Édition de l'ARN par ADAR1 - PDF

Article homéostasie des génomes : **ÉDITION DE L\'ARN** **L\'édition de l\'ARN par ADAR1 empêche la détection des ARNdb endogènes par MDA5 comme étrangers** L\'édition d\'adénosine en inosine (A-I) est une modification post-transcriptionnelle très répandue de l\'ARN, médiée par les enzymes ADAR (...

Article homéostasie des génomes : **ÉDITION DE L\'ARN** **L\'édition de l\'ARN par ADAR1 empêche la détection des ARNdb endogènes par MDA5 comme étrangers** L\'édition d\'adénosine en inosine (A-I) est une modification post-transcriptionnelle très répandue de l\'ARN, médiée par les enzymes ADAR (adénosine désaminase agissant sur l\'ARN). En plus de l\'édition de l\'ARN, d\'autres fonctions ont été proposées pour ADAR1. Afin de déterminer le rôle spécifique de l\'édition de l\'ARN par ADAR1, nous avons généré des souris avec une mutation knock-in déficiente en édition (Adar1E861A, où E861A désigne Glu861→Ala861). Les embryons Adar1E861A/E861A sont morts à \~J13,5 (jour embryonnaire 13,5), avec activation des voies de détection de l\'interféron et de l\'ARNdb (ARN double brin). Une analyse génomique des substrats d\'ADAR1 in vivo a identifié une hyper édition regroupée au sein de longues boucles d\'ARNdb dans les régions 3\' non traduites des transcrits endogènes. Finalement, la mort embryonnaire et les phénotypes des Adar1E861A/E861A ont été sauvés par la suppression concomitante du capteur cytosolique de l\'ARNdb, MDA5. - L\'édition de A-I de l\'ARNdb endogène est la fonction essentielle d\'ADAR1, empêchant l\'activation de la réponse cytosolique de l\'ARNdb par les transcrits endogènes. **L\'édition d\'adénosine en inosine (A-I) est la forme de modification de base de l\'ARN la plus répandue chez les mammifères**. Des centaines de milliers d\'événements d\'édition A-I ont été rapportés dans le transcriptome humain. L\'édition A-I est catalysée par les enzymes ADAR (adénosine désaminase agissant sur l\'ARN), qui désaminent l\'adénosine encodée génomiquement en inosine dans l\'ARN double brin (ARNdb). L\'édition A-I se produit principalement dans des éléments répétitifs non codants, comme les Alus inversés et les éléments nucléaires courts dispersés (SINEs). Il existe trois protéines ADAR chez les mammifères : ADAR1, ADAR2, et ADAR3. ADAR1 est largement exprimé pendant le développement embryonnaire et postnatal et est présent sous une forme nucléaire principalement constitutive, **l\'isoforme ADAR1p110**, exprimée dans tous les tissus, ainsi que sous une isoforme additionnelle, **ADAR1p150**, induite par l\'interféron (IFN) et présente à la fois dans le noyau et le cytoplasme. Les souris Adar1−/− (nulles pour les deux isoformes) et Adar1p150−/− meurent in utero à J11,5 (jour embryonnaire 11,5) à J12,5, en raison d\'une érythropoïèse défaillante et d\'une désintégration du foie fœtal (FL). **Seules ADAR1 et ADAR2 démontrent une activité d\'édition in vitro**. Le pré-ARNm du récepteur AMPA GluA2 est édité par ADAR2 dans le cerveau, convertissant un résidu glutamine en arginine dans une position fonctionnellement critique. Les souris Adar2−/− meurent de crises d\'épilepsie et ont été sauvées par la substitution génomique de l\'adénosine éditée en guanosine, imitant l\'édition du transcrit. Contrairement à ce paradigme élégant d\'un seul substrat qui décrit le phénotype Adar2−/−, aucun site d\'édition similaire n\'a été décrit à ce jour pour résoudre l\'exigence physiologique pour ADAR1. **[Figure 1 : les embryons ADAR1^E861A/E861A^ meurent in utéro : ]** Une image contenant texte, ligne, Police, diagramme Description générée automatiquement Pour déterminer directement la contribution de l\'édition A-I à la fonction biologique d\'ADAR1, nous avons généré une **version knock-in d\'un allèle ADAR1** déficient en édition chez les souris (Adar1E861A, où E861A représente Glu861→Ala861) (Fig. 1A et fig. S1A), homologue à l\'allèle humain ADAR1E912A, inactif in vitro (voir également les matériaux