Genkifejeződés (Génexpresszió) 9 előadás 08012024 PDF

Génkifejeződés (Génexpresszió) Génexpresszió I Minden élő sejtben a genetikai információ átadásának iránya  DNS RNS (transzkripció, RNS szintézis) és  RNS fehérje (transzláció, fehérje szintézis)  e...

Génkifejeződés (Génexpresszió) Génexpresszió I Minden élő sejtben a genetikai információ átadásának iránya  DNS RNS (transzkripció, RNS szintézis) és  RNS fehérje (transzláció, fehérje szintézis)  ez a folyamat egészében a génexpresszió  eredményeként a sejt szerkezete/funkciója megváltozik Centrális dogma: az élő rendszerekben a genetikai információ áramlása egyirányú, a DNS → RNS → fehérje → tulajdonság Génexpresszió Gén: egy fehérje (polipeptidlánc) szintézisét biztosító DNS-szakasz Egy tipikus eukarióta gén szerkezete a fő szabályozó elemekkel ide kötődnek különböző szabályozó fehérjék pl. transzkripciós faktorok, RNS-polimeráz Génexpresszió Gén: egy fehérje (polipeptidlánc) szintézisét biztosító DNS-szakasz  ún. háztartási gének (konstitutív gének, housekeeping genes) ,  a sejtek a sejttípustól függetlenül állandóan kifejezik  alapvető anyagcsere-folyamatok enzimjeit, a membránok, a váz fehérjéit- tehát minden sejtben közösen előforduló fehérjéket kódolnak (pl. aktin, tubulin)  szabályozott gének  szövetspecifikus fehérjék szintézisét irányítják  génjeik minden sejtben jelen vannak, de csak a rájuk jellemző szövetféleség sejtjeiben fejeződnek ki, működésük differenciált sejtpopulációk kialakulását eredményezi  változhat időben is: a szervezet fejlődése során más és más gének kerülhetnek aktív vagy represszált állapotba. A génexpresszió pontosan és bonyolult módon, több szinten szabályozott.  Génexpresszió I: Transzkripció – Átírás  a DNS-szekvencia részei RNS-re íródnak át  „transzkripció” - mivel az információ, bár más kémiai formába, de még mindig ugyanazon nyelven, („nukleotidnyelven”) iródik át (hasonlat: kézírásból – gépírásba) RNS  is egy lineáris polimér, 4 kb. nukleotid-alegységekből áll, amelyeket foszfodiészterkötések kapcsolnak össze  kémiailag két szempontból különbözik a DNS-től: 1. nukleotidjai ribonukleotidok (dezoxiribóz helyett ribózt tartalmaznak) 2. bázisok szintén A, C és G, de timin (T) helyett uracil (U) U is hidrogénkötést tud az A-nel kialakítani (komplementáris bázispárosodás itt is érvényes)  egyszálas igen változatos formában hajtogatódhat, akárcsak egy polipeptidlánc míg a DNS csak információraktár, az RNS különb. formákban Ribóz (még egy – OH csoport) Uracil (egy CH3-csoport hiányzik) fordulhat elő, amelyek közül egyesek információ tárolás mellett a nukleotidok közötti kapcsolatok hasonlók strukturális vagy éppen katalitikus feladatokkal rendelkeznek  A sejtben különböző típusú RNS-ek találhatók  messenger RNS (mRNS) v. hírvivő RNS- fehérjét kódoló génekről másolódnak és végül is a fehérjeszintézist irányítják,  riboszómális-RNS (rRNS)- a riboszómák alapvető strukturális elemei + enzim funkció  transzfer-RNS (tRNS)- adaptációs molekulák, amelyekkel a különböző aminosavak a riboszómán a megfelelő helyre kerülnek a fehérjébe való beépítéshez  mikroRNS (miRNS)- és más kis RNS-ek - kulcsszerep az eukarióták génexpressziójának szabályozásában; strukturális és katalitikus (enzim) feladatokat látnak el mindegyik RNS a megfelelő (RNS)gének átírásának eredménye, és mindegyik részt vesz a fehérje szintézisben Transzkripció – Átírás  a DNS-szekvencia részei RNS-re íródnak át: RNS szintézis A transzkripció előtt a DNS kettős hélixnek -az átírandó gén közelében- le kell tekerednie és a két szálnak el kell távolodnia egymástól a szétnyílt DNS –szakasz = „transzkripciós buborék”  a DNS kettős hélix egyik szála szolgál mintaként (templátként)  a másik szál az RNS-szintézis tekintetében a nem-templát szál (= kódoló szál) Transzkripció – Átírás  báziskomplementaritás szerint DNS-mintáról (templát) történik  a DNS kettős hélix egyik szála szolgál templátként  a másik szál az RNS-szintézis tekintetében a nem-templát szál A kialakuló RNS lánc  a templát komplementere és a  a nem-templát szál másolata (kivéve, hogy az RNS-ben timin helyett uracil található!)  