LAS 2 - Grands systèmes - dév animal - Fiche de cours n°3 PDF

2024-2025 LAS 2 Grands systèmes – dév animal Fiche de cours n°3 Nature moléculaire des facteurs impliqués dans l’induction du mésoderme Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 1 ...

2024-2025 LAS 2 Grands systèmes – dév animal Fiche de cours n°3 Nature moléculaire des facteurs impliqués dans l’induction du mésoderme Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 1  2024-2025 SCHÉMA Embryons ventralisés Embryons dorsalisés Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 2  2024-2025 IDENTIFICATION DES MOLÉCULES CANDIDATES Purification des protéines sécrétées par des tissus d’embryons d’amphibiens en culture Isolement des ARNm présents dans les blastomères végétatifs ou animaux 1) Les ARNm isolés sont rétro-transcrits in vitro (Reverse Transcriptase) 2) Clonés chacun dans un vecteur ADN (plasmide): banques d’ADN complémentaires (ADNc) Différentes stratégies 3) Chaque plasmide est inséré dans des bactéries ce qui permettent de l’amplifier et produire d’importantes quantités d’ADNc 4) Les ADNc sont isolés des bactéries 5) Les ADNc sont transcrits in vitro en ARNm et traduits in vitro en protéines 6) Les protéines obtenues sont testées :  Pour leurs capacités à induire les différents types de mésoderme  Et/ou permettre la mise en place de l’axe Dorso-Ventral Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 3  2024-2025 Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 4  2024-2025 TEST DES MOLÉCULES (INDUCTRICES ?) Expériences in vitro d’ajout sur des calottes animales Des calottes animales de blastulas sont disséquées et mises en culture. Les molécules sécrétées candidates pour l’induction du mésoderme sont ensuite ajoutées au milieu de culture. Protocole expérimental L’ajout de la molécule testée induit-il la présence de structures mésodermiques ? Hypothèses La présence d’ARNM ou de protéines spécifiques du mésoderme ? FGF, Vg1 (TGFß) et Activine (TGFß) induisent la différenciation des cellules de la calotte animale en cellules mésodermique Résultats (Tableaux à connaitre) Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 5  2024-2025 Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 6  2024-2025 TEST DES MOLÉCULES (INDUCTRICES ?) Expériences in vitro d’ajout sur des calottes animales Résultats Caractéristiques o Membre de la famille des TGFß o Codé par un ARNm maternel (déterminant maternel) Vg1 o ARNm Vg1 localisé dans l’hémisphère végétatif Vg1 est un déterminant maternel inducteur du mésoderme Caractéristiques o Membre de la famille des TGFß o Suffisante pour induire du Activine mésoderme in vitro o Effet dose- dépendant Activine est un inducteur du mésoderme Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 7  2024-2025 Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 8  2024-2025 TEST DES MOLÉCULES (INDUCTRICES ?) Expériences in vivo de restauration d’un phénotype normal Hémisphères végétatifs de zygotes irradiés aux rayons UV 30min après la fécondation, avant la première division o Pour bloquer la rotation corticale ▪ Et par conséquent l’induction du mésoderme Dorsal. Expérience de restauration d’un développement normal o Injecter dans les embryons irradiés, les ARNm codant la molécule candidate pour l’induction du mésoderme au stade 32 cellules dans 2 Principe blastomères végétatifs adjacents Les ARNm sont traduits immédiatement o Si la protéine produite est un inducteur du mésoderme dorsal, elle doit pouvoir sauver partiellement/ totalement le développement des embryons irradiés ▪ Donc restaurer des structures dorsales partiellement/totalement. Schéma Résultats Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 9  2024-2025 Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 10  2024-2025 TEST DES MOLÉCULES (INDUCTRICES ?) Expériences de perte de fonction de la protéine candidate Contrôles La perte de fonction d’un inducteur du mésoderme dorsal doit donner des embryons ventralisés. Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 11  2024-2025 RECONNAÎTRE UN EMBRYON VENTRALISÉ (OU DORSALISÉ) Ventralisation Dorsalisation Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 12  2024-2025 TEST DES MOLÉCULES CANDIDATES (INDUCTRICES ?) Expériences de perte de fonction de la protéine candidate Exemple : Inactivation des ARNm maternels ß-caténine (ici avant la fécondation) Stratégie n°1 Conclusion o La ß-caténine serait nécessaire pour la mise en place de l’axe dorso-ventral Stratégie n°2 Conclusion o La perte de fonction d’un inducteur du mésoderme dorsal doit donner des embryons ventralisés. Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 13  2024-2025 TEST DES MOLÉCULES CANDIDATES (INDUCTRICES ?) Expériences de perte de fonction de la protéine candidate Résultats ß-caténine : Déterminant maternel et facteur d’origine zygotique FGF, Activine et ß-caténine sont nécessaires à l’induction du mésoderme Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 14  2024-2025 LA VOIE DE TRANSDUCTION Wnt/ ß-CATÉNINE Schéma Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 15  2024-2025 TEST DES MOLÉCULES CANDIDATES (INDUCTRICES ?) Expériences de gain de fonction de la protéine candidate Gain de fonction Le gain de fonction ectopique doit permettre l’apparition de structures dorsales ectopiques. Injection de l’ARNm Exemple codant la ß- caténine La ß-caténine serait suffisante pour l’induction d’un deuxième axe Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 16  2024-2025 TEST DES MOLÉCULES CANDIDATES (INDUCTRICES ?) Expériences de perte de fonction de la protéine candidate La ß-caténine n’est pas le seul déterminant cytoplasmique permettant la mise en place d’un deuxième axe Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 17  2024-2025 TEST DES MOLÉCULES CANDIDATES (INDUCTRICES ?) Expériences de perte de fonction de la protéine candidate Résultats Siamois est un facteur zygotique (à Nodal, ß-caténine et Siamois sont suffisants pour induire du mésoderme connaître) Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 18  2024-2025 RAPPEL Les déterminants maternels de l’ovocyte d’amphibien à connaître Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 19  2024-2025 LA ROTATION CORTICALE relocalisation des déterminants maternels dorsaux Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 20  2024-2025 IMPACT DU LITHIUM Dorsalisation des embryons traités Le lithium inhibe GSK-3 o maintien de la ß-caténine dans toutes les cellules ▪ provoque une dorsalisation complète de l’embryon. L’injection de lithium peut restaurer un axe dorso-ventral chez un embryon traité aux UV. Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 21  2024-2025 LA MISE EN PLACE DU CENTRE DE NIEUWKOOP ET L’INDUCTION DU MÉSODERME Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 22  2024-2025 NOTION DE MORPHOGÈNE Substance soluble diffusant à partir d’une source selon un gradient décroissant de Définition concentration et auquel les cellules répondent différemment à partir de valeurs seuils de concentration. Signaux « longue-distance Concentration décroît le long d’un segment donné, à partir du point d’émission Concentration en un point donné o caractéristique de sa position sur le segment Effets des morphogènes varient en fonction de leur concentration (plus de 2 possibilités) Caractéristiques Cellules répondent à des valeurs seuils morphogène o valeurs de position (activation de certains gènes). Interprétation de ces valeurs o déterminées par l’histoire des cellules ▪ programme génétique The french flag model source de morphogène localisée. Le morphogène diffuse à partir de cette source sur une distance qui est supérieure au diamètre d’une cellule. morphogène instable o peut-être dégradé en tout lieu après sa diffusion À partir de la source il s’établit un gradient de décroissance exponentiel Formation des La sources de morphogènes correspondent à des centres organisateurs gradients Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 23  2024-2025 LE CENTRE DE NIEUWHKOOP correspond aux blastomères végétatifs dorsaux activité dorsalisante provoque la formation d’une nouvelle face dorsale chez l’embryon receveur Induit les cellules de la zone marginale dorsale en mésoderme o qui sera le centre organisateur de Spemann La mise en place du Le centre de centre de Nieuwkoop a une Nieuwkoop activité et l’induction dorsalisante du mésoderme L’initiation de la gastrulation Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 24  2024-2025 LE CENTRE DE NIEUWKOOP Induit le mésoderme Le gène siamois dorsal soit le o marqueur du CENTRE DE NIEUWKOOP o cible du co-facteur de transcription ß- centre caténine organisateur de Spemann L’encoche blastoporale et le centre organisateur de Spemann o acteurs majeurs de la gastrulation. L’injection d’ARNm siamois provoque l’apparition d’un axe embryonnaire surnuméraire Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 25  2024-2025 RÉSUMÉ Dans les cellules du centre de Nieuwkoop, on trouve les protéines : Vg1 (famille des TGFß), VegT (Facteur de Transcription), ß-caténine o sécrétion de Nodal sous forme de gradient Wnt o voie de transduction Wnt/ß-caténine ou voie Wnt « canonique » Siamois (Facteur de Transcription) o expression est activée par la voie Wnt/ß-caténine LES DIFFÉRENTES VOIES DE SIGNALISATION Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 26  2024-2025 LA SIGNALISATION Wnt/ß-CATÉNINE CHEZ L’EMBRYON DU XÉNOPE AU STADE BLASTULA Wnt est DORSALISANT Wnt est VENTRALISANT Médisup Sciences 1 rue Castex 75004 Paris – Tél : 01 48 04 90 50 27