Analyses Biochimiques des aliments.docx

1^ere^ année master biochimie appliqué **Intitulé du Master : BIOCHIMIE APPLIQUEE\ Semestre *:* 01\ Intitulé de l'UE : UE Fondamentales\ Intitulé de la matière : Analyses Biochimiques des aliments\ Crédits : 6\ Coefficients : 3\ Objectifs de l'enseignement** (*Décrire ce que l'étudiant est censé av...

1^ere^ année master biochimie appliqué **Intitulé du Master : BIOCHIMIE APPLIQUEE\ Semestre *:* 01\ Intitulé de l'UE : UE Fondamentales\ Intitulé de la matière : Analyses Biochimiques des aliments\ Crédits : 6\ Coefficients : 3\ Objectifs de l'enseignement** (*Décrire ce que l'étudiant est censé avoir acquis comme\ compétences après le succès à cette matière -- maximum 3 lignes).\ *L\'étudiant suivant cette unité est censé connaître les différents aspects et techniques\ biochimiques qui régissent le contrôle de qualité des aliments. De plus, les étudiants vont\ acquérir des notions de normalisation et connaître les normes nationales et internationales\ **Connaissances préalables recommandées (***descriptif succinct des connaissances\ requises pour pouvoir suivre cet enseignement -- Maximum 2 lignes)\ *Biochimie structurale et métabolique. **Contenu de la matière :\ Introduction\ Composition des Aliments\ **- Aliments d'origine animale\ - Aliments d'origine végétale.\ **Standardisation et normalisation des méthodes d\'analyses et expression des\ résultats\ Dosages des constituants des aliments\ - Dosage de l'eau\ - Dosage des minéraux\ - Dosage des sucres\ **- Méthode polarimétrique.\ - Méthodes colorimétriques.\ **- Dosage des protéines\ **- Méthode de kdjeldahl\ - Méthodes colorimétriques (Bradford, Lowry, Biuret..ect).\ **- Analyse qualitative d'une huile ou d'une graisse\ **- Indice de saponification\ - Indice d'iode\ - Acidité libre\ - Indice d'hydroxyle\ - Les acides gras volatils\ - Degré d'oxydation d'une graisse\ **- Analyse quantitative des Lipides** \- Estimation du pourcentage de matières grasses dans les produits alimentaires \- Isolement et dosage des constituants lipidiques a partir d'un extrait lipidique\ total\ - Dosage du cholestérol.\ - Méthode gravimétrique.\ - Méthodes colorimétriques\ **- Dosage des Vitamines\ **- Dosage des vitamines hydrosolubles Exemple : Vitamine C\ - Dosage des vitamines liposolubles (Groupe ADEK) Exemple vitamine E. **Introduction** On appelle des aliments tout substance non toxique capable de satisfaire ou : -Besoin nutritif de l'organisme, besoin de matière, besoin de chaleur et d'énergie mécanique. L'aliments est aussi définit comme tout molécules capables de réparer les pertes des partie solides ou liquides de notre corps. L'aliment n'est pas jamais complet, puisque les aliments sont complémentaires les uns a l'autres. ================================================================================================= La digestion est une transformation mécanique et chimique des aliments a des nutriments assimilable mécanisme a l'organisme. Il existe 5 catégories de nutriment qui sont : les glucides, les lipides, les vitamines, les protéines et les sels minéraux. L'aliments nutriments substance. Lait lactose glucose galactose. Viande peptide AA. Certain nutriments constitués une source d'énergie important pour l'organisme, ce dernier utilise cette énergie pour maintenir la T° du corps et assurer les processus vitaux. La nutrition est une science qui étudié les relations de l'être humain avec la nourriture et s'intéresse a l'utilisation des nutriments a la santé alimentaire, au besoin nutritifs population a l'étude dz les comportement et au production agroalimentaire. Les nutriments possèdent plusieurs valeurs : 1. Valeur énergétique : On définit la valeur énergétique par le Nbre de calories exprimée100 g d'aliment ou bien 100 ml d'aliment. 1 Kcal = 4 Kj. 2. Valeur nutritive : elle représente la richesse du nutriment un glucides, lipides, prot, vit, minéraux.... 