a nem-templát DNS szál a kódoló szál - a benne rejlő nukleotidsorrend adja a funkcionális RNS-ek és a fehérjék szerkezetére vonatkozó információt, a kódot a transzkripció olyan RNS-t eredményez, amely komplementer a templát DNS szálhoz Transzkripció – Átírás a transzkripciót végző fő enzim az RNS-polimeráz (Pol) a DNS templát szál mentén mozog 3’→5’ irányban és az RNS molekula 5’→3’ irányban növekszik (csak a lánc 3’ végére képes új nukleotidokat (A, U, C vagy G) kötni - nagy enzimek, több alegységből RNS polimeráz enzim  RNS-t szintetizál DNS mintát használva, a komplementaritás elve alapján Az eukarióta sejtekben az átírást háromféle RNS-polimeráz (Pol) végzi prokariótákban egyféle RNS-polimeráz  RNS-Pol.I. - a magvacskában (nukleóluszban) lokalizálódik, rRNS-molekulákat szintetizálja  RNS-Pol.II. - a nukleoplazmában lokalizálódik, a mRNS-ek (fehérjekodóló RNS-ek) elsődleges átiratait szintetizálja  RNS-Pol.III. a nukleoplazmában lokalizálódik, a tRNS-eket szintetizálja  RNS-Pol. II és III olyan géneket is átírnak, amelyek kis RNS-ek számára kódolnak A mitokondriumoknak és kloroplasztoknak saját RNS-polimerázaik vannak !!  Miért „gyilkol” a gyilkos galóca ? a gyilkos galóca mérgei Amatoxinok: az eukarióta RNS-polimeráz II enzimet alacsony koncentrációban, az RNS-polimeráz III enzimet pedig magasabb koncentrációban gátolja gátolja a transzkripciót nincs fehérjeszintézis Phallotoxinok: sejtvázbénítok (aktinfilamentumokat stabilizálják) májelégtelenség halál "Amanita phalloides„ Gyilkós galóca  Transzkripció (átírás) lépései a szintézist RNS-polimeráz végzi 1) az enzim kapcsolódása a DNS kettős spirál promóter régiójához és a DNS szálak szétválása 2) Iniciáció (kezdés)- a gén (kódoló régió) elejének megtalálása, a transzkripció pontos starthelyének és irányának kijelölése 3) Elongáció (lánchosszabítás)- az átírás végzése a gén hossza mentén ribonukleozid-trifoszfátok (NTP) felhasználásával 4) Termináció (befejezés)- az átírás leállítása a gén végén  jelek a DNS szekvenciájában közlik az RNS-polimerázzal, hogy hol kezdje és hol végezze a tevékenységét  startjel (a promoter régióban !)  terminátor vagy stop-jel  az RNS-szintézis – (a DNS-szintézishez hasonlóan) – 5’→3’ irányban történik, A transzkripció (mRNS) beindításához, az eukarióta RNS-polimeráz II-nek egy csoport általános TF-ra van szüksége az általános TF-k (transzkripciós faktorok): TFIIA, TFIIB, stb. - segédfehérjék, amelyek a promóterhez kötődnek az első TF - TATA-box-hoz kötődik (TBP révén) TBP-TATA-binding protein  TATA-box: a promóterben a start-hely előtt található egy rövid kettős-hélix DNS-szekvencia, amely T- és A- nukleotidokból áll  a DNS alakváltozását okozza, amely felismerő-jelként szolgál más fehérjéknek a promóterhez való kötődéséhez:  a többi faktor és RNS- polimeráz-II is kötődik és kialakul a transzkripció-iniciációs komplex  kb. 50 különböző fehérjéből áll  pontosan a starthely elé helyezi az RNS-Pol.II-t,  egyes komponensei enzimaktivitással is rendelkeznek. Pl.  ATP-áz-aktivitás -a DNS két szálának a szétnyílása  hiszton-acetiláz-aktivitás - a nukleoszómás szerkezet fellazulása a bakteriális polimeráz egyedül  kináz aktivitás - a Pol.II-t foszforilálja -így tud elválni az iniciációs képes a transzkripció iniciációjára komplextől és kezdi meg az átírást (elongációt)  Az iniciációs komplex kialakulása szükséges, de nem elégséges feltétele a transzkripciónak  a transzkripció elindításához specifikus szabályozó faktorok (specifikus transzkripciós faktorok) jelenléte is szükséges  emberben körülbelül 1800 TF van, ami azt jelenti, hogy kb. 10 génre jut egy TF. Specifikus transzkripciós faktorok (aktivátorok, represszorok)  változatos szerkezetű fehérjék  közös tulajdonságuk, hogy rendelkeznek:  DNS-kötő doménnel (felismeri a gén specifikus szabályozó szakaszait)  átírást aktiváló doménnel (aktivátorok) vagy  átírást gátló doménnel (represszorok)  aktivitását, lokalizációját a sejtet érő külső jelek, hatások szabályozzák pl. valamilyen hormon