Analitike Za Prvu Parcijalnu PDF

**[ANALITIKA GLUKOZE?]** **Određivanje glukoze u tjelesnim tečnostima:** Koncentracija glukoze je 12-15% niža od koncentracije glukoze u serumu tj. plazmi. Sadržaj vode u plazmi (93%) i za 12% je veći nego u ukupnoj krvi. Glikoliza dovodi do pada koncentracije glukoze u serumu od 5 do 7% na sat....

**[ANALITIKA GLUKOZE?]** **Određivanje glukoze u tjelesnim tečnostima:** Koncentracija glukoze je 12-15% niža od koncentracije glukoze u serumu tj. plazmi. Sadržaj vode u plazmi (93%) i za 12% je veći nego u ukupnoj krvi. Glikoliza dovodi do pada koncentracije glukoze u serumu od 5 do 7% na sat. Glikoliza dovodi do pada glukoze kod leukocitoze ili bakterijske kontaminacije. Kada se izvodi pod sterilnim uvjerima u serumu, koncentracija glukoze je stabilna 8h na 25°C i do 72h na 4°C. Glikoliza se može prevenirati i stabilizirati čak tri dana dodatkom (NaF). Anti koagulant K- EDTA i NaF (2+2mg) se dodaje za određivanje glukoze u krvi. 2. **[TEST TOLERANCIJE NA GLUKOZU?]** Test oralne tolerancije glukoze OGTT je osjetjiviji test od određivanja koncentracije glukoze natašte, ali ga karakterizira slaba ponovljivost. Ne preporučuje se upotreba OGTT-a za postavljanje dijagnoze tipa I ili tipa 2 šećerne bolesti, nego samo za postavljanje dijagnoze trudničke šećerne bolesti i kad je vrijednost glukoze u krvi dvosmislena. SZO preporučuje učiniti OGTT kad je god to moguće. Faktori koji utječu na slabu ponovljivost OGTT -a obuhvataju biološku varijabilnost koncentracije glukoze u plazmi, utjecaj temperature okoliša i varijabilnost uvjeta pri uzimanju hiperosmolalne otopine glukoze. Test je standardiziran i provodi se ujutro nakon najmanje trodnevne ugljikohidratne, nerestriktivne dijete (najmanje 150 g na dan) i normalne fizičke aktivnosti. Ispitanik 12 sati prije testa ne smije jesti, piti i pušiti niti se teže fizički umarati. Pola sata prije testa mora mirovati i sjediti. Neposredno nakon uzimanja uzorka krvi odraslom se ispitaniku daje 75 g glukoze u 300 mL vode tijekom 5 minuta. Standardno opterećenje glukoze za djecu iznosi 1,75 g/kg tjelesne mase. Ispitaniku se krv ponovno uzme 120 minuta nakon optereienja. Tijekom testa skuplja se i mokraća. Kad se u organizam unese 75 g glukoze, koncentracija glukoze u krvi počinje rasti. Porast uzrokuje pojačano stvaranje i lučenje inzulina, smanjuju se glikogenoliza i glukoneogeneza, a intenzivira se ulazak glukoze u mišiće, jetru i ostala tkiva, gdje se, osobito u jetri, intenzivnije obavlja glikogeneza, a pojačavaju se i glikoliza i oksidacija glukoze. Sve to uzrokuje da se koncentracija glukoze u krvi opet smanji. Kad se koncentracija dovoljno smanji, regulacijski mehanizam počinje djelovati u smislu jačeg lučenja antagonista inzulina, ponajprije glukagona i hormona rasta, ali i glukokortikoida i adrenalina, pa se smanjenje koncentracrje glukoze zaustavlja. Zdrav čovjek reagira na opterećenje glukozom tako da mu koncentrrcija glukoze u krvi raste tijekom 30-60 minuta i dosegne maksimum oko 50% veći od početne vrijednosti natašte, a onda se dva sata nakon toga opet normalizira. U šećernoj bolesti nema dovoljno inzulina ili se polaganije luči, pa je zato porast glikemije, uzrokovan opterećenjem glukozom, jače izražen i dulje traje nego normalno. Koliko krivulja odstupa od normalne krivulje, ovisi o težini bolesti, tj. o tome je li manjak inzulina manji ili veći. Od vanjskih utjecaja na rezultate OGTT-a ponajviše utječu godine tako da se nakon 50. godine očekuje porast od 0,6 mmol/L po svakom desetljeću 3. **[ODREDJIVANJE GLUKOZE GOD POD METODOM?]** U prvoj reakciji glukoza u prisusutvu vode, pod djelovanjem glikozo oksidaze daje glukonsku kiselinu i vodonik peroksid. Ova je metoda vrlo osjetljiva na interference po pitanju hipertrigliciridemije, hemolize uzorka, povecane vrijednosti askorbata, lipemicni uzorci\... U drugoj reakciji je enzim glukozo peroksidaza i tu vidimo da sa stvorenim vodonik peroksidom reaguje ortodianizidin pri cemu nastaje oksidovana forma dianizidina i voda. Ta druga faza treba da se modificira koristenjem kisikovih elektroda, koje mjere brzinu utroska kiseonika. Zatim imamo i drugi nacin modifikovanja, a to je uklanjanje vodikkovog peroksida kao nacin modifikacije gdje vidimo da vodikkov peroksid djeluje sa etanolom koji uz prisusutvo katalaze daje acetaldehid, odnosno taj vodikov peroksid moze djelovati i sa jodidima pri cemu daje molbidat. U ovom slucaju glukoza se mjeri glukozo metrom na nivou pune krvi ili seruma, gdje puferovana glukoza difundira kroz membrane i reaguje sa glukozo oksidazom, te produkuje vodikov peroksid koji difundira duz druge membrane i oksiduje se na platinum anodi. Strujno kolo zavrsava sa srebrenom katodom, gdje se vrsi redukcija kiseonika u vodu, a vodikov peroksid difunduje natrag u komoru za uzorak i razara se putem katalaze. 4. **[ODREDJIVANJE GLUKOZE METODOM SA HEKSOKINAZOM?]** Heksokinaza ili metoda sa heksokinazom je referentna metoda koja se odvija uz proces deproteinizacije gdje vidimo da glukoza sa adenozin tri fosfatom uz istoimeni enzim daje glukozo 6 fosfat i adenozin di fosfat. Glukozo 6 fosfat u reakciji sa konezimom koji iz oksidoivane forme prelazi u redukovanu sa enzimom glukozo 6 fosfat dehidrogenazom daje 6 fosfoglukonolakton. Cim mi imamo prisusutvo koenzima koji iz oksidovane forme prelazi u redukovanu mi taj metod nazivamo UV OPTICKI TEST, koji se detektira na 339 odnosno 340 nm. Ukoliko je deproteinizacija neophodna, a ona se radi uz prisusutvo cink sulfata ili barijum hidroksida, mi onda moramo voditi racuna i uzeti u obzir cijeli niz interferencija koje mogu dovesti do lazno negativnih ili lazno pozitivnih rezultata, a to su svakakorecimo hemoliza gdje vidimo da je povecanje hemoglobina za 0,5g interferira sa enzimima koji su ukljuceni u metaboliziranje. Ukoliko imamo detektovan poviseni bilirubin ili odredjene lijekove u tom slucaju je neophodno da imamo slijepu probu. Ukoliko se kao reagens koriste fenozin meta sulfat sa substituiranim tetrazolijum solima uz prisustvo nikotin amid adenin dinukleotid fosfata, onda mjerenje mijenja svoj apsorpcijski maksimum na 520 nm. 5. **[ODREDJIVANJE GLUKOZE U URINU?]