PROCÉDÉS DE STÉRILISATION PDF

PROCÉDÉS DE STÉRILISATION  PLAN DU COURS I. Généralités II. Stérilisation par la chaleur III. Stérilisation par les gaz IV. Stérilisation par les rayonnements V. Stérilisation par filtration VI. Préparation aseptiques  Introduction Les µorganismes représente...

PROCÉDÉS DE STÉRILISATION  PLAN DU COURS I. Généralités II. Stérilisation par la chaleur III. Stérilisation par les gaz IV. Stérilisation par les rayonnements V. Stérilisation par filtration VI. Préparation aseptiques  Introduction Les µorganismes représentent un risque potentiel pour la santé de l’homme. leur présence dans les aliments, médicaments et l’environnement peut causer des maladies et même la mort. Les travaux de louis pasteur, qui ont permet la mise en évidence de la liaison entre microbes et maladies, poussaient Joseph Lister à utiliser le phénol pour réduire le risque de contamination lors des opérations chirurgicales à la fin du 19ème siècle. Ces connaissances ont conduit à introduire des mesures pour limiter les risques de contamination microbiennes et de développer ainsi des méthodes de stérilisation. I- GÉNÉRALITÉS  1.DÉFINITIONS  Stérilisation La mise en œuvre d’un ensemble de méthodes et de moyens visant à tuer ou éliminer tous les µorganismes qui souillent un objet ou un produit de façon durable.  Stérilité absence de micro-organismes viables.  Produit stérile la probabilité théorique ≤ à 10-6 qu’un µorganisme viable soit présent dans ce produit.  Désinfection Ensemble de méthodes permettant d’éliminer ou de tuer les µorganismes, ou d’inactiver les virus, et en fonction des objectifs fixés, sur une matière inerte. C’est l’abaissement défini de la population de µorganismes sans seuil fixé. C’est un état éphémère car il y a absence de conditionnement  2. INTÉRÊTS  La stérilisation occupe une place importante en industrie qu’à l’hôpital, on stérilise: Les médicaments : préparations injectables, collyres, produits destinés à être appliqués sur certaines blessures et brûlures Matériel utilisé lors des opérations chirurgicales Matériel à injection Objets de pansements Tubes de recueil des prélèvements Nourriture des immunodéprimés Prothèses  3. MÉTHODES DE STÉRILISATION humi sèche de Oxyde formaldéh d’éthylè yde ne chaleur β γ Gaz alkylants Irradiatio Antisepti n Stérilisation que gazeux x Phase plasma Liquide Air - surface UV- filtration salles blanches  4. MÉCANISME DE STÉRILISATION  Procédés de destruction Destruction des microorganismes présents dans la préparation Destruction par des moyens physiques -Action de la chaleur (hydrolyse et dénaturation protéique) -Action des rayonnements ionisants (oxydation) Destruction par des moyens chimiques - Action des gaz toxiques (alkylation)  Procédé d’élimination Séparer les microorganismes de la préparation II- STÉRILISATION PAR LA CHALEUR  1. facteurs influençant la destruction des micro-organismes La sensibilité des micro-organisme dépend De l’espèce microbienne De la durée du traitement Du nombre de germes initial De la température ; Du milieu dans lequel se trouvent les germes.  1.1.Espèce microbienne Sensibilité différente des germes à la chaleur. la forme sporulé plus résistante que la forme végétative. Germes de référence les plus résistants sont: Bacillus stearothermophilus pour la chaleur humide  Bacillus subtilis pour la chaleur sèche. Ces germes permettent d’apprécier l’efficacité d’un traitement thermique donnée.  1.2.Durée et nombre de germes  Loi de décroissance des micro-organismes en fct du temps à T cte - Soit No microorganismes d’une culture microbienne soumis à une température constante assez élevée pour exercer un effet nuisible sur ceux-ci. - Réalisation de la mesure du nombre N de germes revivifiables en fonction de la durée t d'exposition à cette température. Nbre de germes survivants log N/N0= - k.t t  On peut conclure que:  Le risque de survie après un traitement thermique donné est d’autant plus faible qu’il y avait moins de germes au départ.  Il est donc impossible d'atteindre la stérilité absolue en théorie.  La stérilité est une probabilité, non une certitude d’où la définition du niveau d’assurance de stérilité (NAS).  On considère qu'un produit est stérile si le (NAS) est inférieur à 10-6.  