfen können die zugrunde liegende Biologie und experimentelle Methoden zu verstehen. Die aufgezeichnete Vorbesprechung wird Ihnen online zur Verfügung gestellt. Wir bitten dennoch, sofern möglich, um Ihre Teilnahme, damit eventuelle Fragen im Vorfeld geklärt werden können. Besprechung zu Beginn des Kurstags: Zu Beginn des Kurstags werden Sie noch einmal grob über den Ablauf des Kurstags informiert. Im Vordergrund stehen hierbei die Position der jeweiligen Materialien und Anweisungen, die der Instandhaltung der Geräteausstattung dienen. Hiernach werden sich Ihre Tischtutoren einige Minuten mit Ihnen Besprechen. Besprechungen im Verlauf des Kurstags: Nach der Durchführung einzelner experimenteller Abschnitte werden die gewonnenen Erkenntnisse mit den Tischtutoren besprochen. Umgang mit Fehlern: Wie in allen Lebensbereichen sind Fehler im Labor und im Kurs ganz normal. So wie wir uns unsererseits bemühen die Materialien sorgfältig vorzubereiten und die Kommunikation möglichst deutlich zu halten, so erwarten wir natürlich auch von Ihnen, dass Sie sich bemühen Fehler zu vermeiden. Fehler können und werden dennoch vorkommen. Sollten uns Fehler unterlaufen bitten wir Sie uns darauf hinzuweisen. Sollten Ihnen Fehler passieren, wenden Sie sich bitte vertrauensvoll an Ihre Tischtutoren*innen und uns, so dass eine eventuell notwendige Schadensbegrenzung erfolgen kann. III Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Theoretischer Hintergrund Studienleistungen: 1.) Alle Teilnehmer*innen: Füllen Sie die im Praktikumsskript vorhandenen Arbeitsblätter für die jeweiligen Kurstage aus und fertigen Sie die verlangten Skizzen an. Ihre Tischtutor*innen werden im Rahmen der Ergebnisbesprechungen auf diese achten. 2.) Ausgewählte Teilnehmer*innen: Schreiben Sie ein klassisches biologisches Versuchsprotokoll nach den Vorgaben, welche zu Beginn der Veranstaltung mit Ihnen besprochen wurden. Halten Sie sich an die Anleitung und das Musterprotokoll, welche im Moodle Lernraum zur Verfügung gestellt werden. Die Bekanntgabe der fürs Protokoll ausgewählten Studierenden erfolgt in der Abschlussbesprechung des Kurstags 2! Die Abgabe erfolgt dabei über Moodle, zwei Wochen nach dem zweiten Kurstag Zellbiologie (Siehe Abgabeordner in Moodle). IV Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 Inhalt 1. Kurstag 1.......................................................................................................................................... 6 1.1. Kurstag 1 – Theoretischer Hintergrund................................................................................... 6 1.1.1. Die Zelle........................................................................................................................... 6 1.1.2. Das Mikroskop................................................................................................................. 7 1.2. Kurstag 1 – Praktischer Teil................................................................................................... 11 1.2.1. Bedienung des Mikroskops........................................................................................... 11 1.2.2. Aufgaben/Eperimente................................................................................................... 13 1.2.3. Kurstag 1 – Ergebnisblätter........................................................................................... 17 2. Kurstag 2........................................................................................................................................ 20 2.1. Kurstag 2 – Theoretischer Hintergrund................................................................................. 20 2.1.1. Biologisch relevante Makromoleküle: DNA, Proteine, Farbstoffe................................ 20 2.1.2. Konzentrationsbestimmung durch Photometrie.......................................................... 23 2.2. Kurstag 2 – Praktischer Teil................................................................................................... 24 2.2.1. Aufgaben/Experimente................................................................................................. 24 2.2.2. Kurstag 2 – Ergebnisblätter........................................................................................... 28 3. Technischer Anhang...................................................................................................................... 31 4. Literatur........................................................................................................................................... 2 5 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 1. Kurstag 1 1.1. Kurstag 1 – Theoretischer Hintergrund 1.1.1. Die Zelle Zellen sind die grundlegenden Objekte der biologischen Forschung und folgen dem Prinzip "omnis cellula e cellula", was bedeutet, dass jede Zelle aus einer bereits existierenden Zelle entsteht. Die moderne Zelltheorie umfasst wichtige Prinzipien, die heute allgemein von der wissenschaftlichen Gemeinschaft anerkannt werden: Alle lebenden Organismen bestehen aus einer oder mehreren Zellen. Zellen entstehen durch Zellteilung aus bereits existierenden Zellen. Die Molekularbiologie und damit die grundlegenden Strukturen von unterschiedlichen Zellen sind im Wesentlichen gleich. Die Zelle bildet die grundlegende Einheit für die Struktur und Funktion von Organismen. Die meisten Stoffwechselprozesse finden innerhalb von Zellen statt. Während der Zellteilung wird genetisches Material zur Vererbung weitergegeben. Eine Zelle ist von einer Lipiddoppelschicht, der Zellmembran, umgeben und enthält ein umfangreiches Inventar an Molekülen und Organellen, die für die Synthese von Makromolekülen, Stoffwechselprozesse und die Replikation der DNA verantwortlich sind. Gemeinsam haben alle Zelltypen grundlegende Merkmale: Sie sind von einer Plasmamembran umhüllt, die aus einer Phospholipiddoppelschicht besteht. Sie stehen mit der Umwelt in Kontakt und weisen ein Zytoplasma und darin befindliche Organellen auf (siehe Abbildung 1). Weitere Details zur Zellstruktur finden Sie in der Vorlesung des Basismoduls Theorie I (Prof. Kaltschmidt, Zellbiologie). Abbildung 1: Schematischer Aufbau einer tierischen Zelle, mit Organellen (A) sowie dem Zytosol und der Plasmamembran (B). 