Genètica bacteriana PDF

Genètica bacteriana 1. Mutació....................................................................................................................................................... 2 2. Obtenció de soques mutants........................................................................................

Genètica bacteriana 1. Mutació....................................................................................................................................................... 2 2. Obtenció de soques mutants............................................................................................................. 6 3. Selecció de mutants.............................................................................................................................. 7 3.1. Cribatge............................................................................................................................... 7 Procediment......................................................................................................................... 8 Aplicacions............................................................................................................................. 8 3.2. Test d’AMES....................................................................................................................... 9 Procediment......................................................................................................................... 9 Interpretació dels resultats.............................................................................................. 9 Aplicacions 1. Nivells de regulació de l’expressió gènica........................................................................ 11 2. Teoria de l’operó (Jacob & Monod, 1961)......................................................................... 11 3. Operó lactosa (operó lac) Inducció................................................................................... 12 4. Operó triptòfan (operó Trp) Repressió/Atenuació............................................................ 13 5. Intercanvi del factor σ de la RNA polimerasa................................................................... 14 Transferència horitzontal de gens 1. Recombinació bacteriana................................................................................................... 16 2. Recombinació homologa replicativa................................................................................. 17 Transformació → transformació d’alguna cosa lliure Transformació artificial.......................................................................................................... 23 Inconvenients Conjugació............................................................................................................................... 24 1. Plasmidis............................................................................................................................. 26 1.1. Tipus............................................................................................................................ 27 1.2. Curat plasmidis............................................................................................................. 29 2. Procés conjugació.............................................................................................................. 29 3. Conjugació → Pilus............................................................................................................. 31 3.1. Conjugació interrompuda............................................................................................. 33 3.2. Variacions del model: soques F’ 1 Virus......................................................................................................................................... 35 1. Transducció → Virus........................................................................................................... 36 2. Transducció generalitzada................................................................................................. 37 3. Transducció especialitzada................................................................................................ 39 4. Inducció del cicle lític i excisió del profag.............................................................................. 41 5. Conceptes a tenir clars......................................................................................................... 42 Genètica bacteriana El genòfor (p.e., d’E. coli) Massa → 3.1 x 10⁹ g/mol Parells de bases → 3.8 x 103 pb (kb) Longitud → ~2 mm (3.1 x 109 g/mol x (660 g/mol)-1 x (0.34 nm) = 1.59x106 nm = 1.59 mm) Tots els procariotes son haploides, però poden tenir diverses còpies del genòfor E. coli (4 genòfors/cèl·lula), Desulfovibrio gigaris (9–17 genòfors/cèl·lula) n = número de còpies de gens que té un gen1 Hi ha plasmidis (un, pocs, molts) que codifiquen per certs gens Gràcies a les tècniques de seqüenciació massiva i al coneixement de les estructures del gens hem mapat (posició relativa en funció del genoma) els genomes complerts de la majoria de procariotes coneguts fins ara 1. Mutació En la replicació del genoma, l’objectiu principal és la fidelitat en la còpia: perpetuació de l’espècie! Depenent on hi hagi l’error, causaran errors més o menys greus. Les DNA polimerases (DNApol) han de copiar exactament el motlle i, si bé 1 Per aclarir, "n" es pot definir com el nombre de còpies d'un determinat gen en una cèl·lula. En bacteris, això pot variar en funció del tipus de gen i les condicions ambientals. Si necessites més informació sobre com s'expressen aquests gens o sobre la seva regulació, només cal que m'ho diguis! 