Biotechnológia - Irányítás, Szabályzás és Bioszenzorok (PDF)

Biotechnológia Irányítás, szabályzás Bioszenzorok  Fermentor típusok Batch – A fermentáció elején a szubsztrátot bevisszük, a fermentáció addig zajlik, ameddig ez el nem fogy – Szubsztrát, termék gátlás felléphet...

Biotechnológia Irányítás, szabályzás Bioszenzorok  Fermentor típusok Batch – A fermentáció elején a szubsztrátot bevisszük, a fermentáció addig zajlik, ameddig ez el nem fogy – Szubsztrát, termék gátlás felléphet Fed batch – A szubsztrátot szakaszosan adagoljuk a fermentáció ideje alatt – Szubsztrát gátlás nincs (ha pl. metanol, etanol, ecetsav-a szubsztrát ez előnyös, mivel ezek az anyagok nagy mennyiségben toxikusak ) – Katabolit represszió nincs Folyamatos – A szubsztrát bevitele és a fermentációs maradék eltávolítása folyamatos – Nincs szubsztrát és termék gátlás https://www.easybiologyclass.com/industrial-fermentation-process- batch-fed-batch-and-continuous-fermentation/  Biomassza növekedése Számlálás – Mikroszkóp segítségével, bürker kamrával – Lemezelés (CFU) – Coulter számláló Elektrolit: jó vezető, szilárd partikulum: ellenállás Méret meghatározásra is alkalmas Coulter számláló Bürker kamra coulter counter Biomassza növekedése  Flow citometria és FACS (fluorescence activated cell sorting) Sejtek szuszpenzióban Lamináris áramlás: hidrodinamikai fokuszálás Fényszórás, fluoreszcens jelölés 100 ezer sejt / másodperc Fényszórás mértéke: sejtméret Élő sejtek törésmutatója eltért a halottól: élő-élettelen elkülönítése Piezoelektromos kristály: elektromos feszültség hatására alakváltozás: váltakozó feszültség rákapcsolása rezgést eredményez Folyadékoszlop cseppekre bomlik Alpopulációk definiálása Folyadékcseppek feltöltése Szeparálási sebesség mintegy 3000–5000 sejt/s  Biomassza növekedésének nyomon követése Sejttömeg mérése – Száraz súly meghatározása Szárítószekrényben – Nedves súly meghatározása Lecentrifugáljuk a sejteket – Turbiditás mérése Spektrofotométerrel – Image analízis Digitális kamerával lefotózzuk a mikroszkóp alatti sejtkultúrát Software számolja a sejteket  Biomassza növekedése Metabolikus aktivitás mérése – Minél több a sejt annál több hő termelődik (pl. hűtővíz igény alapján) – Elektromos paraméterek mérése Fermentációs folyadék elektromos vezetőképességének meghatározása: minél több a sejt annál alacsonyabb – Fluoreszcencia mérése A sejteket festhetjük fluoreszcensen, minél erősebb a fluoreszcencia annál több sejtünk van  Szaporodást befolyásoló paraméterek Hőmérséklet – mérése: hőmérő termisztor (ellenállása a hőmérséklet növekedésre vagy csökkenésre változik): kis méret, nagy érzékenység, gyors hőváltozások nyomon követése lehetséges Pl: ezüst-szulfid pH – mérése: pH elektród Referenciaoldat pH-ja fix két oldal között kialakuló H+ koncentráció aránya csak a külső (minta) oldattérben lévő H+ koncentrációtól függ potenciálkülönbség a minta hirdogén-ion koncentrációjával lesz arányos  Szaporodást befolyásoló paraméterek Szabad víz Mechanikai hatások – Keverő nyíró hatás – Biofilm  A biofilmek kialakulásának előnyei Védekezés: Flokkulumokban élő szervezetek sokkal jobban viselik környezetük változásait (pl. időszakos tápanyaghiányt, pH változások, antimikrobiális ágensek. Közösségi lét: Metabolikus terhek megosztása (pl. xenobiotikumok kometabolizmusa) vagy a géntranszfer lehetősége. Biofilm vagy flokkulum, mint alap életforma: Számos mikroorganizmusnak ez az elsődleges életformája, számukra a szuszpenzált állapot csupán kedvezőtlen időszakokra jellemző.  