Précaution à prendre pour réduire la biocharge Utiliser du matériel et de la verrerie très propre ; Utiliser, dans le cas des solutions aqueuses, de l’eau fraîchement distillée. Utiliser des matières premières aussi pures que possible et dans un état parfait de conservation ; Travailler en atmosphère aussi pauvre en germes que possible  1-3-TEMPÉRATURE - Plus la température est élevée et plus la destruction est rapide. - Phénomène de destruction suivant une décroissance logarithmique, qui, avec des coordonnées semi logarithmiques, donne une droite : -Temps qui assure pour chaque température une réduction de 10 à 12 100 de spores de Clostridium botulinum. -On appelle valeur stérilisatrice F, pour une température donnée, le temps nécessaire pour réduire de 105 à 100 le nombre des spores par millilitre de préparation, par exemple : à 120°C, F = 3 mn à 100°C, F = 30 mn  1-3-TEMPÉRATURE -Le cycle de stérilisation ou barème de stérilisation est dit de la courbe d’évolution de la température à l’intérieur des récipients en fonction du temps. - Cette courbe comprend une partie ascendante (montée en température), un plateau correspondant au maintien de la température choisie, et une partie descendante correspondant à la période de refroidissement.  1.4. Nature du milieu Humidité Destruction en milieu humide > milieu sec. pH Destruction facile en milieu alcalin ou acide. Présence de substances bactéricides Ex: nitrile, le carbonate acide de sodium et le salicylate de sodium  2. PROCÉDÉ DE STÉRILISATION PAR LA CHALEUR SÈCHE Fours ou étuve à air chaud type Poupinel ou pasteur, Muni d’un ventilateur pour homogénéiser la T°. Généralement on stérilise à: 180°C minimum 30’ Ou 170°C minimum 1h Ou 160°C minimum 2h Ou 140°C minimum 4h Utilisation Objets métalliques ou en verre (récipients, petits matériels...). Peut également être utilisée pour les huiles.  Avantages -Procédé très simple, peu coûteux -Efficace si contrôlé -Permet la libération paramétrique -Seul procédé dépyrogénant Inconvénients - Cycle long. - Mauvaise conductivité thermique de l'air: - de ne pas trop remplir l'enceinte, - d'avoir une ventilation, - de filtrer l'air qui entre dans l'enceinte. - Inactif sur les ATNC => proscrit à l’hopital ATNC : agents transmissibles non conventionnels  3. stérilisation par chaleur humide sous pression L’autoclave  Enceinte cylindrique de cuivre ou d’acier inoxydable.  Un couvercle massif fixé par des boulons.  Un joint en caoutchouc épais assurant l’étanchéité.  Le couvercle comporte: o une soupape de sûreté o un robinet d’évacuation de l’air ou de la vapeur o un manomètre.  panier métallique à l'intérieur. Représentation schématique d’un autoclave Autoclaves industriels  Les différentes phases d’un cycle de stérilisation - Purge de l’air :bon diffusion de la vapeur - Chauffage de la charge : - 0 atm +100°C - 0.5 atm +110°C - 1 atm +121°C - 2 atm +134°C - Stérilisation - Refroidissement - Séchage: réalisé par abaissement de la pression. - Conditions de référence Médicaments stériles: 15’ à 121°C Matériels: 10’ à 134°C Risque d’ATNC (hôpital) :18’ à 134°C  Contrôles en cours de la stérilisation 1. Contrôles avant la stérilisation Vérifier le fonctionnement correct de l’appareil, l’alimentation en eau. Un test d’étanchéité au vide (test de fuite). Test de pénétration de la chaleur dans la charge (test Bowie-Dick.) 2. Contrôles pendant la stérilisation Vérification des manomètres, des thermomètres, du déroulement conforme des phases du cycle (absence d’alarmes).  3.Contrôles après stérilisation Lecture du diagramme d’enregistrement: pression/température/temps Témoins physico-chimiques: Virage des indicateurs de passage Ruban adhésif Indicateurs biologiques: spores Bacillus steatothermophilus  Avantages  Procédé le plus fiable Efficacité la meilleure, même vis-à-vis des ATNC Paramètres réduits et maîtrisables : ( T°, P, t) libération paramétrique de la charge Utilisation d ’un produit non toxique : l ’eau  Procédé le plus rapide : libération possible de la charge en moins d ’une heure.  