6ª aula transição eucariotas_c3bdca8e44921eb2bde1cb007affc4fb.PDF

LICENCIATURA EM CIENCIAS BIOMÉDICAS LABORATORIAIS Biologia Molecular I Transcrição Ano lectivo:2023/2024 24-10-2024 Docente: Fátima Monteiro  Sumário ❑ Dogma central da Biologia Molecular ❑O mecanismo de transcrição: unidade de transcr...

LICENCIATURA EM CIENCIAS BIOMÉDICAS LABORATORIAIS Biologia Molecular I Transcrição Ano lectivo:2023/2024 24-10-2024 Docente: Fátima Monteiro  Sumário ❑ Dogma central da Biologia Molecular ❑O mecanismo de transcrição: unidade de transcrição, regiões promotoras e terminais, ❑RNA polimerases eucariotas ❑Transcrição em modelo eucariota: etapas e características Dogma Central da Biologia Molecular Expressão Génica em Eucariotas  Núcleo RNA polimerase Gene Transcrição hnRNA Processamento mRNA Tradução Citoplasma proteína  O QUE É UM GENE?  Toda a Sequência de DNA necessária para a síntese de um RNA funcional (rRNA,tRNA,microRNA,etc) ou de um polipeptideo que pode ser uma proteina ou peptideos funcionais  DNA ACTATGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGCTAGTCGATCGATCGA Transcrição RNA ACUAUGCUAGCUAGCUAGCUAGCUAGCUAGUCGAUCGAUCGA snRNA RNAr RNAt snoRNA SiRNA PiRNA RNAm Pequenos pequenos microRNA Pequenos RNAs 3% RNAs RNAs RNAs RNAs Micro RNAs de interferência, nucleares nucleolares ribossomais transferência regulam a impedem a , actuam que processam formam a elementos expressão expressão dos em os rRNAs estrutura adaptadores génica genes por diversos Proteína básica do entre o RNAm bloqueando a degradação processos ribossoma e e os tradução dos directa dos nucleares catalisam a aminoácidos RNAm RNAm e tal como síntese na síntese compactação da o slicing proteica proteica cromatina do pré- 80% 15% RNAm ESTRUTURA DE UM GENE EUCARIOTA 5´UTR 3´UTR  ESTRUTURA DE UM GENE DE EUCARIOTA Promotor Região Codificante Sítio de PoliA DNA hnRNA Intrão AAAAAAAAAA RNA Exão mRNA AAAAAAAAAA  ESTRUTURA BÁSICA DE UM GENE Transcription Transcription start site Translation stop site AUG UAA 5’(CAP) (AAAA) 5’UTR Translation start site 3’UTR 5’ CAP, poly A tail and intron only present in eukaryotes UTR = untranslated region. RNA POLIMERASE Reconhece Desnatura Mantém Renatura termina a síntese do RNA  RNA Polimerase RNA Localização Função transcrito RNA Polimerase I rRNA Núcleolo Componentes dos ribossomas; (28S;18S e síntese proteica 5,8S) RNA Polimerase II mRNA Nucleoplasma Proteínas SnRNA Splicing miRNA Regulação da expressão genica SiRNA RNA Polimerase tRNA Nucleoplasma Síntese proteica III rRNA 5S Ribossoma SnRNA U6 Splicing RNA Polimerase I RNA Polimerase I  RNA Polimerase III A distância entre a caixa A e a caixa B pode variar porque muitos genes de tRNA contêm um pequeno intrão.  RNA Polimerase III TFIIC liga-se tanto ao boxA quanto ao boxB. Isto permite que o TFIIIB se ligue no start point. Neste ponto, a RNA polimerase III liga-se RNA Polimerase III RNA polimerase II Fatores de Transcrição  Regiões promotoras Elementos a montante (upstream) (5’)  RNA polimerase II Os promotores da RNA polimerase II frequentemente têm uma pequena sequência conservada, Py2CAPy5(o iniciador, Inr), no start point  RNA polimerase II A TATA box é um componente comum dos promotores da RNA polimerase II O DPE ó o elemento dos promotores da RNA polimerase II que não contêm uma TATA box Um promotor central para a RNA polimerase II inclui uma TATA box ou um DPE Estruturas de promotores eucariotas típicos Nome Seq. consenso TATA box TATAAA CAAT box GGCCAATCT GC box GGGCGGG Octamêro ATTTGCAT  Fatores de transcrição ❑ Fatores gerais, comuns à transcrição de todos os genes, ou específicos para determinados genes. ❑Os fatores de transcrição são proteínas que têm uma região que se liga ao DNA e outra região que interage com outras proteínas e estimulam a transcrição.  