6 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 1.1.2. Das Mikroskop 1.1.2.1. Grundlagen und Definitionen Trotz der Fortschritte in der Entwicklung neuer Mikroskopietechniken (wie z.B. Elektronenmikroskopie, Konfokalmikroskopie und Super-Resolution-Mikroskopie) bleibt das Lichtmikroskop (Mikroskop: μικρός mikrós „klein“; σκοπεῖν skopeín „betrachten“) nach wie vor das Routinemikroskop in der Biologie, insbesondere der Zellbiologie. Die Lichtmikroskopie basiert auf dem sichtbaren Anteil des Lichtspektrums, der in etwa zwischen 400 und 800 nm Lichtwellenlänge liegt. Licht interagiert auf verschiedene Weisen mit den zu untersuchenden Objekten, darunter Reflexion, Absorption, Streuung, Brechung und Polarisation. Diese Wechselwirkungen ermöglichen verschiedene Mikroskopietechniken: Darunter die Auflichtmikroskopie, Durchlichtmikroskopie, Dunkelfeldmikroskopie, Phasenkontrastmikroskopie und Polarisationsmikroskopie. Reflexion: Die Grundlage der Auflichtmikroskopie (z.B. Stereolupe – wird in diesem Praktikum nicht verwendet) ist das Prinzip der Reflexion. Bei dieser Mikroskopietechnik wird Licht auf die Probe gerichtet, welches von der Oberfläche der Probe reflektiert wird. Da diese Reflexion stark von den Oberflächenmerkmalen abhängt, ermöglicht die Auflichtmikroskopie die Visualisierung von Oberflächendetails und -strukturen. Die Intensität, oder Amplitude, des reflektierten Lichts variiert abhängig von der Menge, was dazu führt, dass einige Bereiche im Bild heller und andere dunkler erscheinen. Eine geringe Reflexion führt zu dunkleren Bereichen im Bild, während eine hohe Reflexion hellere Bereiche erzeugt. Dieser Kontrast in der Reflexion ermöglicht es, Oberflächendetails und -strukturen als Bild sichtbar zu machen. Das von der Probe reflektierte Licht wird gesammelt und durch das Mikroskopobjektiv geleitet, um ein vergrößertes Bild aufzunehmen. Die Auflichtmikroskopie konzentriert sich größtenteils auf die Untersuchung von Oberflächen und kann nicht in die Tiefe der Probe eindringen. Trotz dieser Begrenzung bietet sie den Vorteil, dass die Probe nicht speziell präpariert oder durchleuchtet werden muss. Dies macht die Auflichtmikroskopie besonders geeignet, um Oberflächen, Mikroorganismen und Partikel in ihrer natürlichen Umgebung zu betrachten. Absorption: Das Prinzip der Absorption bildet die Grundlage der Durchlichtmikroskopie (praktische Anwendung im Kurstag 1). Tierische Zellen sind normalerweise transparent und haben nur geringfügige Eigenfarben. Daher ist es erforderlich, sie mit speziellen Farbstoffen zu färben, um sie in normaler Durchlichtmikroskopie gut sichtbar zu machen. Die gefärbten Objekte reduzieren die Intensität oder Amplitude des Lichtstrahls und heben sich so von ihrer Umgebung ab. Dies führt dazu, dass die Probe helle und dunkle Bereiche aufweist, welche durch die unterschiedliche Lichtabsorption verursacht werden. Ein weiterer wichtiger Aspekt ist, dass jeder Farbstoff einen charakteristischen Wellenlängenbereich absorbiert, was dazu führt, dass das Präparat nicht nur in Hell-Dunkel-Kontrasten sichtbar ist, sondern auch farblich sichtbar wird. Dies ermöglicht es, verschiedene Strukturen und Bereiche in der Probe aufgrund ihrer unterschiedlichen Absorptionsmuster zu identifizieren. Dieses Prinzip ähnelt in gewisser Weise den Grundlagen der Spektralphotometrie, bei der die Absorption von Licht in Abhängigkeit von der Wellenlänge gemessen wird, um Informationen über die Zusammensetzung von Substanzen zu erhalten. Brechung: Das Prinzip der Brechung ist die Grundlage der Phasenverschiebung. Diese wiederum ist die Grundlage der Phasenkontrastmikroskopie. Die Phasenkontrastmikroskopie ist eine Möglichkeit eine farblose Probe ohne Anfärbung sichtbar zu machen. Brechung 7 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 beschreibt, dass Licht seine Richtung ändert, wenn es von einem Medium in ein anderes mit unterschiedlicher optischer Dichte übergeht. Ein einfaches Beispiel dafür ist, wenn ein Strohhalm ins Wasser ragt, und er sich an dieser Stelle zu biegen scheint. Die Stärke dieses Effekts wird durch den Brechungsindex beschrieben, der angibt, wie stark das Licht in einem Medium im Vergleich zur Lichtgeschwindigkeit im Vakuum verlangsamt wird (n = c / v; wobei n der Brechungsindex, c die Lichtgeschwindigkeit im Vakuum und v die Lichtgeschwindigkeit im Medium ist). Durch die unterschiedliche Geschwindigkeit des Lichts in unterschiedlichen Medien ergibt sich eine Phasenverschiebung zwischen den Lichtwellen, wenn diese durch unterschiedlich dichte Bereiche des Objektes laufen (Die Position der Minima und Maxima verschiebt sich relativ zur benachbarten Welle). Diese Phasenverschiebung ist für das menschliche Auge nicht direkt sichtbar, kann aber über geeignete Vorrichtungen, einen Phasenring im Objektiv und eine Ringblende im Kondensor, sichtbar gemacht werden. Die Ringblende beschränkt das Licht auf einen bestimmten Einfallswinkel. Das nicht durchs Objekt gestreute Licht wird vom Phasenring abgeschwächt und so gestreut, dass es auf der Bildebene zu einer maximalen Interferenz mit dem Streulicht vom Objekt kommt. Je nach Konfiguration von Phasenring und Ringblende unterscheidet man zwei Arten von Phasenkontrast. Im positiven Phasenkontrast erscheinen die meisten Objekte dunkel auf einem hellen Hintergrund. Nur bei Objekten mit sehr hohen Brechungsindizes schlägt der Kontrast um. Die Brechung ist ein grundlegendes Konzept in der Optik und spielt in verschiedenen Arten von Mikroskopen eine Rolle, nicht nur im Phasenkontrastmikroskop. Zum Beispiel nutzen Linsen in Mikroskopobjektiven und Okularen die Brechung des Lichts beim Übergang von Luft zu Glas, um eine Vergrößerung zu erzielen. Die Brechungsindizes variieren zwischen verschiedenen Medien, wie Luft (1,0), Wasser (1,33), Immersionsöl (1,5) und den meisten Objektivglassorten (1,5). Spezielle Abbildungsverfahren wie Fluoreszenzmikroskopie oder Konfokalmikroskopie werden in Fortgeschrittenen-Praktika verwendet. 1.1.2.2. Auflösung und Vergrößerung Die Auflösung bezieht sich darauf, wie nah zwei Punkte beieinander liegen können, bevor sie nicht mehr als getrennte Objekte wahrgenommen werden können. Für das menschliche Auge beträgt dieser Abstand etwa 0,07 mm (70 µm), wenn die Punkte sich in einer Entfernung von 25 cm zum Auge befinden. Wir können die Auflösung mit Hilfe von Linsensystemen, wie sie in Lichtmikroskopen verwendet werden, erheblich steigern. Dabei gibt es jedoch zwei wichtige Faktoren, die diese Auflösung begrenzen: die Wellenlänge des Lichts und Streuungsphänomene, die sowohl im Präparat als auch im Linsensystem auftreten. Aufgrund dieser Begrenzungen beträgt die praktisch erreichbare Auflösung eines Lichtmikroskops etwa 0,25 µm (250 nm). Das bedeutet, dass Strukturen, die kleiner sind als diese Größe, im Lichtmikroskop normalerweise nicht ohne zusätzliche Färbung sichtbar sind. Das trifft z.B. auf die einzelnen Elemente des Zellskeletts zu. Die maximale Vergrößerung, die mit einem Lichtmikroskop in der Praxis erreicht werden kann, liegt bei einer etwa 1000-fachen Vergrößerung. Eine noch höhere Vergrößerung würde keine zusätzlichen Informationen liefern, da die Auflösung der Objektive, beschränkt durch die Wellenlänge, nicht besser werden kann. Im Gegensatz dazu arbeiten Durchstrahlungs-Elektronenmikroskope mit einem Elektronenstrahl, der eine sehr viel kürzere Wellenlänge von etwa 0,005 nm aufweist. Dadurch können sie eine außergewöhnlich hohe Auflösung von 0,2-0,5 nm (2-5 Angström) erreichen. Dies ermöglicht die Untersuchung von Strukturen