3. Valeur sanitaire : n'importe quel produite alimentaire doit obligatoirement apte a la consommation humaine. a. Aspet physicochimique : plusieurs paramètre sont vérifié talque : PH, l'eau, glucides, lipides, Acides volatiles et titrable, Vit, Prot, minéraux. b. Aspet microbiologique : recherche des bactéries. 4. Valeur organoleptique (le gout, l'odeur, texture.......... ). - Les produits laitiers. - Les viandes et produits carnés, les poisons et les œufs. - Les céréales et dérivé légumineuses. - Légumes et fruits. - Les huiles et margarines\... - L'eau, boisson... - Les produits sucrés. La standardisation transforme les valeurs d\'une variable pour qu\'elles aient une moyenne de 0 et un écart-type de 1.  Le plus simple consiste à utilises un logiciel d'analyse de données spécialement conçu a cette effet. Pour calculer cette moyenne, il faut additionner toutes les valeurs de données, puis diviser cette somme par le nombre total de valeurs dans l\'ensemble de données. Contrairement a la normalisation, la standardisation ne fixe pas de plage spécifique pour les valeurs transformées. Ensemble des techniques qui ont pour objet de définir les produits et /ou les méthodes de fabrication aptes a satisfaire des besoins spécifiés. **les paramètres évalués lors d\'une validation de méthode analytique :** 1**. La spécificité** (ou sélectivité)  La [méthode d'analyse](https://filab.fr/nos-prestations/accompagnement-rd/cycle-vie-methode-analytique/) doit permettre de quantifier l'analyte seul, c'est-à-dire sans qu'il n'y ait d'interférences liées à la matrice (impuretés, autres constituants...). Elle sera observée par comparaison de l'analyte avant et après dopage de la matrice. 2.**La fidélité** La fidélité représente l'étroitesse de l'accord entre les résultats d'essais indépendants, réalisés dans des conditions prédéfinies.  Trois opérateurs suivent la méthode sur le même appareil.  Pour pouvoir la valider, il est nécessaire que tous les trois retrouvent les mêmes résultats. 3\. **La justesse** La justesse est l'étroitesse de l'accord entre la valeur moyenne obtenue à partir d'une large série de résultats d'essai et une valeur vraie (valeur de référence). Elle s'exprime généralement en termes de taux de recouvrement et de son intervalle de confiance. 4\. **La linéarité** La linéarité d'une méthode d'analyse est la capacité à obtenir des résultats directement proportionnels à la concentration de l'analyte dans la matrice. 5\. **La sensibilité** La sensibilité d'une méthode est la capacité à distinguer deux concentrations très voisines d'un analyte. Elle est évaluée généralement au travers de la LoD, de la LoQ et de la pente de de la courbe d'étalonnage. 6\. **La Limite de Détection (LoD) et la Limite de Quantification (LoQ)** Le « zéro » en chimie analytique n'existe pas ! De manière générale, la limite de détection LoD et la limite de quantification LoQ sont souvent estimées approximativement à partir du rapport signal/bruit (S/B) d'un analyte mesuré dans la matrice. 7.**La stabilité** Ce paramètre est apparenté à la stabilité de l'analyte au cours du temps. Evaluer la stabilité permet de vérifier la conservation des échantillons au cours du temps pour réaliser la méthode. 8.**La robustesse** C'est la capacité d'une méthode à donner des résultats d'une précision acceptable dans des conditions variables minimes. Elle permet donc d'évaluer la fiabilité d'une méthode analytique dans des conditions d'usage de routine. 9.