Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD) PDF

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/371453556 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD) Article in Tequio · September 2022 DOI: 10.53331/teq.v5i1...

See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/371453556 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD) Article in Tequio · September 2022 DOI: 10.53331/teq.v5i16.0535 CITATIONS READS 0 745 4 authors: Rene Garcia-Contreras Darinka Pamela Durán Gutiérrez National Autonomous University of Mexico National Polytechnic Institute 106 PUBLICATIONS 1,244 CITATIONS 4 PUBLICATIONS 0 CITATIONS SEE PROFILE SEE PROFILE César A. Reyes-López Patricia Chavez-Granados National Polytechnic Institute UNAM 40 PUBLICATIONS 226 CITATIONS 14 PUBLICATIONS 31 CITATIONS SEE PROFILE SEE PROFILE All content following this page was uploaded by Rene Garcia-Contreras on 13 June 2023. The user has requested enhancement of the downloaded file.  Tequio 5(16),2022: 59–70 ISSN: 2594-0546 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD) Importance of cell cultures. Optimization of an assay to evaluate the biological impact of cannabidiol (CBD) Darinka Pamela Durán-Gutiérrez1, César Augusto Sandino Reyes-López2, Patricia Alejandra Chávez-Granados3, René García-Contreras4* Fecha de recepción: 5 de enero de 2022 Fecha de aceptación: 12 de abril de 2022 Resumen - Los cultivos celulares primarios y Abstract - Primary cell cultures and cell lines are líneas celulares forman parte de las herramientas part of the fundamental tools for the evaluation fundamentales para la evaluación de la eficacia of the efficacy and cytotoxicity of drugs, protein y citotoxicidad de medicamentos, expresión de expression, vaccine production, evaluation of the proteínas, producción de vacunas, evaluación con pathogen-host relationship, among other versatile respecto a la relación patógeno-hospedero entre applications. Cellular study models are used to otras versátiles aplicaciones. Los modelos de estudio simulate dental, periodontal, and craniofacial celulares se utilizan para simular las enfermedades diseases. However, the optimization and dentales, periodontales y craneofaciales. Sin standardization can result in multiple errors that can embargo, la optimización y estandarización puede lead to inappropriate interpretations of the results resultar con múltiples errores que pueden ocasionar obtained in drug evaluation. This article has detailed interpretaciones inadecuadas de los resultados the basic aspects of cell cultures, reagent quality obtenidos en la evaluación de fármacos. En este control measures and good practices, the most artículo se han detallado los aspectos básicos sobre frequent mistakes committed when culturing cells cultivos celulares, medidas de control de calidad de and the applicable prevention methods to reduce reactivos y buenas prácticas, errores más frecuentes the risk of error. cometidos al cultivar células y los métodos de 1 Maestra en Ciencias en Biomedicina Molecular. Candidata a Doctora en Ciencias en Biotecnología. Laboratorio de Bioquímica Estructural, Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía (ENMyH), Instituto Politécnico Nacional · Guillermo Massieu Helguera, No. 239, Fraccionamiento "La Escalera", Ticomán, C.P. 07320, Ciudad de México, México · Correo electrónico: [email protected] · ORCID: 0000-0001-9696-8881. 2 Doctor en Ciencias (Químicas). Miembro del SNI Nivel 1. Laboratorio de Bioquímica Estructural, Escuela Nacional de Medicina y Homeopatía (ENMyH). Instituto Politécnico Nacional · Guillermo Massieu Helguera, No. 239, Fraccionamiento “La Escalera”, Ticomán, C.P. 07320, Ciudad de México, México · Correo electrónico: [email protected] · ORCID: 0000-0002-9860-8983. 3 Maestra en Ciencias en Biomedicina Molecular. Laboratorio de Investigación Interdisciplinaria, Área de Nanoestructuras y biomateriales, Escuela Nacional de Estudios Superiores (ENES) · Unidad León, Comunidad de los Tepetates, El Potrero, C.P. 37684, León, Guanajuato, México · Correo electrónico: chgranados@ gmail.com · ORCID: 0000-0001-7822-5531. 4 Doctor en Ciencias de la Salud. Laboratorio de Investigación Interdisciplinaria, Área de Nanoestructuras y biomateriales, Escuela Nacional de Estudios Superiores (ENES) · Unidad León, Comunidad de los Tepetates, El Potrero, C.P. 37684, León, México. Teléfono: +52 (477) 194 0800 Ext. 43463 · ORCID: 0000-0003-3504-5519 · * Autor de correspondencia: [email protected] TEQUIO, septiembre-diciembre 2022, vol. 5, no. 16 60 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD)/Durán- Gutiérrez, Reyes-López, Chávez-Granados & García-Contreras/59–70 prevención aplicables para disminuir el riesgo de Likewise, a pilot study of the biological impact error. Asimismo, se detalla un estudio piloto del of cannabidiol (CBD) in culture with human