Procédé peu coûteux par rapport aux autres. Inconvénients Limitée aux objets thermorésistants et hydrorésistants Utilise un appareil sous pression Nécessite une maintenance rigoureuse Nécessite un « permis de conduire » Consommation d ’eau Installation coûteuse  III. STÉRILISATION PAR LES GAZ Oxyde d’éthylène Formaldéhyde Acide péracétique  Stérilisation par l’oxyde d’ethylene 1. formule chimique : oxyranne 2. propriétés: Gaz incolore, d’odeur éthérée Très diffusible, Bonne diffusibilité Bonne action bactéricide Problème de désorption  Propriétés stérilisantes Alkylation des acides nucléiques. => Bon agent Bactéricide, fongicide, virucide, sporicide  Paramètres de stérilisation par l’OE: N = N0 e- KCt  Contamination initiale doit être la plus faible possible  A faible température la concentration optimale d’OE est de 600 à 800 mg /l pendant 3 heures  Meilleure efficacité obtenue entre 50 et 60% d’HR  Le conditionnement doit être perméable au gaz.  Conduite d’une opération de stérilisation Phase de vide prolongé. Conditionnement en T° et HR. Injection de l’agent stérilisant. Maintien des conditions spécifiées pendant le temps retenu d’exposition. Evacuation de l’agent stérilisant ; Rinçage. Admission d’air jusqu’à retour à la pression atmosphérique. Phase de Désorption : teneur < 2 ppm  5. Avantages  Applicable pour les produits thermosensibles, fragiles (endoscopes et sondes)  Procédé réalisable dans les hôpitaux et les établissements pharmaceutiques 6. Inconvénient Totalement inefficace vis à vis des ATNC  Difficulté de manipulation, personnel qualifié  Problème de toxicité et d’élimination  Risques d’inflammabilité et d’explosion  Stérilisation par le formaldéhydes 1. Structure chimique 2. Propriétés L’effet bactéricide est identique à celui de l’OE. Très efficace en milieu humide Gaz Peu pénétrant L’action germicide est entravée par des matières organiques => utiliser un matériel propre Ce gaz est utilisée pour stériliser le matériel et les locaux. 4. Avantages Pas de risque d’explosion Gaz détectable Courte durée de désorption Coût faible 5. Inconvénients N’inactive pas les ATNC Toxique  peu pénétrant  Stérilisation par l’acide peracétique Liquide incolore à température ordinaire Sous forme d’un mélange de quatre constituants en équilibre : CH3COOOH + H2O CH 3COOH + H2O2  La solution à 35% est lacrymogène.  L’opération consiste à : Chauffer à 40°C-47°C une solution à 3,5% d’acide péracétique Faire passer à la surface de cette solution de l’air qui circulera ensuite dans l’enceinte à stériliser.  Propriétés stérilisantes Oxydation des parois cellulaires et des constituants cytoplasmiques des microorganismes. Effet stérilisant est maximal à 80% humidité relative. Application Stérilisation des bulles et des isolateurs utilisés pour la fabrication et le contrôle microbiologique Tout le matériel doit être en verre ou en matière plastique Inconvénients Toxique Corrosion des métaux  IV. Stérilisation par les rayonnements UV Rayonnement γ et β Rayons X  Rayons UV (rayonnement électromagnétique) :  Propriétés des UV > 300 nm pénétrants , non microbicides. Entre 200 et 300 nm, microbicides mais ne traversent que l’eau pure. < 200 nm , microbicide considérable mais ils sont arrêtés par une mince couche d’eau.  Utilisations Stérilisation de l’atmosphère des enceintes stériles Maintenir la stérilité de l’eau distillée conservée dans des cuves de stockage. Inconvénients N’agissent qu’en rayonnement direct Accidents oculaires  Rayonnement γ et β Sources Radioélément: Co60=>Rt γ électromagnétique très bactéricide et très pénétrant. Accélérateurs d’électrons:=> Rt corpusculaire β. Mécanisme d’action Ionisation des atomes=> formation de radicaux libres responsables de l’action germicide.  Utilisations s’effectue dans des centres spécialisés protégés par d’épais murs en béton pour éviter l’émission de Rts en dehors. utilisée pour stériliser :  Matériel médico-chirurgical: Seringues Aiguilles Sondes Nécessaires de perfusion  Articles de pansement et de suture. permet la stérilisation des objets dans le Schéma d’une centrale pour Irradiation γ Irradiation B  Les paramètres contrôlés en routine sont Le positionnement correct de la source ; L’activité de la source ; Le temps d’exposition (process discontinu) ou vitesse du convoyeur (process continu) ; La dose absorbée (dosimètres) La définition de la charge et densité du produit. L’efficacité du procédé: En utilisant des indicateurs biologiques :spores de Bacillus pumilis  Rayonnement x Produit par l’action d’un faisceau d’électrons accélérés sur une cible métallique. La dose absorbée dépend:  de l’énergie du faisceau d’électrons,  de la largeur de balayage  de la vitesse du convoyeur. Procédé très peu utilisé.  