Egy-egy gén szabályozó régiójában tucatnyi kötőhely lehet specifikus TF-k számára, és ezek aktivitását számtalan külső jel befolyásolja, tehát a lehetséges kombinációk (genetikai válaszreakciók) száma igen nagy már a transzkripcionális szabályozás szintjén. A transzkripció hatásfokát a génen ható összes TF együttes hatása szabja meg. Transzkripciós faktorok - összfoglalás Fehérjék amelyek a gének átírását szabályozzák - DNS kötő doménnel rendelkeznek I. Általános transzkripciós faktorok - valamennyi eukarióta gén átírásához szükségesek (az RNS polimeráz csak ezek segítségével képes a promóterhez kötődni) II. Specifikus transzkripciós faktorok – sajátos, egyedi gének átírását szabályozzák IIa. Aktivátorok IIb. Represszorok Elongáció (lánchosszabítás)- az átírás végzése a gén hossza mentén ribonukleozid- trifoszfátok (NTP) felhasználásával Ar RNS polimeráz lépeget a templát DNS szál mentén 3’ – 5’ irányban, a báziskomplementaritás elve alapján nukleotidokat kapcsolva a növekvő RNS lánc 3’ végére Az RNS transzkript azonos a kódoló DNS lánccal, kivéve: T helyett U Termináció (befejezés)- az átírás leállítása a gén végén, igen bonyolult, Különb. az egyes RNS polimerázok esetében. Egy fehérje komplexum segíti az elsődleges RNS transzkript leválását ?! Az eukarióta sejtmagban az RNS nemcsak átíródik hanem át is alakul: érés, processzálás A transzkripció terméke hosszú, általában több ezer bázisból álló RNS-molekula, az ún. elsődleges átirat (primary transcript) pre-mRNS feldolgozása (érése, processzálása) mRNS esetében: pre-mRNS 2. Kivágás-összeillesztés (splicing)  speciális RNS-ből és fehérjékből álló részecskék (spliceosoma) katalizálják  a fehérjekódoló gének mozaikos szerkezetűek: a fehérje-kódoló exonok közé beékelődnek fehérjét nem kódoló szakaszok, az intronok.  az elsődleges átirat tartalmazza mind az exonok, 1. Vég- módosulások mind az intronok másolatát 1a. capping- a 5’ végre metilált guanin- sapka (mG-cap)  a splicing során az intronok kivágódnak, és a szomszédos exonok összekapcsolódnak 1b. poliadenilálás- a 3’ végre 200–300 adenilnukleotid  így egy erősen megrövidült átirat jön létre, a kivágott (polyA-farok) intronok degradálódnak  a végmódosulások a molekula stabilitását, transzportálhatóságát szabályozzák A processzálás végterméke az érett mRNS, amely ezután a citoplazmába szállítódik. Spliceoszóma RNS-fehérje komplexum, amely az eukarióta sejtmagban az elsődleges transzkript intronjait kivágja Alternatív splicing  a kivágás-összeillesztés következtében egy génről többféle mRNS is keletkezhet (egyes exonok kimaradhatnak az egyik v. másik változatból, v. a sorrendjük megváltozhat az illesztés során) úgyhogy többféle fehérje is keletkezhet  egyes splice-variánsok sejtspecificitást mutatnak pl. alfa-tropomiozin a harántcsíkolt izomban más mint a sima izomban Előnye: többféle fehérje képződhet, mint amennyi fehérje kódoló gén van a DNS-ben A transzkripció szabályozása 1. a nukleoszómák hisztonjainak kémiai módosítása speciális enzimek, pl. hiszton-acetiltranszferázok, metiltranszferázok, dezacetilázok végzik  aktív kromatinban - hisztonok acetilálása - csökkenti pozitív töltésüket, és így kapcsolatuk a negatív töltésű DNS-szálakkal fellazul - fellazult kromatin szerkezet  hiszton dezacetilálás, metilálás általában ellentétes hatású: kompakt, heterokromatikus, az átírást gátló kromatin szerkezet kialakulása 2. ún. kis nem kódoló RNS-eknek szintén jelentős szerepe van a génexpresszió szabályozásában (lásd transzláció szabályozása !) 