stem impacto biológico del cannabidiol (CBD) en cultivo con cells (hDPSC) is detailed, highlighting it’s potential células troncales humanas (hDPSC) y se destaca su therapeutic effect in dentistry. potencial efecto terapéutico en odontología. Palabras claves: Cultivo celular, línea celular, modelo Keywords: Cell culture, cell line, cellular model, celular, cannabidiol, control de calidad. cannabidiol, quality control. TEQUIO, septiembre-diciembre 2022, vol. 5, no. 16 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD)/Durán- 61 Gutiérrez, Reyes-López, Chávez-Granados & García-Contreras/59–70 Introducción L os cultivos celulares primarios y las líneas celulares forman parte de las herramientas esenciales en la investigación biomédica y pre-clínica al permitir estudiar los diferentes procesos que ocurren en las células bajo condiciones controladas, denominadas como ensayos in vitro (en vidrio), aportando un acercamiento fiable a lo que ocurre en un organismo (Segretin, 2002). Estos cultivos se establecen a partir de homogeneizados celulares obtenidos de tejidos disgregados, separando los diferentes tipos celulares utilizando técnicas de centrifugación, capacidad de adherencia, unión a anticuerpos específicos y la microdisección de captura por láser; requiriendo en su mayoría ser establecidos sobre una base para favorecer el crecimiento celular (Segretin, 2002). Las células cultivadas, además de presentar división celular, pueden ser diferenciadas hacia ciertos tipos celulares, desempeñando funciones análogas a las que tendrían estando en un tejido, permitiendo evaluar el impacto biológico de sustancias químicas, enfermedades y terapias celulares (Morales, 2019). En general, el término cultivo celular hace referencia a un cultivo derivado de células dispersadas tomadas de un tejido, cultivo primario o una línea celular (Freshney, 2016). En la actualidad los cultivos celulares son ampliamente utilizados para la evaluación de la eficacia y citotoxicidad de medicamentos, expresión de proteínas y evaluación de la relación patógeno-hospedero (Morales, 2019), además de ser un requisito para la fabricación de biológicos con acción terapéutica como son: hormonas, anticuerpos, interferones, factores de coagulación y vacunas (Verma, 2013). En el área de odontología, los modelos de estudio celulares se utilizan para simular enfermedades dentales, periodontales y craneofaciales, mientras que los cultivos de células troncales de la pulpa dental humana (hDPSC) han resultado prometedores en la odontología regenerativa para el reemplazo de tejidos periodontales y la regeneración de tejidos que rodean al diente (Gili, Aguirre, Segovia, Lezcano, Almirón, 2016). Origen del cultivo celular El desarrollo de cultivos celulares se remonta a mediados del siglo XIX con las suspensiones bacterianas y, a finales del mismo, con el sumergimiento de diferentes órganos animales en fluidos biológicos para intentar promover su crecimiento (Tavira, Ortega, Dávila, Estrada y Meneses, 2009). Sin embargo, hasta principios del siglo XX se lograron mantener viables células no disgregadas y explantes de diferentes tejidos (Harrison, 1906), estableciendo los cultivos celulares como un método de estudio del comportamiento de las células excluyendo las variaciones dadas por la propia homeostasia o por condiciones de estrés. Si bien los cultivos se crearon originalmente para estudiar el desarrollo celular así como eventos fisiológicos normales, las epidemias de poliomielitis en las décadas de los 40’s y 50’s y el requerimiento de vacunas virales hicieron evidente la necesidad de cultivos celulares a gran escala (Verma, 2013). En 1943 se estableció la primera línea celular continua de fibroblastos de ratón y en 1952 se generó la primera línea celular humana, proveniente de un carcinoma cervical, denominada HeLa (Freshney, 2016). El descubrimiento de que los tumores humanos podían dar origen a líneas celulares continuas promovió el interés en los trabajos con material humano. Este interés se siguió desenvolviendo con el desarrollo de medios de cultivos específicos para ciertas líneas celulares. Actualmente, los cultivos celulares son utilizados para la investigación básica en el estudio de la actividad intracelular, flujos intracelulares, interacciones célula-célula, genómica y proteómica; así como en la investigación aplicada para productos celulares, ingeniería de tejidos, inmunología, farmacología y toxicología (Freshney, 2016; Ulrich y Pour, 2013). TEQUIO, septiembre-diciembre 2022, vol. 5, no. 16 62 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD)/Durán- Gutiérrez, Reyes-López, Chávez-Granados & García-Contreras/59–70 Cultivos celulares El cultivo celular puede involucrar tres tipos diferentes de células: troncales, las cuales poseen el potencial de diferenciarse en cualquier tipo celular; precursoras, con la capacidad