2 s’equivoquen, poder corregir els errors. Normalment, les ADN polimerases tenen una taxa d’error de mutació de l’ordre de 10⁻ ⁸ per Kbp per ronda de replicació. Aquesta freqüència d’error es refereix a la incorporació incorrecta d'una base durant la síntesi de DNA. És important que l'enzim responsable de la síntesi de DNA minimitzi els errors possibles per assegurar la fidelitat de la replicació genètica En canvi, les RNApol tenen una taxa d’error molt més gran, de l’ordre de 10- 4–10-5. És més alta perquè l’informacio no pot variar massa (o no tant com el DNA),perquè acabaríem sense saber quin és el material genètic més existent (el que sobreviu més) VIRUS RNA ALTA MUTABILITAT!! Una mutació és un canvi heretable en la seqüència de bases del genoma d’un organisme. Canvi en els bases nitrogenades (substitució) Un mutant és el (micro)organisme que porta una (o vàries) mutacions en el seu genoma (genotip mutant). Ara bé, aquesta mutació pot ser observable o no a nivell fenotípic. Una soca mutant és aquella soca bacteriana que porta una o vàries mutacions en el seu genotip i, per tant, difereix genotípicament de la seva soca parental. Aquesta mutació potser o bé espontània o bé induïda Espontània → Error polimerasa. Radical de l’oxigen, radiació natural (UV, còsmica …) implicarà un major risc de mutació Induïda → existeix un agent causal (mutàgen) deliberat per a un resultat determinat ○ mutàgens físics Raigs X → macrolesions, trencament de doble cadena 3  Llum UV → dimerització de pirimides (CC, TT) (loop al DNA) i errors de reparació (DNAss lliure → SOS) ○ mutàgens químics → alteren l’estructura 3D del DNA agents intercalants → s’uneixen al DNA (Bromur d‘Etidi, taronja d’acridina), distorsió del mateix, diferent marc de lectura anàlegs de base → canvi a la base nitrogenada (5’-bromouracil, 2’-aminopurina) reaccionant → molècules que reaccionen amb el DNA causant canvis molt específics (transicions, transversions i desfase; p.e. agents alquilants, à. nitrós, hidroxilamina) Una mutació és un canvi heretable en la seqüència de bases del genoma d’un organisme. Aquesta, potser espontània (cap causa física o química, error) o induïda (existeix un agent causal (nitroso-Guanidina, UV,..)) El resultat és una progènie diferent al progenitor, és a dir, un mutant. Atenció: la selecció opera a nivell d’individu però l’evolució es dóna a nivell poblacional! Tot i que la mutació afecta a nivell individual, la visualització és en terme evolutius. La mutació pot ser un petit canvi o micro-lesió (SNP) 4  ○ desfasament del marc de lectura ○ Missense → Alteració en la funció ○ Silent → No afecta ○ Wild type → la tnene més de la meitat de la població ○ substitucions – sense/Non-sense → canviar una lletra per un altre implica que sigui inviable (STOP) o un gran canvi o macro-lesió ○ delecions ○ duplicacions ○ inversions ○ insercions ○ translocacions Les mutacions poden tenir diferents efectes: cap efecte: mutació Neutre Negatiu: l’error en la còpia altera un gen, inactivant-lo completament o 5  modificant negativament la seva activitat. En el pitjor dels casos, la mutació té un efecte letal, ja que la pèrdua d’activitat d’aquell gen fa inviable la cèl·lula, causant-li la mort, seria una mutació letal. Positiu: la mutació ha alterat un gen qualsevol i com a resultat, la proteïna ha millorat la seva funció (la que sigui) sota condicions ambientals presents o futures. Aquest canvi pot conferir un avantatge quan les condicions canvien, però no té perquè representar una avantatge immediat! Avantatge selectiu → Selecció → Creixement i replicació → Evolució Les alteracions al genotip poden ser: No Observables a nivell d’individu (mutacions silencioses o neutres): no provoquen canvi de fenotip. Observables: provoquen canvi de fenotip observable sota les condicions adients. De vegades es necessiten una sèrie de condicions (temperatura, nutrients específics, etc.) per què el canvi sigui realment visible. Ex: mutació en lacZ (lacZ–) Mutacions al fenotip: identifica un soca mutant en alguna funció, però no sabem on es localitza aquesta Protòtrof: soca parental, sense mutacions (genotip i fenotip salvatge). Creix bé sense requeriments nutricionals especials. Utilitza tot el que pot i sintetitza tot l’essencial pel seu creixement. Ho pot fer tot Auxòtrof: Mutant que presenta alguna deficiència pel que fa la síntesi (no puc sintetitzar) d’un determinat requeriment nutricional (p.e., síntesi d’aa: His–, Trp–, Arg–), sobretot Aa. ○ per cultivar aquests mutants hem de subministrar l’aa del qual són auxòtrofs perquè no poden sintetitzar-lo. Mutants d’utilització de nutrients: no poden utilitzar un determinat nutrient (ex: fonts de carboni diverses, p.e.: Glu–, Lac–, Man–). Auxòtrofs, de sucres. 6  ○ Tot i que en el medi de cultiu pot haver-hi Glucosa, Lactosa o Manitol com que el mutant no les pot utilitzar, haurem de complementar el medi amb una font de carboni alternativa. Exemples: His–: mutació desconeguda en un dels gens de l’operó histidina. El resultat és que el bacteri no pot sintetitzar histidina. Lac–: mutació en l’operó lactosa però no sabem on. El resultat és que el bacteri no pot utilitzar la lactosa. Strr o Strs: soca resistent (r) o sensible (s) a l’antibiòtic estreptomicina. Només observable en presència d’aquest antibiòtic! 2. Obtenció de soques mutants Depenent de com i quan s’expressin, tindrem un retard fenotípic (no podrem veure la mutació al moment) 3. Selecció de mutants Selecció vs. Cribratge2 2 Cribar → Estudiar per colònies indiviudals. Revisions sistemàtiques a un nombre gran de colònies (cal tenir en compte que han de ser cultius homogènis i selectius) 7 La cosa és quan se si la mutació varia el fenotip i quan podré seleccionar-lo? Algunes mutacions poden ser seleccionables, ja que confereixen algun avantatge selectiu al mutant (resistència a un antibiòtic). D’altres, en canvi, són no seleccionables, tot i que el canvi en el fenotip pot ser evident (pigmentació). Les mutacions seleccionables confereixen un avantatge sota determinades condicions ambientals (presencia d’un antibiòtic). Si encertem en les condicions, el mutant creixerà i reemplaçarà la soca parental. Això és la Selecció, ja que podem aïllar fàcilment el mutant d’entre bilions de bacteris salvatges. La gràcia del mètode és esbrinar quines condicions són les que afavoriran la selecció Un exemple de mutació no seleccionable és la pèrdua de pigmentació d’un bacteri pigmentat. Aquesta mutació no confereixen cap avantatge selectiu i per tant no podem seleccionar el mutant sota noves condicions ambientals. En aquest cas, l’única manera de seleccionar i identificar el mutant és una revisió sistemàtica i indiscriminada d’un nombre molt gran de cultius per intentar identificar la soca mutant. Aquest sistema d’identificació és el que es coneix com screening (cribratge, cribaje). 