3. a DNS kémiai módosítása  DNS-metilálás a gének inaktiválódásával jár együtt A transzkriptek sorsa prokariótákban és eukariótákban különböző Eukarióta  az átirt RNS mind exonokat mind intronokat tartalmaz  mindkét vége módosításon esik át,  az intronokat pedig enzim katalizálta splicing reakció eltávolítja  a kialakult mRNS végül a sejtmagból a citoplazmába szállítódik, Prokarióta ahol fehérjévé transzlatálódik  egyszerűbb  az 5’ vég a transzkripció iniciálásának eredménye az RNS-polimeráz által,  a 3’-vég a transzkripció terminálásával alakul ki  transzkripció és transzláció ugyanabban a térben történik  a fehérje mennyisége ezen lépések hatékonyságától valamint az RNS és fehérje lebontásának sebességétől függ Génexpresszió II Minden élő sejtben a genetikai információ átadásának iránya  DNS RNS (transzkripció, RNS szintézis) és  RNS fehérje (transzláció, fehérje szintézis)  ez a folyamat egészében a génexpresszió  eredményeként a sejt szerkezete/funkciója megváltozik Centrális dogma: az élő rendszerekben a genetikai információ áramlása egyirányú, a DNS → RNS → fehérje → tulajdonság Az érett eukarióta mRNS-ek szállítása, exportja a sejtmagból a citoplazmába szelektív  Magpóruskomplexek (nuclear pore complex)-csak az érett RNS-t ismerik fel és szállítják  hogy exportra kerüljön az mRNS molekulának egy sor fehérjéhez kell kötődnie, amelyek jelzik, hogy a molekula módosítása helyesen ment-e végbe pl. Poli-A-kötő fehérjék, Cap-kötő-fehérje , fehérjék, amelyek a splicing teljességét jelzik (pl. EJC- exon junction complex) Az RNS-től a fehérjéig: Transzláció Marshall Nirenberg, Robert W. Holley és Har Gobind Khorana Nobel díj 1968-ban a genetikai kód megfejtéséért az információátvitel az RNS-ről a fehérjére –transzláció, vagyis lefordítás egy másik nyelvre, amelyik egészen más jeleket használ a mRNS-ben 4 különböző nukleotid, a fehérjékben viszont 20 különböző aminosav van (egy az egyhez átfordítás nem lehetséges) Genetikai kód- a szabály, amely szerint egy gén nukleotidszekvenciája az RNS közvetítésével egy fehérje aminosavszekvenciájára fordítódik át Ez a kód univerzális, bár a mitokondrium DNS-ben kis eltérések vannak  3-egymásutáni-nukleotidból-álló-triplet (kodon)- határoz meg egy aminosavat  a legtöbb aminosavat több kód is kódolja (a különbségek rendszerint a harmadik nukleotidban vannak)- degenerált  egy kodon csak egy aminosavat kódol - egyértelmű  három kódon nem aminosavat kódol, hanem terminációs-helyek – stopp kodonok (UAA, UAG, UGA), amelyek a proteinkódoló szekvencia végét jelzik  egy kodon AUG- egyrészt start-kodon, a proteinkódoló szekvencia kezdetét jelzi, ugyanakkor a methionin -t kódolja !!! A mRNS molekula kodonjai nem ismerik fel direkt az aminosavakat, amelyeket kódolnak, vagyis a három nukleotidból álló csoport nem kötődik közvetlenül az aminosavhoz. a tRNS - hez kapcsolódik a kodonnak megfelelő aminosav az aminoacil-tRNS-szintetáz segítségével a tRNS - ben levő antikódon lép kapcsolatba mRNS-ben lévő kodonnal tRNS-molekulák kapcsolják az aminosavakat a mRNS kodonjaihoz A genetikai kód lefordítását két adapter segíti, amelyek egymás után hatnak és egyformán fontosak:  aminoacil-tRNS-szintetáz, amelyik egy bizonyos aminosavat a megfelelő tRNS-hez kapcsol (a t-RNS feltöltése aminosavakkal)  tRNS - amelynek antikodonja bázispárokat alakit ki a mRNS megfelelő kodonjával (feltöltött v. megrakott tRNS)  tRNS - köti egyik helyen az aminosavat, egy másik helyen pedig a kodont antikodon kodon bármelyik lépésben minden aminosavnak saját tRNS-szintetáza bekövetkező hiba van, tehát 20 kb. tRNS-szintetáz létezik- a hamis aminosav kapcsolódás ATP-hidroliziséhez kötött beépüléséhez vezet tRNS-molekulák kapcsolják az aminosavakat a mRNS kodonjaihoz RNS molekulák bázispárosódás révén háromdimenziós struktúrává hajtogatódhatnak, akár dupla-hélix szerkezet is kialakulhat tRNS  négy dupla-hélix résszel rendelkezik, ezáltal a molekula lóherére hasonlít (szekunder struktúra)  ez tovább hajtógatódik egy L alakú struktúrává (tercier struktúra), amelyet a kb. régiók közötti hidrogénkötések tartanak össze  két páratlan (egyszálas) nukleotidrégió az L-alakú struktúra végén kulcs fontosságú a fehérjeszintézis szempontjából:  antikodon- három egymás utáni nukleotid, a mRNS-ben levő komplementáris kodonnal párosul  egy rövid szakasz a 3’-végen, ahova a megfelelő aminosav kötődik tRNS- sémája, az antikodon kihangsúlyozásával A transzláció a riboszómákon megy végbe: a riboszómák szerkezete, működése Riboszómák  kb. 25–30 nm átmérőjű  megközelítőleg gömb alakú részecskék  egy átlagos sejtben több millió példányban  