de dar origen a un número limitado de células especializadas; y células diferenciadas, que han perdido la capacidad de diferenciaciones subsecuentes. Además, los cultivos celulares poseen tres morfologías principales relacionadas con el origen del tejido primario y el desarrollo celular adherente o en suspensión. Las células con morfología fibroblástica y epitelial crecen formando una monocapa adherente, sin embargo, al despegarlas de su soporte, adquieren una forma esférica hasta que se vuelven a adherir. En el caso de las células con morfología linfoblástica, éstas crecen en suspensión, lo que ofrece mayores ventajas para la propagación celular (Verma, 2013). Si bien de forma característica las líneas celulares con requerimiento de anclaje a superficies crecen de forma adherente, tras un periodo de adaptación, algunas poseen la propiedad de crecer en suspensión (Gili et al., 2016). Cultivos primarios Se denominan cultivos primarios aquellos que han sido establecidos directamente a partir de un tejido con células que conservan sus características originales con proliferación limitada. Se caracterizan por estar constituidos por diferentes tipos de células que mantienen una morfología característica del tejido del cual fueron aisladas, con un número diploide de cromosomas y por presentar quiescencia, es decir, ausencia de división pero con la capacidad de reingresar al ciclo celular y reanudar la proliferación en respuesta a ciertos estímulos (Aguayo, Montalvo, Jara, Vélez, Velarde y Vélez, 2020) Cultivos secundarios Un cultivo primario al ser pasado a un nuevo recipiente para su desarrollo, es decir, al ser subcultivado, da paso a un cultivo secundario, el cual se desarrollará sobre la superficie del recipiente formando una monocapa hasta alcanzar confluencia, entendiendo por confluencia el momento en el que las células abarcan toda la superficie del recipiente o bien, estén en contacto con otras, lo que detendrá temporalmente su proliferación. De forma general, estos cultivos poseen un único tipo celular, homogéneo genéticamente (Gili et al., 2016). Al ser subcultivadas continuamente, las células mostrarán propiedades características de su origen, como son la secreción de colágeno, desarrollo de prolongaciones, fusión en fibras, sin embargo, después de cierta cantidad de divisiones, la cual será dependiente del tipo celular, las células alcanzarán la senescencia celular, dejando de dividirse (Segretin, 2002). Línea celular Una línea celular corresponde al establecimiento de células animales provenientes de cultivos celulares primarios, que pueden ser propagadas repetidamente. Las líneas celulares pueden ser divididas en finitas, con un número limitado de subdivisiones celulares; e inmortalizadas, células transformadas que pueden presentar aneuploidía o heteroploidía, además de propiedades de crecimiento alteradas (Verma, 2013). A estas células inmortalizadas se les ha forzado a seguir codificando el gen de la telomerasa -para evitar el acortamiento de telómeros- y/o se les han inactivado los mecanismos de frenado de división celular denominados check-points introduciendo ciertos oncogenes obtenidos de virus (Segretin, 2002). Hibridomas Los hibridomas son líneas celulares resultantes de la fusión de dos tipos celulares: una célula B productora TEQUIO, septiembre-diciembre 2022, vol. 5, no. 16 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD)/Durán- 63 Gutiérrez, Reyes-López, Chávez-Granados & García-Contreras/59–70 de anticuerpos de vida corta y una célula de mieloma inmortal. Estos hibridomas son propagados como clones individuales, y cada uno de ellos expresa constitutivamente una gran cantidad de un anticuerpo monoclonal (mAb) específico. El proceso de generación de hibridomas aprovecha la capacidad natural de un animal hospedero para generar anticuerpos altamente específicos (Parray et al., 2020) que reconocen un único epítope antigénico (es decir, una pequeña porción de una proteína). Una de las mayores ventajas de los hibridomas, en comparación con los cultivos clonales de linfocitos B, es que pueden ser sometidos a proliferación de manera indefinida (Segretin, 2002). Uso de cultivos primarios vs líneas celulares en odontología Es ampliamente aceptado que los datos que se pueden obtener de cultivos primarios son una fuente importante en el estudio de interacciones fisiológicas. La experimentación en estos cultivos permite una evaluación más profunda de las funciones celulares de proteínas y enzimas -entre otras moléculas- modificando y comparando rutas metabólicas y de regulación, estableciendo con mayor precisión el efecto fisiológico de un compuesto; sin embargo, en la mayoría de los laboratorios, al no tener acceso a muestras de tejidos o a los recursos necesarios para el establecimiento de un cultivo primario, existe la necesidad de utilizar líneas celulares bajo el riesgo