3.1. Cribatge Sembres en replica (replica plating) 8 La tècnica de siembra en rèplica o replica plating és un mètode per transferir colònies bacterianes o fúngiques d’una placa de cultiu a una altra mantenint la mateixa disposició de colònies. Això facilita fer proves sobre característiques específiques (com ara resistència a antibiòtics o capacitat de metabolitzar certs compostos) en múltiples plaques sense haver de replicar cada colònia manualment. Procediment Preparació de la placa original: Es cultiven bacteris o fongs en una placa mestra amb un medi de cultiu general. Transferència amb vellut: Es fa servir una peça de vellut estèril per pressionar suaument sobre la superfície de la placa original. Així, el vellut recull petites porcions de les colònies. Rèplica en noves plaques: Es pressiona la mateixa peça de vellut sobre noves plaques amb diferents medis de cultiu, transferint-hi les colònies en la mateixa disposició que la placa original. Incubació i anàlisi: Les noves plaques es deixen incubar per permetre el creixement de les colònies, i aleshores es comparen les colònies en diferents plaques per identificar aquelles amb les característiques desitjades o específiques Aplicacions 9  Selecció de mutants: Identificar mutants amb característiques específiques, com ara resistència a antibiòtics. Estudis de metabolisme: Verificar si algunes soques poden metabolitzar o sobreviure en un medi concret. Investigació de resistència: Analitzar les soques que poden sobreviure en medis que inhibeixen el creixement d’altres colònies. La tècnica és especialment útil en la investigació de característiques genètiques i metabòliques de microorganismes. Enriquiment directe: resistència a fags, a antibiòtics, prototròfia a algun nutrient, … Contraselecció (enriquiment indirecte): auxotròfia, font de C no metabolitzable, font de N no metabolitzable Alguns agents per a la contraselecció: penicil·lines → inhibeix l’activitat transpeptidasa, per tant mata les cèl·lules en creixement 8-azaguanina → un cop inncorporada a nivell de DNA, aquest no es transcriu nutrient radioactiu → mort per la incorporació del nutrient radioactiu privació de Timina → mort dels bacteris en creixement auxòtrofs per T, però no aquells que no creixen per culpa del procés de contraselecció Hi ha certes substàncies que poden induïr mutacions als orgaismes, i per tant, no es poden fer servir per segons quines coses. Per saber si es poden fer servir o no, fem servir: 3.2. Test d’AMES El test d’Ames és una prova bioquímica utilitzada per avaluar el potencial mutagènic (capacitat de causar mutacions genètiques) de diferents compostos químics. Es basa en bacteris específics amb mutacions conegudes que els impedeixen sintetitzar histidina, un aminoàcid essencial. Si el compost que es vol analitzar causa una 10 mutació en els bacteris, aquests podran sintetitzar histidina i créixer en un medi sense aquest aminoàcid. Procediment 1. Preparació de bacteris mutants: Es fa servir una soca mutant de Salmonella typhimurium o Escherichia coli que té una mutació en el gen responsable de la síntesi d’histidina (bacteris His-, histidina negativa). 2. Exposició al compost químic: Es col·loquen els bacteris en una placa de cultiu amb un medi deficient en histidina. També s'hi afegeix el compost que es vol estudiar. 3. Control amb activació metabòlica: Alguns compostos només es tornen mutagènics després de ser metabolitzats pel fetge; per tant, s’afegeix una mescla de fetge de rata per simular aquest procés en algunes mostres. 4. Incubació i observació del creixement: La placa es deixa incubar i després s’observa. Si el compost indueix mutacions, apareixeran colònies de bacteris que han recuperat la capacitat de sintetitzar histidina (His+). Interpretació dels resultats Positiu (mutagenicitat): Si es formen colònies en la placa amb el compost químic, significa que el compost ha induït una mutació en els bacteris i, per tant, pot ser potencialment mutagènic (l’acrilamida en cas que afegim Histidina amb acrilamida). Negatiu (no mutagènic): Si no hi ha creixement bacterià o és mínim, significa 11  que el compost no ha induït mutacions, i és poc probable que sigui mutagènic. Aplicacions El test d’Ames és molt utilitzat en toxicologia i indústria farmacèutica per: Avaluar la seguretat de nous fàrmacs o productes químics. Analitzar contaminants ambientals i altres substàncies exposades a humans. Aquest test és una eina valuosa per determinar possibles riscos cancerígens, ja que la mutagènicitat sovint es correlaciona amb la capacitat carcinogènica de les substàncies Regulació mutacions Resum El genòfor bacterià Els bacteris tenen un genoma en forma de genòfor circular. Exemple: E. coli té un genòfor de: ○ Massa: 3.1 x 10⁹ g/mol. ○ Longitud: ~2 mm. ○ Parells de bases (pb): 3.8 x 10³ kb. Tots els procariotes són haploides però poden tenir diverses còpies del genòfor (E. coli: 4 còpies, Desulfovibrio gigaris: 9-17 còpies). A més, poden contenir plasmidis (1 o més), que codifiquen gens addicionals. Mutació Definició: Canvi heretable en la seqüència del genoma, que pot ser espontani o induït. ○ Espontànies: Errors en la replicació (ex: radicals lliures, radiació UV). ○ Induïdes: Agents físics (raigs X, UV) o químics (agents intercalants, anàlegs de bases, reaccionants). Frequència d’errors: ○ ADN polimerases: ~10⁻ ⁸ errors/Kbp per replicació. ○ ARN polimerases: Major taxa d’error (~10⁻ ⁴ a 10⁻ ⁵). 12  Tipus de mutacions: ○ Micromutacions: Substitucions: Missense, Silent, Nonsense. Desfasaments del marc de lectura. ○ Macromutacions: Insercions, delecions, inversions, duplicacions, translocacions. Efectes de les mutacions 1. Neutres: No afecten el fenotip. 2. Negatius: Inactivació d’un gen, letalitat. 3. Positius: Milloren funcions en condicions específiques (avantatge selectiu → evolució). Soca mutant Protòtrof: Soca salvatge (sintetitza tot el necessari). Auxòtrof: Mutant deficient en la síntesi d’un component essencial (ex: His⁻ , Trp⁻ ). Mutants d’utilització de nutrients: Incapaços de metabolitzar un nutrient específic (Lac⁻ , Glu⁻ ). Selecció i cribratge de mutants 1. Selecció: Aïllar mutants amb avantatges selectius (ex: resistència a antibiòtics). 2. Cribratge (replica plating): Identificació sistemàtica de mutants amb diferències fenotípiques. Test d’Ames Prova per avaluar el potencial mutagènic d’un compost químic. Utilitza bacteris mutants (His⁻ ) en medi deficient en histidina: ○ Si el compost és mutagènic, apareixen colònies capaces de sintetitzar histidina (His⁺ ). Aplicacions: ○ Testar fàrmacs i contaminants. 