részben szabadon a citoszólban,  részben az endoplazmatikus retikulum membránfehérjéihez kötődve  Riboszómák  minden eukarióta riboszóma egy kisebb (40S) és egy nagyobb (60S) alegységből áll  együtt egy teljes riboszómát (80S) alkotnak  egy hatalmas komplex négy RNS-ből és több mint 80 fehérjéből 60S 40S  az RNS teszi ki több mint a felét a riboszóma tömegének  a két alegység a mRNS-en kerül össze egymással, rendszerint annak kezdeti (5’) részén, a fehérjeszintézis 80S megindítása céljából  amikor a fehérjeszintézis befejeződött az alegységek elválnak a riboszómák és alegységeik centrifugálással választhatók egymástól el a többi sejtorganellumtól az „S” érték (Svedberg-egység) az ülepedés sebességét jellemző mutató, arányban áll a részecske tömegével Prokarióta riboszómák  hasonló szerkezetűek,  de kevesebb RNS-t és fehérjét tartalmaznak, ezért össztömegük is kisebb (70S). Mitokondriális riboszómák = Mitoriboszómák 55S (39S/28S) - emlősökben  Riboszómák Minden riboszóma tartalmaz :  egy kötőhelyet a mRNS és  három kötőhelyet a tRNS molekulák számára (A-, P- és E):  „A”-aminoacil-hely - aminosavakat szállító tRNS  „P”-peptidil-hely - a növekvő peptidszálat hordozó tRNS  „E”- exit - a „terhétől” megszabadított tRNS távozik Funkció  kis alegység - kiosztja a mRNS kodonjait a találó tRNS-hez  nagy alegység - a peptidképzést katalizálja (az aminosavakat köti egy polipeptidlánchoz)  bizonyos feltételek mellett a riboszóma, nagyobbik alegységén keresztül az endoplazmatikus retikulum membránjaihoz kötődhet A transzláció (polipeptidlánc-szintézis) szakaszai  alapfeltétele, hogy a tRNS molekulák feltöltődjenek a megfelelő (specifikus) aminosavakkal, vagyis hogy ATP felhasználása mellett kialakuljanak az aminoacil-tRNS molekulák  3 szakasz 1) Iniciáció (kezdés) 2) Lánchosszabbítás (elongáció) 3) Termináció (befejezés) A transzláció (polipeptidlánc-szintézis) szakaszai 1. Iniciáció (kezdés) 1a. lánckezdő (iniciációs) komplex kialakulása  a mRNS 5’ végének közelében elhelyezkedő AUG start kodon köré szerveződik  összetevői iniciációs-tRNS  a kis alegység, mindig a methionin-t hordoz, így az újonnan szintetizált fehérjék mindig  az első aminosavat (AA1- methionin) hordozó tRNS, methionint tartalmaznak első as-ként (N-term.)  a mRNS-ből, valamint később ezt egy specifikus proteáz eltávolítja  a citoszolból felvett fehérjék (iniciációs faktorok, IF) 1b. a nagyobbik alegység rákötődése az iniciációs komplexre: összeáll a működőképes riboszóma kialakulásához GTP és IF-k szükségesek A transzláció (polipeptidlánc-szintézis) szakaszai 2. a lánchosszabbítás (elongáció)  elongációs faktorokat (EF) igényel a citoszolból GTP-t és  újabb és újabb aminosavak épülnek be a EF-kat peptidláncba, miközben a riboszóma végighalad igényel az mRNS-en 5’→3’ irányba  a növekvő lánc a nagyobbik alegységben a P- helyről nyíló csatornán keresztül tolódik ki a riboszómából A transzláció (polipeptidlánc-szintézis) szakaszai 3. Termináció (befejezés):  a lánchosszabbítás során a riboszóma eléri az mRNS 3’ végének közelében elhelyezkedő stop kodont (UAG , UGA vagy UAA) Itt leáll a szintézis (termináció):  a peptidlánc felszabadul,  a riboszóma alegységeire disszociál, és leválik a mRNS-ről újabb tRNS molekulák helyett terminációs faktorok (Release Factor-ok, RF1, RF2) A transzláció (polipeptidlánc-szintézis) szakaszai Poliriboszóma (Poliszóma)  egy-egy mRNS-en egyidejűleg több riboszóma is végez leolvasást  egymás után haladva az 5’→3’ irányba,  mintegy 80 nukleotid távolságra egymástól  az egy mRNS-re felfűzött riboszómacsoportot poliriboszómának (poliszómának) nevezik  lehetővé teszi időegység alatt nagyobb mennyiségű fehérje szintézisét  különösen gyakoriak intenzív fehérjeszintézist folytató sejtekben Poliszómák mind az eukariótákban, mind a prokariótákban megtalálhatók. EM: eukarióta poliriboszómája Egy közös riboszómaalegység - raktár áll a fehérjeszintézis rendelkezésére A fehérje szintézis mindig a szabad riboszómán indul meg !!! Ebből állnak össze:  Szabad riboszómák (poliriboszómák):  itt citoszólikus fehérjék