**L'incertitude** L'incertitude de mesure peut être définie de plusieurs manières. De nombreux référentiels abordent la validation de méthodes analytiques et les critères d'acceptation, entre autres: **Les étapes d'analyse** Les principales étapes du processus danalyse consistent à cerner les sujets d'anlyse, à déterminer la disponibilité de données appropriées, à décider des méthodes qu\'il y a lieu d\'utiliser pour répondre aux questions d\'intérêt, à appliquer les méthodes et à évaluer, résumer et communiquer les résultats L\'objectif de l\'analyse des données est d'extraire une information statistique qui permet de cerner plus précisément le profil de la donnée.Les résultats obtenus permettent ensuite d\'optimiser la stratégie de la société en question en ajustant certains points. **Méthodes de préparation et de prélèvement des échantillons\ **La préparation de l'échantillon et le prélèvement de la portion servant à l'analyse sont\ les deux premières étapes d'une analyse physico-chimique. Ces étapes sont\ importantes pour la réussite d'une analyse, car l'exactitude du résultat en dépend. Les\ techniques qui seront utilisées lors de ces étapes devront permettre de respecter le\ principe suivant :\ \*L'aliquote prélevé pour l'analyse doit être le plus représentatif possible du lot. Appelé parfois la prise d'essai, c'est la portion de l'échantillon ou du sous-échantillon utilisée pour une analyse physico-chimique. \*Lot : ensemble d'une production alimentaire ou d'une matière première.\ \*Échantillon : portion du lot prélevée au hasard ou selon des méthodes statistiques.\ \*Sous-échantillon : portion de l'échantillon prélevée qui servira à la prise de l'aliquote. **CHAÎNE DE PRÉLÈVEMENT\ **LOT\ ÉCHANTILLON\ SOUS-ÉCHANTILLON\ ALIQUOTE (Analyse physico-chimique) **Les principes généraux pour la préparation des échantillons\ 1)** **Enlèvement des matières étrangères et des parties non comestibles**\ -Lavage des fruits et légumes (sable, terre)\ -Enlèvement des os (viandes)\ -Enlèvement de la partie habituellement non consommée (fromage à pâte molle)\ **2) Homogénéisation**\ [Aliments liquides]\ -Brassage par inversion, rotation ou transfert d'un récipient à un autre\ -Brassage énergique pour émulsification (vinaigrette)\ -Enlèvement des gaz (les boissons gazeuses)\ -Décongélation complète d'un échantillon avant le prélèvement de l'aliquote\ [Aliments solides]\ -Découpage adéquat de l'échantillon (viande,)\ -Broyage approprié (hache-viande, moulin à farine, malaxeur, appareil Stomaker,\ mortier, bêcher et spatule, râpe, etc \...)\ 3) **Prévention des altérations de l'échantillon**\ -[Altération physique ou chimique due à l'action de la chaleur\ ]- Séparation de la matière grasse (lait cru)\ - Caramélisation (aliments sucrés)\ -[Altération chimique au contact avec l'air ambiant\ ]- Oxydation par l'action de O2 (rancissement)\ -Modification de la concentration des constituants\ - Absorption d'humidité par les aliments hygroscopiques\ - Evaporation d'eau ou des constituants volatils d'un aliment\ **N.B**. Un gain ou une perte d'eau modifie la concentration de tous les constituants d'un échantillon alimentaire.\ 4) **Conservation des échantillons**\ -Réfrigération ou congélation selon la nature de l'échantillon et le délai d'analyse -Utilisation de contenants hermétiquement fermés\ -Utilisation de préservatifs inhibant la croissance microbienne\ - **Ex**: pastilles de bichromate de potassium K2Cr~2~O~7~ pour les laits crus.\ **Exemples de préparation d'échantillons tirés du AOAC\ 1) Produits laitiers** 1. **Méthode thermogravimétrique** 1. Échantillon contenant de la matière organique volatile. 2. Échantillon formant un gel à la chaleur. 3. Échantillon riche en sucres 4. Échantillon séché hygroscopique. 5. Autres sources d'erreurs affectant la précision ou l'exactitude. ------------------------ ------- ------------------ **% H2O= V(eau) x 100\ **=** **M (eau) x 100\ M(échantillon)** M(échantillon)** ------------------------ ------- ------------------ **Cendres solubles et insolubles dans l'eau :** Les cendres solubles et insolubles dans l'eau peuvent être utiles dans certains aliments. Par exemple, elles servent à évaluer le contenu en fruits des confitures, ou la quantité de corps étrangers (ajout de sable) dans les épics Principe de la méthode. Pour déterminer les cendres insolubles dans l'eau, on dissout la partie soluble des cendres totales dans l'eau chaude qu'on filtre sur un papier filtre. Le résidu insoluble sur le papier filtre est incinéré de nouveau pour brûler le papier filtre. On pèse les cendres insolubles. Le % de cendres solubles est déduit par calcul. **Méthodes de dosage des glucides\ **Il existe beaucoup de méthodes de dosage des glucides. Certaines de ces méthodes\ utilisent le pouvoir réducteur ou non réducteur des sucres. Un sucre réducteur doit posséder\ dans sa structure une fonction aldéhyde ou cétone libre.