auf atomarer Ebene, was mit klassischen Lichtmikroskopen unmöglich ist. 8 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 1.1.2.3. Aufbau des Durchlichtmikroskops und numerische Apertur Abbildung 2 illustriert den Aufbau und den Strahlengang eines einfachen Durchlichtmikroskops. Die äußeren Grobtriebe und die inneren Feintriebe dienen der Bewegung des Tisches, nicht des Objektivs! Mechanik Optik Mechanik Optik Okular Okular (herausnehmbar) (herausnehmbar) Auge Kamera Kopf Kopf Okular (drehbar) (drehbar) Objektive Objektive Objektiv Objekttisch Objekttisch Präparat (verschieb-, (verschieb-,heb-heb- & senkbar) Kondensor Fokussierung & senkbar ) Fokussierung Kondensor grob grob Kondensor (mit Blende & fein fein (m. Blende& Phasenring) Phasenring) Tischverstellung Tischverstellung (X- & Y-Achse) (X- & Y-Achse ) Netzleitung Netzleitung Fuß Fuß (enthält (enthält TrafoTrafo & Lampe) & Lampe) Abbildung 2: Aufbau und Strahlengang eines einfachen Durchlichtmikroskops. Die Angaben auf Mikroskop-Objektiven enthalten wichtige Informationen. Zum Beispiel steht "Ph2" für ein Phasenkontrastobjektiv, das den Phasenring Nummer 2 erfordert. Phasenkontrastobjektive können jedoch auch im Hellfeld-Modus verwendet werden, wenn der Phasenring am Kondensor aus dem Strahlengang geklappt ist. Die Zahl "40" steht für die Objektivvergrößerung und die Zahl "0,65" ist die numerische Apertur, die das Auflösungsvermögen des Objektivs angibt (NA = n * sin(α); n = Brechungsindex des Mediums zwischen dem Objektiv und Präparat, "α" = halber Öffnungswinkel, unter dem das Licht in das Objektiv eintritt). Wenn dieses Medium Luft ist (Brechungsindex = 1), liegt die numerische Apertur immer unter 1. Einige Objektive, wie das 100er Objektiv, erfordern die Verwendung von Immersionsöl (Brechungsindex = 1,5), um eine höhere numerische Apertur zu erreichen. Wenn auf dem Objektiv "Imm" oder "Oel" steht, bedeutet dies, dass das Objektiv ausschließlich mit Immersionsöl zwischen Objektiv und Präparat verwendet werden sollte. Beachten Sie, dass Immersionsöl im Rahmen des Kurses ausschließlich für das 100er Objektiv verwendet werden darf. Nicht für den Gebrauch mit Immersionsöl bestimmte Objektive können durch Immersionsöl beschädigt werden! 9 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 1.1.2.4. Vergrößerung in der Mikroskopie In der Mikroskopie ergibt sich die Endvergrößerung (Vend) durch die Multiplikation der Objektivvergrößerung (Vobj) und der Okularvergrößerung (Vok): Vend = Vobj x Vok Handelt es sich um digitale Mikroskopie, kommt hierzu der Kamerafaktor und die digitale Nachvergrößerung. 10 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 1.2. Kurstag 1 – Praktischer Teil 1.2.1. Bedienung des Mikroskops Die Ihnen im Praktikum zur Verfügung gestellten Mikroskope sind empfindliche und teure mechanisch-optische Präzisionsgeräte und mit entsprechender Vorsicht zu behandeln!! Wenn Sie das Mikroskop bewegen oder tragen möchten, halten Sie es nie am Kopf, den Okularen, Objektiven oder dem Objekttisch mit allen daran befindlichen Aufbauten an. Fassen Sie das Mikroskop zum Tragen stets am Hals oder unter dem Fuß an. Überprüfen Sie das Mikroskop vor Verwendung auf offensichtliche Beschädigungen oder Verschmutzungen. Sollten Sie Beschädigungen oder Verschmutzungen an funktionell relevanten Bauteilen feststellen, kontaktieren Sie bitte die Kursbetreuung. Reinigen Sie das Gerät nach Gebrauch. Entfernen Sie eventuelle Feuchtigkeitsspuren vom Objekttisch und reinigen Sie das 100er Objektiv mit einem geeigneten Linsenputzpapier (wird gestellt). Schwenken Sie auf die niedrigste Vergrößerung zurück. 1.2.1.1. Durchlichtmikroskopie 1. Senken Sie den Objekttisch vorsichtig mit dem Grobtrieb (dem großen Rad an der Seite des Mikroskops) vollständig ab. 2. Schwenken Sie das Objektiv mit der niedrigsten Vergrößerung (normalerweise 4x oder 10x) in Position. Achten Sie darauf, dass der Objektivrevolver richtig eingerastet ist (Bei manchen Mikroskopen gibt es einen deutlichen Widerstand, bei anderen ist Fingerspitzengefühl gefragt). 3. Legen Sie das Präparat mit der Deckglas-Seite nach oben auf den Objekttisch und platzieren Sie es möglichst zentral unter dem Objektiv. 4. Schalten Sie das Licht ein und stellen Sie es auf eine sehr helle Einstellung (Stufe 5-6). 5. Passen Sie den Okularabstand an Ihre Augenweite an. 6. Fahren Sie den Objekttisch mit dem Grobtrieb behutsam nach oben, während Sie das Präparat durch das Okular betrachten, bis das Präparat im Blickfeld erscheint. Überprüfen Sie die Position des Objekttischs in regelmäßigen Abständen von der Seite. Verwenden Sie nur noch den Feintrieb (das kleine Rad auf dem Grobtrieb), wenn das Präparat nah am Objektiv ist. Wenn es schwierig ist, die Fokusebene des Präparats zu finden, stellen Sie zunächst auf den Rand des Deckglases oder eine Luftblase scharf. Berühren Sie niemals mit dem Objektiv das Objekt! 7. Bewegen Sie den Kondensor in die höchste Position. Öffnen Sie nun die Kondensorblende (auch Aperturblende genannt) vollständig und schließen Sie sie dann langsam, bis die Helligkeit gerade abnimmt. Für ungefärbte Präparate können Sie die Blende gegebenenfalls etwas weiter schließen, um mehr Kontrast zu erhalten. Denken Sie daran, dass die Einstellung der Kondensorblende nach einem Objektivwechsel erneut durchgeführt werden muss. Stellen Sie sicher, dass die Kondensorlinse (außer beim 4x-Objektiv) im Strahlengang ist. 8. Erkunden Sie beim Beobachten des Präparats die räumliche Struktur, indem Sie den Feintrieb (das kleine Rad) verwenden. Wählen Sie einen geeigneten Bereich des Präparats. 11 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 9. Wenn Sie eine höhere Vergrößerung wünschen, schwenken Sie das Objektiv mit der nächstgrößeren Vergrößerung in Position. Die Längen der Objektive sind so aufeinander abgestimmt, dass die Bildschärfe beim Objektivwechsel weitgehend erhalten bleibt. Deswegen sollten Sie nie ein Objektiv überspringen. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv nie mit dem Präparat kollidiert! Da das Objektiv in Schräglage eventuell etwas länger ist, kann es nötig sein den Objekttisch ein wenig nach unten zu fahren und nach Einschwenken des Objektivs erneut nach oben zu bewegen (Beim Kursmikroskop evtl. für das 100x-Objektiv notwendig, sonst nicht). Beachten Sie, dass die Tiefenschärfe bei stärkeren Objektiven geringer ist. Passen Sie die Schärfe mit dem Feintrieb erneut an. 1.2.1.2. Köhlern / Köhlersche Beleuchtung Die Köhlersche Beleuchtung, oft als Köhlern bezeichnet, ist eine entscheidende Technik in der Lichtmikroskopie. Sie dient dazu, die Beleuchtung im Mikroskop präzise einzustellen, um eine gleichmäßige und kontrastreiche Ausleuchtung des Präparats zu erreichen. Ein gut geköhlertes Mikroskop trägt zur Verbesserung der Bildqualität, zur Steigerung des Kontrasts, zur Reduzierung von Artefakten und zur Erhöhung der Reproduzierbarkeit bei. Das Ziel des Köhlerns besteht darin, die Ausleuchtung so zu regulieren, dass nur diejenigen Bereiche des Präparats beleuchtet werden, die tatsächlich beobachtet werden sollen. Dadurch wird die Menge an Streulicht reduziert, und die Helligkeit kann präzise gesteuert werden. 