** Stari način upotrebe -- Benedict reagens Svako smanjenje tvari u mokraći također može interferirati -- davanje lažno pozitivne greške. Analitička osjetljivost do 250mg / dl Nove metode -- papirnate trake -- komercijalno dostupne Određivanje koncentracije glukoze na osnovu specifičnog enzima se vrši upotrebom reagenasa. Analitička osjetljivost je 100mg/dl. Lažno pozitivni rezultati PO kontaminacija hipohlorita (bleach). Lažno negativni rezultati sa velikom količinom ketona, askorbinske kiseline i salicilata. Procjena koncentracije glukoze u krvi kroz praćenje glukoze u urinu je nepoželjno. **[8.) ANALITIKA UREJE]** DIREKTNA METODA odredjivanja sa diacetil monoksimom, gdje vidimo da ureja sa diacetil monoksimom u reakciji daje dazonijum jone koji imaju crvenkasto ruzicastu boju I maksimum apsorpcije na 540 nm. Ova metoda spade u grupu direktnih metoda jer se direktno mjeri hromogen odnosno obojeni kompleks koji se producira iz reakcije kao krajnja tacka odnosno krajnji kompleks. U indirektnim mjerenjima se odredjuje ureja preko mjerenja amonijaka koji je medjuprodukt za sintezu u ciklusu same ureje. Ureja se ovom metodom moze odredjivati I u serumu I u plazmi, odvija se najcesce uz prisustvo kadmijum jona pri cemu ce da nastane dijazonijum crvene boje. NESLERIZACIJA je poprilicno stara metoda koja sluzi za kvantifikaciju amonijaka I koja se zasniva na principu titracije sa sufatnom kiselinom ili putem Bertoletove metode. Ureja procesom urease se razara na amonijum karbonat koji se raspada na amonijum jone I na karbomnatne jone. Amonijum joni u baznoj sredini reaguju sa ziva jodidom pri cemu nastaje zuto narandzasti koloid, koji se takodjer spektrofotometrira. DIREKTNO ODREDJIVANJE PREKO ORTOFTALIL ALDEHIDA pri cemu nastaje hromofor izoindolin koji se spektrofotometrira na 510 nm. INDIREKTNA METODA gdje je drugi dio metode Bertoletova reakcija. Ureja pod uticajem enzima ureaze se razlaze na amonijum jone a uz prisustvo fenola daje indolfenol kao krajnju tacku koja se mjeri na 560 nm. REAKCIJA PO BERTOLETU gdje vidimo da amonijum jon koji nastaje uticajem ureaze na ureu zapravo reaguje sa natrij hipohloritom uz prisustvo fenola pri cemu nastaje plavi indol fenol. Ova metoda se cesto izvodi uz natrij nitroprusid koji sluzi kao katalizator I reaguje sa navedenim hipohloritom dajuci zapravo hloramin koji sa fenolom gradi indolfenol koji je plave boje I koji se spektrofotometrira na oko 540 nm. Uz prisustvo salicilata malo se mijenja apsorpcioni maksimum I ista se detektira na 578 nm. Ovo je dugotrajna metoda a takodjer je I nespecificna metoda. METODA SA INDIKATOROM: Ph moze biti razlicita, pa ukoliko je taj ph kiseliji doc ice do promjene boje ka zutoj a ukoliko je isti bazicniji doci ce do promjene boje ka plavoj. UV OPTICKI TEST gdje ponovno u prvoj reakciji vidimo aktivnost enzima ureaze koja hidrolizira ureu na amonijum jone I onda mi te amonijum jone odredjujemo dalje. Amonijum joni ulaze u reakciju sa 2-oksoglutaratom uz enzim glutamatdehidrogenazu pri cemu nastaje glutamate. Ono sto je kod UV optickog testa kljucno to je prisustvo koenzima koji prelazi iz svoje redukovane forme ka oksidovanoj formi I tada se prati pad apsorbance I UV opticki test se sprovodi na valnoj duzini od 340 nm. TRINDEROVA METODA gdje vidimo da amonijum joni nastali prvom rekacijom ulaze u reakciju sa alfaketoglutarnom kiselinom ali je ovdje bitno napomenuti da pored koenzima koji vidimo da je redukovan I prelazi u oksidovanu formu, imamo odvijanje reakcije uz prisustvo adenozin trifosfata ili ATPa. Ova reakcija je potpomognuta katalitickim dejstvom glutamil sintetaze pri cemu iz alfaketoglutarne kiseline nastaje glutaminska a iz ATPa nastaje ADP. ADP piruvat kinazom ili piruvat oksidazom daje vodik peroksid I taj vodik peroksid u trinderovoj metodi stupa u reakciju sa 4-aminoantipirinom ili 4-aminofenazonom uz prisustvo fenola koji daje kinonimin I isti kao ruzicasto crveni spoj se spektrofotometrira na 540 nm. **[9.) ANALITIKA KREATININA]** JAFFE REAKCIJA je metoda odredjivanja kreatinina koja spade u grupu fotometrijskih metoda I temelji se na rekaciji kreatinina sa pikruinskom kiselinom u baznim uslovima pri cemu nastaje narandzasto crveni kompleks koji se spektrofotometrira na 485 nm. Nedostatak ove metode jeste da ima jako veliki broj uticaja interferencija kao sto su utuicaj hemolize, iktericnog I lipemicnog uzorka. Druge nekreatinske supstance koje stupaju u reakciju sa pikrinskom kiselinom su protein, glukoza, askorbati, gvanidin, cefalosopini. Modifikacija metode je imala za cilj povecati specificnost, pa se tako uticaj proteina moze ikloniti dijalizom, precipitacijom, kompleksiranjem. Koristenje kiselih slijepih proba da bi smo nakon razdvajanja boje dobili kompleks samog hromogena. Zatim recimo preoksidacijske manipulacije dodavanja fericijanida da bi smo sprijrcili oksidaciju bilirubina I slicno. U kinetickoj Jaffe metodi smo ogranicili odredjeni vremenski period u kojem detektiramo kontakt naseg uzorka I reagensa. Nekreatinski hromogeni reaguju vrlo velikom brzinom cak I kroz 20 sekundi, a recimo spororeagujuci protein reaguju nakon 100 sekundi tako da cemo mi zapoceti mjerenje tek nakon 20 sekundi a mjerenje cemo zavrsiti nakon 100 sekundi. TRINDEROVA REAKCIJA gdje kreatinin pod uticajem kreatin imunohidrolaze daje metilirani product koji prelazi u karbamoil sarkozin. Karbamoil sarkozin uz amidohidrolazu uz izdvajanje ugljen dioksida I amonijum jona daje saharozin I u konacnici isti oksidira u glicin, a taj korak nam je bitan jer dobijemo vodonik peroksid koji reaguje sa 4-aminoantipirinom ili 4-aminofenazonom uz prisustvo fenola I nastaje obojeni hromogen. UV OPTICKI TEST gdje kreatinin sa vodom daje kreatin koji uz ATP daje kreatin fostat I ADP pod djelovanjem kreatin kinase. ADP uz fosfoenol piruvat istoimenim enzimom piruvat kinase daje ponovno ATP I piruvat. Glavni medjuprodukt ovog niza reakcija je piruvat i ponovno redukovana forma koenzima prelazi u oksidovanu a pretvorba piruvata u laktat je katalizitrana enzimom laktat dehidrogenaze. ENZIMATSKA METODA SA IMUNOHIDROLAZOM preko amonijum jona gdje dakle kreatinin djelovanjem iminohidrolaze prelazi u N-metilhidantoin I amonijak. HPLC je referentna, laksa ali I dosta skuplja metoda. Tu dakle imamo hromatografsku separaciju kreatinina a potom apsorpcija na 200 nm. **[10.) ANALITIKA MOKRAĆNE KISELINE?]