A biofilmek kialakulása több fázisra osztható  Indukciós fázis alatt a felszínért való verseny játszódik le. Az indukciós fázist egy visszafordítható folyamat a mikrobikus sejtek hozzákapcsolása indítja el (elsődleges adhézió).  Irreverzibilis kötődés: EPS termelés megindul (barrier közeg, védelmet nyújt), sejtek szaporodása lassul (korlátozott tápanyag diffúzió)  Logaritmikus fázisban a biofilm fejlődése a tapadó sejtek növekedésének köszönhető és ugyanakkor független a sejtek koncentrációjától a vízfázisban.  Plató fázis további sejtosztódással és a mikroorganizmusok új beépülésével, egy többé-kevésbé folyamatos biofilm alakul ki.  EPS: exopoliszaharidok 50-90%-a a biofilm szervesanyag tartalmának Mátrixképző anyag Szénhidrát, fehérje, nukleinsav alkotja Szénhidrátok: semleges vagy polianionos tulajdonságúak Kationok megkötése (kálcium, magnézium): keresztkötések elősegítése a láncok között Hidratált: hidrogén kötések, kiszáradás megakadályozása Mikrobák stabilitásának fenntartása: mérgező ágensek megkötése A biofilmek kialakulása több fázisra osztható  Biofilm vizsgálat Konfokális lézer szkenning mikroszkóp - hagyományos: mintát a fényforrás egyszerre világítja meg, mintáról szóródó fényt mind összegyűjti - fény minta egy adott síkjának egy pontjára - tárgypontból jövő kép éles - pásztázás a teljes minta megfigyeléséhez https://www.muszeroldal.hu/measurenotes/konfocal.pdf Konfokális lézer szkenning mikroszkóp  Biofilm vizsgálat - pásztázó, mechanikus tű Atom erő mikroszkóp - felület atomjai közötti erő mérése - piezoelektromos elven működő tű mozgatás: nagyon finom mozgások - max kb. 15x150 mikrométeres felület - nanométeres felbontás Atom erő mikroszkóp  Szubsztrát, termék mérése oldatban HPLC (high performance liquid chromatography) – Mozgó fázis pumpák – oszlop méret, ioncsere, hidrofób – detektor UV-VIS, törésmutató, vezetőképesség, fluoreszcencia, DAD  HPLC detektorok - UV- VIS (Ultribolya–látható spektrofotometriás) detektor - adott hullámhosszon fényelnyelés - ha nincs UV fényelnyelés kromofór csoport szükséges - Fluoreszcens detektor - választott hullámhosszúságú fénnyel megvilágítás - gerjesztés hatására fluoreszcencia jön létre - Specifikusak: kizárólag a vizsgálandó komponenst jelzi, kis koncentrációban  HPLC detektorok - Vezetőképesség detektor - oldat vezetőképességének detektálása - platina elektródok közötti ellenállás mérése - arányos az oldott anyag koncentrációval - RI detektor - átfolyó anyag törésmutatójának mérése - törésmutató változik, amennyiben a detektálási cella mintát tartalmaz - oldott anyag mennyiségével arányos  Szubsztrát, termék mérése gáz fázisban Gázkromatográf (GC) – vivőgáz – oszlop – detektor TCD (thermal conductivity detector) – Elektromosan fűtött szál – A vezető szál ellenállását mérjük, ami a hőmérsékletétől függ, ezt viszont az azt körülvevő gáz hővezetőképessége határozza meg. – Rosszabb hővezető képesség: szál kevébé hűl le FID (flame ionization detector) – A hidrogén lángban a szerves vegyületek lebomlanak és ionizálódnak, ezért a két elektród között a koncentrációval arányos áram fog folyni.  