de presencia de mutaciones y anormalidades cromosómicas. Si bien las líneas celulares presentan la ventaja de alcanzar una mayor densidad celular en cultivo, así como el potencial de ser cultivadas en suspensión y su amplio uso en el desarrollo de vacunas, proteínas terapéuticas y agentes farmacéuticos, también es cierto que las mayores desventajas de estos cultivos son la inestabilidad cromosómica, variación fenotípica e incluso cambios en marcadores tisulares específicos (Verma, 2013). Una gran ventaja en el área odontológica es que en diversas ocasiones existe la oportunidad de poder tomar biopsias de tejido, estableciendo un cultivo primario definido para un(a) paciente, lo que permite la evaluación de tratamientos específicos. Si bien se deben considerar factores como las variaciones en el genotipo, edad y raza, entre otros; también es cierto que la principal desventaja es la pericia requerida con el manejo de la muestra para establecer el cultivo primario, así como las condiciones de cultivo seleccionadas; por lo que en cualquier condición se deben tener protocolos estandarizados, incluyendo reactivos utilizados, para garantizar la reproducción de los resultados obtenidos, así como la reconciliación y comparación con los resultados encontrados en otros grupos de estudio (Gili et al., 2016). Principales contaminantes en cultivos celulares Los contaminantes, tanto biológicos como químicos, pueden tener un impacto negativo en los cultivos celulares, generando desde cambios menores en morfología y rango de crecimiento, hasta mutaciones y destrucción del cultivo. Los contaminantes biológicos incluyen a los virus, bacterias y hongos, los cuales son introducidos por técnicas de asepsia incorrectas, uso de reactivos contaminados o una esterilización de consumibles inadecuada. por su parte, los contaminantes químicos engloban residuos de detergentes, radicales libres, metales pesados, entre otros, habitualmente relacionados con un manejo inadecuado de las fuentes de reactivos y consumibles utilizados para el cultivo celular (Nims y Price, 2017). Estrategias para mitigar el riesgo de contaminación biológica Si bien algunos contaminantes biológicos resultan en cambios en la viabilidad y apariencia celular, en los casos de contaminación con virus o bajos niveles de bacterias u hongos no habrá cambios detectables visualmente, lo que TEQUIO, septiembre-diciembre 2022, vol. 5, no. 16 64 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD)/Durán- Gutiérrez, Reyes-López, Chávez-Granados & García-Contreras/59–70 es un gran riesgo para el cultivo y sus aplicaciones. Es por ello que debe llevarse a cabo una rutina de revisión al microscopio que permita la detección temprana de agentes contaminantes, así como el uso de medios de cultivo con indicador de pH que mostrarán una rápida acidificación del medio en caso de contaminación bacteriana (viraje de rojo de fenol a amarillo); o una alcalinización, en caso de contaminación por levaduras (viraje de rojo a rosa- morado). La mitigación de riesgo de contaminación asociada a agentes infecciosos se logra al llevar a cabo los siguientes puntos: a) Obtención de stock celular certificado como libre de contaminantes siempre que sea posible; b) Uso de reactivos que han sido tratados para lograr la reducción de patógenos; c) Uso de sanitizante o alcohol al 70% para limpiar botellas o consumibles inmediatamente antes de su acomodo en la campana; d) Realizar ensayos celulares periódicamente para evaluar la posible presencia de agentes infecciosos y e) Llevar a cabo todas y cada una de las buenas prácticas de cultivo celular (Nims y Price, 2017). Al manejar cultivos celulares es importante mantener en mente los elementos esenciales que forman parte de las buenas prácticas de cultivo celular, que van desde la disponibilidad de un espacio adecuado para el manejo de los cultivos, con un área de trabajo estéril (Freshney, 2016), incubadora específica -para cultivos de células de mamífero, para mantenimiento de temperatura y atmósfera-, selección del cultivo primario o línea celular adecuados para los objetivos propuestos, selección de medios de cultivo recomendados por tipo celular, así como su suplementación, hasta la capacitación del personal para disminuir el riesgo de contaminación tanto de los cultivos como de la persona encargada de su manejo (Coecke et al., 2005). Estrategias para mitigar el riesgo de contaminación química Las fuentes de contaminación química más frecuentes involucran el agua utilizada para la preparación de buffers, así como la presencia de endotoxinas en soluciones o materiales consumibles, por lo que este tipo de contaminación es indicativo de un mal manejo o de una fuente inadecuada de los agentes utilizados para los cultivos celulares. Si bien este tipo de contaminación ha disminuido con la introducción de reactivos y consumibles estériles