** METODA SA FOSFOTUNGSTATOM odvija se u pretvorbi mokracne kiseline ka alantoinu gdje nastaje plavo obojeni kompleks koji se spektrofotometrira u plavom filter spektru na 650-700 nm. Za odredjivanje ovom metodom je neophodno ponovno da uklonimo proteine I da ponovno minimiziramo efekat interferenci koje se I ovdje javljaju kao sto su askorbati, glukoza... METODE SA URIKAZOM, dakle ove metode koriste enzim urikazu da bi razlozili mokracnu kiselinu do alantoina. U ovom slucaju direktnim odredjivanjem alantoina mozemo vrsiti na 293 nm jer ce na toj valnoj duzini spektrofotetrirati samo mokracna kiselina ali ne I razgradni product. UV OPTICKI TEST gdje imamo koenzim koji prelazi iz oksidovane u redukovanu formu I u ovom slucaju biljezimo rast apsorbance. Dakle, mokracna kiselina sa urikazom se razlaze na alantoin I vodik peroksid a vodik peroksid reaguje ut etanol do acetilaldehida koje uz koenzim daje acetat I redukovanu formu na 340 nm. HANČOVA METODA gdje je reakcija do dobijanja vodik peroksida ista a onda uz prisustvo metanola nastaje formaldehid koji uz prisustvo amonijum jona I acetilacetona daje hidroksilutidin sto spektrofotometriramo na 410 nm, zuta boja. METODA SA PEROKSIDAZOM gdje je samo razlika u katalitickom enzimu gdje mi zapravo imamo akceptiranje kiseonika pri cemu nastaje ortodianizidin a ponovno sa fenolom dobijamo obojeni spoj. 11.) **[ANALITIKE HOLESTEROLA?]** LIBERMAN BUHARDOVA METODA je jedna od najkoristenijih metoda za odredjivanje holesterola. Karakteristika za ovu referentnu metodu jeste da se izvodi u ekstremno kiseloj sredini koju ovdje postizemo dodatkom sulfatne, acetatne, ili anhidrida acetatne kiseline. U ovoj metodi holesterol se podvrgava stepenastoj oksidaciji gdje u svakoj fazi zapravo nastaje jedan od holesterol poliena, gdje ce se prvo pretvarati hidroksilna skupina holesterola, gubiti ce se voda, I onda nastaje prvi rezultat stepenaste oksidacije a to je holestadien. Daljnjim stepenastim oksidacijama karbonijum jona stvara se holestaheksan sulfonska kiselina ciju apsorbancu mjerimo na 620 nm. METODA SA FERI JONOM U KISELOJ SREDINI, gdje vidimo da u ovom slucaju feri joni vrse oksidaciju do tetraenilnog kationa, a kiselu sredinu obezbjeduju ili acetatna ili sumporna kiselina, a intenzitet nastale boje se mjeri na 563 nm I taj intenzitet boje I kod odredjivanja I slobodnog I esterificiranog holesterola je idenican. Prednost ove metode jeste to sto se smatra osljetljivijom od Liberman Buhardove metode, jer nemamo pocetni korak saponifikacije u stepenastoj oksidaciji holesterola. Nedostatak ove metode je prisusutvo interference gdje smetaju odredjeni lijekovi I naravno hemolizirani uzorak. METODA SA PARATOLUEN SULFONSKOM KISELINOM koja se takodjer izvodi u kiseloj sredini u prisusutvu sumporne, acetatne, ili anhidrida acetatne kiseline, gdje takodjer nemamo potrebu za saponifikacijom. ENZIMATKE METODE se odvijaju u dva koraka gdje se prvo vrsi hisroliza estera holesterola pod katalitickim djelovanjem enzima holesterol esterase, gdje se na taj nacin holesterol esteri kidaju na holesterol I masne kiseline. U drugoj reakciji oslobodjeni holesterol djelovanjem holesterol oksidaze daje te holestenone koje mi zapravo mozemo I odredjivati. ODREDJIVANJE HOLESTEROLA POLAROGRAFSKI, dakle kada dobijemo oksidovanu formu mi taj holestrol mozemo mjeriti putem brzine utroska kiseonika. Prednost metode je to sto ne interferiraju oksidacijski anliti ili bilirubin koji je takodjer podlozan oksidaciji. Nedostatak je to sto se ova metoda ne moze lahko automatizirati, potrebno je mnogo enzima holesterol oksidaze da bismo dobili holestenone. Interferiraju lipemicni, iktericni I hemolizirani uzorci. ODREDJIVANJE KONCENTRACIJE HOLESTEN 4 EN 3 ONA NA 240 NM, dakle ova se metoda danas ne koristi u praksi obzitom da jako dugo traje I da se tesko identifikuju ove forme holestenona. ODREDJIVANJE HOLESTEROLA PREKO KONCENTRACIJE VODONIK PEROKSIDA, koja se jos naziva I reakcija po Trinderu. Spadaju u indirektne metode zato sto je prva reakcija potrebna da nastane voduikov peroksid a onda je ta rekacija svijestvena svima njima I ista je, a to je da vodonik peroksid u prisusutvu 4 amino antipirina ili 4 amino fenazona I uz prisusutvo fenola pod katalitickim djelovanjem peroksidaze daje kinonimin uz izdvajanje 4 molekule vode. UV OPTICKI TEST koji se odvija uz prisustvo koenzima, gdje jedna forma I to u ovom slucaju oksidovana prelazi u redukovanu formu. Stvpreni vodonik peroksid uz prisusutvo etanola I pod sjelovanjem katalaze daje acetaldehid a taj acetaldehid uz prisusutvo nikotin amin adenine dinukleotid fosfata oksidirane forme uz istoimenu dehidrogenazu daje acetat I redukovanu formu koenzima. Umjesto etanola, moze vodonik peroksid da reaguje I sa mwtanolom, gdje katalaza daje formalddehid a formaldehid uz prisustvo acetil acetone aje 3,5 diacetil 1,4 dihidroksilutidin, zuti kompleks a cim je zuta boja onda spektrofotometriramo na valnoj duzini od 410 nm. 12.) **[ANALITIKA TRIGLICERIDA?]** HEMIJSKE METODE su takozvane referentne metode gdje je neophodno da se izvrsi saponifikacija, odnosno da nas uzorak podlijeze procesu ekstrakcije koja se odvija uz prisustvo organskog rastvaraca hloforma ili silicijsumske kiseline, pri cemu se uklanjaju slobodni fosfolipidi I slobodni glicerol. Dakle, da kalijevim hidroksidom se vrsi saponifikacija pri cemu se trigliceridi cijepaju na masnu kiselinu I glicerol. Potom se glicerol tretira sa perjodatom pri cemu nastaje mravlja ili sircetna kiselina I formaldehid, a formaldehis sa hromotropnom kiselinom daje obojeni hromogen kojega spektrofotometriramo na 570 nm. ENZIMATSKE METODE se rutinski koriste u praksi I viidmo da se trigliceridi uvijek enzimom lipaze razlazu na glicerol I masne kiseline. Ti trigliceridi se potom odredjuju UV OPTICKIM TESTOM koji zapocinje reakcijom glicerola I adenozin tri fosfata uz enzim glicerol kinazu pri cemu nastaje glicerol 3 fosfat I adenozin difosfat. Adenozim difosfat se tretira sa fosfoenol piruvatom uz enzim piruvat kinazu, pri cemu nastaje piruvat I ponovo adenozin tri fosfat. Krajnja reakcija jeste da se piruvat uz prisustvo redukovane forme koenzima uz laktat dehidrogenazu prevodi u laktat I oksidovanu formu koenzima. Ukoliko je redukovani koentzim presao u svoju oksidovanu formu tada se mjeri pad apsorbance, dakle mjeri se na 399 odnosno 340 nm. ODREDJIVANJE PREKO VODIKOVOG PEROKSIDA gdje se vrsi fosforilizacija glicerola sa glicerol kinazom, pri cemu opet nastaje glicerol 3 fosfat I adenozin difosfat. Nadalje se glicerol 3 fosfat oksiduje uz prisusutvo glicerol 3 fosfat oksidaze pri cemu nastaje dihidroksi aceron fosfat I vodikov peroksid. Ponovno u zadnjoj Trinderovoj reakciji vodikov peroksid reaguje sa 54 amino antipirinom ili 4 amino fenazonom uz prisusuvo fenola, a uz djelovanje fosfokinaze nastaje kinonimin koji se spektrofotometrira u crvenom spektru od 500 do 550 nm. ODREDJIVANJE PREKO FORMAZANA gdje je prva reakcija opet identicna, dakle glicerol uz adenozin tri fosfat I djelovanje enzima glicerol kinase daje glicerol 3 fosfat I adenozin difosfat. Nakon toga fosforilizirani glicerol uz prisusutvo oksidovane forme koenzima uz enzim glicerol 3 fosfat dehidrogenazu daje dihidroksiaceton fosfat I redukovanu formu konezima. Tertrazoljumove soli sa redukovanom formom konezima uz diaforazu daje formazan I oksidovanu formu koenzima, a formazan je crveno obojen gdje ponovo mozemo vidjeti da je spektar crvenog filtera od 500 do 590 nm. 13.) **[ANALITIKA LDL I HDL?]