transzlatálódnak, amelyek egyrészt a citoplazmába maradnak, másrészt a membránnal rendelkező organellumokba jutnak  ER-hez kötött riboszómák (poliriboszómák)  egy szignálszekvencia a növekvő polipeptidláncon a riboszómát az ER membránjához irányítja  itt membránférjék, szekretoros v. lizoszóma fehérjék transzlatálódnak Minden fehérjeszintézis – ciklus végén a riboszómális alegységek szabaddá válnak és visszatérnek az általános tartalékhoz szignálszekvencia! A fehérje transzláció utáni sorsa Az „érett” fehérje kialakulása A riboszóma elhagyása után számos fehérjének további módosuláson kell átesnie ahhoz, hogy a sejt számára hasznosítható legyen Ko- és Poszttranszlációs módosulások:  hajtógatódás és más nem-kovalens módosulások pl. kis ko-faktorok kötődése  kovalens módosulások, pl. foszforiláció, glikolizáció  különböző alegységek összeállása  fehérje „splicing” - az inteinek eltávolítása és a megmaradt exteinek összeragasztása A fehérjék eljutása rendeltetési helyükre Fehérje transzport mechanizmusai: 1. Kapu transzport- nukleáris pórus komplexen keresztül (sejtmagba) 2. Transzmembrán transzport: fehérje transzlokátorok segítségével (citoszolból ER-ba, mitokondriumba, peroxiszómába) 3. Vezikuláris transzport: transzport vezikulumokban (az ER-ból)  mindhárom energia igényes  1. és 3. : a fehérje a transzport során hajtogatott állapotban marad  2. a fehérjének ki kell hajtógatódnia A fehérjék eljutása rendeltetési helyükre: válogatás, célba juttatás  válogatási jelek (szignálszekvenciák) irányítják a fehérjéket a megfelelő organellumhoz  rövid aminosav-sorozatok  a szintézis során épülnek be a fehérjébe  jelfogó molekulák (más fehérjék) ismerik fel  jel nélküli fehérjék a citoszólba jutnak és ott is maradnak (pl. vázfehérjék, glikolítikus enzimek)  az ER fehérjéi N-terminális szignálszekvenciával rendelkeznek  egy szignálszekvencia szükséges és elégséges a fehérjék megfelelő szortírozásához Géntechnikai eljárásokkal a fehérjék irányítottsági helye megváltoztatható: a szignálszekvencia eltávolítása az ER-fehérjéről és a citoszólos fehérjére való átvitele a két fehérje sejten belüli helyének megváltozását eredményezi A transzláció (és génexpresszió) szabályozása RNS interferencia:kis nem kódoló RNS-ek  siRNS (small interfering RNA, kis interferáló RNS-ek) – exogén eredetű kettős szálú RNS, amelyeket egy ribonukleáz (dicer) két szálra hasít  miRNS (mikro-RNS-ek) – endogén eredetű (miRNS-génekről íródik át, hosszabb prekurzorók pre-miRNS) formájában a citoplazmába kerül, egy ribonuleáz (dicer) két szálra hasítja csendesítő komplex  viszonylag rövid (20–25 nukleotidból álló) láncok  bázisszekvenciájuk komplementer valamilyen mRNS bázis-sorozatával, ezért azt fel tudják ismerni és a bázis párosodás szabályai szerint hozzákötődnek  speciális fehérjékhez kötődve ún. csendesítő komplexeket (RISC) képeznek, ebben a formában párosodnak a komplementer mRNS-el : Poszt- transzkripciós  megakasztják azokról az átírást, vagy kiváltják az adott mRNS degradációját génelcsendesítés  a hatás specifikus: csak azon mRNS-k transzlációját gátolják, melyekkel szemben a komplementaritás fennáll !! RISC (RNA-induced silencing complex) A transzláció szabályozása A prokarióta fehérjeszintézis inhibitórai antibiotikumként kerülnek használatra  vegyületek, melyek a riboszómaműködés akadályozásán keresztül gátolják a fehérjeszintézist. Így pl.  sztreptomicin és származékai gátolják az iniciációt és hibás leolvasást okoznak  tetraciklin az aminoacil-tRNS bekötődését akadályozza  kloramfenikol a peptidkötés kialakulását gátolja  mivel hatásukkal szemben a prokarióta riboszómák érzékenyebbek, mint az eukarióta riboszómák, alkalmazhatók bakteriális fehérjeszintézis szelektív gátlására és ezen keresztül a fertőzés leküzdésére  Fehérjelebontás (proteolízis)  egy (másik) lehetőség a sejt számára egy fehérje mennyiségét a szükségletnek megfelelő szinten alakítsa  a fehérjék élettartama igen különböző:  hosszú - pl. struktúrfehérjék csontban, izomban hónapokig, akár évekig megmaradnak  rövid - pl. anyagcsere