Maduración del ARN - PDF

Tema 8b Maduración del ARN Internal use MADURACIÓN DEL ARNm eucariota Transcrito primario  Splicing → eliminación de intrones  Casquete en 5’ (cap) ARNm  “Cola” poli(A) en 3’ → 80 a 250 residuos...

Tema 8b Maduración del ARN Internal use MADURACIÓN DEL ARNm eucariota Transcrito primario  Splicing → eliminación de intrones  Casquete en 5’ (cap) ARNm  “Cola” poli(A) en 3’ → 80 a 250 residuos  Los complejos proteicos que llevan a cabo la maduración están asociados unos con otros y con la Pol II (CDT fosforilado)  Maduración acoplada a su transporte al citoplasma Internal use  Casquete en 5’ del ARNm (“CAP”) Residuo de 7-metilguanosina unido al residuo 5’-terminal  Enlace 5’,5’-trifosfato  Protege al ARNm de las ribonucleasas  Participa en la unión del ARNm al ribosoma Internal use Se transcriben intrones y exones La inmensa mayoría de los genes de los vertebrados contienen intrones Genes de las histonas → excepción Se transcriben con el resto del gen → Transcrito primario Se cortan los intrones y se empalman los exones ARN maduro y funcional ARNm de eucariotas Exones → menos de 1.000 nucleótidos, lo más frecuente 100-200 nucleótidos Intrones → 50 – 20.000 nucleótidos Más ADN en los intrones que en los exones Internal use Tipos de intrones  Grupo I  Grupo II  De espliceosoma  De corte y empalme Internal use Intrones grupo I y grupo II  Intrones grupo I En algunos genes nucleares, mitocondriales y de cloroplastos: codifican ARNm, ARNr y ARNt. Algunos intrones bacterianos (muy escasos)  Intrones grupo II Transcritos primarios de ARNm de mitocondrias y cloroplastos, en hongos, algas y plantas. Intrones bacterianos (muy escasos) Características comunes a los dos grupos  No necesita enzimas → Auto corte y empalme  Son ribozimas  No necesitan cofactores de alta energía (ATP) Internal use Intrones de espliceosoma  Grupo más numeroso de intrones  En eucariotas  En transcritos primarios del ARNm nuclear  No autocorte y empalme Se eliminan por acción del espliceosoma  Complejo ARN-proteínas denominados snRNP Pequeños ARN nucleares (snRNA, 100-200 nt)  U1, U2, U4, U5 y U6 Proteínas muy conservadas Internal use  Mecanismo de corte y empalme de intrones de espliceosoma snARN U1 se aparea junto a región 5’ snARN U2 se aparea en una región del corte del intrón → ayuda a que contiene un residuo A que definir el sitio de corte y empalme actúa como nucleófilo en la reacción de corte-empalme Dinucleótidos específicos en los extremos 5’ y 3’ del El apareamiento de U2 produce intrón una protuberancia que desplaza y activa a la A (formará estructura en lazo) Internal use  Ensamblaje del espliceosoma Primero se unen las snRNP U1 y U2 A continuación se unen las restantes snRNP para formar un espliceosoma inactivo Reordenamiento interno y liberación de U1 y U4 → espliceosoma activo U6 está apareado simultáneamente con el lugar de corte en 5’ y con U2 Internal use El 2’-OH de la adenosina específica del intrón actúa como nucleófilo para formar una estructura en lazo. Se formará un enlace 2’,5’- fosfodiéster (≈ intrones grupo II) El 3’-OH del exón 5’ actúa como nucleófilo: rotura en el extremo 3´del intrón El intrón es degradado en el núcleo Internal use  El proceso de corte y empalme está coordinado con la transcripción Algunos componentes del espliceosoma están unidos al CTD de la ARN polimerasa II Cuando se sintetiza el primer punto de empalme se le une un espliceosoma Se capta el segundo punto de corte facilitando el proceso de corte y empalme Internal use  Cuarta clase de intrones  Presente en ciertos ARNt de eucariotas y arqueobacterias  Mecanismo de corte y empalme  Requiere ATP  Una endonucleasa corta los extremos del intrón  Los dos exones se unen por un mecanismo similar al de la ADN ligasa Internal use  Cola de poli(A) en el extremo 3’ 80 a 250 residuos A en el extremo 3’ Sitio de unión de proteínas específicas en traducción Protegen al ARNm de la destrucción enzimática Señal de poliadenilación El transcrito se extiende más allá del sitio donde debe añadirse la cola de poli(A) Secuencia que señala el sitio de corte del ARN “extra” (10-30 nucleótidos corriente arriba del sitio de corte) donde se sintetizará la cola poli(A) Complejo enzimático, con actividad endonucleasa, reconoce la secuencia señal Internal use  El ARN es cortado por la endonucleasa en un punto a 10 - 30 nucleótidos en el lado 3’ de la señal El corte genera un 3’-OH libre - La enzima sintetiza una cola de poli(A), empezando en el sitio de corte Reacción de la poliadenilato polimerasa: RNA + nATP → RNA-(AMP)n + nPPi n= 80 a 250 No necesita molde, pero sí un ARNm cortado Internal use  Resumen: maduración global de un ARNm eucariota por dominados espeacing evitein se poliadenila  A veces “edición” del ARN maduro → procesos que añaden o eliminan bases en las regiones codificantes o que cambian la secuencia Internal use Maduración diferencial del ARN Transcrito primario de ARN 1 ruta de maduración Más de 1 ruta de maduración 1 único ARNm Diferentes ARNm 1 único polipéptido Diferentes polipéptidos  Factores de Maduración Proteínas de unión al ARN que promueven una ruta determinada  Los transcritos complejos pueden tener:  Más de un sitio de