8. Chromatographie liquide sur colonne HPLC

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE SUR COLONNE I) Introduction : La chromatographie liquide sur colonne est divisée en fonction des principaux phénomènes de séparation il s’agit de : - chromatographie de partage ou chromatographie liquide – liquide. - chromatographie d’adsorption ou chromatographie liquide –...

CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE SUR COLONNE I) Introduction : La chromatographie liquide sur colonne est divisée en fonction des principaux phénomènes de séparation il s’agit de : - chromatographie de partage ou chromatographie liquide – liquide. - chromatographie d’adsorption ou chromatographie liquide – solide. - chromatographie par échange d’ions. - chromatographie d’exclusion ou chromatographie sur gel. Les premières chromatographies en phase liquide sur colonne y compris les travaux de Tswett ont été effectuées sur des colonnes en verre dont le diamètre interne variait entre 1et 4cm, et la longueur entre 15 et 20cm et parfois plus. Le diamètre des particules constituant la phase stationnaire était compris entre 150 et 200m. Elle utilisait principalement la gravité pour faire couler la phase mobile sur les colonnes remplies de phases stationnaires. Les séparations étaient longues dépassant souvent plusieurs heures. Cette méthode appelée actuellement chromatographie classique sur colonne. La chromatographie liquide sur colonne utilisait actuellement de nos jours se distingue de la chromatographie classique par les points suivant : - diamètre interne plus petit 2 à 8mm. - phases stationnaires de granulométrie fines et régulière 3 à 10m. - pression d’entrée élevée qui nécessite l’utilisation d’une pompe. - contrôle du débit de la phase mobile. - introduction de faible quantité de substances. - détecteurs spécifiques et sensibles. - rapidité des analyses. - résolution élevée. En raison de ces différentes caractéristiques, cette nouvelle technique a été appelée chromatographie liquide à haute pression, ou chromatographie liquide à haute résolution, ou chromatographie liquide à haute performance ( C.L.H.P), En anglais H.P.L.C (High performance liquide chromatographie). Le terme général de chromatographie liquide (C.L) est actuellement adopté. 1 II) Appareillage : L’appareillage utilisé en H.P.L.C doit être capable de supporter les pressions élevées imposées par la très fine granulométrie des phases stationnaires. Il est pour cela en acier inoxydable résistant à la corrosion chimique des phases mobiles. Une installation d’HPLC comprend différents modules : - un réservoir à solvant contenant la phase mobile. - un système de pompage (chromatographie haute pression). - un injecteur (introduction de l’échantillon). - une colonne (contenant la phase stationnaire). - un détecteur. - un système d’acquisition des données. Les différents modules sont reliés par des canalisations courtes et de très faible diamètre interne (0,1 mm). Les différentes parties de l’appareillage en contact avec la phase mobile sont généralement construites en acier inoxydable qui présente l’avantage de résister à la pression et d’une bonne résistance à la corrosion chimique. 2 Les canalisations sont soit en acier inoxydable soit en polymère de type PEEK (polyether-etherketone) qui est un polymère souple plus économique que l’acier et pouvant résister aux solvants sous des pressions élevées jusqu’à 400 bars. CHAINE H.P.L.C Une installation HPLC comporte divers modules intégrés dans un même châssis pour gagner de l’espace (moins encombrant). a) Réservoir de phase mobile : - un ou plusieurs réservoirs de phase mobile. - Des réservoirs de 0,5 à 2litres équipent en général les appareils les plus courants pour des chromatographies analytiques. - Des volumes importants qui peuvent aller jusqu’à 10 litres sont réservés aux chromatographies préparatives (appareillage différents dans ce cas). - les réservoirs doivent être étanches afin d’éviter l’évaporation des solvants ou leur contamination par la vapeur d’eau de l’atmosphère. - La phase mobile doit être filtrée et dégazée pour chasser les gaz dissous et en particulier l’oxygène afin d’éviter la perturbation de la chromatographie et les systèmes de détection par les bulles formées par ce gaz. 3 Régime isocratique - Lorsque la phase mobile conserve pendant toute la durée de la chromatographie la même composition on parle de régime isocratique. Elle peut être préalablement préparée et déposée dans un seul réservoir. Certains appareils permettent cependant de l’obtenir instantanément par mélanges de solvants provenant de réservoirs différents. La proportion de chaque liquide est alors réglée par des vannes dont l’ouverture est réglable. Gradients de polarité ou programmation de