** Na osnovu fizickih osobina I karakteristika, orva metoda za odredjivanje LDL holesterola jeste ultracentrifugiranje. Slijedeca metoda izbora jeste elektroforeza gdje se cestice mogu separirati I razdvajati na osnovu njihovog naboja odnosno brzine putovanja. Potom postoji Fridvalova formula, metoda hemijskog precipiotiranja I direktno homogeno odredjivanje. ULTRACENTRIFUGIRANJE gdje na odredjenom broju obrtaja u supernatantu zaostaju hilomikroni, nakon toga VLDL, a onda kako gustoca napreduje se dalje nizu IDL, LDL, I HDL koja zaostaje u tom talogu. BETAKVANTIFIKACIJA je metoda koja se takodjer zasniva na nekoliko faza, a tu je prisutna faza ultracentrifugiranja plazme na 105000 obrtaja, odvija se na 10 stepeni celzijusa I traje 18 sati. Tu ce se prvenstveno akumilirati VLDL cestica, kao I njeni ostatni ili rembrant VLDLovi, a LDL I HDL ce potpuno zaostati u talogu. U drugom dijelu cemo mi plivajuci sadrzaj ukoloniti a donji sadrzaj promijeati I dodati 0,1 M natrijev hlorid, I tu dolazi do izdvajanja najveceg dijela LDL I HDL cestica. Nakon toga ce se izvrsiti precipitacija sa polianionima I kationima pri cemu tacno mozemo vidjeti razdvojenu formu HDL I LDL holesterola, I u zavisnosti sta zelimo odredjivati mi cemo dakle uzeti ili supernatant ili istalozeni dio. ODREDJIVANJE PREKO FRIDVALOVE FORMULE a ta formula je izracun razlike ukupnog holesterol, HDL frakcije I triglicerida podjeljeno sa 2,22. Ova metoda ima svoja ogranicenja a to je da je ne mozemo koristiti ukoliko pacijent ima ekstremnu hipertrigliciridemiju a vrijednosti triglicerida su mu vece od 4,52 mmol/L, a to znaci da ujedno ima I visoku frakciju hilomikrona, I u tom slucaju se formula ne moze koristiti. Takodjer ako pacijent boluje od tipa 3 dislipidemija takodjer se formula ne moze koristiti. Zene u postmenopauzi zbog koristenja nadomjensne hormonske terapije estrogenima, koji takodjer dovode do promijena u lipidnom skriningu I status, ne mogu se koristiti ove formule, jer bi ova formula u tim slucajevima dovela do nize vrijednosti nego betakvantifikacija. HEMIJSKA PRECIPITACIJA gdje se LDL lipoproteinske cestice precipotiraju na osnovu svoje specificnosti prema odredjenim reagensima. Da bi se hemijska precipitacija odvijala neophodno je da se izvrsi centrifugiranje da bismo odvojili LDL od ostalih lipoproteinskih cestica I da bismo onda mogli u odredjenoj frakciji vrsiti njegovo odredjivanje. Ta precipitacija se cesto odvija sa polovinil sulfatom ili heparinom pri vrlo niskim , odnosno kiselim vrijenostima ph. Nedostatak ove metode jeste to sto se ne zna da da li su I druge aterogene cestice takodjer udruzene I prisutne sa LDLom, a to se rijesava dodatkom anitijela vezanih za smoluj, koja ce zapravo vezati preostale lipoproteinske cestice a onda cemo procesom filtriranja odvojiti sve ono sto nije LDL , odnosno tako znamo da cemo imati potpuno precipitirani losi holesterol. Sto se tice HDL holesterola ne postoji definitivna metoda, ali prpcesom ultracentrifugiranja mozemo iz plazme ukloniti VLDL cestice na osnovu gustoce, nakon cega mi na taj nacin mozemo dobiti HDL. Obicno se u ovu svrhu cesto koriti I kombinovacija ultracenrifugiranja sa dodatkom smjese heparina ili magnezijevog hlorida koja zapravo kombinacijom poilaniona I dvovalentnog lationa omogucava specificno talozenje. Druge metode koje koristimo za razdvajanje HDL subfrakcije jeste elektroforeza u ciju se svrhu moze koristiti recimo izoelektticno fokusiranje , zatim imamo tecnu hromatografiju, magnetnu rezonancu I hemijsku precipitaciju. PREPARATIVNO ULTRACENTRIFUGIRANJE je najlakse I sluzi kao referentna metoda jer se odvija u jednom koraku I na jendostavan nacin mozemo vrsiti odvajanje.preparativno ultracentrifugiranje se zasniva na osnovu razlicite gustine I mjeri se sadrzaj HDL, triglicerida, fosfolipida I proteina. Koristi se iskljucivo u istrazivackim laboratorijama, te je pooprilicno skupa I dugotrajna metoda. Zatim immao elektroforetsku separaciju koju mozemo kvantificirati na osnovu naboja nasih cestica. Potom ima I jonoizmjenjivacka kromatografija, selektivna precipitacija I direktna homogena metoda. PRECIPITACIONA METODA spade u skupinu direktnih homogenih metoda, sluzi za rutinsku detekciju HDLa, a iskljucivo podrazumijeva precipotaciju lipoproteina koji imaju apoliporpteine B100 a to su VLDL, IDL, LDL. Kada precipitiramo te cestice onda ce ostati HDL crstica koju onda mozemo kvantificirati. Njegova kvantifikacija se moze vrsiti dodavanjem polianiona koji reaguje sa pozitivno naleketrisanim kationima koji reaguju sa negativno naelektrisanim grupama I izazavati ce precipitaciju. Najcesce se u te svrhe koriste heparin, zatim kombinacija heparina I mangan hlorida ili kalcijevog hlorida. Zatim kombinacija dekstran sulfata I magnezijevog hlorida ili natrijum fosfovaltonat sa magnjezijevim hloridom. Nedostatak metode je to sto cesto nije potpuno automatizirana, I to sto zahtjeva centrifugiranje nakon precipitiranja. Osnovni princip metode jeste dodavanje tih specificnih deterdzenata koji zapravo modifikacijom mogu odvojiti lipoproteine koji sadrze apoB100 a nakon toga odrediti u supernatantu HDL. 14.) **[ANALITIKA AMONIJAKA?]** - Neslerizacija ista kao kod ureje - Bertoletova reakcija ista kao kod ureje - Tittracijske reakcije sa kiselinama - Enzimatske metode kinetickog tipa koje su referentne za ureju a to su Trinderova metoda I UV opticki test - Jonoselektivne electrode su elementi visefaznog Sistema koje omogucava potenciometrijsko odredjivanje nekog jona u otopini u prisutnosti drugih jona. 16. **[ODREĐIVANJE VOLUMENA TJELESNE TEKUĆINE?]