enzimek vagy amelyek a sejtciklus szabályozásában vesznek részt (napok, órák, akár mp-ek) Proteolízis  a fehérjék aminosavakra való lebontása  proteázok végzik – a fehérjéket előbb rövid peptidekre majd as-akra bontják – hidrolizálják a peptidkötéseket  szerepe:  rövid életű fehérjék lebontása  hibásan hajtogatott proteinek eltávolítása- ez igen fontos az élőlények számára !!! hibásan hajtogatott fehérjék aggregációja: neurodegenerativ betegségek pl. a Huntington betegség, Alzheimer kór, Creuzfeld - Jacob betegség  helye:  a citoplazmában nagy proteolitikus enzimekből álló komplexeken: proteaszómák  az eukarióta sejtben vannak speciális, de nem kizárólag proteolízisre szakosodott kompartimentumok is: lizoszómák Proteaszómák  szabadon helyezkednek el a citoszólban és a sejtmagban 17x11nm Felépítése  egy központi rész, mag (ún. 20S proteaszóma)  henger alakú, belső ürege kb. 5 nm átmérőjű, itt történik a peptidlánc enzimatikus feldarabolása  ez a tér olyan szűk, hogy normális térszerkezetű, feltekeredett fehérjék nem férnek el benne  regulációs egységek (ún. 19S egységek)  a henger végeihez kapcsolódnak sapkaszerűen,  megkötik a lebontásra szánt fehérjéket, majd a henger belsejébe továbbítják  Minthogy az enzimek a henger belsejében találhatók, nem ártanak a sejtnek.  A folyamat energiaigényes, ATP felhasználásával jár. Honnan tudja a proteaszóma, hogy melyik fehérjét kell lebontania ?  a jel egy kis molekulatömegű, minden sejtben előforduló fehérje, az ubikvitin  láncait (poliubikvitint) egy több tagból álló enzimrendszer köti a degradálandó fehérjére  a poliubikvitint hordozó fehérjéket a 19S regulációs egység ismeri fel  ubikvitin leválik és újra felhasználódik (reciklálódik) Az endoplazmatikus retikulum (ER) Az endoplazmatikus retikulum (ER)  egymással összefüggő lapos zsákokból, ciszternákból álló üregrendszer  kb. 6 nm vastagságú hártya határolja  fejlettsége, kiterjedése sejttípustól, működési állapottól függően változik  szerkezet és működés szempontjából két részre választható:  durva felszínű ER (DER)  sima felszínű ER (SER) az elhatárolódás nem éles, a két rész membránjai átmennek egymásba és üregrendszerük közös az endoplazmatikus kompartimentumot ultracentrifugálásos módszerekkel mikroszóma frakcióként lehet elkülöníteni a sejt egyéb organellumaitól. Durvafelszínű endoplazmatikus retikulum (DER)  membránjának citoplazmatikus felszínén riboszómák találhatók („érdes”)  membránja folytonos a külső maghártyával, lumene a perinukleáris térrel  Durvafelszínű endoplazmatikus retikulum (DER)  különösen fejlett nagy mennyiségű váladékfehérjét termelő sejtekben (pl. hasnyálmirigy, máj, neuronok) Ergastoplasma (erősen bazofil)- exokrin pankreászban ezekben a sejtekben számos, szorosan egymás mellé rendeződött ciszternából áll (ergasztoplazma), gyakran a sejtmag körül helyezkedik el Durvafelszínű endoplazmatikus retikulum (DER) Fő funkciója  fehérjék szintézise, módosítása, válogatása és szállítása  A fehérjék bizonyos csoportjai termelődnek itt: Transzportra szánt fehérjék melyeket majd a sejt az extracelluláris térbe ad le – szekréciós fehérjék membránnal határólt organellumban tárólt – lizoszómális -fehérjék Strukturális fehérjék sejtmembránba beépülő membránproteinek (integrált membránfehérjék) ER- , Golgi-apparátus-, lizoszóma membránok fehérjéi Durvafelszínű endoplazmatikus retikulum (DER) Funkciók  külső felszínén riboszóma- kötő helyek DER felszínén:  szignálpeptid /szignálszekvencia (S) minden kötött riboszómán szintetizálódó fehérjén megtalálható  szignálfelismerő részecske = signal recognition particle/ SRP - egy fehérje komplexum a citoplazmában  S- SRP–riboszóma komplex kialakulása és kapcsolódása a DER membránjaiban levő  SRP-receptorhoz –  a receptorhoz egyéb fehérjék is kapcsolódnak, amelyek egy –transzlokációs pórust – képeznek = Transzlokon  Transzlokon a hosszabbodó peptidláncok  a transzlokonon keresztül becsúsznak a DER üregébe ER-beltere Durvafelszínű endoplazmatikus retikulum (DER) DER üregében: Ko-transzlációs módosulások  a szignálpeptid-szakasz eltávolítódik a szignálpeptidáz által (a proteaszómában degradálódik)  N-glikoziláció - oligoszacharid oldalláncok kapcsolása az aszparagin aminocsoportjához; nem specifikus glikoziláció specifikus glikolizáció a Golgi-készülékben történik !  