solvant - La modification de la polarité de la phase mobile nécessite la présence des systèmes munis de dispositifs de programmation qui permettent de faire varier dans le temps la composition des mélanges de solvant qui constituent la phase mobile et d’établir ainsi des gradients de polarité ou programmation de solvant, et ceci pour augmenter les possibilités séparatives. b) Pompes : - élément important de chromatographie liquide. - la pompe a pour rôle de provoquer dans la colonne un écoulement de la phase mobile compatible avec la séparation chromatographique. - ces pompes doivent être très puissantes car la viscosité des solvants et la très fine granulométrie des phases stationnaires entraînent une différence de pression ou perte de charge entre le sommet et l’extrémité de la colonne qui peut parfois être importante (50 ou 100bars). - les plus usuelles permettent d’obtenir des pressions de 420bars et peuvent aller jusqu’à 600bars. On distingue deux sortes de pompes :  Pompes à pression constante : ce sont des pompes pneumatiques qui par l’intermédiaire d’un gaz inerte imposent une pression constante à la phase mobile. Simples peu coûteuses, mais leur utilisation est limitée, elles sont réservées actuellement aux remplissages des colonnes.  Pompes à débit constant : la régularité des débits qui peuvent aller de 0,01ml à 10ml/min est une condition essentielle à la reproductibilité des chromatographies et très souvent obligatoire pour certains systèmes de détection. Le modèle le plus simple est de type seringue, dans lequel le déplacement d’un piston refoule le liquide à vitesse constante. L’avantage fondamental de ces systèmes est de permettre une bonne répétabilité des Volumes et des temps d’élution. N.B : les pompes des équipements actuels sont pilotées par informatique (bien utile lors de l'utilisation de gradient d'élution). 4 c) Systèmes d’injection : introduction des échantillons L’injection d’un volume précis de l’échantillon en tête de la colonne doit se faire en un temps très bref afin de ne pas perturber le régime d’écoulement de la phase mobile qui doit être stable de la colonne au détecteur. La difficulté consiste à introduire en tête de colonne un volume d’échantillon là ou la pression atteint plusieurs dizaines de bars. On utilise pour cela une vanne haute pression à plusieurs voies (vanne à boucle d’échantillonnage). Ce type de vannes peut être utilisé soit manuellement soit commandé par un passeur automatiques d’échantillons (injecteurs automatiques). Procédé par boucles = vanne à boucle d’échantillonnage C’est la méthode d’introduction la plus courante en H.P.L.C utilisant des boucles d’échantillonnage. Ils permettent l’injection de volumes variables allant du microlitre au millilitre et peuvent fonctionner sous de fortes pressions, jusqu’à 600bars. L’échantillon est introduit à la pression ordinaire dans une boucle, petit volume clos, qui peut être mis en communication par un système de vannes avec le réservoir de phase mobile et avec la colonne. Le principe de fonctionnement est le suivant : 1) la boucle est isolée par la fermeture des vannes de l’ensemble de l’appareil. 2) on introduit l’échantillon à la pression atmosphérique dans la boucle à l’aide d’une seringue (position chargement ou load). 3) on ouvre les vannes par simple translation pour permettre à la boucle d’être en communication avec le système chromatographique et son contenu est entraîné dans la colonne (position inject). Ce système évite les brusques variations de pression dans l’appareil, et en diminuant les irrégularités des injections, augmente la reproductibilité. La quantité introduite dans la colonne étant obligatoirement celle du volume de la boucle. Le volume prélevé avec la seringue est toujours supérieur à celui de la boucle L’excès du volume est évacué par le trop plein (évent). Ces dispositifs font généralement partie intégrante de l’appareillage HPLC moderne utilisés actuellement. 5 Vannes à boucles d’échantillonnage 6 d) Colonne = le cœur d’un chromatographe Les colonnes utilisées en H.P.L.C se caractérisent par leur géométrie et par la nature des phases stationnaires qu’elles contiennent. Elles sont en acier inoxydables de diamètre interne 2 à 8mm, la longueur est comprise entre 5 et 30cm. Capables de résister aux fortes pressions. La colonne probablement la plus utilisée a une longueur de 25cm, un diamètre interne de 4,6mm, la granulométrie est de 5m. Le nombre de plateaux théoriques de ce type de colonne est compris entre 40.000 et 60.000 par mètre. Depuis peu sont apparues sur le marché des micro colonnes à haute performance et à grande vitesse. Leur diamètre interne est de 1à 4,6mm et leur longueur de 3 à 7,5cm. Ces colonnes qui sont remplies de particules de 3 à 5m possèdent