TP5 - Alterações Neuropatológicas em SCA2 PDF

TP5 Alterações neuropatológicas em SCA2 O Cérebro e a região do cerebelo A estrutura do cortex cerebeloso Coloração com violeta de cresilo Utilizado na chamada “coloração de Nissl” Corante básico (“acidófilo) Cora ácidos nucleicos de roxo/azul - RNA no retículo endoplasmático e nos ribossoma...

TP5 Alterações neuropatológicas em SCA2 O Cérebro e a região do cerebelo A estrutura do cortex cerebeloso Coloração com violeta de cresilo Utilizado na chamada “coloração de Nissl” Corante básico (“acidófilo) Cora ácidos nucleicos de roxo/azul - RNA no retículo endoplasmático e nos ribossomas (substância/grânulos/corpos de Nissl) - DNA no núcleo Método de Golgi Permite visualizar neurónios individuais e observar as suas projeções Cora alguns neurónios mas não outros, aleatoriamente Sais de prata precipitados coram as células de castanho/preto Método: 1. Incubação com dicromato de potássio 2. Secagem 3. Incubação com nitrato de prata 4. Formação de complexos de cromato de prata 5. Desidratação com álcool 6. Montagem das preparações com lâminas e lamelas Imunocitoquímica e imunohistoquímica Imunodeteção Imunocitoquímica e imunohistoquímica Quem é quem ? mouse anti -Calbindin (PCs) IHC vísivel DAB + ABC Coloração com Método de Golgi rabbit anti-ATXN2 IHC vísivel DAB + ABC mouse anti-Calbindin (PCs) IHC Fluorescência Alexa 488 Coloração violeta de cresilo Procurar um artigo científico na internet que tenha resultados de histologia do cerebelo. Identificar o contexto da investigação e com que objetivo se utilizou técnicas histológicas. Identificar que métodos quatitativos foram utilizados no contexto da investigação. TP6-Alterações neuropatológicas em SCA2 As camadas do cerebelo e o seu conteúdo celular Que dados podemos obter da análise histológica do cerebelo? - Diferentes técnicas histológicas produzem diferentes dados Que dados podemos obter da análise histológica do cerebelo? - Diferentes técnicas histológicas produzem diferentes dados Que dados podemos obter da análise histológica do cerebelo? - Diferentes técnicas histológicas produzem diferentes dados Quantificação automática pelo software Fiji/ImageJ - Adjust Threshold - O ajuste do threshold transforma uma imagem em binária balizando os que é considerada expressão verdadeira para uma proteína específica (ex. calbindina). - Esse ajuste tem de ser o mais ajustado à realidade possível para não dar “falsos positivos” ou “falsos negativos”. Quantificação automática pelo software Fiji/ImageJ - Analyse particles - O ajuste da quantificação do tamanho dos pixéis permite definir o que é uma partícula que é efetivamente uma célula e partículas que não representam uma célula Análise de dados - Que informações Podemos retirar de um gráfico com os dados obtidos? - Comparação de 2 grupos (WT vs TG) - Comparação dos grupos em diferentes timepoints. - Realizar estatística para verificar se as diferenças observadas são estatisticamente significativas. Nota: Só Podemos afirmar que existem diferenças quando p < 0,05 (*). COISAS IMPORTANTES - É essencial que todas as técnicas realizadas desde o desenho da experiencia, obtenção dos tecidos, realização das colorações/marcações histológicas, à análise de dados seja feita de forma meticulosa para que os resultados sejam o mais fiéis possível à realidade. - A coloração/marcação depende do que se está à procura analisar naquele tecido e experiência em específico. - Dependendo de cada coloração/marcação que se que fazer, diferentes preparações são necessárias ter em conta? Ex. Fixações de tecidos diferentes, protocolos diferentes, planos de corte diferentes, etc..