1. Beginnen Sie, wie im Abschnitt zur Durchlichtmikroskopie beschrieben, damit, das Licht auf die Beobachtungsebene zu fokussieren. 2. Fahren Sie den Kondensor (die Optik unter dem Objekttisch) zu Beginn in seine oberste Position. 3. Schließen Sie die Leuchtfeldblende so weit, dass nur noch ein Teil des Sichtfeldes beleuchtet ist und der Rand der Lichtblende sichtbar ist. 4. Variieren Sie die Höhe des Kondensors, bis der Rand der Kondensorblende so scharf wie möglich abgebildet ist. Normalerweise erscheint das Licht als ein Lichtsechseck oder Lichtachteck im Inneren. Das Lichtfeld sollte scharf begrenzt sein. Ist das Licht als Kreis sichtbar, ist das Lichtfeld noch unscharf. 5. Richten Sie das Licht mithilfe der Schrauben am Kondensor möglichst zentral im Sichtfeld aus. 6. Öffnen Sie die Leuchtfeldblende nun so weit, dass gerade eben das gesamte Sichtfeld gut ausgeleuchtet ist. 7. An diesem Punkt können Sie die Lichtquelle fein von minimaler bis maximaler Intensität einstellen. Durch Schließen der Kondensorblende können Sie die Lichtmenge begrenzen und gleichzeitig den Kontrast erhöhen. Nicht alle Kursmikroskope besitzen die notwendigen Vorrichtungen, um die Köhlersche Beleuchtung korrekt einzustellen. Während die Vorteile des Kölerns den anderen Geräten verwehrt bleiben, so können diese Mikroskope allerdings auch nicht so falsch eingestellt sein. Mehr einstellmöglichkeiten führen in der Mikroskopie immer auch zu mehr Faktoren, welche berücksichtigt werden müssen. Die Köhler-Beleuchtung ist für gelungene Phasenkontrastmikroskopie notwendig. Die im Hellfeld getroffenen Einstellungen können aber beibehalten werden. Die Einstellungen des Kondensors und der Leuchtfeldblende müssen nach erfolgreichem Köhlern nicht geändert werden, solange dasselbe Präparat betrachtet wird. 12 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 1.2.1.3. Phasenkontrastmikroskopie Wenn Sie das 40x-Objektiv verwenden, können Sie auch die Phasenkontrasteinrichtung nutzen. Stellen Sie zunächst mit dem 40x-Objektiv im Hellfeld scharf. Klappen Sie dann die Kondensorfrontlinse weg und zentrieren Sie den Phasenring im Phasenringträger von unten im Kondensor. 1.2.1.4. Immersionsobjektiv Für die Bakterienpräparate und die Analyse der Blutausstriche ist ein Immersionsobjektiv notwendig. Schwenken Sie dazu vom 40x-Objektiv zum 100x-Objektiv, verweilen Sie dabei aber in der Mitte zwischen beiden Objektiven. Tragen Sie vorsichtig einen Tropfen Immersionsöl auf das Deckglas auf und schwenken Sie das 100x-Objektiv in Position. Wechseln Sie niemals zurück zum 40x-Objektiv, ohne das Öl vom Präparat zu entfernen! Achtung, einige Präparate sind nicht abwischbar! Reinigen Sie die Frontlinse des 100x-Objektivs nach Gebrauch sorgfältig mit Linsenputzpapier, um ein Verharzen des Öls zu vermeiden. Wenn das Öl auf dem Objektiv eintrocknet/verharzt wird dieses unscharf und ist unter Umständen unverwendbar. 1.2.1.5. Troubleshooting Sollte sich das Präparat nicht scharfstellen lassen, liegt in der Regel einer der folgenden Fehler vor: 1. Präparat ist zu dick (z.B. Elodea). 2. Durch zu schnelles Einschwenken des Objektivs wurden Luftblasen im Öltropfen eingeschlossen. 3. Der Ölfilm ist abgerissen, weil zu wenig Öl verwendet wurde. 4. Das Präparat liegt mit der Objektseite nach unten. 5. 100x-Objektive haben z.T. zum Schutz eine "Parkposition", dann über 90° Linksdrehung am Frontteil des Objektivs hinunterfahren. 1.2.2. Aufgaben/Experimente 1.2.2.1. Zusammenfassung: Bestimmung von Zellgrößen und Zellmorphologie mittels Lichtmikroskopie Im Rahmen des 1. Kurstags des Praktikums sollen Sie die Anwendung des Lichtmikrokops erlernen und die erworbenen Kenntnisse dazu verwendet werden, Morphologie und Größe von Zellen und Zellkompartimenten unterschiedlicher Spezies zu bestimmen (u.a. in Form von Skizzen). Sie lernen folgende Zelltypen als Vertreter der biologischen Reiche kennen: Bakterien (Escherichia coli und Staphylokokken) Pilze (Saccharomyces cerevisiae) Höhere Pflanzen (Elodea canadensis) Höhere Tiere (Gallus gallus domesticus) / Säugetiere (Homo sapiens, Oryctolagus cuniculus) 1.2.2.2. Regeln für das Anfertigen biologischer Skizzen/Zeichnungen Für die Zeichnung von lichtmikroskopisch beobachteten Strukturen gibt es ein paar klassische „Regeln“. Skizzen werden heute oft durch Fotographien ersetzt. Ein ausgeprägtes Verständnis der Abstraktionsleistung in dieser Form der Abbildung ist allerdings nicht nur notwendig, um „alte“ Quellen verstehen zu können, es trägt auch dazu bei, komplexe Inhalte auf die wichtigsten Informationen 13 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 reduzieren zu können. Um die gesetzten Lernziele zu erreichen ist es daher wichtig, dass Sie sich mit der Anfertigung biologischer Skizzen/Zeichnungen befassen und diese im Rahmen des Kurses anfertigen. Sie sind trotzdem herzlich eingeladen mit den Kameras ihrer Smartphones Bilder durch die Okulare zu machen und diese auch im Protokoll, neben Ihren Zeichnungen zu verwenden. Bei der Benutzung von Smartphones im Laborbereich ist allerdings mit Vorsicht vorzugehen, da Spuren von Gefahrstoffen so leicht „verschleppt“ werden können. Bitte achten Sie daher auf einen vorsichtigen Umgang. Eine mikroskopische Zeichnung soll das Objekt nach Form, Größenverhältnissen und im Zusammenhang mit der Umgebung darstellen. Das mikroskopische Momentbild ist flächig-eben. Für eine gelungene Zeichnung sollten die verschiedenen optischen Ebenen nacheinander betrachtet werden. Die Beobachtungen sollten dann in einer Zeichnung kombiniert werden. Aufgrund der inhärent zweidimensionalen Natur des Mikroskopiebilds werden normalerweise Schraffierungen, Punktierungen oder andere Mittel ein „dreidimensionales Bild“ zu zeichnen vermieden. Eine „klassische“ mikroskopische Zeichnung verzichtet auf Farben und ist mit einem Bleistift gezeichnet. Eine Vereinfachung der Strukturen ist üblich. Die Zeichnung sollte mit einem Maßstab versehen werden. Die Zeichnung sollte ausreichend beschriftet sein. Hierzu gehören: Name der Spezies (z.B. Escherichia coli), die Präparat Art (z.B. Abziehpräparat des Zwiebelhäutchens), eventuelle Färbungen, Name und Datum, sowie der Vergrößerungsfaktor. Die wesentlichen dargestellten Inhalte/Strukturen sollten beschriftet werden. Die Beschriftung erfolgt meist an der rechten Seite der Zeichnung. Die Beschriftungen werden der Struktur mit Linien zugeordnet. (Abb. 3) Abbildung 3: Beispiel für eine klassische mikroskopische Zeichnung (Abziehpräparat der Zwiebelhaut) mit Übersichtsskizze/geringer Vergrößerung (A) und stärkerer Vergrößerung (B). Beachten Sie die fehlende Beschriftung. (Quelle: unterrichten.zum.de, modifiziert) 14 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 1.2.2.3. Experiment 1: Erstellung des Mundschleimhautpräparats 1. Fahren Sie mit dem Spatel über die Innenseite Ihrer Mundhöhle (Backenbereich) und streichen Sie das gewonnene Material auf einem Objektträger aus. 2. Lassen Sie das Präparat 5 Minuten an der Luft Trocknen. 