\ **Dosage des sucres réducteurs par la méthode Lane-Eynon\ **La méthode Lane-Eynon est une méthode volumétrique de détermination des sucres\ réducteurs totaux dans les aliments. C'est une méthode colorimétrique. empirique qui relie, à l'aide d'une\ table de conversion, une quantité de sucres réducteurs contenus dans un volume de solution\ alimentaire requis pour réduire un volume donné de réactif de Fehling.\ [Principe de la méthode] La méthode est basée sur la capacité des sucres réducteurs de réduire l'hydroxyde\ cuivrique en oxyde cuivreux. On titre à chaud un volume donné de réactif de Fehling (10 ml\ ou 25 ml) à l'aide d'une solution de l'aliment contenant le ou les sucres réducteurs.\ L'indicateur Bleu de méthylène est utilisé pour rendre plus claire la disparition de la couleur\ bleue du réactif de Fehling (point de virage). Le volume de solution alimentaire utilisé pour le\ titrage est converti en mg de sucres réducteurs à l'aide d'une table de conversion. [Quantités mesurables de sucres réducteurs] : L'aliment doit être dilué de façon à ce que le volume de solution alimentaire utilisé pour le titrage corresponde à une quantité mesurable de sucres réducteurs. On doit utiliser des colonnes de conversion spécifiques pour les aliments contenant un mélange de sucre inverti et de sucrose. **Dosage des sucres réducteurs par la méthode Munson-Walker** La méthode Munson-Walker est une méthode gravimétrique de détermination des sucres réducteurs totaux dans les aliments. C'est une méthode colorimétrique empirique qui relie, à l'aide d'une table de conversion, une quantité de précipité formé par la réaction de Fehling à une quantité d'un sucre réducteur particulier. [Principe de la méthode] Les sucres possédant une fonction aldéhyde ou cétone libre peuvent réduire l'hydroxyde cuivrique (réactif de Fehling) en oxyde cuivreux, un précipité de couleur rouge brique. L'aliment est mis en solution et une portion de la solution est traitée avec un excès de la solution de Fehling. Le précipité Cu~2~O formé par la réaction est récupéré quantitativement, séché et pesé. La quantité de précipité est convertie en mg de sucres réducteurs à l'aide d'une table de conversion (table de Hammond). [Quantités mesurables de sucres réducteurs :] L'échantillon doit être dilué de façon à ce que la quantité de précipité Cu2O formé par la réaction puisse être convertie en quantité mesurable d'un sucre réducteur dans la table de Hammond. **Dosage des sucres réducteurs par la méthode polarimétrique (par polarimètre) ** Les sucres sont menues d'un pouvoir rotatoire spécifique qui est la capacité de dévier l'angle de la lumière polarisé soit vers la droite soit vers la gauche avec un angle de déviation spécifique. Cette méthode de dosage spécifique pour les sucres réducteurs ou non réducteurs permet de calculer la pouvoir rotatoire de chaque sucre selon la loi de Biot : \[α\] ~20°~= α observé / \[C\]. L **Méthodes de dosage des protéines** Contrairement aux sucres et aux lipides, les protéines contiennent de l'azote. Cette propriété sera exploitée dans la méthode de détermination de la teneur en protéines dans les aliments. 