jusqu’à 100.000 plateaux par mètre Ces colonnes ont l’avantage : de la rapidité de l’analyse, de consommer moins de solvant (les solvants de haute pureté pour l’HPLC sont très coûteux), de conduire à une meilleure résolution de l’analyse (par suite d’une moindre diffusion), de permettre de faire du couplage avec la spectrométrie de masse HPLC/MS. Colonne de garde = pré colonne On place souvent une courte colonne de protection avant la colonne afin d’en augmenter la durée de vie de notre colonne par élimination des impuretés contenus dans les solvants, et aussi des espèces qui se lient de manière irréversible à la phase stationnaire. La composition de la colonne de garde doit être semblable à celle de la colonne analytique. N.B : pour éviter les écarts de température modifiant parfois les temps de rétention, les appareils actuels sont équipés de four permettant de thermostater la colonne, à la fois : - pour assurer la répétitivité des analyses. - et aussi pour faire intervenir éventuellement la température comme paramètre de séparation. 7 COLONNE HPLC 8 e) Systèmes de détections : Ils ont pour rôle de suivre en continu la présence des composés dans la phase mobile au fur et à mesure de leur élution. D’une manière générale pour qu’un détecteur puisse permettre une analyse quantitative fiable, Il doit satisfaire à plusieurs critères :  donner pour chaque composé une réponse proportionnelle à sa concentration.  fournir une réponse stable, rapide et reproductible.  Présenter une bonne sensibilité.  Ne pas modifier la qualité de la séparation apportée par la colonne. Les systèmes utilisés pour la détection sont répartis en deux groupes : - ceux qui ont un caractère universel et qui exploitent une modification par les solutés d’une propriété de la phase mobile tel que le Réfractomètre. - et ceux qui sont dits sélectifs parce qu’ils utilisent les propriétés physicochimiques particulière des solutés tel que détecteurs : électrochimique, spectrophotométrique, spectrofluorimètrique. 1) Réfractomètre : consiste à mesurer la différence d’indice de réfraction entre la phase mobile pure qui sert de référence et les solutions éluantes contenant les substances. Le Réfractomètre possède une sensibilité médiocre. Il est très sensible au changement de température (ce qui peut être évité en le thermostatant). Il est aussi sensible au changement du débit ce qui est le plus gênant. Il ne peut entre autre être employé lorsque l’on utilise des gradients d’élution, car l’indice de réfraction des mélanges varie sauf cas exceptionnel avec leur composition. Sa principale application est la chromatographie d’exclusion stérique. 2) Détecteur spectrophotométrique : La détection est basée sur la loi de Beer-Lambert. La méthode la plus employée utilise les spectres électroniques. Elle nécessite que les phases mobiles absorbent peu aux longueurs d’ondes auxquelles sont faites les mesures. Les mesures dans l’UV proche étant les plus nombreuses, on se limite en général aux phases mobiles n’absorbant pratiquement plus à des longueurs d’ondes supérieures à 250nm. 9 Les types d’appareils qui équipent les chromatographes sont : Photomètre à filtre dont la source est une lampe à vapeur de mercure (à basse pression détection en UV 254nm ou à pression moyenne donnant une raie à 280nm). Spectrophotomètre à prisme ou à réseau dont la source couvre toute La gamme UV/visible de 200 à 800nm utilisant soit des détecteurs classiques, soit de Plus en plus des détecteurs à barrettes de diodes (D.A.D), Ces derniers peuvent fournir un chromatogramme en trois dimensions 3D (absorbance, longueur d’onde, et temps de rétention.) Les détecteurs spectrophotométriques présentent un certains nombre d’avantages : - Ils sont spécifiques. - Ils sont cent fois plus sensibles que les réfractomètres. - Leur réponse est peu influencée par les variations de température ou de débit de phase mobile. - Ils peuvent être employés lorsque l’on utilise le gradient d’élution. - Couplés à une informatique, ils permettent :  De rendre une identification plus spécifique et de vérifier la pureté des échantillons,  De rendre possible le dosage de produits d’altération dans des préparations médicamenteuses,  De faire une analyse simultanée de plusieurs principes actifs dans un produit. Présentation d’un chromatogramme 3D 10  3) Détecteur à fluorescence = (spectrofluorimètre) Ce mode de détection est spécifique aux composés qui présentent une fluorescence lorsqu’ils sont excités par une radiation lumineuse. Ce détecteur est caractérisé par : - Sa grande sélectivité - Et sa grande sensibilité. Le domaine d’application de la spectrofluorimètrie peut être élargi par la synthèse de dérivés fluorescents soit avant l’injection dans le système chromatographique, soit en sortie de la colonne. Par ailleurs, afin d’améliorer les sensibilités la technologie actuelle tend à remplacer la source d’excitation (lampe) par un faisceau laser (parfaitement monochromatique et d’intensité stable). 