Fatores de Transcrição (FTs) Gerais Específicos Aproximadamente 5% dos genes humanos codificam FTs Formam complexo no DNA Recrutam a RNA polimerase → a enzima não se liga isoladamente Promovem início da transcrição Gerais Suficientes para níveis basais de transcrição (housekeeping genes; estruturais – proteínas constituitivas) Todos os genes associados à RNA polimerase II  Fatores de Transcrição Com função reguladora na transcrição Sintetizados ou ativados em alturas ou tecidos específicos Controlo do padrão de transcrição no tempo e no espaço Específicos Ligam-se a sequências do DNA designadas elementos de controlo, como os enhancers ou repressors. Níveis elevados de transcrição, (genes reguladores – proteínas indutíveis) Fatores de Transcrição: ✓ Regulam ✓ Precisam de ser regulados  Complexo de iniciação da transcrição  Iniciação Fatores gerais de transcrição = Complexo de pré-iniciação + RNA Polimerase II ✓ RNA Polimerase II ✓ TFIIA ✓ TFIIB ✓ TFIID ✓ TFIIE ✓ TFIIF ✓ TFIIH Montagem do complexo de iniciação - RNA Polimerase II Região TBP (tata binding protein) do fator TFIID reconhece a TATA box A ligação de TFIIA estabiliza o TFIID já ligado TBP – TATA binding protein 180 aa Estrutura em “forma de sela” Liga ao DNA através do sulco menor DNA dobra cerca de 80º Liga preferencialmente a regiões AT porque requer menos energia para desnaturar o DNA RNA Polimerase Outros fatores ligam-se ao complexo TFIIE e TFIIH ligam e contribuem para a estabilização do complexo TFIIH tem atividade ATPase, helicase e quinase. Fosforila a cauda CTD da polimerase A fosforilação permite que a polimerase II se desligue do complexo e avance ao longo do gene A fosforilação da cauda CTD também atrai a enzima guanilil transferase que é fundamental para a proteção do mRNA em formação – Formação do 5’ cap Fator geral Características principais Contem a TBP (TATA binding protein); liga à TATA box; é TFIID um fator de posição TFIIA Estabiliza a ligação do TFIID Liga a montante (sulco maior) e jusante (sulco menor) da TFIIB TATA box; direciona a transcrição; essencial para a ligação do conjunto “TFIIF-RNA PolII” Heterotetrâmero, com 2 subunidades diferentes; uma delas tem função de helicase (envolvido na desnaturação TFIIF do promotor); estabiliza o complexo “DNA- TBP-TFIIB”; essencial para a entrada dos TFIIE e TFIIH TFIIE Heterotetrâmero; Atrai o TFIIH para o complexo 9 sub-unidades; 2 delas com atividade helicase; tem TFIIH atividade quinase (fosforilação do CTD) ✓ Remoção do complexo de iniciação (promoter clearance) ✓ Entrada dos fatores de elongação ✓ Inicia-se a etapa de ELONGAÇÃO Elongação Renaturação  TERMINAÇÃO Nos eucariotas, cada uma das RNA polimerases tem mecanismos de terminação diferentes RNA Polimerase I – requer um fator de terminação específico que liga a jusante da unidade de transcrição RNA Polimerase II – termina numa região a 0.5-2 kb da cauda poli(A) (sinal de poliadenilação – AAUAAA e é um processo associado à clivagem e poliadenilação da extremidade 3’ RNA Polimerase III – termina após a polimerização de vários resíduos de U Fim???