1. **Méthode de kjeldahl** La méthode Kjeldahl est la méthode de référence pour la détermination des protéines dans les aliments. [Principe de la méthode] La détermination des protéines par la méthode Kjeldahl s'effectue en trois étapes : **Étape 1: Digestion ou minéralisation de l'échantillon** Pendant l'étape de la digestion, l'azote protéique est transformé en azote ammoniacal par oxydation de la matière organique dans l'acide sulfurique concentré à haute température, en présence d'un catalyseur et d'un sel : MO → NH4^+^ \- l'acide sulfurique concentré a pour but d'oxyder la matière organique et de transformer l'azote protéique en ammoniac NH3. Il sert également à piéger l'ammoniac gazeux sous la forme de sulfate d'ammonium, par action de la base avec l'acide : \- l'addition du sel K2SO4 a pour but d'élever le point d'ébullition de la solution pour accélérer la réaction de minéralisation de la matière organique. -le catalyseur utilisé peut être Hg (HgO), Cu (CuSO4) ou Se. **Étape 2: Distillation de l'ammoniac** Avant de distiller l'ammoniac à la vapeur d'eau, on doit libérer l'ammoniac sous la forme du sel (NH4)2SO4 par l'addition d'une solution concentrée de NaOH en excès. L'ammoniac est ensuite distillé par la vapeur d'eau et piégée dans une solution d'acide borique. L'ammoniac réagit avec l'acide borique pour former des sels borates d'ammonium. **Étape 3: Titrage de l'ammoniac** L'ammoniac sous la forme de borates d'ammonium est titré directement à l'aide d'une solution standardisée d'acide, tel HCl ou H2SO4, et d'un indicateur : On fait un blanc en mettant tous les réactifs sauf l'échantillon, pour soustraire l'ammoniac contenu dans les réactifs de l'ammoniac contenu dans l'échantillon.\ **Calcul du % de protéines dans l'échantillon\ **Le % de protéines dans l'échantillon est obtenu en multipliant le % d'azote par un facteur F dépendant du type d'aliment analysé.\ **% protéines = % N x F = \[(VE- VB) x CN x 14,01 x F/\] Masse de l'échantillon** Le tableau suivant montre les principaux facteurs utilisés avec la méthode Kjeldahl. Aliment Facteur ------------------- --------- farine de blé 5,70 pain 5,70 Produits laitiers 6,38 amandes 5,18 arachides 5,46 noix du Brésil 5,46 autres noix 5,30 Facteur général 6,25 Pour les aliments dont on ne connaît pas la protéine principale ou qui sont préparés avec\ des ingrédients contenant plusieurs types de protéines, on utilise le **facteur général de 6,25**. 2. **Méthodes colorimétriques (Bradford, Lowry et Biuret).** - **Méthode du biuret :** - **Méthode de lowry :** - **Méthode de Bradford :** Les capsules de cellulose sont perméables au solvant et à la matière grasse qui y est dissoute. Ces capsules sont jetables. **% lipides = M (lipides) x 100** **M(échantillon)**  Représentation schématique d\'un appareil d\'extraction Soxhlet classique **Méthode Goldfisch** La méthode Goldfisch est une variante (appareillage différent) de la méthode Soxhlet. C'est une méthode gravimétrique utilisée pour la détermination de la matière grasse dans les aliments solides déshydratés. [Principe de la méthode] L'aliment solide est pesé et placé dans une capsule de cellulose ou un contenant poreux d'alundum. L'échantillon est extrait en continu par de l'éther éthylique à ébullition (P.E. 35^o^C) qui dissout graduellement la matière grasse. Le solvant contenant la matière grasse retourne dans un bêcher placé sous le contenant d'alundum. Comme seul le solvant peut s'évaporer bêcher jusqu'à ce que l'extraction soit complète. Une fois l'extraction terminée, l'éther est évaporé et la matière grasse pesée. **% lipides = M (lipides) x 100** **M (échantillon)** **Méthode Babcock\ **La méthode Babcock est une méthode officielle utilisée pour la détermination des lipides dans les produits laitiers. Cette méthode volumétrique est rapide et peu coûteuse, mais moins précise que la méthode de référence Mojonnier. De plus, les résultats obtenus par cette méthode sont, en moyenne, légèrement plus élevés que ceux obtenus par la méthode Mojonnier.