3. Stellen Sie den Objektträger für 15 Sekunden in eine mit Quickstain-Färbung gefüllte Färbeküvette. 4. Überführen Sie das Präparat aus der Färbelösung in eine mit Wasser gefüllte Färbeküvette. 5. Überführen Sie das in eine weitere mit Wasser gefüllte Färbeküvette. 6. Wiederholen Sie den schritt, bis 4 mit Wasser gefüllte Färbeküvetten durchlaufen sind. 7. Lassen Sie das Präparat an der Luft für mindestens zwei Stunden trocknen. (Das Präparat wird nicht mit einem Deckgläschen eingedeckelt. Das Präparat ist somit nicht Abwischbar oder Abtupfbar!) 8. Werten Sie das Präparat mikroskopisch im Rahmen von Experiment Nummer 5 aus. Abbildung 4: Anfertigung des Mundschleimhautpräparats ohne Deckgläschen. 1.2.2.4. Experiment 2: Eichung des Okularmikrometers Ermitteln Sie den Bildfelddurchmesser für die Nicht-Öl-Objektive (4x; 10x; 40x) mittels des in einem der beiden Okulare befindlichen Okularmikrometers ("Strichplatte") anhand der ausgegebenen Raster- Strichplatten (= Agar-scientific 200 mesh copper-grid). Der Durchmesser des ganzen „grids“ beträgt von Außenkante zu Außenkante 3,05 mm. Die Innenlänge eines einzelnen Quadrates (Innenkante zu Innenkante) beträgt 90 µm („hole“). Die Strichdicke beträgt 35 µm (bar). Ein ganzes Feld (Innenquadrat und ein Strich) ist damit 125 µm lang („pitch“). Notieren Sie sich die Eichwerte in Ihrem Skript zur weiteren Nutzung im Verlauf des Praktikums. Extrapolieren Sie den Wert für das 100x-Objektiv nach graphischer Auftragung. 15 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 Abbildung 5: Hellfeld Aufnahme eines "200 mesh copper-grid" aus der Elektronenmikroskopie, angefertigt auf einem digitalen Durchlichtmikroskop unter Nutzung des 4x-Objektivs (A) und des 20x-Objektivs (B), „Scalebars“ automatisch; Pfeile - Herstellerangaben 1.2.2.5. Experiment 3: Der pflanzliche Zellverband am Beispiel von Elodea canadensis Skizzieren Sie den Aufbau des pflanzlichen Zellverbandes am Beispiel der Elodea canadensis. Bestimmen Sie die Größe der Pflanzenzelle und die Größe der Chloroplasten (Der Zellkern ist hier meist gar nicht bzw. nur schwer zu erkennen). Abbildung 6: Anfertigung des Elodeapräparats. 1.2.2.6. Experiment 4: Größe von Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae Sichten Sie die bereitgestellten Bakterienpräparate und fertigen Sie ein Hefepräparat wie in Abbildung 7 dargestellt an. 1. Wie viele Hefezellen enthält ein Quader Bäckerhefe (3 cm x 3 cm x 4,5 cm; 42 g)? 2. Wie viel wiegt eine Hefezelle? 16 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 Abbildung 7: Anfertigung der Hefepräparate. 1.2.2.7. Experiment 5: Darstellung von Epithelzellen von Homo sapiens Betrachten Sie das Präparat aus Experiment 1. 1. Welche Zelltypen erkennen Sie? 2. Skizzieren und vermessen Sie die Zellen. Erkennen Sie noch andere Strukturen außer Ihren Epithelzellen? (=> Nutzen Sie hier unbedingt auch das 100x Öl-Objektiv) 1.2.2.8. Experiment 6: Hochspezialisierte Zellen höherer Tiere Darstellung von hoch spezialisierten Zellen höherer Tiere am Beispiel von roten Blutkörperchen von Homo sapiens (Mensch) und Gallus gallus domesticus (Huhn). Diese Präparate sind NICHT unter Deckglas eingeschlossen und können daher nur mit dem 100x Öl-Objektiv + 1 Tropfen Immersionsöl betrachtet werden. Präparate anschließend NICHT ABWISCHEN, sondern senkrecht zurück in den Objektträgerkasten stellen. Tragen Sie alle anhand der Präparate bestimmten Größen in die Sammeltabelle ein. 1.2.3. Kurstag 1 – Ergebnisblätter 17 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 Ergebnisblatt 1 / Kurstag 1: Gruppe: ___________ Zu Experiment 2: Eichung Okularmikrometer Objektiv Sehfelddurchmesser in µm bzw. mm 1 Teilstrich (von Strich zu Strich, bzw. von Zahl zu Zahl) entspricht in µm 4x 10 x 40 x 100 x (extrapoliert) 5 Sehfelddurchmesser [mm] 4 3 2 1 4 10 40 100 Vergrößerungsfaktor des Objektivs Zu Experiment 3: Skizze Elodea-Zellen (mit Vergrößerungsfaktor und Maßstab) 18 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 1 Ergebnisblatt 2 / Kurstag 1 Gruppe: ____________ Zu Experiment 4: Das ungefähre Volumen einer Hefezelle beträgt ca. _____ µm3 (Grundannahme: Betrachten Sie die Zelle als quadratischen Würfel mit einer Kantenlänge von 5 µm). 1 cm3 / 1 g enthält demnach ca. ______ / _____ Zellen. Eine Hefezelle wiegt demnach _________ g (statt Gramm auch andere Größeneinheitsangabe möglich). Zu Experiment 5: Zu Experiment 6: Skizze von Epithelzellen der Skizze von jeweils einem roten Blutkörperchen von Homo Mundschleimhaut des Homo sapiens sapiens und Gallus gallus domesticus Größenbestimmungen von Zellen verschiedener Spezies ca. Länge ca. Durchmesser / "Breite" [µm] Bakterien [µm] Hefezellen Pflanzenzelle Chloroplast ----- Tierische Zelle ----- " Zellkern rotes Blutkörperchen G. gallus dom rotes Blutkörperchen H. sapiens 19 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 2 2. Kurstag 2 2.1. Kurstag 2 – Theoretischer Hintergrund 2.1.1. Biologisch relevante Makromoleküle: DNA, Proteine, Farbstoffe Im Rahmen von Kurstag 2 sollen Sie sich mit den biochemischen Eigenschaften von Nukleinsäuren und Proteinen befassen. Proteine sind biologisch wichtige Makromoleküle, die in verschiedenen Zellprozessen eine Schlüsselrolle spielen. Nukleinsäuren, insbesondere Desoxyribonukleinsäure (DNA), beherbergen die zur Herstellung von Proteinen notwendigen Informationen. Nukleinsäuren sind aus Bausteinen namens Nukleotide aufgebaut. Ein Nukleotid besteht aus drei Hauptkomponenten: einer stickstoffhaltigen Base (es gibt zwei Arten, die Pyrimidine: Cytosin, Thymin, Uracil und die Purine: Adenin, Guanin), einer Zuckergruppe (entweder Desoxyribose oder Ribose, welche zur Gruppe der Pentosen gehören) und einer Phosphatgruppe. An den Zuckern sind die Basen über eine N-glykosidische Bindung angehängt. Die Nukleotide sind durch sogenannte Phosphodiesterbindungen zwischen der 5'-Phosphatgruppe des einen Nukleotids und der 3'-Hydroxy- Gruppe der Pentose des nächsten miteinander verknüpft. Die so entstehenden langen Ketten werden Polynukleotide genannt. Das Rückgrat dieser Ketten besteht also aus einer abwechselnden Abfolge von Zucker-Phosphat-Zucker-Phosphat. Ribonukleinsäure (RNA)-Moleküle liegen (meist) als einzelne Polynukleotidkette vor. DNA-Moleküle hingegen bestehen aus zwei Polynukleotidketten, die durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen miteinander nicht kovalent interagieren (die einzelnen Stränge hybridisieren). Diese Struktur bildet die berühmte Doppelhelix der DNA (siehe Abb. 6 sowie Deckblatt). Da die Phosphatgruppen auf dem Rückgrat unter physiologischen