diszulfidkötések kialakítása Durvafelszínű endoplazmatikus retikulum (DER) DER üregében:  fehérjék korrekt térszerkezetének kialakítása (a peptidlánc feltekeredése, hajtogatódása),  gyakran speciális fehérjék (dajkafehérjék, chaperonok, hősokkfehérjék) segítségével a nem megfelelő szerkezetet ki is javítják: pl. kalretikulin, kalrexin  “minőségellenőrző rendszer”  hibás (nem javítható) fehérjék a transzlokációs póruson keresztül visszaáramlanak a citoplazmába, ahol a proteaszómákban lebomlanak A „helyes”fehérjék sorsa  a megfelelő térszerkezettel rendelkező fehérjék vezikuláris transzporttal kerülnek a Golgi készülékbe  az ER saját lumenális- és membránfehérjéi –– egy speciális, ún. ER retenciós (visszatartó) szignált tartalmaznak, amely hatására e fehérjék el sem hagyják az ER –t vagy a Golgi cisz oldaláról visszaválogatódnak Simafelszínű endoplazmatikus retikulum (SER)  feltagolódó lapos zsákokból, tubulusokból álló hálózat  membránjához nem kötődnek riboszómák  általában a DER-nél kisebb térfogatú kompartimentum DER és SER egymással összefüggnek igen fejlett  koleszterint, szteroidhormonokat szintetizáló sejtekben  méregtelenítést, biológiailag aktív idegen anyagok, pl. gyógyszerek feldolgozását végző sejtekben pl. mellékvesekéreg, gonádok sejtjei, májsejtek Simafelszínű endoplazmatikus retikulum (SER) Funkciói 1. Lipid szintézis  foszfolipid szintézis ( a membrán lipid kettős rétege is itt keletkezik)  enzimei a SER membránjának citoszól felőli felületén vannak  Flipáz-enzim- a foszfolipidek egy részét a SER membránjának citoszol felőli rétegéből átforgatja a lumen felőli rétegbe  ceramid és koleszterin szintézis, szteroid vegyületek szintézise pl. Leydig sejtek sárgatest mellékvese A lipidek sorsa  vezikuláris transzporttal kerülnek át a Golgi-készülékbe, ahol bizonyos lipidmolekulák (pl. a ceramidok) átalakítódnak, és további vezikuláris transzporttal jutnak el célterületükre (pl. plazmamembrán)  transzmembrán transzport - szállítófehérjék (ún. karrier proteinek) közreműködésével juthatnak el a mitokondriumba, a peroxiszómákba Simafelszínű endoplazmatikus retikulum (SER) Funkciói 2. A citoszól kálciumszintjének szabályozása  a sejten belül a kálcium a SER-ben raktározódik  üregrendszerükben Ca++-kötő fehérjék (Calreticulin, Calstorin, Calsequestrin) lokalizálódnak  membránjaik pedig Ca++-pumpát (Ca++-ATP-ázt), ill. Ca++-csatornákat tartalmaznak  megfelelő ingerek hatására a SER-ből a kálcium felszabadul  igen fontos szerepet játszik az izomsejtek, harántcsíkolt és szívzomrostok működésében  harántcsíkolt izomrostokban SER nagy kiterjedésű, speciális változata: szarkoplazmatikus retikulum  a miofibrillumokat hálózatosan körülöleli  szorosan összefekszik a plazmamembrán betüremkedéseivel (T-tubulusok) Simafelszínű endoplazmatikus retikulum (SER) Funkciói 3. Glukóz anyagcsere:  Glukóz-6-foszfatáz: SER-ben lokalizálódik, Gluc-6-P-ról lehasítja a foszfátot  a glikogénből felszabaduló G-6-P egy transzporter segítségével jut a SER lumenébe  a szabad glukóz molekula transzporter közvetítésével jut ki a citoszólba, majd a plazmamembránon át a vérbe  májsejtekben, vesetubulusok hámsejtjeiben glikogén szemcsék jellemzően a SER környékén, csoportokba rendeződve találhatók Simafelszínű endoplazmatikus retikulum (SER) Funkciói 4. Méregtelenítés  a szervezet számára idegen anyagok (xenobiotikumok, mint pl. gyógyszerhatóanyagok (barbiturátok), mérgek, vagy a szervezetben keletkező káros anyagok átalakítása  kevert funkciójú oxidázrendszer (mixed function oxidases – MFO) enzimkomplexek révén: alkotóelemei pl. a citokróm-P450, citokróm-b5, flaprotein fehérjecsaládok tagjai  az átalakítás célja az oldhatóság növelése (lipofil anyagok hidrofillá való átalakítása pl. hidroxilálás révén), a szervezetből való eltávolításuk megkönnyítésére  májsejtekben