4) Détecteur électrochimique = Ne s’adresse qu’aux composés douées de propriétés oxydo-réductrices. Leur fonctionnement est basé sur l’ampérométrie, la polarographie, et la coulomètrie. Son application peut être élargie par la mise en œuvre de réactions chimiques de transformation à l’aide de marqueurs électroactifs. 5) Couplage entre méthodes chromatographiques et méthodes spectrales : Le couplage constitue actuellement l’un des outils les plus puissants pour l’analyse des mélanges complexes. - spectrométrie de masse : C.L/SM. - spectrophotométrie d’absorption infrarouge : C.L/ IR 11 III) choix du procédé chromatographique : La connaissance des poids moléculaires, des polarités et des caractères ioniques des solutés va orienter le choix du procédé chromatographique à mettre en œuvre pour réaliser leur séparation. 1) Chromatographie d’adsorption ou chromatographie liquide – solide : C’est la plus ancienne des méthodes chromatographiques. Elle met à profit (expérience de Tswett), la propriété que possèdent certaines substances en solution d’être retenues par la surface d’une phase stationnaire très finement divisée appelée adsorbant. Les phases stationnaires utilisées en chromatographie liquide – solide sont : la silice et l’alumine. La chromatographie liquide – solide s’adapte particulièrement aux composés non polaires de masse molaire inférieure à 2000. Les phases mobiles utilisées sont par ordre de polarité croissante : L’hexane, l’isooctane, le dichlorométhane, les éthers isopropylique et éthylique, le méthanol, et l’acétonitrile. Les solvants sont rarement utilisés seuls. Sous réserves de leur miscibilité et de leur compatibilité avec le système de détection pour obtenir de bonnes séparations, on emploie des mélanges binaires ou tertiaires. 2) Chromatographie de partage ou chromatographie liquide – liquide : Des quatre méthodes de chromatographie liquide, la plus utilisée est sans aucun doute la chromatographie de partage (environ 80% des analyses). La chromatographie de partage peut être divisée en : - Chromatographie liquide – liquide - Chromatographie liquide – phase greffée. 12 La différence entre ces techniques réside dans la manière de fixer la phase stationnaire aux particules qui constituent le support. En chromatographie liquide – liquide, la phase stationnaire est retenue à la surface du support par adsorption physique, En chromatographie liquide – phase greffée, la phase stationnaire est fixée au support par liaison chimique. Ce qui permet d’augmenter la stabilité des phases stationnaires. Les premières chromatographies de partage étaient exclusivement du type liquide – liquide, actuellement celles-ci présentent certains inconvénients comme la dissolution de la phase stationnaire dans la phase mobile qui nécessite une régénération périodique du support. Ainsi la chromatographie liquide – phase greffée est devenu prédominante. Colonnes de chromatographie liquide – phase greffée : Les supports de la majorité des matériaux de remplissage en chromatographie liquide – phase greffée sont préparés à partir de silice ou de dérivés à base de silice. Schéma (1) La plupart des supports à phase greffée sont constitués de siloxanes (Si – O – Si) formés par réaction entre la surface hydrolysée et un organochlorosilane. Par exemple, on a : CH3 CH3 - Si – OH + Cl – Si – R - Si – O – Si - R CH3 CH3 Sur le dérivé obtenu, on fixe ensuite des groupements R de polarité variables. La plupart du temps, le groupement R du siloxane est une chaîne en C8 (n-octyle) 8atomes de carbones, ou en C18 (n-octyledecyle) 18 atomes de carbones. Schéma (2). Le taux de greffage se situe entre 25 et 40% selon les phases commercialisées. Recouvrement final : End capping Substitution des groupements OH libre par traitement avec du TMCS ( triméthylchlorosilane) pour éviter les interactions hydrophiles parasites. 13  Schéma (1) Silice greffée contenant des gpts silanol Si-OH libre Schéma(2): silice greffée par un alkyl à 18 atomes de carbones C18 14 Support à phase normale et à phase inversée : On peut distinguer deux types de chromatographie de partage selon les polarités relatives des phases mobile et stationnaire. Les premiers travaux de chromatographie liquide utilisaient des phases stationnaires très polaires telles que le tri éthylène glycol ou l’eau adsorbés sur de la silice ou de l’alumine ; Et des phases mobiles non polaires tel que l’hexane ou l’éther isopropylique. Ce type de chromatographie est appelé actuellement chromatographie en mode normal. L’autre mode de chromatographie est appelé : Chromatographie en mode inversé ou à phase inversée ou la phase stationnaire est non polaire, alors que la phase mobile est polaire comme l’eau, le méthanol, ou l’acétonitrile. En chromatographie en mode normal, le constituant le moins polaire est élué le premier, (phase mobile moins polaire) Par contre dans la méthode en mode inversé, le constituant le plus polaire est élué le premier, (phase mobile polaire). 