** Supstance se apliciraju intravenski. Osobine sups: - **Zadrzavaju se u odredjenom odjeljku tj.tekucine** - **Jednoliko se rasporedjuju u tekucini** - **Ne eliminiraju se iz tekuvine u toku trajanje odredjivanja** - **Postoji dobra metoda za njihovo odredjivanje** Ukupna voda- markeri : **D2O, ANTIPIRIN, TIOUREJA, SULFONAMIDI** Markeri za ECF : **SAHAROZA, SULFOCIJANAT, MANITOL, SULFATI, BROMIDI, RADIOAKTIVNI Na** ***[Osobine markera]*** : - Prolaze kapilare, ne prolaze kroz membrane, ne ulaze u stanicnu tekucinu 1. **Metode odredjivanja volumena krvi i plazme EVANS MODRILOM** MASA VOLUMEN BOJE KOR.FAKTOR --------------- -------------- ------------ Ispod 55kg 5,0 ml 0,50 55-100 kg 7,5 ml 0,75 Vise od 100kg 10,0 ml 1,00 **Evans plavo -- 2 mg/ml fialna koncentracija** Postupak : - Izvaditi iz vene 10ml krvi - Promesati krv - Isprati strcaljku pet puta (uvuci Evans plavo), ukljuciti merac vremena - 9 min iza igla u venu druge ruke, ponoviti postupak Princip: Razredjivanje boje u plazmi -- stupanj ovisan o volumenu plazme **Volumen plazme = 20 x C / A x F** A - apsobanca F -- korekcioni faktor (vidimo u tabeli) 20 -- kolicina Evans plavog u 10ml C -- 0,004 **Nacin spravljanja boje:** - 1ml boje + 49 ml vode DF = 50 - 5ml ovako pripremljene boje - Proba -- 0,5 ml plazme u 50 ml fizioloske otopine **VOLUMEN KRVI = VOLUMEN PLAZME / 100 -- HEMATOKRIT x 100** **[17.) ANALITIKA NATRIJA?]** PLAMENA EMISIONA SPEKTROSKOPIJA, kod te metode se dakle desava da se neki uzorak izlaze plamenu pri cemu taj plamen ekscitira te elektrone, a elektroni dolaskom u ekscitirano stanje to jest nakon primanja energije, kada se vracaju u svoje osnovno, nepobudjeno stanje, on ice emitirati neku frekvenciju, odnosno neku svjetlost koja ce se onda na detektoru mjeriti, I tako ce se odredjivati koncentracija tog nekog elementa. Spektri nakon ekscitacije kod natrija je 589, kod kalija 768. Kod litija 671 I kod cesija 852, a ovdje je takodjer bitno napomenuti da se uvijek radi I neka vrsta dilucije, a za tu dilucije se najcesce koristi litiji, osim kada odredjujemo litiji tada se diliucija radi u cesijum diluentu. Dakle, ovdje plamen omogucava da elektroni primaju odredjenu kolicinu energije I prelaze u ekscitirano stanje, a prilikom vracanja u osnovno stanje oni ce emitirati neku vrstu energije odnosno neku vrstu svjetlosti koja je karakteristicna zvaki taj mjerljivi elektrolit. Dakle, uzorak seruma ili mokrace razrijedi se otopinom koja sadrzava poznatu kolicinu litija ili cesija ako se odredjuje litij, I rasprsi se u plamenu smjese butane I zraka. Natrij karakteristicno oboji plamen u zuto, a svjetlosna energija koju emitira u plamenu prolazi kroz odgovarajuci filtar I transformira se u fotostanici u elektricnu energiju I refistrira se pomocu glavanometra. Intenzitet emitiranog svjetla razmjeran je koncentraiji natrija u ispitivanom uzorku. Odnos signala I koncentracije odredjuje se pomocu mikroprocesora. Za odredjivanje natrija, serum se razrjedjuje u odnosu 1:500 to jest 0,2 ml seruma se dopuni destilovanom vodom do 100 ml. ATOMSKA EMISIONA SPEKTROSKOPIJA gdje mi pkamen koristimo da razgradimo razlicite veze izmedju atoma a onda zahvaljujuci halogenoj lampi mi gadjamo te atome koji apsorbiraju neku energiju, pri cemu prelaze u ekscitirano stanje. Ta valna duzina se krene od 190 pa do 860 nm, sto je u vidljivom spektru I koja u sustini prelazi kroz sloj slobodnih atoma u nepobudjenom osnovnom stanju, a oni su slobodni zahvaljujuci tom plamenu, I ti slobodni atomi stvaraju tu takozvanu atomsku paru koja nastaje atomizacijom u plamenu ili elektrotermickom nekom atomizacijom na visokim temperaturama koje se krecu od 1000 do 3000 kelvina. Dakle, u zavisnosti od hemijskog elementa ovo zracenje ce omoguciti da ti elektroni prelaze u pobudjeno stanje I imati ce svoj karakteruistican prepoznatljiv spektar. Izvor zracenja je ovjde suplja katoda, koja daje linijski spektar elementa od kojeg je nacinjena sama elektroda, odnosno njena povrsina. Ono sto je bitno jeste da je ova metoda jako jako koristena metoda za kvantitativno odredjivanje razlicitih metala u tragovima. POTENCIOMETRIJA mjeri razliku izmedju mjerne I referentne electrode, a taj potencijal moze biti difuzijski, redoks I membranski. Sto se tice membranskog potencijala same electrode koje koriste membranski potencijal se mogu podijeliti na nekoliko razlicitih grupa a to su: - Staklene electrode koje su razlicite u zavisnosti od razlicitih kombinacija oksida silicija sa oksidima drugih metala - Membranske electrode u cvrstom stanju koje ukljucuju jonsku reakciju sa kristalnom membranom, koja se zasniva na prisusutvu hlorida ili srebrenog hlorida ili lantan fluoride - Tekuce jonoizmjenjivacke electrode gdje je supstanca otopljena u nekom matriksu koji se sastoji od kalija, kalcija, bikarbonata itd - Gasne electrode koje su specificne I gasno permeabilne za neke gasove kao sto su kisik I ugljen dioksid - Enzimatske electrode koje u svom sastavu imaju odgovarajuce enzyme kao sto je recimo ureaza da odredjivanje ureje ili glukozo oksidaza za odredjivanje glukoze. Ako govorimo o JONOSELEKTIVNIM ELEKTRODAMA, dakle kao sto sam naziv kaze to su electrode koje selektivno mogu propustati odredjene elektrolite I na taj nacin mjere potencijal unutar tih elektroda I ponovno imamo nekoliko razlicitih vrsta a to su: - Staklene electrode electrode koje su razlicite u zavisnosti od razlicitih kombinacija oksida silicija sa oksidima drugih metala - Electrode koje su zasnovane na nekom cvrstom stanju, koje ukljucuju jonsku rrakciju sa kristalnom membranom - Tecna jonska razmjena electrode gdje je supstanca otopljena u nekom matriksu koji se sastoji od kalija, kalcija, bikarbonata itd - Gasni senzori koji su specificni I gasno permeabilni za neke gasove kao sto su kisik I ugljen dioksid NATRIJEVA ELEKTRODA je elektroda koja se zasniva na prisustvu staklenih I kalijevih elektroda s tim da je razlika izmedju jedne I druge electrode u sastavu oksida silicijuma I procenat zastupljenosti recimo aluminijevog oksida Itd. Bez obzira da li odredjuemo natriji ili kaliji dakle, uvijek je referentna elektroda hlorid/ srebro hlorid. Ako govorimo o tecnim jonoizmjenjivackim membranama one uvijek inkorporiraju valinomicin koji ima mogucnost vezivanja kalija I na taj nacin se dakle mogu koristiti za odredjivanje kalija. INDIREKTNA POTENCIOMETRIJA, dakle