listos para usar, aún existen medidas que deben ser tomadas en cuenta antes, durante y después del manejo de los cultivos celulares (Nims y Price, 2017). Dentro de estas medidas se consideran usar reactivos con certificado de análisis que indique los niveles de endotoxinas para ese lote. Algunos reactivos denominados estériles están libres de LPS (lipopolisacáridos), sin embargo, pueden poseer concentraciones altas de endotoxinas. Se debe considerar que dosis de 1000 a 5000 unidades de endotoxina (UE) por pozo presentan un leve efecto mitogénico en algunas líneas celulares, 10000 UE afectan la proliferación y viabilidad celular (Butash, Natarajan, Young y Fox, 2000). En el caso de los medios de cultivo, los suplementados con suero poseen propiedades antioxidantes y antiradicales libres, por lo que, en caso de trabajar con medios libres de suero o libres de proteínas se debe garantizar la presencia de agentes con propiedades antioxidantes como son el Selenio o las vitaminas A, C y E. De igual forma, se debe evaluar la presencia de metales que puedan resultar tóxicos para las células, particularmente en el agua utilizada como diluyente para constituir medios de cultivo en polvo o para la preparación de buffers (Nims y Price, 2017). Un punto importante en la suplementación de los medios de cultivo es el uso de antibióticos, sin embargo, mientras que su presencia es efectiva contra bacterias, también poseen el potencial de causar efectos tóxicos en células de mamífero. El uso de antibióticos debe estar enfocado en dos áreas primordiales que son: la protección contra contaminación por agentes biológicos y la selección de clonas recombinantes con determinados genes de TEQUIO, septiembre-diciembre 2022, vol. 5, no. 16 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD)/Durán- 65 Gutiérrez, Reyes-López, Chávez-Granados & García-Contreras/59–70 resistencia a antibióticos, siendo importante en ambos puntos evitar exceder la dosis recomendada para disminuir el riesgo de efectos citotóxicos (Coecke et al., 2005). Finalmente, los reactivos utilizados para la limpieza de la campana o para fijación celular pueden resultar contaminantes en los cultivos. Dependiendo del solvente utilizado será la persistencia que tenga en la incubadora, así como la toxicidad celular que pueda causar, por lo que es recomendado evitar, en la medida de lo posible, solventes con alta capacidad de formación de vapores residuales como el formaldehído (Nims y Price, 2017). Células troncales humanas (hDPSC) Las hDPSC -células troncales de la pulpa dental humana, por sus siglas en inglés- representan células troncales mesenquimales, obtenidas de un tejido adulto, con capacidad de autorrenovación y diferenciación en diferentes linajes como son: osteoblastos, neuroblastos y condrocitos. Si bien aún se desconoce el origen estas células, se sabe que comparten un perfil de expresión génica similar a las células troncales mesenquimales de médula ósea y que su expresión de los marcadores CD146+ y STRO-1+ indican que se localizan en la región perivascular de la pulpa (Romero et al., 2014). Un aspecto importante de estas células es su potencial para producir tejidos dentales in vivo, incluyendo la dentina, la pulpa dental y las estructuras de la corona, teniendo, por tanto, un alto potencial terapéutico (Yu et al., 2006). Cannabidiol El término cannabinoides hace referencia a tres grupos de compuestos: endógenos, sintéticos y fitocannabinoides (Campos, Araújo, Villela, Aparecida y Silveira, 2012). El cannabidiol (CBD) es un fitocannabinoide no psicotrópico derivado de Cannabis sativa, que representa hasta el 40% del extracto de cannabis (Fernández et al., 2013). El CBD ha exhibido propiedades ansiolíticas, antidepresivas, anti-inflamatorias, antieméticas e inmunomoduladoras en diversos modelos animales y humanos, por lo que se le ha asociado con efectos terapéuticos neuroprotectores en condiciones neurodegenerativas y de isquemia, así como en desórdenes neuropsiquiátricos como son ansiedad, psicosis, enfermedad de Huntington, Alzheimer, Parkinson y depresión (Campos, Fogaça, Sonego y Guimarães, 2016). En el caso de la aplicación de CBD en odontología, se han reportado efectos antiinflamatorios con la administración de CBD en cutivos de células orales, así como una disminución en la producción de especies reactivas de oxígeno dosis dependiente (Pagano et al., 2020). Las propiedades terapéuticas del CBD no parecen estar relacionadas con la activación del sistema endocannabinoide, al tener una actividad desestimable en los receptores cannabinoides CB1 y CB2, por lo que, de forma general, se asume que su actividad farmacológica está relacionada con sus propiedades químicas; sin embargo, para ciertas enfermedades, el CBD ha mostrado efectos directos e indirectos sobre el receptor de CB2 a través de la inhibición de mecanismos de inactivación