13 ○ Identificar substàncies potencialment carcinògenes. 14 Genètica bacteriana II 1. Nivells de regulació de l’expressió gènica Mecanismes de control a tots els nivells de la expressió gènica Regulació de la transcripció proteïnes d’unió al DNA (teoria de l’operó) atenuació intercanvi del factor σ de la RNA polimerasa → permet una estabilitzacio de la polimerasa per treballar eficientment Hi ha tot un seguit de molècules indicadores de l’estat actual de l’organisme que actuaran d’efectors, alarmons 2. Teoria de l’operó (Jacob & Monod, 1961) Operó o unitat genètica funcional és un conjunt de gens relacionats amb una activitat determinada que es cotranscriuen en un sol mRNA i es troben sota el control d’un sol lloc regulador. Gens que s’expressen conjuntament i es comproten com una unitat d’expressió 15 coordinada Format per gens estructurals operador → punt d’unió de la proteïna reguladora regulador → codifica per la proteïna repressora gens/proteïnes inductores/repressores (actius o inactius segons el corepressor o inductor) 3. Operó lactosa (operó lac) Inducció Els gens de les vies catabòliques són generalment induïbles → Vies catabòliques Operó d’expressió gènica no-constitutiu (no s’expressen sempre, només quan sigui necessàri)i induïble quan no hi ha glucosa i si hi ha lactosa Inducció per transcripció dels gens implicats en l’us de Lactosa E. coli creixent en glucosa, no li calen els enzims d’altres sucres. Creixement diauxic (1er gluc, 2on lactosa o maltosa) 16 No hi ha lactosa: proteïna repressora activa i unida a lloc Operador no inducció operó lac Si hi ha lactosa: Lactosa + H20 –ß-gal–> alolactosa Inactivació proteïna repressora i lloc Operador “lliure” inducció operó lac Si hi ha glucosa: adenilciclasa inactivada => [cAMP] baixa CRP no s’uneix a lloc C no inducció operó lac Si no hi ha glucosa: adenilciclasa activada => [cAMP] alta CRP s’uneix a lloc C inducció operó lac 17  4. Operó triptòfan (operó Trp) Repressió/Atenuació Els gens de les vies anabòliques són generalment repressïbles → Vies anabòliques Reprimim l’expressió gèenica en presència de triptòfan i activada en absència de triptòfan. Control negatiu Codifica fins a 5 gens de la ruta de biosíntesi del Triptòfan, conté peptid leader que actua com a atenuador 18 No hi ha triptòfan: RNApol s’uneix al Promotor inducció operó Trp Si hi ha triptòfan: estat repressiu repressor unit a Trp s’uneix al Promotor, no hi ha unió RNApol no inducció operó Trp 5. Intercanvi del factor σ de la RNA polimerasa RNApol és una proteïna oligomèrica: 2 α, β, β’ i σ. Un cop unida a DNA i iniciada la transcripció, σ la s’allibera σ actua com a reconeixedora del Promotor E. coli, 1 σ B. subtilis, diverses σ, doncs hi ha diverses RNApol 19 Transferència horitzontal de gens Els microorganismes poden transferir-se material genètic? Si, però no en el sentit eucariota, no hi ha fusió de gàmetes Però si que hi ha transferència d’una part del material genètic d’una cèl·lula donadora (mascle) a una receptora (femella) formant un zigot incomplert o merozigot ––> fenòmens sexuals bacterians Aquest intercanvi de material no és pas obligat per a completar el cicle biològic. 20 Aquest intercanvi té lloc per 3 mecanismes diferents: Transformació → DNA lliure alliberat per una cèl·lula és adquirit per una altra cèl·lula. El DNA és alliberat i és capaç de penetrar mitjançant uns porus específics per transportar l'ADN a l'interior de la cèl·lula receptora. Conjugació → la transferència de DNA requereix un contacte cèl·lula a cèl·lula i la presència d’un plasmidi conjugatiu. Perquè la cèl·lula pugui conjugar, haura de tenir una sèrie de característiques perquè es doni. Transducció → la transferència de DNA és fa a través d’un virus (fag, Ø). Infecció vírica 1. Recombinació bacteriana Agafar una cosa de fora i fer-me-la meva. Incorporació d’un material genètic forani entre regions homòlogues La cèl·lula no tolera que hi hai fragments de DNA oberts, sinó que al que l’extrem 5’ i 3’ plegats/amb proteïnes CAP, per fer-lo innaccessible als enzims Procés pel qual una cadena de material genètic (DNA, però també RNA) és fragmentat i posteriorment unit a una molècula de DNA diferent La recombinació / intercanvi de material genètic entre cèl·lules / microorganismes a partir de regions homòlogues del DNA Les regions homòlogues del DNA son aquelles que gaire bé tenen la mateixa seqüencia, i per tant, les bases es poden aparellar a lo llarg d’una regió del DNAds per facilitar l’intercanvi 21 Component essencial de l’intercanvi de material genètic / informació entre microorganismes que necessàriament s’incorpora al genoma de la cèl·lula receptora Les SSB proteins mantenen la cadena oberta un cop ha passat l’helicasa perquè es dongui la replicació La proteïna RecA és essencial per als processos de recombinació homòloga. Proteïna de la cèl·lula procariota. Els eucariots en tenim una de similar, però no aquesta. Hi ha altres processos de recombinació rec. específica de lloc (en bacteriòfags atenuats, codificada per gens vírics; no RecA) rec. replicativa (en la inserció/transposició de seqüències d’inserció i transposons; no RecA) rec. il·legítima (regions no complementaries, molt rara; no RecA), Recombinacions que recombinen regions no complementàries, però si que segueix el procés (tall, canvi i re-unió) 22  2. Recombinació homologa replicativa Recombinació amb factors de similitud que em permeten combinar Elements mòbils de DNA, és a dir, elements transposables → fragments de DNA ds mòbil, que pot moure’s (no sempre estaran localitzats en el mateix lloc del genoma). Això ens dificulta l’estudi genètic/genòmic dels genomes. Transposons (TN) Seqüències d’Inserció (IS) Son seqüencies curtes de DNA que es mouen com a unitats d’un lloc a un altre d’una molècula de DNA Sempre els trobem a regions de plasmidis, cromosomes o bé al genoma víric No tenen origen de replicació, per tant, no tenen replicació autònoma. Nomé saugmentarà el seu número de còpies si es duplica el genoma. Molt abundants a la natura Ambdós codifiquen per la transposasa i tenen repeticions invertides curtes (IR) als extrems Transposasa → TN → Una transposasa és una classe d'enzims capaços d'unir- se a l'extrem d'un transposó i