et méthodes supplémentaires). Dans des embryons entiers à J12,5, la protéine **ADAR1p110** a été détectée dans les échantillons Adar1E861A/E861A à des niveaux comparables à ceux d'Adar1+/+ et d'Adar1E861A/+ (Fig. 1B). En outre, les embryons Adar1E861A/E861A présentaient une expression élevée d\'**ADAR1p150** (Fig. 1B). Les souris hétérozygotes **Adar1E861A/+** étaient normales, présentes selon le ratio mendélien attendu, et n'avaient aucun phénotype discernable. Aucun nouveau-né Adar1E861A/E861A viable n\'est né des croisements entre Adar1E861A/+. Ces embryons semblaient mourir vers J13,5 (Fig. 1C). Les **sacs vitellins** d\'Adar1E861A/E861A étaient pâles et les embryons paraissaient retardés par rapport aux contrôles (Fig. 1D), bien qu\'ils fussent normaux à J12,5 (fig. S1, D et E). À J13,5, le **foie fœtal (FL)** des Adar1E861A/E861A était plus petit et contenait huit fois moins de cellules viables (Fig. 1D et fig. S1E).  - ***CD71** = marqueurs des précurseurs érythroïdes dans la moelle hématopoïétique normale et la rate* - ***Ter119** = marqueur des cellules érythroïdes murines des stades précoces (proérythroblastes) à mature* ***R2-R5** = populations d'érythroblastes de + en + différenciées* ***7AAD** = composé fluo dérivé de l'actinomycine D qui s'intercale dans les ADN bicaténaire riche en GC. Il permet de repérer les c ayant une **mb p endommagée**, car le matériel génétique des c dont la mb est intacte ne seront pas coloré car le 7AAD ne pourra pas pénétrer dans la c.* Nous avons observé une défaillance de l\'érythropoïèse avec une perte sévère de populations d\'**érythroblastes** (Fig. 1, E et F) et une augmentation de la **mort cellulaire** (Fig. 1G), également visible dans d\'autres populations hématopoïétiques (fig. S2). Notre analyse précédente de l\'allèle conditionnel ADAR1 montrait que les **cellules souches hématopoïétiques (HSC) adultes** exprimant uniquement l\'ADAR1 catalytiquement **inactif** ne pouvaient être maintenues in vivo et étaient perdues au fil du temps (fig. S3). - L\'activité **d\'édition A-I** d\'ADAR1 est donc essentielle au **développement embryonnaire** et au maintien de **l\'hématopoïèse in vivo**. **[Figure 2 : Absence de modification des phénocopies transcriptionnelles de perte d'ADAR1 :]** *Graphe MA comparant l'expression génique dans les **FL** WT et E861A à E12.5. Points rouge = gènes exprimés différentiellement et points bleus = ISGs exprimés différentiellement. ISG = Interferon-Stimulated Genes* Nous avons effectué un profilage transcriptionnel sur **trois foies fœtaux (FL)** Adar1+/+ et Adar1^E861A/E861A^ issus de la même portée. L\'absence d\'édition d\'ADAR1 a entraîné une surexpression de 383 transcrits (log2FC \> 2), dont 258 sont des gènes stimulés par **l\'IFN** (ISG) (Fig. 2A et tableau S1). *Analyse QuSAGE des 100 signatures de voies différentielles les plus importantes classées par enrichissement fold et P-value.* Une analyse des voies a révélé un enrichissement marqué de signatures activées après **traitement par l\'IFN ou infection virale** (Fig. 2B et tableau S1). *Heat map des 50 gènes les plus différentiellement exprimés. Les points noirs indiquent des ISGs connus.* Parmi les 50 gènes les plus différentiellement exprimés, 44 étaient activés par **l\'IFN de type I, de type II, ou les deux** (Fig. 2C et tableau S1).  *qRT-PCR des ISGs dans les **FL** et **MEF** (Mouse Embryonic Fibroblast) E861A comparés aux contrôles* La **dérégulation des ISG** a été confirmée par PCR en temps réel (qRT-PCR) (Fig. 2D). De plus, la réponse transcriptionnelle dans les FL d\'Adar1E861A/E861A s\'est avérée similaire à celle observée lors d\'une carence complète en ADAR1 (fig. S4A). Une image contenant capture d'écran, texte, Tracé, diagramme Description générée automatiquement *Set de gènes de la réponse ARNdb IU des E861A comparé avec les WT (gauche) et HSCs Adar-/- comparé avec les WT (droite)* *HSC = Hémathopoïétique Stem Cell* Les séquences **d\'ARNdb** **synthétiques**, basées