pojedini elementi mogu indirektno uticati na koncentraciju natrija, tako da se upravo indirektnom potenciometrijom izbjegavaju netacni rezultati. Posto koncentracija uzima u obzir originalni volume te diluciju, sve sto je iskljuceno iz volumena ubacuje gresku koja je obicno bezznacajna. Medjutim kada uzorak sadrzi viskoke koncentracije lipida ili proteina, diluciona greska kod nedirektnih potenciometriskih mjerenja moze postati znacajna. Hiperlipidemija I hiperproteinemija mogu za posljedicu imati pseudo hiponatrijemiju kada se mjerenja rade indirektnom potenciometrijom. SPEKTROFOTOMETRIJA tu mozemo pricati recimo o koristenju O-nitrofenil beta D galaktopiranozidina koji ce u prisustvu natrija I beta galaktozidaze ce dati galaktozu I O-nitrofenol, koji se onda spektrofotometrijski mjeri na 420 nm. Te mozemo pricati o kriptanidima koji predstavljaju ciklicne supstance koje imaju mogucnost da vezu monovalentne katione u vodenim rastvorima I ustvari njihovim vezivanjem mijenja se njihov spektar, odnosno on ice pomjeriti svoj mnaksimum apsorpcije ka nekim drugim talasnim duzinama sto se naravno spektrofotometrijski moze jednostavno odrediti. Za ovu metodu nije potrebna dilucija tako da se koristi kao alternativni postupak, te takodjer to je metoda bez interference. **[18.) ANALITIKA KALIJA?]** PLAMENA EMISIONA SPEKTROSKOPIJA, kod te metode se dakle desava da se neki uzorak izlaze plamenu pri cemu taj plamen ekscitira te elektrone, a elektroni dolaskom u ekscitirano stanje to jest nakon primanja energije, kada se vracaju u svoje osnovno, nepobudjeno stanje, on ice emitirati neku frekvenciju, odnosno neku svjetlost koja ce se onda na detektoru mjeriti, I tako ce se odredjivati koncentracija tog nekog elementa. Spektri nakon ekscitacije kod natrija je 589, kod kalija 768. Kod litija 671 I kod cesija 852, a ovdje je takodjer bitno napomenuti da se uvijek radi I neka vrsta dilucije, a za tu dilucije se najcesce koristi litiji, osim kada odredjujemo litiji tada se diliucija radi u cesijum diluentu. Dakle, ovdje plamen omogucava da elektroni primaju odredjenu kolicinu energije I prelaze u ekscitirano stanje, a prilikom vracanja u osnovno stanje oni ce emitirati neku vrstu energije odnosno neku vrstu svjetlosti koja je karakteristicna zvaki taj mjerljivi elektrolit. Dakle, uzorak seruma ili mokrace razrijedi se otopinom koja sadrzava poznatu kolicinu litija ili cesija ako se odredjuje litij, I rasprsi se u plamenu smjese butane I zraka. Kalij karakteristicno oboji plamen u ljubicasto, a svjetlosna energija koju emitira u plamenu prolazi kroz odgovarajuci filtar I transformira se u fotostanici u elektricnu energiju I refistrira se pomocu glavanometra. Intenzitet emitiranog svjetla razmjeran je koncentraiji natrija u ispitivanom uzorku. Odnos signala I koncentracije odredjuje se pomocu mikroprocesora. Za odredjivanje natrija, serum se razrjedjuje u odnosu 1:500 to jest 0,2 ml seruma se dopuni destilovanom vodom do 100 ml. ATOMSKA EMISIONA SPEKTROSKOPIJA gdje mi pkamen koristimo da razgradimo razlicite veze izmedju atoma a onda zahvaljujuci halogenoj lampi mi gadjamo te atome koji apsorbiraju neku energiju, pri cemu prelaze u ekscitirano stanje. Ta valna duzina se krene od 190 pa do 860 nm, sto je u vidljivom spektru I koja u sustini prelazi kroz sloj slobodnih atoma u nepobudjenom osnovnom stanju, a oni su slobodni zahvaljujuci tom plamenu, I ti slobodni atomi stvaraju tu takozvanu atomsku paru koja nastaje atomizacijom u plamenu ili elektrotermickom nekom atomizacijom na visokim temperaturama koje se krecu od 1000 do 3000 kelvina. Dakle, u zavisnosti od hemijskog elementa ovo zracenje ce omoguciti da ti elektroni prelaze u pobudjeno stanje I imati ce svoj karakteruistican prepoznatljiv spektar. Izvor zracenja je ovjde suplja katoda, koja daje linijski spektar elementa od kojeg je nacinjena sama elektroda, odnosno njena povrsina. Ono sto je bitno jeste da je ova metoda jako jako koristena metoda za kvantitativno odredjivanje razlicitih metala u tragovima. Sto se tice analitike kalija tu se metode poput ATOMSKE EMISIONE SPEKTROSKOPIJE, PLAMENE EMISIONE SPEKTROSKOPIJE, JONOSELEKTIVNE ELEKTRODE, te SPEKTROFOTOMETRIJSKE METODE iste kao I kod natrija. ENZIMATSKE METODE koja se zasniva na takozvanom UV optickom testu, a uv opticki testovi su testovi koji koriste koenzim nikotin amid adenine dinukleotid fosfat, gdje redukovana forma koenzima prelazi u oksidovanu formu koenzima pri cemu ce se ta reakcija pratiti na 340 nm, a s obzirom dakle da nastaje oksidovana forma koenzima ovdje cemo pratiti pad apsorbance a reakcija tece tako da imamo triptofan koji u prisusutvu fosfata I triptofanaze te kalija daje indol uz prisustvo piruvata te amonijevih jona koje ce onda u prisusutvu 2 okosoglutarata I redukovane forme koenzima u prisusutvu glutamate dehidrogenaze nastat ce glutamate I oksidovana forma koemzima, gdje cempo pratiti pad apsorbance na 339 odnosno 340 nm. KORISTENJE MAKROCIKLICNIH HROMOFORA koji su organizirani tako da imaju odredjene supljine u koje se karakteristicno vezu odredjeni elekroliti , a to su takozvali policiklicni eteri -- kriptamidi recimo valinomicin koji je prije svega jonoselektivan za kalijum. Vezivanje kalija uzrokuje pomak spektra sto ce dovesti do toga da mozemo primjetiti razliku izmedju slobodnog hromofora I onog vezanog za kaliji, I naravno mjerimo apsorbancu na drugoj talasnoj duzini sto odgovara koncentraciji vezanog kalija. HROMOLIT METODA koja se zasniva na reakciji izmedju fosfoenol piruvata I adenozin difosfata gdje ce u prisusutvu kalija I piruvat kinase nastati piruvat I adenozin tri fosfat. Zatim opet imsmo UV opticki test gdje piruvat reaguje sa redukovanom formom koemzima uz djelovanje enzima laktat dehidrogenaze nastaje laktat I oksidovana forma koenzima. Tu se mjeri pad apsorbance na 339 nm. **[19.) ANALITIKA HLORIDA?]