catalitzar el seu moviment a una altra part del genoma, generalment mitjançant un mecanisme de tallar i enganxar o un mecanisme replicatiu, en un procés conegut com a transposició. Ajuden en la resistència als antibiòtics o factors de creixement. ○ tipus complexe d’element mòbil ○ >1000 pb (fins a 10 Kb) ○ IR de 10–50 pb 23  ○ codifica per diversos gens diferents (resistència a AB, o altres) ○ Si trenco l'operó, la seva funció deixa de ser efectiva. Quan incorporo un transposó, depenent d'on l'incorpori, l'efecte pot ser neutre o pot afectar el genoma de manera positiva o negativa Repeticions invertides → IR → En una repetició invertida, la seqüència llegeix el mateix cap endavant en una cadena que cap enrere a la cadena complementària. Són semblants als telòmers, tot i que amb diferent funció i permetent el moviment ○ tipus més senzill d’element mòbil ○ ~1000 pb ○ IR de 10–50 pb ○ nombre específic de bases per a cada IS ○ cromosòmiques i plasmídiques ○ nombre i localització diversa entre espècies i soques ○ plasmidi F té IS específiques per a recombinar amb el genoma d’E. coli ○ Allargament del genoma 24 Transformació Incorporació de DNA lliure (del medi) a la cèl·lula receptora i posterior recombinació amb el genoma del receptor. Quan el DNA que s’incorpora prové d’un bacteriòfag el procés s’anomena transfecció (≈transducció). Descobriment essencial per la Genètica (Griffith 1928) i posteriorment per Avery, McLeod i McCarthy (1944) → Streptococcus pneumoniae presentava a nivell fenotípic (creixement en placa) dues estètiques diferents. El procés de transformació comprèn vàries fases Desenvolupament de l’estat de competència ○ Competència és l’estat fisiològic que permet incorporar DNA i recombinar-lo. No totes les cèl·lules són competents, és un estat regulat genèticament (estat transitori). a Bacillus subtilis, el 20% de les cèl·lules durant varies hores → K a Streptococcus, el 100% del cultiu durant uns minuts → S ○ Depèn també de l’expressió de diferents proteïnes a la membrana que faciliten el procés (DNA binding protein, autolisina de paret, nucleases, …) ○ Molt sovint està lligat a fenòmens de “percepció de quòrum” (quorum sensing) a Bacillus, proteïna ComX i en resposta a diferents estímuls (nutrients, fase del creixement.…) → determinar si hi ha o no DNA fora perquè pugui enllaçar a Streptococcus en resposta a un factor d’activació de competència (CAF) 25  Inducció artificial de l’estat de competència ○ Shift-down ○ Addició al medi de factors de competència ○ Tractament de xoc químic i tèrmic E. coli: 0,02 M de Ca2+ i 4ºC → 42ºC → 4ºC ○ Electroporació Canvis durant l’estat de competència ○ expressió de diferents proteïnes en la membrana ○ obertura de porus ○ canvi de càrrega elèctrica de la membrana (neg.à pos.) ○ major sensibilitat a la penicil·lina ○ capacitat d’incorporar DNA Adsorció reversible del DNA (DNA binding protein) Adsorció irreversible del DNA (irreversible) Incorporació del DNA (només una cadena) → monocatenàri. un cop dins el citosol: Recombinació (recA)...i posterior expressió (!¡tans sols 1 bri recombina → expressió a la meitat de la descendencia!¡)3 → Cal que hi hagi homologia. Només s’expressarà si hi ha recombinació Hi ha certs microorganismes amb capacitat de transformar-se de manera natural, son competents per naturalessa (p.e., S. pneumoniae, B. subtilis, B. cereus, i Haemophilus influenzae, Neisseria, Azotobacter, Pseudomonas ) La recombinació genètica en bacteris implica l'intercanvi de fragments de DNA entre 3 cèl·lules, mitjançant mecanismes com la transformació, la transducció o la conjugació. Quan es recombina un sol fragment de DNA, només una part de la descendència (aproximadament la meitat) expressarà aquesta nova informació genètica. Això permet augmentar la variabilitat genètica en la població, encara que no totes les cèl·lules filles mostraran immediatament els canvis. 26 El procés a gram-positius (p.e. Bacillus spp., Streptococcus spp.) Estat de competència temporal (minuts, al principi fase exponencial), es perd després de 30 min de competència. A partir de la meitat de la fase exponencial, ja no s’incorpora res més. Inducció de la competència per un pèptid CSP (gen comX), que actua com a pèptid senyal en un procés de quorum sensing. Aquest pèptid detecta la presència de DNA fora de la membrana, s'uneix a receptors de membrana i activa la síntesi de 12 proteïnes diferents. S'activaran proteïnes que facilitaran la unió, la separació i l'entrada de la cadena de DNA al citoplasma. Incorporació de DNA mitjançant el translocasoma (entre 30 i 80 llocs d’unió). Incorporació del DNA foràni i al principi de la fase exponencial El procés a gram-negatius (p.e. Neisseria spp., Haemophilus spp.) El DNA s’uneix a la membrana externa i es processa a l’espai periplàsmic. A partir d’aquí 1 cadena entra a la cèl·lula No es coneixen fenòmens de quorum sensing. La majoria de gram-negatius són competents de forma natural tot i que s’indueix aquest estat en entrar en fase estacionària o en limitació de nutrients La incorporació de material genètica és en fase estacionària Curiosament la incorporació de DNA no és a l’atzar sinó que es selecciona el DNA mitjançant seqüències concretes: Neisseria [5’-gCC gTC TgA A-3’] 27  Haemophilus [5’-AAg TgC ggT CA-3’] El procés a gram-positius (p.e. Bacillus, Streptococcus) El procés a gram-negatius (p.e. Neisseria, Haemophilus) Hem de tenir en compte que és un procés poc eficient: DNA com a font de C i N com a mecanisme de reparació del DNA malmès (mutacions) transferència de gens: tot i que altres processos funcionen millor en la transferència horitzontal de gens (transducció, conjugació), no es pot descartar la transformació com a mecanisme per incorporar gens d’utilitat (avantatge selectiva) 28 Gram-Positius Els bacteris Gram-positius, com els Streptococcus i els Bacillus, indueixen la competència amb un pèptid senyal (com el CSP) que activa la maquinària de transformació. Aquests bacteris no tenen membrana externa, de manera que el DNA exògen passa directament a través de la paret cel·lular i la membrana plasmàtica. Només una de les cadenes del DNA entra al citoplasma, on pot recombinar- se amb el genoma de la cèl·lula receptora. Gram-Negatius Els bacteris Gram-negatius, com els Neisseria i els Haemophilus, tenen una membrana externa addicional. Els bacteris