sur les ARN endogènes contenant de l\'adénosine mais pas d\'inosine, stimulent les **ISG** et **l\'apoptose** in vitro en se liant à **MDA5** et **RIG-I**. Nous avons défini un ensemble de gènes associés à la réponse à l\'ARNdb IU (ARNdb apparié inosine-uracile) dans les cellules humaines. Les signatures géniques du FL Adar1E861A/E861A et des HSC Adar1−/− étaient fortement enrichies pour la réponse à l\'ARNdb IU (Fig. 2E), montrant une réponse conservée aux ARNdb entre espèces, modulée par la présence de résidus **inosine**. - Ainsi, la **désamination de l\'adénosine** dans l\'ARNdb par ADAR1 est nécessaire pour **réprimer la réponse IFN** en conditions homéostatiques. De plus, l\'absence de substitutions A-I dans l\'ARNdb endogène pourrait initier cette réponse. **[Figure 3 : Définition de l'éditome FL ADAR1 : ]** Une image contenant texte, capture d'écran, ligne, Tracé Description générée automatiquement *(A) Résumé de l'analyse du site **d'édition A-à-I** dans les FL. SNPs, polymorphismes mono nucléotidiques ; ANOVA, analyse de la variance ; ncRNA, ARN non codant. (B) Différence moyenne d'édition pour les sites avec \>20 lectures (gauche, n=1634). Fréquence moyenne d'édition des sites édités différemment entre E861A et les contrôles (droite, n=673).* Pour définir des **événements d\'édition spécifiques à ADAR1 in vivo**, nous avons analysé les discordances A-à-I dans les données de séquençage RNA. Dans tous les échantillons, 6167 sites d\'édition A-à-I ont été identifiés : 5540 connus et 627 auparavant non découverts (fig. 3A). Les polymorphismes nucléotidiques spécifiques aux **souches** ont été exclus, et seules les fréquences de discordances A-à-I qui différaient significativement entre les **génotypes** ont été prises en compte (fig. 3B). En utilisant ces critères, **673 sites d\'édition A-à-I** ont été définis. Parmi ceux-ci, 666 sites présentaient une réduction de l\'édition chez les mutants, y compris des loci hyper édités, qui n\'avaient aucune édition détectable (Fig. 3B et tableaux S2 et S3). - Cela a confirmé que l\'allèle Adar1E861A est **catalytiquement inactif** et que la **majorité de l\'édition A-à-I FL dépend d\'ADAR1**. *Validation par séquençages Sanger des sites d'édition : **ADNg** en bas et **ADNc** en haut et au milieu. Les flèches rouges représentent les adénosines éditées.* Nous avons validé 281 des sites A-à-I identifiés sur des échantillons FL indépendants Adar1E861A/E861A et Adar1+/+. Tous les sites testés ont été confirmés comme étant **différemment édités** à la fois dans les échantillons FL et dans les fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs). Le séquençage Sanger a validé des **sites d\'édition spécifiques à ADAR1, BlcapY2C, Mad2l1, Rbbp4 et Klf1** à partir d\'échantillons FL indépendants (Fig. 3C). ADAR1 est requis pour l\'érythropoïèse (Fig. 1, E à G). Fait intéressant, 40 % (264 sur 666) des sites d\'édition spécifiques à ADAR1 se trouvaient dans des **clusters hyper** édités de seulement trois gènes : **Klf1, Oip5 et Optn**, qui présentent une expression maximale ou restreinte dans la **lignée érythroïde** (tableau S3). 70, 61 et 133 **loci hyper édités** spécifiques à ADAR1 se trouvaient dans de **longues régions 3' non traduites (3′UTRs)** de **Klf1, Oip5 et Optn**, respectivement. *Image de Klf1 dans FL E12.5 WT et structure secondaire prévue du 3' UTR. La ligne rouge indique la région représentée dans (E).* Un exemple d\'hyper édition dans Klf1 est illustré à la figure 3D. L\'absence d\'édition par ADAR1 de ces loci fournit un lien possible avec l\'échec FL dans les embryons Adar1E861A/E861A. *Structure secondaire prédite **d\'une tige-boucle d\'ARN double brin** de 212 paires de bases provenant de la région 3′UTR de Klf1, avec de **l\'inosine** (IU-ARNdb, à gauche) et de la **guanosine** (GU-ARNdb, au milieu) à la place de **l\'adénosine** aux sites d\'édition. À droite, structure secondaire prédite sans édition de A en I.