\ [Principe de la méthode] Le produit laitier pesé (ou pipetté pour le lait) est dissout dans l'acide sulfurique dont l'action sert à libérer la matière grasse qui remonte à la surface de la solution. Par addition d'eau et centrifugation, la matière grasse est dirigée dans la partie graduée du butyromètre. On mesure, à une température de 57^o^C, la hauteur d'une colonne de gras sur une échelle graduée en % P/P de matière grasse. Matériel : - tube Babcock \- centrifugeuse Babcock \- bain thermostaté à 57^o^C [Particularités de la méthode] : \- Pour les laits, on utilise un butyromètre gradué jusqu'à 8% en divisions de 0,1%. Pour le prélèvement de l'échantillon, on utilise une pipette de 17,6 ml, ce qui équivaut à 18,0 g de lait. La précision de l'analyse est de ± 0,1%. \- Pour les laits écrémés, on utilise un butyromètre spécial gradué jusqu'à 0,5% en divisions de 0,01%. Le prélèvement de l'échantillon est de 18,0 g (17,6 ml). \- Pour les autres produits laitiers liquides (crèmes, crèmes glacées, etc), on utilise un butyromètre 0-20% (divisions de 0,25%) ou 0-50% (divisions de 0,5%). Le prélèvement de l'échantillon est de 9,0 g. La précision de l'analyse est de ± 0,25 % ou 0,5% selon le butyromètre utilisé. \- Pour les produits laitiers solides, tels les fromages, on utilise un butyromètre Paley 0-20% ou 0-50%. Le prélèvement de l'échantillon est de 9,0 g. La précision de l'analyse est de ± 0,25% ou 0,5% selon le butyromètre utilisé. **Méthode Mojonnier** La méthode Mojonnier est la méthode de référence pour la détermination de la matière grasse dans les produits laitiers. Cette méthode gravimétrique, une adaptation de la méthode Roëse-Gotlieb, utilise un appareil spécial, l'appareil Mojonnier. [Principe de la méthode] Le produit laitier est pesé puis dissout dans la phase aqueuse contenant de l'hydroxyde d'ammonium et de l'alcool éthylique. La matière grasse est extraite à l'aide d'un solvant organique immiscible avec l'eau, composé d'éther éthylique et d'éther de pétrole. La phase organique est décantée dans un plat, le solvant évaporé et la matière grasse pesée. **% lipides = M (lipides) x 100** **M (échantillon)** [Composantes de l'appareil Mojonnier] : \- balance analytique \- centrifugeuse \- plaque chauffante \- four à vide \- dessicateur (compartiment à double paroi dans laquelle circule une huile soluble) [Particularités de la méthode :] À cause de la teneur très variable en matière grasse dans les produits laitiers, la quantité d'échantillon pesée, le nombre d'extractions et le volume de solvant utilisé doivent être ajustés en fonction de chaque type de produits laitiers. [Précision de la méthode] : \- ± 0,02% pour les laits écrémés \- ± 0,03% pour les autres laits \- ± 0,1% pour les crèmes [Rôle des réactifs :] \- Hydroxyde d'ammonium (NH4OH) à densité relative 0,8974 : Neutralise l'acidité du produit laitier, réduit la viscosité, facilitant ainsi l'action des solvants, et prévient la formation de gel. -Alcool éthylique à 95% : Facilite l'extraction, l'alcool étant miscible avec l'éther en toute proportion ; brise toute liaison entre les protéines et les phospholipides qui sont alors inclus avec la matière grasse ; facilite la séparation de la phase aqueuse et de la phase organique. \- Éther éthylique (P.E. 35^o^C) : Dissout la matière grasse et la garde en solution éthérée. L'éther dissout également un peu d'eau contenant une petite quantité de solides non gras qui peuvent causer des résultats erronés à moins de correction subséquente. \- Éther de pétrole 40-60^o^C : L'éther de pétrole est un mélange d'hydrocarbures ayant des points d'ébullition entre 40 et 60oC et sert à éliminer de la solution d'éther toute trace d'eau pouvant contenir des solides non gras. **Dosage du cholestérol**. [Méthode gravimétrique :] C'est la méthode classique de WINDAUS - CaMrNAD! (7), on dose le cholestérol sous forme de complexe avec la digitonine ; on évalue le cholestérol libre dans l'extrait lipidique total et le cholestérol total dans l'insaponifiable total obtenu après saponification. [Méthodes colorimétriques]. - Elles sont utilisées pour de petites quantités de cholestérol (le cholestérol estérifié ou total dissous dans le chloroforme donne en présence d'acide sulfurique la réaction colorée de LIEBRMANN -BuRCHARD). Citons parmi ces méthodes cette dernière