competents sovint tenen un sistema de pilis tipus IV que capta el DNA exògen i el transporta a través de la membrana externa. El DNA passa després per un por canal proteic que el transporta a través de la membrana interna, on pot integrar-se en el genoma bacterià. En resum, en Gram-positius el DNA exògen entra directament, mentre que en Gram-negatius requereix un sistema més complex per travessar la doble membrana. Transformació artificial S’obren els porus i s’injecta el material genètic S’utilitza no només per incorporar gens concrets a bacteris “domèstics” sinó també per conèixer la distància entre diferents marcadors gènics (mapejat genètic4). Ara en desús degut a les noves tècniques genòmiques/seqüenciació massiva5 Es basa en el raonament que dos marcadors (gens) es transformaran junts si es troben prou propers l’un de l’altre com per estar inclosos en el mateix fragment de DNA incorporat 4 Mapejar → Localitzar un determinat gen en una determinada posició 5 Seqüenciació massiva → Llegir tota la seqüencia en unes 2 hores i de manera més barata i eficient 29 En canvi, si dos gens es troben molt separats és molt poc probable que s’incorporin junts en la cèl·lula ja que no estaran localitzats en el mateix fragment de DNA Inconvenients Si no es cotransformen junts no podem saber la localització exacte, només tenim la certesa que els gens es troben allunyats un de l’altre. L’estat de competència afecta molt les freqüències de transformació que s’obtenen i sovint pot portar a resultats contradictoris. No podem conèixer la localització exacte de tots els gens. De fet només podem mapejar aquells gens seleccionables, és a dir, aquells que confereixen un tret distintiu a l’organisme que el porta en funció de les condicions de creixement ex1: DNA donador trp+ bacteri receptor trp– Per reconèixer i seleccionar els transformants hem de fer créixer el cultiu en un medi mínim sense triptòfan. Només podran créixer aquells bacteris que hagin incorporat el marcador trp+ (del donant) i, per tant, sintetitzar triptòfan per ells mateixos. ex2: DNA donador trp+his+leu+ bacteri receptor trp–his–leu 30 Conjugació Procés que requereix contacte directe entre la cèl·lula donadora i la receptora (aparellament) → és el que s’ha entès falsament com a sexe Existeix un tipus especial de plasmidi que permet sintetitzar un tipus de pilus que permetrà aquest contacte entre cèl·lules (Plasmidi F). Porta la característica de conjugar. Procés entre bacteris, però també pot tenir lloc entre bacteris i cèl·lules animals, vegetals o fongs (Lacroix & CItovsky 2016 mBio doi: 10.1128/mBio.00863-16) A molts procariotes (gram-positius, -negatius, arqueus) hi ha soques: F+ → portadores de plasmidi F o conjugatiu. Són donadores de material genètic F– → no portadores de plasmidi F. Són potencials receptores de material genètic Procés observat per J Lederberg, E Lederberg i EL Tatum el 1946 en soques d’E. coli Calia contacte directe (presència de DNAsa al medi no afectava) i hi havia polaritat del procès + DNAsa al medi → resultats idèntics → descartem Transformació no detectem fags al medi → resultats idèntics → descartem Transducció 1951 Bernard Davis aporta proves concloents, tub en U dividit. Hi ha pas de medi, però no contacte entre els cultius Existia algun mecanisme mitjançant el qual algunes soques de bacteris podien transferir-se gens i que aquest mecanisme necessitava del contacte físic entre elles 31 soca B × soca C → No Recombinants (cap de les dues tenia el plasmidi F) soca A × soca B → Recombinants → soca B × soca C → Recombinants després d’aquest creuament la soca B adquiria la capacitat de transferir els seus gens → es tornava fèrtil → Factor de Fertilitat (F) ○ soca F+ → soques amb capacitat de transferir els seus gens ○ soca F- →soques incapaces de transferir els seus gens aquest factor de fertilitat (F) va resultar ser un plasmidi de 5×107 Da, amb capacitat per transferir-se d’una cèl·lula a una altra (operó tra) → tra = transferència 1. Plasmidis Són molècules generalment circulars de DNA que es distingeixen del cromosoma per la seva mida mida variable entre 1Kpb i 1 Mpb (aprox. 1–1000 gens) molt diversos: només a E. coli se’n coneixen més de 500 tipus diferents el nº de còpies per cèl·lula varia depenent del tipus de plasmidi baix nombre de còpies → astringents (1–2 per cèl·lula) alt nombre de còpies → relaxats (20–100 o més per cèl·lula) Alguns poden transferir-se a d’altres cèl·lules (Conjugació). Aquesta capacitat depèn de la presència dels gens tra Grups d’incompatibilitat → plasmidis amb característiques comunes no poden mantenir-se en la mateixa cèl·lula. La incompatibilitat té a veure amb les funcions o requeriments similars durant la replicació (competència per proteïnes iniciadores de la replicació, etc.) Es pot forçar la coexistència sota pressió selectiva (antibiòtics). Especificitat → Hi ha de tot, plasmidis que només es troben en una espècie i d’altres 32 que són universals (rang d’hostes estret o ample). Els de rang d’hoste ample són menys dependents de la maquinària de l’hoste. Normalment els de rang d’hoste estret es troben en gran nombre i els de rang d’hostes ample en nº baix. Alguns plasmidis poden integrar-se al genoma i formar-ne part, replicant-se conjuntament amb aquest. Normalment, això permet donar resistència a antibiòtics a noves soques. Això dota al cromosoma de capacitat per mobilitzar-se i, per tant, transferir els seus gens (soques Hfr) → hight frequency of recombination Replicació → independent de la replicació cromosòmica (inici i control) però no de la maquinària de replicació cel·lular (~virus). Inici de replicació OriV regula el nº de còpies dins la cèl·lula (replicació vegetativa) OriT: regula la replicació durant la conjugació (transferència), per tant OriT NOMÉS es troba en plasmidis conjugatius. Es troba als 66,7 min. 33  La replicació la porta a terme la DNA pol-I (la replicació del genoma la fa la DNA pol-III) Els plasmidis porten gens no essencials pel creixement i la supervivència del microorganisme però que poden conferir un avantatge sota determinades condicions o en ambients peculiars 1.1. Tipus 1.1.1. Resistència (Plasmidis R) → resistència a antibiòtics (majoritàriament). És diferent a la resistència que es dóna en el genoma. Resistències plasmídiques: nou enzim, bombeig Resistències cromosòmiques: mutacions en el gen que codifica per la diana de l’antibiòtic. Generen molts de problemes als Hospitals (soques resistents que transfereixen el plasmidi a altres soques, espècies). Infeccions nosocomials. 