* La modélisation de la structure secondaire prédite des 3′UTRs hyper édités a montré qu\'en **l\'absence d\'édition**, il y avait un potentiel de formation de **longs segments d'ARNdb** parfaits par le biais de l\'appariement de régions répétitives (Fig. 3E et fig. S7, A à C). La thermodynamique de l\'appariement des bases d\'inosine n\'est pas définie. Par conséquent, nous avons modélisé les structures secondaires pour les substrats hyper édités de deux manières : - En prédisant les **structures secondaires des 3′UTRs de Klf1** (Fig. 3E gauche), Optn et Oip5 (Fig. S7) avec de l\'inosine à la place de l\'adénosine, en supposant qu\'il n\'y ait pas d\'appariement de bases - En remplaçant **l\'adénosine par de la guanosine** (Fig. 3E milieu) en supposant un appariement de bases en wobble. Dans les deux cas, les structures de dsRNA prédites ont des **états d\'énergie libre plus élevés** en présence de **substitutions A-à-I ou A-à-G** (fig S7, A à F). Par conséquent, on s\'attend à ce que des **discordances I-U étendues déstabilisent des tiges boucles d'ARNdb** parfaites au sein des **3′UTRs hyper édités** (fig 3E et fig S7, A à F). - Ainsi, nous avons émis l\'hypothèse que l\'édition par ADAR1 **remodelait la structure secondaire de l\'ARN endogène** pour abroger la formation de **longs ARNdb appariés**. **[Figure 4 : La perte de MDA5 sauve la viabilité d'Adar^E861A/E861A^ : ]** Les **signatures transcriptionnelles** dans les échantillons FL Adar1E861A/E861A ressemblaient à celles de l\'activation de **RIG-I** et **MDA5**. Nous avons postulé qu\'en l\'absence d\'édition par ADAR1, des ARNdb endogènes---comme les 3′UTRs de Klf1, Oip5 et Optn---pourraient être liés par MDA5 et/ou RIG-I et pourraient activer la réponse cellulaire aux ARNdb. Une image contenant ligne, diagramme, capture d'écran, Tracé Description générée automatiquementUne image contenant texte, diagramme, capture d'écran Description générée automatiquement A. ***KSL cells** = forme précoce de cellules souches hématopoïétiques murines* ***7AAD** = c avec mb endommagées* ***Annexine 5** = marqueur des c en 1^ère^ et en mi-phase d'apoptose* Le **knockdown de MDA5** par des petits ARN interférents (shRNA) a permis de restaurer la **prolifération** et la **viabilité** (Fig. 4, A à C) et a supprimé **l\'induction des** **ISG** dans les cellules souches et progénitrices **hématopoïétiques** exprimant uniquement l\'allèle Adar1E861A à des niveaux de contrôle, en utilisant deux shRNAs MDA5 indépendants (fig. S8). Sur la base de la restauration in vitro, nous avons croisé les **souris Adar^1E861A/E861A^** avec des souris **MDA5−/−** (Ifih1−/−). Dans un premier temps, nous avons évalué les embryons à E13.5, un moment où les embryons Adar1E861A/E861A ne sont **plus viables** (Fig. 1C = tableau). Les **sacs vitellins**, les **embryons** et le **FL** double mutants Adar1E861A/E861A Ifih1−/− étaient comparables aux contrôles et étaient présents dans le rapport attendu (Fig. 4D et fig. S9A). Une image contenant texte, capture d'écran, carte, diagramme Description générée automatiquement *(E) Profils FACS et (F) nombres d'érythrocytes du FL à E13.5. (G) qRT-PCR des ISGs du FL à E13.5* ***CD71** = marqueurs des précurseurs érythroïdes* ***Ter119** = marqueur des cellules érythroïdes murines des stades précoces (proérythroblastes) à mature* **L\'érythropoïèse** a été complètement restaurée, et les **ISG** FL étaient équivalents à ceux des porteurs contrôles (Fig. 4, E à G). Fait le plus surprenant, des mutants **Adar1E861A/E861A Ifih1−/− viables** ayant survécu au sevrage ont été identifiés (fig. S9B). Les doubles mutants viables sont extérieurement sains, bien qu\'un peu plus petits que les contrôles de portée, et n\'ont pas montré de phénotypes supplémentaires à ce jour (Fig. 4H). - La restauration de la **viabilité** à la fois au **développement** et à l\'âge **adulte** démontre que **MDA5** est le principal **capteur d'ARNdb endogène** en l\'absence de l\'édition par ADAR1. Contrairement