de endocannabinoides y por la activación directa e indirecta de receptores metabotrópicos para serotonina y adenosina, ejerciendo así una acción moduladora sobre la transmisión sináptica (Fernández et al., 2013). Dados los efectos asociados con el CBD, principalmente los relacionados con propiedades anti-inflamatorias e inmunomoduladoras, así como la existencia de pocos estudios relacionados con pruebas de citotoxicidad; se realizó un estudio piloto para evaluar el impacto biológico del CBD en un cultivo de células hDPSC, buscando destacar su potencial uso terapéutico en odontología. TEQUIO, septiembre-diciembre 2022, vol. 5, no. 16 66 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD)/Durán- Gutiérrez, Reyes-López, Chávez-Granados & García-Contreras/59–70 Materiales y métodos El aceite de CBD (Hemp Oil Cannabis sativa without THC) se obtuvo de la empresa Green Lotus Hemp en Denver, Colorado, EE. UU. Las células hDPSC fueron obtenidas a partir de tejido pulpar y cultivadas en medio MEM (Sigma- Aldrich), suplementado con suero fetal bovino (SFB, Sigma-Aldrich) al 10 %, 100 UI de Penicilina G y 100 µg/mL de sulfato de estreptomicina (Sigma-Aldrich), a 37 °C, 5 % de CO2 hasta confluencia celular. 24 horas antes del tratamiento las células fueron subcultivadas en platos de 96 pocillos utilizando 0,25 % de tripsina-0,025 % EDTA (Sigma-Aldrich) para desprendimiento enzimático para el ensayo de citotoxicidad. Ensayo de actividad citotóxica Se inocularon 2x105 célula/mL de hDPSC en una placa de 96 pozos y se incubaron durante 48 h para su adecuada confluencia. Posteriormente, se añadió el aceite de CBD a una dosis máxima de 2 mg/mL con diluciones subsecuentes para las dosis de 0-2 mg/mL, dejando incubar por 48 horas a 37 °C, 5 % de CO2, tras lo cual se determinó el número relativo de células viables por el método de colorimetría rápida de MTT (Sigma-Aldrich). Ensayo de viabilidad celular El medio de cultivo fue reemplazado por medio MEM (Sigma-Aldrich) con 0.2 mg/mL de MTT y las células fueron incubadas por 7 horas a 37 ˚C, 5 % de CO2. Inicialmente, este compuesto presenta una coloración amarilla que cambia a morada indicando la reducción de MTT a formazán dada por las células viables presentes en la placa. El producto formazán se disolvió con DMSO (Karal, León, Guanajuato, México) y la absorción del lisado se determinó a 570 nm usando un espectrofotómetro para microplacas Multiskan (MultiSkan Go, ThermoScientific, Helsinki, Finlandia). La concentración citotóxica media (CC50) se determinó a partir de la curva dosis-respuesta. Análisis estadístico. Los datos se expresaron en porcentajes como la media muestral y desviación standard (SD). El análisis estadístico se realizó mediante una prueba de Tukey post-hoc de ANOVA usando el programa Origin Pro 2021b (OriginLab) y Real Statistics Using Excel. Se consideraron diferencias estadísticamente significativas aquellas con un valor de p50 % en la viabilidad celular. Este efecto podría estar relacionado con un aumento del Ca2+ mitocondrial, lo que conduce a disfunción mitocondrial y muerte celular (Olivas-Aguirre et al., 2019). Cuadro 1. Porcentaje de células viables a 48 horas de incubación con dosis variables de CBD. Dosis de % de Células CBD (mg/ viables mL) 100 0 100 0.016 93.852 0.032 89.331 0.062 89.052 0.126 88.233 0.25 85.582 0.5 67.519 1 32.376 2 Fuente: Elaboración propia a partir de los ensayos de MTT realizados. Figura 1. Ensayo de MTT. Viabilidad celular de hDPSC tras 48 horas de incubación con diferentes concentraciones CBD (0 a 2 mg/mL). La viabilidad fue determinada por ensayo de MTT. CC50 = 1.5 mg/mL. Fuente: Elaboración propia TEQUIO, septiembre-diciembre 2022, vol. 5, no. 16 68 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD)/Durán- Gutiérrez, Reyes-López, Chávez-Granados & García-Contreras/59–70 Figura 2. Ensayo de MTT. Viabilidad celular de hDPSC tras 48 horas de incubación con dosis variables de CBD (0 a 2mg/mL). Las dosis en el rango de 0.016 a 0.5 mg/mL no son citotóxicas, la dosis de 1 mg/mL es ligeramente citotóxica y la correspondiente a 2 mg/mL de CBD es moderadamente citotóxica. ** Diferencias estadísticamente significativas en la viabilidad celular en comparación con el grupo control. Fuente: Elaboración propia. Cabe resaltar que los resultados obtenidos son específicos para las hDPSC y que la evaluación de citotoxicidad para otros cultivos primarios o líneas celulares debe llevarse a cabo para determinar el efecto particular que pueda poseer el CBD. En general, el CBD tiene un efecto sobre la viabilidad celular de manera dosis-dependiente. Existen reportes de líneas celulares tumorales donde el CBD induce un efecto citotóxico a dosis menores de las observadas en este estudio, por lo que existe una clara dependencia del tipo celular con las propiedades que mostrará el CBD. También se ha observado una disminución