1.1.2. Conjugatius (Plasmidis F) → capacitat de transferir-se (gens de l’operó tra). Factor sexual de fertilitat en E. coli (plasmidi F), en Pseudomonas (plasmidi K). → bacteris amb plasmidi F (no competents) 1.1.3. Síntesi de bacteriocines → plasmidis amb gens que codifiquen per proteïnes que afecten la viabilitat d’individus de la mateixa espècie o relacionades (competència). Avantatges de les bacteriocines i dels microorganismes productors com a agents de biocontrol per aplicacions tant industrial, medicina i agricultura 1.1.4. Factors de virulència → Codifiquen per proteïnes o factors que 34  afavoreixen la patogènia o incrementen la virulència (toxicitat) del patogen. Enterotoxines (ent), exotoxines (tètanus, àntrax) o tumors (Plasmidi Ti, gens vir → Allà on s’expressen els gens (les cèl·lules vegetals que han rebut els plasmidis), contenen un bony o evolució cancerosa) 1.1.5. Simbiosi (Plasmidis sym) → permeten establir simbiosi amb d’altres organismes. Plasmidi nod (Rhizobium). 1.1.6. Fisiològics → permeten utilitzar diferents substrats (més o menys complexes) com a nutrients (font de C, energia, etc.). Molt útils en bioremediació (p.e., plasmidi tol (Pseudomonas) → trenquen els anells benzènics, fent-los lineals i faciltant la seva degradació) Els plasmidis poden classificar-se en quatre categories depenent de la capacitat de portar a terme aquestes quatre fases: Plasmidis conjugatius (CO) → poden fer l’aparellament (Plasmidi R) Plasmidis mobilitzables (MO) →poden transferir el DNA Plasmidis auto-transmissibles (AT) → poden fer les 4 fases (Plasmidi F) Plasmidis no transmissibles (NT) → cap fase (críptics) 35  1.2. Curat plasmidis Procés natural on el genoma es replica més ràpid que el plasmidi. Això provoca que només una de les cèl·lules filla rebi el plasmidi + genoma i l’altra només el genoma. A més, és possible forçar la pèrdua del plasmidi afegint agents intercalants (fluorescents) que s'inserten entre les bases del DNA i afecten la seva estructura. Aquesta intercalació impedeix la replicació del plasmidi, mantenint les cadenes unides, i pot resultar en cèl·lules filles que no contenen el plasmidi. Aquesta tècnica s'utilitza en laboratoris per estudiar els efectes de la pèrdua de plasmidis i la seva contribució a la variabilitat genètica en bacteris. El tractament inhibeix la replicació del plasmidi però no del cromosoma bacterià. Això provoca que les cèl·lules que porten el plasmidi vagin disminuint en nº a mida que es van dividint. És un procés molt delicat, rang de concentracions molt estret, depenent de pH (7.6 òptim) i no funciona amb tots els plasmidis. 2. Procés conjugació Dos models de replicació bidireccional (θ, vegetativa) cercle rodant (σ, transferència) Al ser més petits, la seva replicació és més ràpida (2 min) que la del genoma (a E. coli 40 min) Soques involucrades soques F+ → donadores de material genètic soques F– → receptora de material genètic 36  soques Hfr → alta capacitat de transferència (plasmidi F integrat al cromosoma) soques F’ → soca amb F que té un tall de cromosoma fase Hfr x F– → F– ~0% d’efectivitat gens plasmidi F 100% d’efectivitat gens cromosòmics A una població/cultiu, el plasmidi F pot integrar-se (seqüències d’inserció) al genoma (freq. 10–5) i replicar-se conjuntament amb ell → cèl·lula Hfr En aquest cas, el plasmidi F està integrat en el cromosoma bacterià, la qual cosa permet que es transfereixi part del cromosoma de la cèl·lula donadora a la cèl·lula receptora. Els passos són els següents: F+ x F– → F+ 70–90% d’efectivitat gens plasmídics 0% d’efectivitat gens cromosòmics 100 Kb en 5 minuts (tot el plasmidi F) A una població/cultiu, el plasmidi F pot integrar-se (seqüències d’inserció) al genoma (freq. 10–5) i replicar-se conjuntament amb ell → cèl·lula Hfr Gràcies a les seqüències d’inserció, el plasmidi F es pot integrar al cromosoma. Així doncs, sabem la posició on es col·locarà i podrem tenir-los mapats (ubicats) La estabilitat d’aquest pont és fonamental per garantir l’eficiència del procés … quan 37 més duri el contacte entre cèl·lules, més gens es transferiran 1. Aparellament: Es genera el pilus i les cèl·lules s’aparellen. 2. Mobilització: Es talla una de les cadenes de l’ADN i es mobilitza cap a la cèl·lula receptora. 3. Transferència: La cadena d’ADN és transferida de la cèl·lula donadora a la receptora. 4. Replicació (cercle rodant): Es replica la cadena transferida en ambdues cèl·lules per completar el plasmidi. Durant la conjugació 4.1. Iniciació: La replicació comença en un punt anomenat origen de replicació, on l'enzim helicasa desenreda les dues cadenes del DNA, creant una forquilla de replicació. 4.2. Formació de Cadenes Noves: L'enzim DNA polimerasa afegeix nucleòtids complementaris a les cadenes originals. Una cadena es replica contínuament (cadena líder) i l'altra de manera discontínua (cadena retards) en fragments anomenats fragments d'Okazaki. 4.3. Finalització: La replicació continua fins que les dues forquilles es troben. L'enzim topoisomerasa separa les dues molècules de DNA circulars, formant dues cèl·lules filles amb còpies idèntiques del material genètic. 5. Separació: Les cèl·lules es separen, cadascuna amb el seu plasmidi complet Soques Hfr → soques amb el plasmidi integrat al genoma i per tant tenen la capacitat de transferir part del genoma...o tot complet! Donen lloc a recombinants d’alta 38 freqüència la integració es pot donar per diferents llocs (seqüències d’inserció) → IS3 conté el plasmdi F (plasmidi F que es troba entre l’operò pro i el lac) mobilització del genoma (operó tra del plasmidi) Les IS3 permeten que el plasmidi F s’integri al cromosoma, formant diferents soques Hfr. Dins del cromosoma bacterià, les regions IS3 tenen variants repetides a altres llocs del genoma. Això significarà que hi haurà gens diferents abans i després, i hi haurà variabilitat entre les soques Hfr, les quals podran transmetre gens diferents. 