est particulièrement intéressante car elle ne comporte pas les causes d'erreurs par excès des autres méthodes colorimétriques - le dosage colorimétrique porte ici sur le complexe digitonine-cholestérol, préalablement isolé par centrifugation. Généralement. Les techniques les plus anciennes, qui utilisaient des méthodes gravimétriques et colorimétriques, sont maintenant considérées comme obsolètes et ne sont plus conseillées. Les méthodes de choix sont chromatographiques, l'utilisation de la CPG est possible mais sur des dérivés qui peuvent être séparés sur des colonnes à faible polarité (Punwar, 1975; Hubbard et al., 1977). Le problème dans l'analyse des stérols est la présence en grandes quantités d'autres lipides dans la plupart des aliments qui gênent une application directe de la méthode sur l'extrait lipidique. Une saponification avant la préparation des dérivés méthylés est nécessaire. L'utilisation de dérivés triméthyl silyliques (TMS) pour l'application à des aliments complexes a satisfait les normes de l'AOAC (Carpenter, Ngeh-Ngwainbi et Lee, 1993). Les procédures sont un peu délicates à réaliser et des méthodes simplifiées demandant des temps de préparation de l'échantillon plus réduits ont été proposées (Thompson et Merola, 1993). Les améliorations de la CPG capillaire fournissent les bases au développement de procédures sans dérivatisation dont les résultats sont conformes aux normes (Jekel, Vaessen et Schothorst, 1998). **Dosage des Vitamines** Les vitamines sont des substances organiques nécessaires au bon fonctionnement du métabolisme des êtres vivants. Certaines d\'entre elles sont directement synthétisées par le corps. D\'autres, au contraire, nécessitent d\'être apportées à l\'organisme par le biais de l\'alimentation ou de la complémentation alimentaire. Elle est nécessaire en faible quantité au métabolisme d\'un organisme vivant, et qui ne peut être synthétisée en quantité suffisante par cet organisme. Les vitamines sont des compléments indispensables aux échanges vitaux. Elles ont des fonctions diverses participant dans beaucoup de processus métaboliques, de fonctions immunitaires des cellules et dans la régulation des gènes. Une carence d'une vitamine peut provoquer des signes cliniques spécifiques et des symptômes de déficiences subcliniques peuvent subvenir dans lesquels les symptômes ne sont pas évidents. Mais la productivité animale ou l'état de santé est moindre. La classification traditionnelle des vitamines dépend de leur solubilité dans les lipides ou dans l'eau. \- **Les vitamines liposolubles** (A, D, E et K) sont associées aux lipides dans les aliments. Elles sont absorbées dans l'intestin grêle par des mécanismes similaires à ceux intervenant dans l'absorption des acides gras à longues chaînes. Elles sont stockées dans des quantités appréciables dans l'organisme. **Ex : La vitamine E.** [Role] : protège les cellules de l\'oxydation en agissant contre les radicaux libres. [Carence] : atteinte hématologique de type anémie et ataxie. [Source] : les fruits à coque (noisette, noix et amande), les huiles végétales (tournesol, noisette, colza) et les germes de céréales. La vitamine E participe à la protection des membranes cellulaires et contribue ainsi à ralentir le vieillissement cutané. \"La vitamine E possède également des vertus antioxydantes. Elle est très utile pour limiter l\'oxydation du cholestérol dans le sang, premier facteur de risque de la formation des plaques d\'athérome, à l\'origine de nombreuses maladies cardio-vasculaires\", ajoute notre experte. **Les vitamines hydrosolubles** ne sont pas associées avec les lipides et les altérations dans l'absorption des lipides n'affecte pas leur absorption : et la plupart du temps elles ne peuvent être stockées en quantités suffisantes dans l'organisme et les excès sont rapidement excrétés. Ainsi une complémentation continue des vitamines hydrosolubles est nécessaire pour éviter les carences. Les vitamines hydrosolubles ne sont relativement pas toxiques, mais les excès des vitamines A et D peuvent causer de sérieux problèmes : Ce sont les vitamines du groupe B (thiamine, riboflavine, niacine, acide pantothénique, B12, choline) et la vitamine C. Les vitamines hydrosolubles sont dites \"solubles dans l\'eau\". Elles ne sont pas stockables par le corps. **Ex : La vitamine C.