Konditionen deprotoniert vorliegen, weisen sie negative Ladungen auf. DNA ist daher polar und in Wasser löslich. Ebenfalls polare Wassermoleküle bilden eine sogenannte Hydrathülle und Van-der-Waals-Wechselwirkungen gewährleisten die Stabilität. Abbildung 8: Struktur der DNA-Doppelhelix (3D-Druck). Die Abfolge der Basen in der DNA, die sogenannte Basensequenz, ist entscheidend, da sie die genetische Information enthält. Zum Beispiel bildet Adenin immer Wasserstoffbrückenbindungen mit Thymin, und Cytosin bildet Bindungen mit Guanin. Diese Basenpaarung ist ein Schlüsselkonzept für die genetische Information und die DNA-Replikation. Die DNA wird in Zellen als Vorlage für die Biosynthese von Proteinen verwendet. Dieser Prozess beginnt mit der Transkription, bei der eine RNA-Kopie der DNA erstellt wird. Diese RNA wird dann als Vorlage für die Translation verwendet, um Polypeptide herzustellen. Die Sequenz der Basen in der RNA 20 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 2 bestimmt dabei die Abfolge der Aminosäuren in der Polypeptidkette, was wiederum die Struktur bestimmt, welche wiederum die Proteinfunktion bestimmt. Bei Eukaryoten findet die Transkription im Zellkern statt, die Translation im Zytosol. Da Prokaryoten keinen Zellkern aufweisen, erfolgen Transkription und Translation hier räumlich gekoppelt. Proteine sind aus Aminosäuren aufgebaut. Von über 400 bekannten Aminosäuren zählen beim Menschen allerdings nur 21 zu den proteinogenen, d.h. proteinbildenden, Aminosäuren. Eine Aminosäure besteht aus einem zentralen Kohlenstoffatom, das mit einer Aminogruppe, einer Carboxylgruppe, einem Wasserstoffatom und einer sogenannten Seitenkette verbunden ist. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften einer Aminosäure werden weitgehend von seiner Seitenkette bestimmt, die je nach Aminosäure unpolar, polar, sauer oder basisch sein kann. Aminosäuren werden durch Peptidbindungen miteinander zu Polypeptiden verknüpft. Die Abfolge der Aminosäuren in einer Polypeptidkette bestimmt die Primärstruktur eines Proteins. Zusätzlich zur Primärstruktur können Proteine Sekundärstrukturen aufweisen, die sich aus Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Polypeptiden ergeben. Diese Sekundärstrukturen formen sich weitestgehend unabhängig von den Seitenketten und umfassen die α-Helix (eine Spirale) und das ß-Faltblatt (mehrere parallel verlaufende Abschnitte). Weitere räumliche Anordnungen werden durch Wechselwirkungen zwischen den Seitenketten der Aminosäuren in die Tertiärstruktur eines Proteins gebildet. Diese Struktur wird durch verschiedene Arten von Bindungen stabilisiert, darunter Van-der-Waals-Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindungen, Ionenbindungen und sogar kovalente Disulfidbrücken. Schließlich bestehen einige Proteine aus mehreren Polypeptidketten, was ihre Quartärstruktur definiert. Proteine sind in fast allen zellulären Aktivitäten involviert, sei es als strukturelle Bestandteile des Zytoskeletts, als Transporter, als Signalmoleküle oder als Enzyme, die chemische Reaktionen katalysieren. Ein Beispiel für ein solches Enzym ist die NAD(P)-abhängige Laktatdehydrogenase (LDH), die im Praktikum untersucht wird. LDH ist ein Tetramer, das aus vier Untereinheiten besteht und die Reduktion von Pyruvat zu Laktat katalysiert (Quartärstruktur, Abb. 7). Dieser Prozess ist in verschiedenen Geweben des menschlichen Körpers von Bedeutung und ermöglicht die Aufrechterhaltung der Glykolyse unter anaeroben Bedingungen. LDH kann jedoch auch in pathologische Prozesse verwickelt sein, wie z.B. in erhöhter LDH-Aktivität bei Tumoren. Pyruvat + NADH + H+ Laktat + NAD+ Im Praktikum wird die LDH als Beispielprotein hinsichtlich thermischer Stabilität und Aktivität untersucht. Die Konformation eines Proteins und damit die Aktivität eines Enzyms sind in höchstem Maße mit physikalischen und chemischen Parametern der Umgebung, wie pH-Wert, Salzkonzentration oder eben auch der Temperatur verknüpft. Änderungen dieser Parameter können eine Entfaltung des Proteins herbeiführen (Denaturierung). 21 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 2 Abbildung 9: Strukturmodell der Quartärstruktur der humanen muskulären Laktatdehydrogenase (Read JA, Winter VJ, Eszes CM, Sessions RB, Brady RL (May 2001). "Structural basis for altered activity of M- and H-isozyme forms of human lactate dehydrogenase". Proteins 43 Im Rahmen des zweiten Kurstages sollen neben den biochemischen Eigenschaften von Nukleinsäuren und Proteinen auch die Eigenschaften einfacher Farbstoffe vermittelt werden. Hierbei stehen Anthocyane (aus Rotkohlextrakt) und Carotinoide (aus Tomatenextrakt) im Fokus. Sie werden diese Farbstoffe extrahieren und ihre Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln untersuchen. Carotinoide sind Moleküle mit einem Tetraterpen-Gerüst (siehe Abbildung 8A) und absorbieren Licht im Bereich von 400-550 nm. Anthocyane hingegen weisen eine Ringstruktur auf (siehe Abbildung 8B) und absorbieren Licht im Bereich von 450-650 nm. A B Abbildung 10: Strukturformeln des Carotinoids Lycopin (A, u.a. vorkommend in der Tomate) sowie des Anthocyans Cyanidin (B, u.a. vorkommend im Rotkohl). 22 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 2 2.1.2. Konzentrationsbestimmung durch Photometrie Gelöste Substanzen können im sichtbaren (wie Farbstoffe, z.B. Anthocyane oder Carotinoide) oder im ultravioletten (einige Aminosäuren, Nukleotide, Nukleinsäuren) Wellenlängenbereich eine Eigenabsorption aufweisen. Alternativ kann ein Farbstoff durch eine chemische Reaktion erzeugt werden (z.B. Proteinbestimmung). Eine gängige Methode zur Konzentrationsbestimmung basiert auf der Messung der 'Extinktion' (Auslöschung) oder 'Absorption' (Aufnahme), da sie in einem weiten Konzentrationsbereich des absorbierenden Stoffes proportional ist (Lambert-Beer'sches Gesetz). Merke: Konzentration = Menge/Volumen Menge = Konzentration x Volumen Gesetze der Lichtabsorption Bei einem gleichmäßig absorbierenden Medium bezeichnet man den Anteil an Strahlung, der es durchdringt, als Transmission, T: Die Absorption A oder Extinktion E gibt an, dass Strahlung von der zu messenden Substanz „ausgelöscht“ wird (E = log1/T). Der Ausdruck optische Dichte (O.D.) ist im Englischen üblich. Das Lambert-Beer´sche Gesetz besagt, dass die Extinktion der Konzentration der absorbierenden Substanz und der Schichtdicke proportional ist, d.h. E=εxcxd wobei: c = molare Konzentration der absorbierenden Substanz d = Lichtweg im absorbierenden Material in Zentimetern (Schichtdicke) ε = molarer Extinktionskoeffizient für die absorbierende Substanz bei einer definierten Wellenlänge λ, ε eine Materialkonstante der Substanz und wird nachgeschlagen. Die Transmission wird gewöhnlich in % ausgedrückt. Die Extinktion/Absorption variiert von 0 - ∞. Beide Größen sind dimensionslos, da ein Logarithmus enthalten ist. 23 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 2 2.2. Kurstag 2 – Praktischer Teil 2.2.1. Aufgaben/Experimente 2.2.1.1. Zusammenfassung Am zweiten Kurstag werden Ihnen anhand einfacher Versuche die biochemischen Eigenschaften von Nukleinsäuren, Proteinen und Farbstoffen vermittelt. Hierbei werden die Extraktion bzw. Reinigung von Zellbestandteilen sowie Untersuchungen zur Quantifizierung, biologischen Aktivität, Stabilität, Löslichkeit und spektroskopischen Eigenschaften vorgestellt. 