en la viabilidad celular en cultivos de células normales humanas a dosis mayores de 2 µM (Pagano et al., 2020), mientras que en el caso particular de cultivos de células estromales mesenquimales de origen gingival humanas (hGMSC) la disminución en la viabilidad celular dada por el CBD se observó con dosis mayores a 10 µM (Soundara et al., 2017). En este ensayo se encontró una disminución en la viabilidad celular de las hDPSC a concentraciones mayores de 5 µM. Por otro lado, también se ha reportado una asociación entre la citotoxicidad de CBD y la suplementación del medio utilizado con SFB al 0.5 y 10 % (Sainz, Müller y Espel et al., 2020); por lo que un siguiente paso será la evaluación de citotoxicidad del CBD en células hDPSC con medio con deprivación de suero. Si bien se ha descrito que las dosis bajas de CBD en algunas poblaciones celulares pueden inducir la proliferación celular (Aguirre et al., 2019) por un incremento limitado del Ca2+ mitocondrial, que conduce a una aceleración del metabolismo debido a la dependencia de Ca2+ de las enzimas del ciclo de Krebs (Denton, 2009); en este estudio no se encontraron diferencias estadísticamente significativas que indicaran un aumento en la proliferación de las hDPSC. Esto podría suponer una ventaja a evaluarse en el uso del CBD como terapia coadyuvante, ya que si bien una de las características de las células troncales es su capacidad de proliferación, un aumento desmedido en la misma se podría relacionar con patologías de tipo proliferativo (Pagano et al., 2020). TEQUIO, septiembre-diciembre 2022, vol. 5, no. 16 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD)/Durán- 69 Gutiérrez, Reyes-López, Chávez-Granados & García-Contreras/59–70 El efecto de una droga/fármaco puede ser evaluado de forma efectiva in vitro en condiciones experimentales establecidas; sin embargo, una vez que se adiciona más de una variable a un ensayo, los resultados obtenidos no podrán ser asociados únicamente al efecto del fármaco evaluado, por lo que, habiendo tenido un primer acercamiento al impacto del CBD sobre la viabilidad celular de las hDPSC y determinado que dosis menores a 0.5 mg/mL pueden ser utilizadas de forma segura al no resultar citotóxicas, se puede continuar con la evaluación del CBD y su posible efecto terapéutico y uso odontológico como terapia coadyuvante aplicada en regeneración de tejidos. Conclusiones Las condiciones de cultivo apropiadas son determinantes en el desarrollo y supervivencia celular, sin embargo, no siempre se detallan con precisión las condiciones de cultivo utilizadas, lo que impacta en la reproducibilidad de estudios y resultados reportados. Para mitigar los riesgos de error relacionados con los cultivos celulares, es vital seguir una normativa de buenas prácticas en el manejo del cultivo celular, así como llevar a cabo análisis de los reactivos utilizados para garantizar que estén libres de contaminantes. El uso de las hDPSC se considera una estrategia prometedora en el área odontológica debido a la accesibilidad para la toma de muestra y establecimiento de cultivo, además de sus propiedades de regeneración, donde resalta la formación de dentina a una velocidad superior en comparación con la observada en células troncales no dentales, lo que hace que sean más competentes en ingeniería de tejidos dentales. La determinación del impacto del CBD sobre la viabilidad celular de las hDPSC, así como de las dosis a las cuales este compuesto puede ser utilizado sin efectos citotóxicos, resultan un paso vital para continuar con la evaluación in vitro del posible efecto terapéutico del CBD, determinando así su posible uso como terapia coadyuvante en el área odontológica. Referencias 1. Aguayo Moscoso, S. X., Montalvo Villagómez, M. P., Jara González, F. E., Vélez Páez, P. A., Velarde Montero, C. G., & Vélez Páez, J. L. (2020). Quiescencia y senescencia : Enfoque traslacional al paciente oncológico y críticamente enfermo. Revista Científica Digital INSPILIP, 4, 1–23. https://doi.org/10.31790/inspilip.v4i1.96. g171 2. Butash, K. A., Natarajan, P., Young, A., & Fox, D. K. (2000). Reexamination of the effect of endotoxin on cell proliferation and transfection efficiency. BioTechniques, 29(3), 610–619. https://doi. org/10.2144/00293rr04 3. Campos, Alline C., Fogaça, M. V., Sonego, A. B., & Guimarães, F. S. (2016). Cannabidiol, neuroprotection and neuropsychiatric disorders. Pharmacological Research, 112, 119–127. https://doi.org/10.1016/j. phrs.2016.01.033 4. Campos, Alline Cristina, Moreira, F. A., Gomes, F. V., del Bel, E. A., & Guimarães, F. S. (2012). Multiple mechanisms involved in the large-spectrum therapeutic potential of cannabidiol in psychiatric disorders. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 367(1607), 3364–3378. https://doi. org/10.1098/rstb.2011.0389 5. Coecke, S., Balls, M., Bowe, G., Davis, J., Gstraunthaler, G., Hartung, T., Hay, R., Merten, O. W., Price, A., Schechtman, L., Stacey, G., & Stokes, W. (2005). Guidance on good cell culture practice: A Report of the Second ECVAM Task Force on good cell culture practice. ATLA Alternatives to Laboratory Animals, 33(3), 261–287. https://doi.org/10.1177/026119290503300313 6. Denton, R. M. (2009). Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics, 1787(11), 1309–1316. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2009.01.005 TEQUIO, septiembre-diciembre 2022, vol. 5, no. 16 70 Importancia de los cultivos celulares. Optimización de un ensayo para evaluar el impacto biológico del cannabidiol (CBD)/Durán- Gutiérrez, Reyes-López, Chávez-Granados & García-Contreras/59–70 7. Fernández-Ruiz, J., Sagredo, O., Pazos, M. R., García, C., Pertwee, R., Mechoulam, R., & Martínez-Orgado, J. (2013). Cannabidiol for neurodegenerative disorders: Important new clinical applications for this phytocannabinoid? British Journal of Clinical Pharmacology, 75(2), 323–333. https://doi.org/10.1111/j.1365- 2125.2012.04341.x 8. Freshney, R. I. (2016). Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. (A. Capes-Davis, C. Gregory, & Stefan Przyborski (eds.); Seventh Ed). Wiley Blackwell. 9. Gili, M. A., Aguirre, M. V., Segovia, M., Lezcano, M. R., & Almirón, M. S. (2016). Aplicaciones del cultivo celular en odontología. Rev. Ateneo Argent. Odontol, 55(1), 49–53. http://es 10. Harrison, R. G. (1907). Observations on the living developing nerve fiber. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 4(1), 140–143. https://doi.org/10.3181/00379727-4-98 11. Nims, R. W., & Price, P. J. (2017). Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal, 53(10), 872–879. https://doi.org/10.1007/ s11626-017-0203-9 12. Olivas-Aguirre, M., Torres-López, L., Valle-Reyes, J. S., Hernández-Cruz, A., Pottosin, I., & Dobrovinskaya, O. (2019). Cannabidiol directly targets mitochondria and disturbs calcium homeostasis in acute lymphoblastic leukemia. Cell Death and Disease, 10(10). https://doi.org/10.1038/s41419-019-2024-0 13. Pagano, S., Coniglio, M., Valenti, C., Federici, M. I., Lombardo, G., Cianetti, S., & Marinucci, L. (2020). Biological effects of Cannabidiol on normal human healthy cell populations: Systematic review of the literature. Biomedicine and Pharmacotherapy, 132, 110728. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2020.110728 14. Parray, H. A., Shukla, S., Samal, S., Shrivastava, T., & Ahmed, S. (2020). Hybridoma technology a versatile method for isolation of monoclonal antibodies, its applicability across species, limitations, advancement and future perspectives. International Immunopharmacology, January. https://doi.org/10.1016/j. intimp.2020.106639 15. Romero, S., Córdoba, K., Valbuena, C. A. M., Quintero, J. G. G., Riveros, J. Y. D., Carlos, J., & Niño, M. (2014). Marcadores candidatos, estrategias de cultivo y perspectivas de las DPSCs como terapia celular en odontología. 18, 156–163. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/S1870-199X(14)72065-8 16. Sainz-Cort, A., Müller-Sánchez, C., & Espel, E. (2020). Anti-proliferative and cytotoxic effect of cannabidiol on human cancer cell lines in presence of serum. BMC Research Notes, 13(1), 1–6. https://doi.org/10.1186/ s13104-020-05229-5 17. Segretin, M. (2002). Los cultivos celulares y sus aplicaciones I (cultivos de celulas animales). ArgenBio, 1–6. 18. Soundara Rajan, T., Giacoppo, S., Scionti, D., Diomede, F., Grassi, G., Pollastro, F., Piattelli, A., Bramanti, P., Mazzon, E., & Trubiani, O. (2017). Cannabidiol Activates Neuronal Precursor Genes in Human Gingival Mesenchymal Stromal Cells. Journal of Cellular Biochemistry, 118(6), 1531–1546. https://doi.org/10.1002/ jcb.25815 19. Tavira Montalván, C. A., Ortega García, A., Dávila González, I., Estrada Mondaca, S., & Meneses Acosta, A. (2009). Alcances y perspectivas del cultivo de células animales en la biotecnología farmacéutica Animal cell culture in pharmaceutical biotechnology : research and perspectives. Revista Mexicana de Ciencias Farmacéuticas, 40(4), 35–46. www.redalyc.org 20. Ulrich, A. B., & Pour, P. M. (2013). Cell Lines. In Brenner’s Encyclopedia of Genetics: Second Edition (Vol. 1). Elsevier Inc. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-374984-0.00212-6 21. Verma, A. (2013). Animal Tissue Culture: Principles and Applications. In Animal Biotechnology: Models in Discovery and Translation. Elsevier. https://doi.org/10.1016/B978-0-12-416002-6.00012-2 22. Yu, J., Deng, Z., Shi, J., Zhai, H., Nie, X., Zhuang, H., Li, Y., & Jin, Y. (2006). Differentiation of dental pulp stem cells into regular-shaped dentin-pulp complex induced by tooth germ cell conditioned medium. Tissue Engineering, 12(11), 3097–3105. https://doi.org/10.1089/ten.2006.12.3097 TEQUIO, septiembre-diciembre 2022, vol. 5, no. 16 View publication stats