** [Rôle] : la vitamine C (acide ascorbique) favorise les défenses immunitaires, protège les cellules contre les radicaux libres. [Carence] : scorbut, hypertension artérielle et déficit immunitaire. [Source :] les légumes et les fruits (rouges et agrumes). La vitamine C possède des propriétés antioxydantes qui luttent contre le vieillissement des cellules. Elle aide à la cicatrisation et consolide les dents et les os. \"Très précieuse en hiver, elle renforce également les défenses immunitaires. **Dosase de la vitamine C** Les méthodes biologiques dosent à la fois la forme oxydée et la forme réduite de l'acide ascorbique. Comme on le sait le Rat synthétise la vitamine C ce qui oblige à se servir du Cobaye pour les études sur le scorbut. Dans le dosage de la vitamine C on utilise donc des cobayes que l'on choisit adultes (contrairement à ce qui se passe pour les membres du complexe B il est possible de carencer un animal adulte en acide ascorbique). Ia méthode préventive, la première utilisée (i5o), consiste à rechercher la quantité minimum d'échantillon pour prévenir le scorbut. La méthode curative s'applique à la restauration des animaux carencés par une pré période d'une quinzaine de jours. Dans les 2 cas le test est la courbe pondérale des animaux. Par ailleurs, une des manifestations du scorbut, toujours chez le Cobaye, est utilisée à des fins analytiques. Cette avitaminose modifie nettement l'histologie de la dent : - désorganisation des odontoblastes ; - structure irrégulière de la dentine ; - décalcification de la prédentine. On a échafaudé une méthode de dosage basée sur la prévention des troubles scorbutiques de la dent). Il est également possible de mesurer l'intensité de la carence ascorbique en dosant la phosphatase alcaline du sang, dont le taux est proportionnel à la quantité de vitamine chez l'animal. La méthode chimique est la seule technique couramment employée pour le dosage de l'acide ascorbique. Ce corps réduit nombre de réactifs, et pour la détermination quantitative de l'acide ascorbique on utilise généralement son pouvoir de transformer un colorant en son leuco dérivé. La technique la plus répandue consiste à observer la décoloration du dichloro 2-6 phénolindophénol qui est un colorant rouge ou bleu selon le pH. Il convient de prendre certaines précautions car le dichloro-2-6 phénol indiphénol peut oxyder des substances organiques très variées. En pratique, on extrait l'acide ascorbique de l'échantillon à l'aide de l'acide trichloracétique, acétique, métaphosphorique, oxalique, etc. Si l'on veut doser l'acide ascorbique total il faut passer l'extrait à un courant de SH~2~ en milieu acide pour réduire la forme déhydroascorbique. Ensuite, on mesure au photomètre, toutes les 15 ou 30 secondes, la décoloration d'une solution à 0,25 p. 1oo de dichloro 2-6 phénolindophénol par action de l'extrait contenant l'acide ascorbique. Une autre méthode d'effectue à pH 3, o et, en présence, d'hyposulfite on éclaire violemment la solution de bleu de méthylène contenant l'extrait d'acide ascorbique. On peut doser la somme acide ascorbique plus acide déhydroascorbique par une réaction avec la dinitro-2- 4phénylhydrazine, qui donne une osazone de couleur rouge et dont on dose l'intensité au photomètre. Enfin, il est possible de doser chromatographiquement la vitamine C sur papier en faisant un chromatogramme de la dinitro 2-4 phénylhydrazone de l'acide ascorbique, que l'on dose colorimétriquement après élution une autre méthode chromatographique sépare l'acide ascorbique de l'acide isoascorbique et d'autres substances perturbantes.