2.2.1.2. Experiment 1: Extraktion von DNA aus tierischem Gewebe Ein kleines Stück Kalbsthymus/Kalbsbries (Würfel, Kantenlänge: 5 mm, Gewicht: ca. 125 mg) in einer Reibschale mit Quarzsand und 1,5 ml DNA-Puffer zerreiben (Zerstörung von Zellverbänden und Zellen durch mechanische Einwirkung) Das entstandene Homogenat in ein Eppendorf-Röhrchen überführen 4 Megaperls von Persil zugeben (Megaperls enthalten Detergenzien zur Erhöhung der Löslichkeit von Lipiden und Proteinen; Enthaltene thermostabile Proteasen, Lipasen und Amylasen bauen Proteine, Lipide und Zucker durch Spaltung ab) 60°C für eine Stunde inkubieren Bei 13.000 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 5 Minuten zentrifugieren (Wie viel g entspricht diese Drehzahl - Umrechnung gemäß der Berechnungsformel im Anhang) 750 µl des flüssigen Überstands in ein neues Röhrchen pipettieren und den restlichen Überstand in ein weiteres neues Eppi überführen und für Experiment 4 aufheben (mit „[E-D] (Extrakt-DNA) beschriften“) 750 µl Isopropanol zugeben (DNA fällt aus und wird sichtbar) Untere, trübe Flüssigkeit absaugen, dabei darauf achten keine DNA zu entfernen Mit frischem Isopropanol auffüllen (verbessert Sichtbarkeit) 2.2.1.3. Experiment 2: Löslichkeit hydrophiler und lipophiler Farbstoffe Um aus den Zellextrakten einzelne Substanzen anzureichern, werden deren physikochemische Eigenschaften wie z.B. die Löslichkeit ausgenutzt (z.B. Hydrophilie oder Lipophilie): Für Rotkohl: Ein kleines Stück Rotkohl (Kantenlänge: ca. 5 mm) in einer Reibschale mit Quarzsand und 1 ml Protein-Puffer zerreiben Homogenat in ein Eppendorf-Röhrchen übertragen Zentrifugation bei 13.000 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 5 Minuten Klaren Überstand in ein neues Röhrchen überführen 500 µl Überstand mit etwa 500 µl Petroläther (Gemisch verschiedener Alkane, organisches Lösungsmittel) versetzen und kräftig mischen Bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugieren (zur Phasentrennung) Löslichkeit optisch überprüfen Für Tomatenmark: 24 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 2 Eine Spatelspitze Tomatenmark mit 1 ml Protein-Puffer in ein Eppendorf-Röhrchen geben und bei höchster Stufe für ca. 1 min vortexen Zentrifugation bei 13.000 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 5 Minuten Klaren Überstand in ein neues Röhrchen überführen 500 µl Überstand mit etwa 500 µl Petroläther (Gemisch verschiedener Alkane, organisches Lösungsmittel) versetzen und kräftig mischen Bei 13.000 rpm für 1 min zentrifugieren (zur Phasentrennung) Löslichkeit optisch überprüfen 25 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 2 2.2.1.4. Experiment 3: Extraktion, thermische Stabilität und Aktivität von Proteinen Teil 1: Extraktion Ein kleines Stück Fleisch (Würfel, Kantenlänge: 5 mm, Gewicht: ca. 30 mg) in einer Reibschale mit Quarzsand und 1,5 ml Protein-Puffer zerreiben Homogenat in ein Eppendorf-Röhrchen überführen Zentrifugation des Fleischextrakts bei 13.000 Umdrehungen pro Minute (rpm) für 5 Minuten Klaren Überstand in ein neues Röhrchen überführen und entsprechend benennen: [E-P] (Extrakt-Protein) (das nicht verwendetes Sediment enthält im Fall des Fleischextrakts: Zellkerne, Mitochondrien, Membranfragmente / Mikrosomen und Zytoskelettelemente) Teil 2: Thermische Stabilität Die Stabilität der Faltung (= geordnete Raumstruktur) gegenüber der Temperatur ist eine biochemische Eigenschaft, die charakteristisch für ein bestimmtes Makromolekül ist. Mit der Denaturierung eines Proteins geht in der Regel die Wasserlöslichkeit (Kochen von Eiern) und die biologische Aktivität verloren: Je 50 µl Fleischextrakt in 4 Eppendorf-Röhrchen geben (Den Rest NICHT verwerfen) Jeweils 1 Röhrchen bei 37 °C, 50 °C, 60 °C und 100 °C (Deckel durchstechen, damit Druck entweichen kann!) für 10 Minuten inkubieren Bezeichnung der Röhrchen entsprechend der Temperatur: z.B. [E-P-37], [E-P-50], [E-P-60], [E- P-100] (Extrakt-Protein-37 °C, etc.) Sie beobachten je nach Temperatur eine Trübung des klaren Fleischextrakt-Überstandes [E-P] Teil 3: Biologische Aktivität In diesem Experiment soll die enzymatische Aktivität und Stabilität der Laktatdehydrogenase (LDH) als repräsentatives Beispiel für ein Protein untersucht werden: Tragen Sie entsprechend des in Abbildung 9 dargestellten Schemas jeweils einen Tropfen (1-1,5 µl) der verschiedenen behandelten Extrakte und der zugehörigen Kontrollen (unbehandeltes Proteinextrakt [E-P], Eiklar [E-K] sowie Protein-Puffer [P- P]) auf ein Filterpapier auf. Beachten Sie, dass alles auf ein Filterpapier mit der Größe einer Briefmarke passt. (bitte gut beschriften, Gruppennummer) (1) unbehandelter Fleischextrakt = 22 °C (Raumtemperatur) [E-P] (2) Fleischextrakt, der 10 min bei 37 °C inkubiert wurde [E-P-37] (3) “ “ 50 °C “ [E-P-50] (4) “ “ 60 °C “ [E-P-60] (5) “ “ 100 °C “ [E-P-100] (6) Eiklar [EK] (7) Kontrolle: reiner Protein-Puffer [P-P] 26 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 2 Die Proben sollten nun antrocknen. Legen Sie die Filterpapiere danach an die im Kurs kommunizierten Stellen. Von der Kursbetreuung werden die Filterstreifen anschließend in die giftige Färbelösung (Substratlösung) überführt und 10 Minuten lang im Dunkeln inkubiert. Danach wird der Filter in 5 % Essigsäure gespült und getrocknet. Die Enzymaktivität kann anhand einer dunkelblauen Farbreaktion analysiert werden. Abbildung 11: Muster f. Auftrag; Größe max. 20 x 20 mm Abbildung 12: Die chemische Aktivität von Laktatdehydrogenase und ihre Detektion. LDH konvertiert Laktat + NAD zu Pyruvat + NADH+ H+. Das Proton, was dabei entsteht reduziert das Tetrazolium, zu Formazan, welches eine blaue Farbe hat. (Jelinek et al. 2018) 2.2.1.5. Experiment 4: Bestimmung der Konzentration von extrahierten Proteinen und DNA In diesem Versuch sollen die Konzentrationen der in den Experimenten 1 und 3 gewonnenen Makromoleküle DNA [E-D] und Proteine [E-P] untersucht werden. Hierzu werden die Proben in verschiedenen Verdünnungen mit dem Spektralphotometer vermessen. Achten Sie darauf, die spezifischen Wellenlängen für DNA und Proteine zu beachten, da sie unterschiedliche Absorptionsmaxima haben. Mit Hilfe des Lambert-Beer´schen Gesetzes kann dann die Konzentration errechnet werden: Von beiden Proben ([E-D] und [E-P]) die Verdünnungen 1:10, 1:50, 1:100 und 1:1000 vorbereiten (notieren Sie zuvor die nötigen Volumina für die Herstellung von je 1 ml jeder Verdünnung im Ergebnisblatt). Fertigen Sie die entsprechenden Volumina in den Messküvetten an. Bei welcher Wellenlänge sollten die Verdünnungen des DNA-Extraktes [E-D], bei welcher die Verdünnungen des Proteinextraktes [E-P] vermessen werden? -Tragen Sie die Wellenlängen ins Ergebnisblatt ein. Vermessen Sie die Verdünnungen im Spektralphotometer bei den entsprechenden Wellenlängen, verwenden Sie die entsprechenden Puffer als Leerwerte. 