corte y poliadenilación  Patrones de corte y empalme alternativos Internal use  Patrones de corte y poliadenilación alternativos Dos sitios de poliadenilación ARNm maduros de distinto tamaño Ej. dominios variables de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas Internal use  Patrones de corte y empalme alternativos Dos sitios diferentes de corte en 3’ Diferentes ARN m maduros a partir del mismo transcrito primario Ej. Tres formas diferentes de la cadena pesada de miosina en la mosca del vinagre Internal use Maduración diferencial del transcrito del gen de la calcitonina en ratas 2 sitios de poliadenilación Splicing alternativo CEREBRO TIROIDES (CGRP: péptido relacionado con el gen calcitonina) Internal use (calcitonina)  UTR: Regiones no traducidas  En el ADN genómico podemos distinguir las mismas regiones  Regiones que se transcriben pero no se traducen.  Importantes en la regulación de la expresión génica. ADN Codón de Codón de & iniciación de terminación de la traducción la traducción ARN Transcrito primario -da lugar prot. a Región codificante (CDS) ARN Maduro Región No Traducida 5’ Región No Traducida 3’ 5’-UTR 3’-UTR pero Necesaria pero NecesariaInternal use Degradación celular de los ARNm  Un factor crucial en la expresión génica es la concentración celular del ARNm Velocidad de síntesis En equilibrio Velocidad de degradación Concentración estacionaria Tasa de degradación de ARNm variable →vida media promedio 3 h en vertebrados  Procariotas  Eucariotas  Cortes por una endonucleasa  Acortamiento cola poli (A)  Exorribonucleasas 3’→ 5  Pérdida casquete 5’  Exorribonucleasas 5’→3’  Exorribonucleasas 3’→ 5’  Estructuras que estabilizan los tránscritos Procariotas → Horquillas Eucariotas → Cola poli A y casquete 5’ Internal use Modificaciones postranscripcionales en ARNr y ARNt Tanto los ARNr como los ARNt se forman a partir de precursores de mayor longitud (pre-ARNr y pre-ARNt) Estos ARN pueden contener bases modificadas como resultado de reacciones postranscripcionales  Se han encontrado hasta 96 81 en ARNt nucleósidos modificados diferentes 30 en ARNr Internal use  Maduración del ARNt específico de la tirosina de levadura (en amarillo, secuencias que se eliminarán) 1.- Se modifica el 2.- Se modifica el 3.- Se añade extremo 5’ extremo 3’ CCA3’ A la vez que se modifican los extremos, se modifican bases específicas: ARNs pequeños 4.- Corte y empalme del intrón Internal use RIBOZIMAS: Enzimas de ARN  Catalizan dos reacciones fundamentales Transesterificación Hidrólisis del enlace fosfodiéster  Intrones del grupo I  RNasa P RIBOZIMAS MEJOR  Ribozima en cabeza de martillo CARACTERIZADOS  Sustrato → ARN (a veces integrante del ribozima) Aprovecha las interacciones de apareamiento de bases para llevar a cabo su función  Tamaño variable → 400 (intrón grupo I) – 41 (r. cabeza de martilllo)  Estructura tridimensional importante para la función T > T de fusión Agentes desnaturalizantes Oligonucleótidos complementarios Inactivación Sustitución de nucleótidos esenciales Internal use  Otras polimerasas  Transcriptasa inversa  Telomerasa Internal use  Transcriptasa inversa Cataliza 3 reacciones diferentes 1. Síntesis de ADN dependiente de ARN Diferentes 2. Degradación de ARN sitios activos 3. Síntesis de ADN dependiente de ADN Máxima actividad con ARN propio (podrían usar otros) Requiere un cebador → ARNt (huésped)  Secuencia en 3’ complementaria al ARN vírico Síntesis ADN dirección 5’ → 3’ No exonucleasa 3’ → 5’ correctora de pruebas  1 error cada 20.000 nucleótidos añadidos  ↑ Tasa de mutación → nuevas cepas l explicac nuevas upas ! Internal use Transcriptasa inversa Internal use  Telomerasa Muchas copias en tándem Tx Gy x e y → 1-4 Ax Cy Una hebra es más larga que la complementaria → ADN cadena sencilla en 3’ ADN 5’ TTTTGGGGTTTTG− OH(3’) 3’ No hay molde disponible para el apareamiento del cebador → No se puede replicar → los cromosomas se acortarían en cada generación celular Telomerasa → incorpora telómeros  Formada por proteínas + ARN: 150 nucleótidos 1,5 copias repetición CyAx → molde para TxGy del telómero Telomerasa  Acortamiento de los telómeros por eliminación de los cebadores Internal use  El molde interno de ARN de la telomerasa se aparea con el cebador TG del ADN La telomerasa añade residuos T y G al cebador TG La telomerasa se desplaza para posicionarse de nuevo y reemprender la extensión del telómero  La hebra complementaria CyAx es sintetizada por las ADN polimerasas a partir de un cebador de ARN Internal use  Telomerasa – Envejecimiento  Perdida de la telomerasa → acortamiento gradual de los telómeros → muerte de la línea celular  Hombre Células germinales → actividad telomerasa Mantienen la longitud de sus telómeros Células somáticas → carecen de telomerasa Los telómeros se acortan gradualmente ↑Longitud de los telómeros → ↓Edad del individuo Internal use   Telomerasa – Cáncer  Estudio en ratones María Blasco, CNIO La telomerasa no actúa como un oncogén, si bien favorece la selección de células malignas en presencia de mutaciones adicionales (especialmente en genes supresores de tumores). Sin embrago, la longitud telomérica sí constituye una firme barrera para la progresión tumoral. Internal use