15 Les supports à phase greffées sont classés en mode inversée lorsque la phase greffée au support est non polaire, colonne R.P C8 (Octyl) et colonne R.P C18 (Octadecyl) et en mode normal, lorsque la phase greffée contient des groupements fonctionnels polaires (amino ou cyanopropyl). R.P : en anglais reversed phase. Plus de 75% de la chromatographie liquide est effectuée en mode inversée. (R.P) 16 Choix de la phase mobile en H.P.L.C: La phase mobile est constituée d’un Mélange eau/solvant organique en proportions variables. Propriétés recherchées: - Haute pureté. - Solubilisation des échantillons. - Compatibilité avec le détecteur. - Faible viscosité (η↓). - Inerte chimiquement. - polarité. - Prix abordable. Il est rare de trouver une phase mobile adéquate constituée par un seul « solvant pur », Généralement, l’obtention d’une bonne séparation nécessite de recourir à un mélange d’au moins deux solvants. En changeant la composition de la phase mobile donc sa polarité on agit par l’intermédiaires des coefficients de distribution sur le facteur de rétention K’ des composés. (paramètre d’optimisation). Solvants les plus courants en mode inverse:  Eau: permet d’ajuster la polarité du milieu.  Méthanol.  acétonitrile.  Tétrahydrofuranne THF. L'utilisation de solvants en HPLC implique le respect de quelques règles essentielles :  Utilisation de solvants spécifiques pour l'HPLC (solvants pour analyse).  Utilisation d'eau déminéralisée exempte de toute trace de matière organique. Eau ultra pure  Filtration nécessaire des solvants sur filtres spéciaux. (0,4 à 0,5 μm)  Dégazage des solvants après filtration 17  Caractéristiques des systèmes en phases normale et inversée Phase normale Phase inversée Polarité de la Élevée Faible phase stationnaire Polarité de la Faible à moyenne Moyenne à phase mobile élevée Phase mobile Heptane, chloroforme, etc. Mélange typique additionnés de quantités méthanol/eau variables de solvants polaires ou acétonitrile/eau Ordre d'élution Les moins polaires d'abord Les plus polaires d'abord IV) Application de la chromatographie de partage : L’utilisation de phases greffées en mode inverse en présence de solvants très polaires souvent aqueux, le couplage avec les méthodes spectrales se rapproche du système idéal universel de la chromatographie liquide. En raison de leur vaste domaine d’application, de leur confort, et de la facilité avec laquelle les valeurs de α et de K’ peuvent être ajustées par modification de la nature et de la composition de la phase mobile, ces techniques sont souvent les premières à être utilisées lors des études exploratoires de nouveaux types d’échantillons. Domaine d’utilisation Exemples de mélanges Pharmaceutique Antibiotiques, sédatifs, stéroïdes, analgésiques. Biochimique Acides aminés, protéines, hydrates de carbone, lipides. Alimentaire Edulcorants artificiels, antioxydants, aflatoxines, additifs. Industrie chimique Aromatiques condensés, surfactants, combustibles pour fusée, colorants. Pollution Pesticides, herbicides, phénols, P.C.B. Chimie légale Médicaments, poisons, alcool dans le sang, stupéfiants. Analyse médicale Acides biliaires, VMA et dérivés, métabolites de médicament, extraits d’urine, œstrogènes. 18 Ultra performance liquide chromatographie : U.P.L.C - Nouvelle invention de la chromatographie liquide (2004). - l'UPLC améliore l'HPLC dans trois domaines :  Résolution chromatographique.  Vitesse d'analyse.  Sensibilité. -Grace à la mise sur le marché des colonnes de granulométrie réduite proposées par de nombreux fabricants (taille inférieure à 2 μm). -Simultanément à cette évolution des supports chromatographiques, l’instrumentation a également été améliorée afin d’offrir une compatibilité optimale avec les analyses rapides, tout en restant à la fois robuste et précise pour les analyses quantitatives. -Les nouveaux systèmes chromatographiques sont ainsi susceptibles de travailler avec des pressions maximales de l’ordre de 600 voire 1000 bars, afin d’être compatibles avec les colonnes remplies de petites particules. -De plus, la plupart des systèmes analytiques sont actuellement équipés de dispositif de thermorégulation pouvant atteindre des températures proches de 100 °C, car l’utilisation de hautes températures permet de réduire les temps d’analyse par le biais de la diminution de la viscosité de la phase mobile. 19