27 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 2 Notieren Sie die Extinktionswerte für jede Probe und Verdünnung im Ergebnisblatt und berechnen Sie die Konzentrationen der verdünnten Proben mithilfe des Lambert-Beer'schen Gesetzes. Dokumentieren Sie die Ergebnisse im Ergebnisblatt und tragen Sie diese als Graphen auf, der die Konzentrationen der Proben im Verhältnis zu den Verdünnungsfaktoren zeigt. 2.2.2. Kurstag 2 – Ergebnisblätter 28 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 2 Ergebnisblatt 1 / Tag 3: Gruppe: _______ 1.1. Zu Experiment 1: Beschreiben Sie den Zustand der DNA nach Isopropanolbehandlung. 2. Zu Experiment 2: Welche der getesteten Substanzen sind hydrophil = wasserlöslich, welche lipophil = fettlöslich? Angabe der Farbe der Petrolätherphase, der Wasserphase Rotkohl Tomate lipophil (obere Petroläther-Phase) hydrophil (untere = Wasser-Phase) 3. Zu Experiment 3, Teil 2: Wie hitzestabil ist das Proteinextrakt [E-P], ab welcher Temperatur fällt das Protein im Extrakt aus (bzw. denaturiert)? 4. Zu Experiment 3, Teil 3: In welchen Extrakten befindet sich LDH-Aktivität und wie hitzestabil ist diese Enzym-Aktivität? Geben sie das Ergebnis der Farbreaktion bzw. die LDH-Aktivität in 0, +, ++ oder +++ an Ergebnis Versuchsteil Proteinextrakt (unbehandelt; 22° C) [E-P] " 37 °C [E-P-37] " 50 °C [E-P-50] " 60 °C [E-P-60] " 100 °C [E-P-100] Eiklar [EK] Proteinpuffer [P-P] 29 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Kurstag 2 Ergebnisblatt 2 / Tag 3: Gruppe: _______ 5. Zu Experiment 4: Bestimmung der Konzentration von extrahierten Proteinen und DNA Tragen sie die Volumina der Verdünnungen, gemessene Extinktionen sowie Konzentrationen entsprechend in die Tabelle ein. Verdünnung Volumen Volumen finales Gemessene Berechnete DNA [E-D] (Probe) (Puffer) Volumen Extinktion (E) Konzentration (Verdünnung) 1:10 1000 µl 1:50 1000 µl 1:100 1000 µl 1:1000 1000 µl Verdünnung Volumen Volumen finales Gemessene Berechnete Protein [E-P] (Probe) (Puffer) Volumen Extinktion (E) Konzentration (Verdünnung) 1:10 1000 µl 1:50 1000 µl 1:100 1000 µl 1:1000 1000 µl Extinktion E für Protein gemessen bei ________ nm Extinktion E für DNA gemessen bei ________ nm 6. Zu Experiment 4: Graph: Konzentrationen der Proben im Verhältnis zu den Verdünnungsfaktoren 30 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Technischer Anhang 3. Technischer Anhang Präparative Zentrifugation Schnittzeichnung eines Festwinkelrotors, wie er im Praktikum in einer Eppendorf-Tischzentrifuge zu finden ist: rmin = 3,8 rav = ? cm rmax = 6,4 cm Abbildung 13: Illustration des Radius eines Zentrifugen Rotors. Schleuderradien r am oberen Ende (rmin), am Boden des Röhrchens (rmax) und der durchschnittliche Radius (rav). Die Sedimentationsgeschwindigkeit ist abhängig von der Zentrifugalbeschleunigung A (Dimension Ix t-2), die radial nach außen wirkt und durch die Winkelgeschwindigkeit des Rotors (ω, Dimension t-1) und durch den Abstand des Teilchens vom Mittelpunkt des Rotors (r, Dimension I) bestimmt wird. Die Zentrifugalbeschleunigung ist: A = ω2 r [cm s-2] wobei r = Schleuderradius in cm (s. Zeichnung). ω = 2 π U/60 [min-1] mit U = Umdrehungen/min, daher Faktor 60, so daß A = 4 π2 U2 x r/3.600 [cm x min-2] Die relative Zentrifugalbeschleunigung (RZB) ist A ausgedrückt als Vielfaches von g (daher dimensionslos), der Erdbeschleunigung (980 cm x s-2): RZB = 4 π2 [U x min-2] x r [cm]/3.600 x 980 [cmx s-2] Dieser Term kann gekürzt werden zu: RZB = 1.11 x 10-5 U2 x r U in rpm, r in cm Diese Formel ist auch für die Waschmaschine zuhause maßgebend: Überlegen Sie, welche Werte bei einem Radius von z.B. 18 cm und einer Drehzahl von 1000 U min-1 bei einer Beladung mit 5kg Wäsche vorliegen. Die im Praktikum verwendeten Klein-Zentrifugen erreichen Drehzahlen von ca. 13.000 U min-1. 31 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen Technischer Anhang Angaben für das praktische Rechnen Zehnerpotenzen in der Biologie und Chemie Bezeichnung* Kommentar/Beispiel Zehnerpotenz -12 p, pico 3 pg: DNA-Gehalt einer menschlichen Zelle pM: Wirkkonzentration hochwirksamer Botenstoffe, z.B. Sexualhormone -9 n, nano 1 nm: (Nanometer) = 10 Å (Angström) 1 Å: Größenordnung von Atomabständen und praktisches Auflösungsvermögen vieler Elektronenmikroskope -6 µ, mikro** 100 µm (Mikrometer) ist der Durchmesser vieler Eizellen, ca. 0,1 mm ist das Auflösungsvermögen des menschlichen Auges -3 m, milli mm (Millimeter) Standard-Maßeinheit im täglichen Leben -2 c, centi cm: Haushalts-Maßeinheit (z.B. Bauchumfang) m: (Meter) = SI-Einheit der Länge 0 1 m ≈ Länge der menschlichen DNA / 23 Chromosomen Sekunde s = SI-Einheit der Zeit 3 K, kilo auch k, Kilogramm kg = SI-Einheit der Masse 6 M, mega 1 Mg = 1 t (Tonne) 4 M Basen ≈ Größe des E. coli-Genoms 1 MByte ≈ Kapazität eines Arbeitsspeicher (Computer der 90er Jahre) 9 G, giga 3 Gigabasen ist die Größe des menschlichen Genoms = etwas unter 1 GByte 12 T, tera Tera: Präfix für Billion (1012) SI = Système International d`Unités * Die hier aufgeführten Bezeichnungen sind dem Lateinischen und Griechischen entlehnt. ** (sprich „mikro”, nicht „mükro”) Formel zur einfachen Verdünnung einer gewünschten Konzentration: Werden weniger als a ml Lösung gewünscht: 𝐛∗𝐕 a = Ausgangskonzentration =𝐱 b = benötigte Konzentration 𝐚 V = gewünschtes Volumen x = Volumen der Ausgangslösung, das auf V aufgefüllt werden muss 32 Basismodul Biologie Praxis I: Von der Zelle zu MakromolekülenTheoretischer Hintergrund 4. Literatur Der Stoff dieses Praktikumsteiles wird in der Vorlesung ”Basismodul Biologie I Theorie” (Vorl.-Verz. 20 01 00) vorbereitet. Diese bezieht sich auf das Lehrbuch Campbell, N.A., Reece, J.B. (201x) Biologie. Spektrum Verlag, welches auch die Grundlage dieses Praktikums darstellt. Außerdem werden folgende Bücher zum Nachlesen empfohlen: Purves, W.K., Sadava, D., Orians, G.H., Heller, H.C. (201x) Biologie. Spektrum Verlag (ISBN: 9783827420077) Klinke, R. und Silbernagl, S. (1996) Lehrbuch der Physiologie. Thieme Verlag Lottspeich, F., Zorbas, H. (200x) Bioanalytik. Spektrum Verlag Maßeinheiten und Dimensionen werden verständlich erläutert in: Silbernagl, S. und Despopoulos, A. (2005) Taschenatlas der Physiologie, Thieme Verlag Auch Schullehrbuch (so noch vorhanden), z.B. „Biologie heute (SII) Schroedel Verlag oder Linder „Biologie“ Schroedel Verlag können zum Nachlesen des Basiswissens verwendet werden. 2

Zellbiologie Praxis I: Von der Zelle zu Makromolekülen PDF - Praktikumsskript

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