Szubsztrát, termék mérése gáz fázisban GC-MS detektor : MS ionizáló forrás elektronok a vizsgálandó gáz molekuláit ionizálják molekulákat akár alkotórészeikké bontják elektromos tér gyorsít mágneses tér eltérít ion tömeg szerint frakciók csúcsok megfelelnek egy-egy atomfajtának, molekula alkotórésznek  Szubsztrát, termék mérése: gázok Gáz áramlási sebesség mérése – Rotaméter áramlási sebesség hőmérséklet és nyomás függő – TMFM (thermal mass flow monitor) Fűtött szálat az áramló gáz hűti Tömegáram mérés nem függ hőmérséklettől és nyomástól  Bioszenzorok Felépítés: – Biológiai érzékelő – Jelátalakító – Mérőműszer Előnye: – Specifikus – Érzékeny Hátránya: – A biológiai komponens Érzékeny Instabil Bioszenzorok  Bioszenzorokkal szemben támasztott követelmények Specifikus Hosszú ideig stabil legyen Ne legyen érzékeny a fizikai, kémiai paraméterek változására Pontos, reprodukálható eredmények Lineáris a méréstartományon belül Olcsó, kis méretű, könnyen használható Mérések terepen  Bioszenzorok Kanári madár – Gyors anyagcsere – Érzékeny a környezetre – CH4, CO kimutatás  Indikátor szervezetek - jelenlétük/ hiányuk - nagyon érzékenyek - zuzmó (SO2) - csalán (talaj N )  Bioszenzorok - BOI Biológiai oxigén igény (BOI, BOD) – Gáznyomást mér Corg + O2 = CO2 NaOH + CO2 = NaCO3 + H2O – Mikróbák fogyasztják az O2-t – Fix hőmérsékleten – Kevertetés mellett – Toxikus anyagok gátolnak Kémiai oxigén igény (KOI, COD) – kálium-dikromáttal, KMnO4-val történő meghatározás  Bioszenzorok - elektrokémia elektromos jel Glükóz kimutatás Gyógyászatban Iparban Glükóz oxidáz az enzim  Bioszenzorok - Immunológia Human chorion gonadotropin (hCG) – Terhességi teszt polipeptid hormon petesejt beágyazódást indít – Ellenanyagok hCG ellen: szabadon mozgó enzimmel (festékkel) jelölt + rögzített (pozitív jelnél) anti-hCG ellen: negatív kontroll  Bioszenzorok - ELISA Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) – Általános ellenanyag kikötve – Antigén kötődik – Specifikus, antigén elleni ellenanyag kötődik – Anti-antigén másodlagos ellenanyag marker enzimmel, fluoreszcens festék jelölt – Színreakció  Bioszenzorok - PSR Plazmon felületi rezonancia (PSR) – Molekuláris kölcsönhatások vizsgálata – Vékony fémréteg (arany) – Fény reakcióba lép a fémrétegben található szabad elektronokkal: gerjeszti azokat (plazmon rezonancia): fény elnyelődik, intenzitása csökken – Erősítő és gyengítő rezonanciák – Hullámhossz és görbe eltolódásából mérjük a makromolekulák közötti kölcsönhatást  Bioszenzorok - QCM Kvarc kristály mikromérleg (QCM) – Piezoelektromos kvarc kristály – Molekulák lerakódása változtatja a rezgés frekvenciáját – Nagyon érzékeny a felületi lerakódásokra – Biológiai minta kis változását méri  Bioszenzorok – QCM Monoklonális ellenanyag QCM – Kábítószer hatóanyagok kimutatására – Nagyon Kis molekulákra is jó – Kimutatási idő: 1 perc  Bioszenzorok – DNS chip – Több ezer cella – génexpresszió vizsgálatában, mutációk kimutatásában és genetikai betegségek elemzésében – Hordozóra a “próba” rögzítve (oligonukleotidok), ezzel hibridizál a “target” – Gén expresszió változások (pl. betegség), mutációk kimutatása – Egy dimenzió: a target egyszer jelölt pl. radioaktívan – Két dimenzió: eltérő színű jelölések Expressziós mintázat Diagnosztikai értékű  Bioszenzor - fluoreszcencia Glükóz – glükóz a cukorkötő concanavalin A fehérjéhez kötődik – fluoreszcencia arányos a glükóz koncentrációval  Bioszenzor - fluoreszcencia Rekombináns élesztő – Trinitrotoluol (TNT) bontó enzim – Zöld fluoreszkáló fehérje (GFP) – Robbanóanyag kimutatásra  Bioszenzorok - jövő Biológia – Immunológia (10-12 M) vs. Enzim (10-6 M) – Stabilitás – Szerves oldószerben Detektorok – Kevésbé érzékeny, mint a biológia – On line – Méretcsökkentés