Contrôle du procédé En routine, il convient de surveiller les éléments suivants : Enregistrement continu des caractéristiques du faisceau et de la vitesse du convoyeur ; Dose absorbée ; Distribution du produit et densité des matériaux  V. Stérilisation par filtration Mode applicable aux fluides : liquides monophasiques et gaz. Appliqué aux solutions contenant un PA thermolabile. Les filtres doivent être adaptés:  Compatibilité avec le(s) principe(s) actif(s) dissous,  Faible taux de rétention,  Diamètre des pores adéquat pour la filtration stérilisante (0.22 ou 0.1µm).  Différents types de filtres  Les filtres profondeur  Deux mécanismes d'action : le criblage et l'adsorption  Inconvénient : il existe un relargage de fibres  L es filtres écran  Un seul mécanisme d'action : le criblage  Ces filtres sont composés de polymères ayant des pores de 0,20 à 0,22µm  Inconvénient : il existe un colmatage rapide, d'où l'utilisation d'un pré-filtre, souvent de type filtre profondeur. Conduite de la filtration des préparations liquides Précautions à prendre Le matériel de préparation et de répartition doit être stérilisé au préalable par des moyens appropriés Diminuer au max la contamination initial. Assurer un débit régulier S’assurer de la fiabilité des filtres. La répartition du filtrat dans des récipients stériles doit se faire dans des conditions aseptiques. Effectuer la filtration aussi près que possible du point de remplissage.  Validation de la filtration stérilisante Qualification des filtres Deux types de contrôles sont réalisés : Vérification de l'intégrité du filtre :point de bulle. Tests de rétention microbienne: Le germe de référence est Pseudomonas diminuta (0,3µm). Validation des conditions opératoire Milieu de culture approprié répartis dans les mêmes conditions que le produit à examiner.  VI. Préparation aseptiques  Mode réservé aux produits qui ne peuvent subir aucun traitement de stérilisation dans leur conditionnement définitif. Exemples: Certaines préparations pour usage parentéral poudres, suspensions…) Certains vaccins, Certains réactifs de laboratoire.  Ils sont préparés dans des enceintes ou règne une asepsie rigoureuse.  1. Filtration stérilisante de l’air Contamination de l’air L'air est un transporteur des micro-organismes les micro-organismes vont se fixer sur différents supports :  Les poussières  Les gouttelettes L'élimination de ces particules est réaliser par la filtration stérilisante. Rôle de la filtration - Apporter de l'air propre dans la zone de travail. -Éviter l’introduction des produits dangereux dans l'environnement.  Montage filtrant Système de préfiltre : éviter des colmatages très rapide des filtres stérilisants Appareil de conditionnement d'air :appareils de réglage de l’humidité, T° Filtre stérilisant: dénommé filtre absolu ou filtre HEPA (Haute Efficacité pour les Particules de l'Air) En fibre de verre Plié en accordéon Contrôlé par le test DOP ( Di Octyl Phtalate)  2. Enceintes stériles Enceintes stériles Enceintes stériles Enceintes stériles à flux d'air laminaire classiques Les salles ou Salles blanches Isolateurs Hottes stériles blocs stériles stériles  Isolateurs De forme diverses, de taille réduite, closes, transparentes. l’opérateur se trouve à l’extérieur. Opérations réalisées à l’aide de:  gants étanches fixés sur la paroi demi-scaphandre. un ou plusieurs sas pour l’acheminement des produits et des arrivées de fluides filtrés.  Salles stériles -Les manipulateurs se trouvent à l’intérieur. -La ventilation est réglée de telle sorte que la pression aille en décroissant de l’intérieur vers l’extérieur. - pour que les mouvements d’air se fassent dans le sens d’une enceinte moins contaminée vers une enceinte plus contaminée, e  Salles blanches stériles -Traversées par un flux d’air qui se déplace à une vitesse uniforme le long de lignes parallèles verticales ou horizontales. -Comportent deux faces opposées poreuses dont l’une pour l’entrée de l’air est équipée de filtres stérilisants juxtaposés de type HEPA. Enceintes à flux vertical: De plafond à sol Enceintes à flux horizontal: Mur à mur Enceintes mixtes: de mur à sol ou de plafond à mur  Hottes stériles - de taille réduite, réservés à des opérations nécessitant des appareils peu encombrants. À flux d’air horizontal À flux d’air vertical Utilisées surtout En microbiologie pour les ensemencements Pharmacies hospitalières: préparation aseptique des médicaments