à ADAR2, le rôle principal d\'ADAR1 n\'a pas été clairement défini. Bien qu\'il ait été supposé que **l\'édition de l\'ARN** fût sa fonction centrale, des rôles supplémentaires indépendants de l\'édition de l\'ARN ont été proposés. Les phénotypes murins et les conséquences transcriptionnelles d\'une **déficience complète en ADAR1** et de la perte spécifique de **l\'édition A-à-I** sont remarquablement similaires, démontrant que **l\'édition de l\'ARN** est la fonction principale et physiologiquement la plus importante d\'ADAR1. Les embryons Adar1E861A/E861A **meurent** environ 1 à 1,5 jour plus tard que les embryons Adar1−/−, suggérant que les contributions des **fonctions non éditoriales d\'ADAR1 sont limitées**. Nous croyons que la différence de survie s\'explique par le fait qu\'ADAR1, **catalytiquement inactif**, conserve la capacité de **séquestrer les ARNdb immunogènes**. Cependant, la séquestration par ADAR1 n\'est pas suffisante pour empêcher complètement la reconnaissance par **MDA5 des ARNdb** **non édités** et la **signalisation** subséquente. Par conséquent, la survie prolongée des animaux déficients en édition reflète un **retard** plutôt qu\'une différence fondamentale dans la présentation du même phénotype. Les données des mutants Adar1E861A sont cohérentes avec les **interféronopathies de type I** des patients atteints du **syndrome d\'Aicardi-Goutières (AGS)** portant des mutations dans ADAR1. L\'édition des transcrits endogènes chez les patients AGS mutants d\'ADAR1 est probablement réduite, entraînant la rétention d'ARNdb endogènes appariés qui peuvent être détectés par MDA5. Dans ce sens, des mutations à **gain de fonction de MDA5** ont été identifiées chez des patients AGS **non mutants d\'ADAR1**. Les mutations MDA5 dans AGS ont entraîné un lien d\'affinité plus élevé avec les ARNdb autologue, entraînant une **détection inappropriée de l'ARNdb autologue**. Aussi, la fonction physiologique d\'ADAR1 est probablement **conservée chez les mammifères.** Environ la moitié du génome des mammifères est composée de **rétrotransposons non codants** tels que les **SINE** et les **Alus**, qui forment généralement des **duplexes d'ARNdb**. Les rétrotransposons subissent une **édition extensive de l\'ARN A-à-I**. L\'emplacement des éléments répétitifs peut déterminer leur **immunogénicité**. Les rétrotransposons situés dans les **introns** ne persistent pas dans le **cytosol** et ne peuvent donc pas **activer MDA5**. Les éléments répétitifs dans les **3′UTRs**, bien que rares, peuvent être retenus et former des **duplexes**, ayant le potentiel d\'être reconnus par **MDA5**. Nous proposons que l\'hyper édition de l'ARNdb autologue par ADAR1 (comme les 3′UTRs de Klf1, Optn et Oip5) génère de **multiples discordances I-U** qui empêchent **l\'oligomérisation de MDA5**. En l\'absence de l\'édition par ADAR1, de **longues tiges boucles d'ARNdb** peuvent se former, **activant** **MDA5**. Cependant, nous ne pouvons pas écarter la possibilité alternative que les **substrats édités** se lient préférentiellement à **MDA5** pour empêcher son activation par d\'autres transcrits d'ARNdb (non identifiés et non édités). L\'ablation simultanée de **MAVS**, **l\'adaptateur en aval de MDA5** et **RIG-I**, permet de **sauver** des souris nulles pour ADAR1 à la naissance, démontrant un rôle pour ADAR1 dans la suppression de la **voie RLR**. Notre étude identifie spécifiquement le capteur cytosolique critique en amont de MAVS et démontre que le phénotype Adar1E861A/E861A et, par extension, **Adar1−/−** peut être attribué à **l\'absence d\'édition de plusieurs substrats**, entraînant une **activation inappropriée de MDA5**. Nous supposons que ces transcrits non édités sont perçus comme **non autologues** par **MDA5** et activent la signalisation **immunitaire innée**. - La fonction physiologique principale d\'ADAR1 est **d\'éditer les ARNdb endogènes** pour empêcher la détection des ARNdb endogène comme non autologue par MDA5.