** MERKURIMETRIJSKA TITTRACIJA koja je zasnovana na prisustvu zive nitrata pri cemu se grade netopivi kompleksi zive hlorida, a u ovoj situaciji se koristi indikator difenilkarbazon pri cemu ce se visak zive reagovati sa difenilkarbazonom I gradit ce se ljubicasti kompleks koji nam je pokazatelj zavrsetka reakcije. SPEKTROFOTOMETRIJSKE METODE koje se zasnivaju ponovo na reakciji hloridnih jona sa zivinim tiocijnidom pri cemu se stvara zivin hlorid I oslobadjajau se tiocijanatni joni. Zatim ce ti tiocijanatni joni reagovati sa zeljezom pri cemu se gradi kompleks koji se mjeri na 480 nm I koji je crvene boje. Potom imamo reakciju sa tri piridil triazinom koji ce dovesti do toga da ce nastati plava boja kompleksa koja ce se mjeriti na 560 do 600 nm. Te imamo reakciju sa zeljezo hipohloritom koji ce reagovati sa hloridnim jonima I ponovo ce nastati kompleks koji se mjeri na 344 do 562 nm. KULOMETRIJSKO AMPEROMETRIJSKA TITTRACIJA gdje srebrena elektroda pod djelovanjem struje otpusta srebrene jone koji ce u prisusutvu hloridnih jona graditi kompleks srebro hlorida, a kolicina hlorida u ovom slucaju je direktno proporcionalna vremenu koje je potrebno da se generira dovoljna da bi se istitrirali svi hloridni joni sto bi u prevodu znacilo da zahvaljujuci ovoj elektricnoj struji oslobadjaju se srebreni joni koji ce vezati hloridne jone I sve dok ima hloridnih jona ce se graditi netopivi srebro hlorid, medjutim kada se istitrira sva kolicina hloridnih jona detektovati ce amperometrisjki kolicina slobodnih srebrenih jona I to vrijeme koje je potrebno da se detektuje kolicina srebrenih jona je ustvari proporcionalna kolicini hlorida I na taj nacin se direktno upravo preko vremenskog okvira ustvari izracaunava koncentracija hlorodnih jona. **[20.) ANALITIKA BIKARBONATNOG JONA?]** KONTINUIRANI ANALIZATORI koji se zasnivaju prije svega na oslobadjanju ugljen dioksida to jest na njegovoj difuziji preko specificnih silikonskih membrana na pufer cija je ph vrijednost 9,2, gdje u prisusutvu fenolftaleina dolazi do redukcije boje, sto je komplementarno koncentraciji bikarbonatnih jona. ENZIMATSKE METODE gdje se dakle bikarbonatni joni mogu mjeriti u reakciji bikarbonatnih jona sa fosfoenolpiruvatom pod djelovanjem enzima fosfoenolpiruvat karboksilaze pri cemu se oslobadja fosfor I nascentni kisik, a taj nascentni kisik potom reaguje sa redukovanom formom koenzima koji pod djelovanjem enzima malat dehidrogenaze daje malat I oksidovanu formu koenzima, pri cemu ponovno imamo pad apsorbance. MONOMETRIJSKA METODA koja se zasniva na indirektnom mjerenju kolicine ugljen dioksida. PCO2 ELEKTRODA gdje CO2 prolazi silikonsku memebranu I dolazi do promjene ph pufera u klom se nalazi mjerna elektroda, a promjena ph vrijednosti pufera ce biti direktno proporcionalno koncentraciji CO2. Dakle CO2 sa vodom pod djelovanjem karboanhidraze daje vodikove I bikarbonatne jone, mi dakle preko bikarbonatnih jona mozemo odrediti koncentraciju CO2. **[21.) ANALITIKA MAGNEZIJA?]** SPEKTROFOTOMETRIJSKE METODE koje se zasnivaju na vezivanje nekih specificnih boja kao sto su eriohrom crno T, fast blue, titatn zuto. Danas najcesce koristi kalmagit pri cemu nastaje ljubicasti kompleks koji se mjeri na 530-550 nm. Takojder tu postoje I neki drugi kompleksirajuci agensi kao sto je metil timol plavo koji gradi complex koji se mjeri na 600 nm, zatim magon ksilidil plavo na 600 nm, formazan komleks na 630 nm, te titanovo zutilo pri cemu nastaje koloidna otopina I crveni kompleks koji se mjeri na 540 nm. Dakle, ovdje se mora voditi racuna o hemolizi koja moze dovesti do netacnih rezultata I oslobadjanja kalcija I magnezija iz eritrocita pa moze dovesti do lazno pozitivnih rezultata. Zatim nikada ne treba koristiti okslat ili EDTA kao antikoagulanse jer vezu magneziji pa onda mozemo dobiti lazno niske vrijednosti. Ako koristimo urin kao uzorak njega obavezno treba zagrijati na 60 stepeni a naravno I zakiseliti na ph = 1, a to se radi zato da bi se mogao osloboditi od svojih soli koji su naravno netopivi. NASTANAK FLUORESCENTNIH KOPLEKSA recimo da kalceinom, pa zatim fluorescentni komleks sa dihidroksi benzenom pri cemu je ekscitacija na 420 a emisija na 530 nm. PLAMENA EMISIONA SPEKTROSKOPIJA na 370, 383 nm ATOMSKA APSORPCIONA SPEKTROSKOPIJA koja je inace referentna metoda NEUTRONSKA AKTIVACIJA kao definitivna metoda **[22.) ANALITIKA KALCIJA?]** Kao uzorak se najcesce koristi heparinizirana plazma a moze se koristiti I serum I urin. Ako koristimo urin onda moramo voditi racuna da on bude jako kiseo za sta se koristi 5-10ml 6 M HCl. Ako odredjujemo jonizirani kalcij onda koristimo serum ili hepariniziranu krv. PLAMENA EMISIONA SPEKTROSKOPIJA gdje kalcij ima maksimum apsrorpcije na 422,7 nm. ATOMSKA APSORPCIONA APEKTROSKOPIJA koja je I referenzna metoda I gdje je apsorbanca proporcionalna broju atoma kalcija u graoun stanju. MASENA SPEKTROSKOPIJA kao definitivna metoda. TITRTIMETRIJSKE METODE se baziraju na stvaranju fluorescentnih kompleksa sa kalcijumom, I najcesce se u te svrhe koristi kalcein gdje dakle kalcij reaguje sa kalceinom I dobije se kalcijum kalcein ili EDTA,gdje pratimo pad fluerescencije I pri cemu je dakle ekscitacija na 490 a emisija na 530 nm. SPEKTROFOTOMETRIJSKE METODE gdje imamo razlicite hromofore kao sto su kalcein, kalcon, kalcifast plavo, plazmakorint B, hidroksinaftol plavo, glioksal.... Kada kalcijum djeluje sa kresol ftaleinom u baznoj sredini nastaje crvni kompleks koji se spektrofotometrira od 520 do 570 nm. Tu problem mogu predstavljati hemoliza, iktericni, lipemicni uzorci, te paraproteini. Sto se tice jonskog kalcija se tu koristi POTENCIOMETRIJA kao princip odnosno kao metoda izbora gdje se mjeri razlika potencijala izmedju kalcija I ph referentne electrode za kalibratore. Moze se koristiti I JONOSELEKTIVNE ELEKTRODE koje su neosjetljive na promjene ph, kao uzorak se koristi plazma a kao antikoagulans se koristi heparin. Tu mogu biti pristine varijacije u zavisnosti od spola, dobi, trudnoca, doba godine itd. Te imamo I neke starije metode kao sto su dijalizat, ultracentrifugiranje, jonoizmjenjivacka hromatografija, te racunski put. **[23.) ANALITIKA FOSFATA?]** Kod analitickog dijela dakle krv se treba sto prije centrifugirati I da se odvoji serum, jer u sustini ukoliko to ne uradimo onda ce doci do toga da ce fosfati biti veci u odnosu na ono sto je zaista realna situacija, zbog toga sto ce fosfataza razlagati estere koji u sebi imaju fosfate I na taj nacin cemo dobiti lazno pozitivne rezultate, I zato je veoma bitno da se krv nakon sto se izvadi vrlo brzo centrifugira I odvoji se serum. Takodjer ako se javi hemoliza povecani ce biti fosfati zato sto ce se oslobadjati iz eritorocita, a povecane vrijednosti fosfata imamo I kod trombocitoze. Analitika fosfata se zasniva na detekciji I reakciji odredjenih I odgovarajucih molibdenovih oksida a detekcija se vrsi zahvaljujuci UV apsorpciji ali se moze vrsiti I zahvaljujuci nekim reducirajucim agensima kao sto su aminonaftol sulfonska kiselina, stanohlorid, metil p aminofenol sulfat, feroamonij sulfat, askorbat itd. I ima druga opcija a to je stvaranje zutog kompleksa sa fosfatom ukoliko je prisutna kisela ph vrijednost. ENZMATSKE METODE gdje imamo UV OPTICKI test pri cemu se u te svrhe koriste odgovarajuci anelati odnosno enzimi kao sto su glikogen fosforilaza, fosfogluko mutaza I glukozo 6 fosfo dehidrogenaza. U svim ovim reakcijama se koristi fosfor kao supstanca koja omogucava aktivaciju I reakciju ovih enzima I takodjer se ovdje koristi koenzim u redukovanoj ili oksidovamoj formi, a u zavisnosti od toga sta nastaje kao prodkt reakcije mjeri se rast ili pad apsorbance na 339 odnosno 340 nm. PREKO HIDROGEN PEROKSIDA uz hromogeni supstrat gdje fosfati uz prisusutvo inozina I uz pomoc enzima purin nukleozid fosforilaze nastaje hipoksantin riboza 1 fosfat. Potom taj hipoksantin riboza 1 fosfat u prisustvu vode I kisika I uz pomoc ksantin oksidaze nastaje mokracna kiselina I vodikov peroksid. Zatim taj vodikov peroksid zahvaljujuci hromogenim supstratima uz pomoc peroksidaze daje crveno ljubicasti kompleks koji se spektrofotometrira na 555 nm. Moze se odredjivati I TRINDEROVOM REAKCIJOM gdje nastaje kinonimin uz enzim fosforilazu, fosfofruktomutazi I glukozo 6 fosfat dehidrogenazu. **[24.) ANALITICKI ASPEKTI ACIDOBAZNOG STATUSA, UZORKOVANJE I PROBLEMI?]** Analiticki aspekti na koje moramo da obratimo paznju kada govorimo o acidobaznom statusu su svakako odredjivanje ph, PCO2, bikarbonatni joni kako bismo mogli da dijagnosticiramo ono sto nam je najbitnije. Bitno je tu dakle odrediti da li se radi o acidozi ili alkalozi, treba da se diferencira da li se radi o metabolickom ili respiratornom poremecaju, treba da znamo dakle da promjene PCO2 uzrokuju respiratorne poremecaje a promjene bikarbonata da uzrokuju metabolicke poremecaje. Cesto se anlizira I ekces baze I saturacija kisikom. Uzorkovanje krvi za analizu acidobaznih parametara se moze vrsiti na dva nacina I to sakupljanje krvi u hepariniziranim plasticnim kapilarama pri cemu dobro moramo voditi racina da nema zraka u tim kapilaricama. Cesto se uzorak uzima I putem respiratorne terapije, dakle lijekova koji uticu na intenzitet disanja. Tu se krv sakuplja pod anaerobnim uslovima I uzorak se stavlja na led, jer led usporava metabolizam. Testiranje se vrsi na 37 Stepeni celzijusa, da bi se imitirala tjelesna temperature. Kao uzorak se dakle moze uzimati arterijska I venska krv I obicno se oni koriste kod analize gasova, ph I saturacije kisikom, u analizi elektrolita, ukupnom CO2 pri cemu pacijent mora biti miran. Sto se tice arterijske krvi kao antikoagulans se koristi heparin, uzorak se mora brzo transportovati jer je ovo urgentna analiza, zato sto izlaganje zraku moze dovesti do rasta PO2, pada PCO2 te do rasta ph. Sto se tice preanalitickih problema mi tu moramo voditi racuna o mjehuricima zraka jer zrak uzrokuje rast PO2 I ph, a izaziva pad PCO2. Takodjer moramo voditi racuna da ne smije biti koaguluma jer osim sto moze dovesti do pogresnih rezultata moze dovesti do zacepčjenja uskih kapilara u aparatu. Takav se uzorak dakle ne mozekoristiti, tu ce nastupiti I glikoliza, a celijska respiracija ce dovesti do pada ph I PO2 a do rasta PCO2. Mora se voditi racuna I o temperature koja moze dovesti do poremecaja ph vrijednosti, gdje svaki rast temperature za jedan stepen dovodi do pada ph za 0,015 jedinica. **25. [ANALITIKA PCO2?]** Indirektna metoda --preko mjerne promjene pH sredine gasni CO2\-\-\-\-\-\-\-\-\-\--difuzija\-\-\-\-\-\-\-\-- silikonska membrana *[Enzimatsko određivanje]* -Apsorpcija CO2 u alkalnom mediju -CO2 prolazi semipermeabilnu membranu, spaja se sa vodom i gradi H2CO3 koja disocira na H+ i HCO3- \- H+ prolazi u elektrodu i mijenja Ph Indirektno određivanje hidrogen karbonata enzimskim putem HCO3+PEP \-\-\-\-\-\-- PEP karboksilaza \-\-\-\--oksalacetat +Pi Oksalacetat + NADH + H+ \-\-\-\-\-\--MDH\-\-\--malat +NAD *[Manometrijski]* Mjerenje razlike u pritisku gasova oslobođenih iz plazme u zatvorenom sistemu. *Problemi:* - STAROST MEMBRANE - PROTEINI - UGRUŠCI - KALIBRACIJA **28. [ODREDJIVANJE PH?]** Obzirom da veliki broj biohemijskih reakcija ovise od pH, tačno mjerenje i kontrola pH vrijednosti su od izuzetne važnosti. Mjerenje pH sa pH metrom predstavlja vrlo jednostavan proces, ali u cilju izbjegavanja grešaka i kod ovog mjerenja treba obratiti pażnju na izbjegavanje grešaka. pH metri pH metar je de facto potenciometar koji se koristi za mjerenje koncentracije H+ jona u rastvoru. Tom prilikom se mjeri električni potencijal koji ovisi od razlike napona između referentne elektrode, obično kalomel i staklene elektrode koja je osjetljiva na promjenu koncentracije H+ jona. Staklena membrana pokazuje selektivnu permeabilnost za H+ jone dok je za druge katione i anione nepermeabilna. Ova permeabilnost za posljedicu ima pojavu potencijala duž membrane koji je linearna funkcija pH. B=konstanta + 2.303RT/F \* pH Konstanta koja je dio ove jednačine ovisi od broja faktora i mijenja se u odnosu na tip elektrode. Kod mjerenja pH mora se standardizirati elektroda i pH metar sa rastvorima poznatih koncentracija H+ jona. Obzirom da izmjereni potencijal pokazuje ovisnost i od temperature, za adekvatno mjerenje, temperaturna kompenzacijska kontrola na pH metru se mora podesiti na temperaturu rastvora čijí se pH mjeri. Postupak: Neposredno prije korištenja pH metra, elektrode je potrebno isprati sa destilovanom vodom i nakon toga ih osušiti. Potom se one očiste papirom. pH metar se uvijek standardizira sa 2 pufera i to jednim čiji pH je ispod i drugim čiji pH je iznad vrijednosti koje se trebaju izmjeriti, pH 4 i 7 ili pH 7 i 10. Tek nakon što je pH metar standardiziran i očitanja na njemu stabilna, može se pristupiti mjerenju pH rastvora. pH metri sa dvije posebne elektrode, staklenom i kalomel se koriste ukoliko je volumen rastvora dovoljan. Kombinacijska elektroda kod koje su i staklena i referentna elektroda inkorporirane u maloj tankoj epruveti predstavlja dobar odabir prilikom rada sa malim zapreminama tečnosti. Pogreške prilikom mjerenja pH mogu se javiti uslijed prisustva visokih koncentracija Na+, pri većim jonskim jačinama (na primjer prilikom rada sa rastvorom amonijum sulfata). Nakon korištenja elektrode treba isprati sa destilovanom vodom i uskladištiti ih prema uputstvu proizvodača.