3. Conjugació Codis i nomenclatura en els creuaments marcadors plasmídics / marcadors genòmics 6 F+ MerR / x F– / Hfr Leu+ StrS x F– / Leu–StrR F’(té l’operó tra, per tant, pot mobilitzar) Leu+ / StrS x F– / StrR 6 Davant una / → gens plasmídics Darrere la / → gens cromosòmics 39 Algunes característiques de la transferència amb Hfr El pont de conjugació no aguanta els 100 minuts (a E. coli) que triga el genoma a transferir-se. Per tant, no passa tot el genoma (ni tot el plasmidi). Conjugació interrompuda El receptor, per tant, no es converteix en F+, continua sent F– i no podrà mobilitzar el cromosoma El fragment introduït no circularitza, sinó que recombina amb el fragment homòleg del genoma receptor Hfr Leu+ x F– / Leu– → F– / Leu+ → com els diferenciem dels donants, també Leu+? Utilització de marcadors contraselectius per aïllar els recombinants sense interferència dels donants Soques Hfr tenen diferents punts d’inserció i orientació de transferència això permet conèixer l’ordre dels gens mitjançant experiments de conjugació interrompuda 3.1. Conjugació interrompuda 40 Com que l’entrada és sincrònica a partir d’un punt concret, es pot establir l’ordre dels gens a mida que van entrant (i recombinant). Es tracta d’anar seleccionant els recombinants que es van generant a diferents intervals de temps. Aturant la conjugació. Gràcies a les tècniques de seqüenciació massiva, podem fer-ho de manera més ràpida, deixant de banda l’aturació de la conjugació. L’entrada de DNA al receptor es fa a una taxa constant. Això fa que l’interval de temps entre diferents gens sigui fix i no depèn de la soca Hfr ni del receptor F– sinó que depèn de la distància entre els dos marcadors. Permet mapar i ordenar els gens. El temps al que entra un determinat marcador (gen) està relacionat només amb la posició d’aquest marcador al genoma del donant … aquells marcadors més allunyats d’oriT presentaran una freqüència de recombinació menor 41 Virus 1. Transducció Intercanvi genètic amb baixa probabilitat procariota → virus, bacteriofag, fag virió = virus (DNA/RNA) + estructura La transducció, descoberta per Lederberg i Zinder el 1951 treballant amb Salmonella, és un procés en què un bacteriòfag transfereix material genètic d’una cèl·lula donadora a una receptora. Aquesta troballa es va fer per casualitat (serendipitat → casualitat) mentre estudiaven la conjugació. Donant + receptor + DNAsa + ? → transferència de gens + desaparició de part del cultiu (donador) És la transferència de gens d’un bacteri (donant) a un altre (receptor) mitjançant un bacteriòfag. Té el seu origen en errors del cicle viral i en l’empaquetament del DNA que resulten en la formació de partícules transductants (càpsides víriques que contenen DNA del bacteri en comptes de DNA viral) La transducció permet incorporar un o varis gens, dotant al receptor de noves 42 funcions o bé corregint d’altres que estaven malmeses (mutacions). És un procés comú en la natura En la transducció hem de distingir clarament dues fases: 1. Generació de les partícules transductants7 (fag + bacteri donant) Les partícules transductants són fags anòmals degut a errades en l’empaquetament del DNA o bé en el procés d'excisió del DNA viral integrat en el genoma de l’hoste. Són minoria en relació a les partícules virals normals (virions). Tenen part o tot el seu material genètic substituït per DNA del bacteri donat (partícules defectives). 2. Infecció del bacteri receptor per la partícula transductant i incorporació del DNA (part. transductant + bacteri receptor) El DNA introduït pot … degradar-se per nucleases cel·lulars recombinar (poc freqüent, ~5%) mantenir-se al citoplasma sense recombinar i … Partícula vírica/fàgica → allà on i ha el genoma del virus que infecta bacteris (virus normal) 7 Partícula transductant → té o tot el genoma del virus o part d’aquest substituït pel genona procariota 43  ○ mantenir la capacitat de replicar-se (similar a un plasmidi) ○ no tenir activitat replicativa. S’anirà perdent a mida que el bacteri es va dividint (transducció defectiva) Un virió és específic per a receptors de membrana, cosa que permet distingir entre cèl·lules procariotes i eucariotes. Tot i aquesta especificitat, no sempre és exclusiu entre espècies, ja que alguns organismes, com els porcs i els humans, poden compartir receptors similars, facilitant la infecció viral entre ells. Virus Lítics: Aquests virus infecten cèl·lules hoste i, eventualment, causen la seva mort. Després de la infecció, el virus utilitza la maquinària cel·lular de l'hoste per replicar- se i produir nous virus. Un cop s'han acumulat prou partícules virals, el virus provoca la lisi (trencament) de la cèl·lula hoste, alliberant els nous virus per infectar cèl·lules adjacents. Cicle lític → segresta la seva cèl·lula amfitriona i utilitza els recursos de la cèl·lula per fer molts fags nous, cosa que causa que la cèl·lula lisi (esclati) i mori en el procés. Virus Lisogènics: Aquests virus s'incorporen al genoma de l'hoste sense causar immediatament la seva mort. El material genètic del virus (normalment en forma de DNA) es fusiona amb el DNA de l'hoste i es transmet a les cèl·lules filles quan la cèl·lula hoste es divideix. Aquest procés es coneix com a lisogènia. En determinades 44 condicions, el virus lisogènic pot entrar en un cicle lític, activant-se i provocant la mort de la cèl·lula hoste. 2. Transducció generalitzada es dona amb bacteriòfags lítics o temperats que no s’integren al genoma de l’hoste. es pot transferir qualsevol gen del donant Les partícules transductants contenen únicament DNA bacterià Es deu a errors en l’empaquetament, incorporant-se fragments de DNA de l’hoste enlloc de DNA viral p.e., fag P22 en Salmonella, P1 a E. coli infecció circularització del DNA víric al citoplasma (episoma) replicació per cercle rodant i processament dels concatèmers (pac sites) empaquetament per “head-full” (càpside plena), on hi caben 43,5 Kb de DNA (víric o bacterià). Això equival a ~1.0% del genoma de Salmonella. El fragment de DNA conté una seqüència específica de la càpside i es va introduint cap a dins ERRORS!! Les nucleases que tallen el DNA de la càpside s’equivoquen amb una certa probabiltat (2% de les vegades) en el reconeixement de les seqüències de tall i processen a partir de seqüències pseudo-pac (molt similars) presents al genoma de Salmonella. S’empaqueta més DNA del que hi cap i aquella càpside no caba de ser viable, també podem no empaquetar tot el DNA (partícula transductant sense èxit)... ○ entre 10 i 15 seqüències pseudo-pac ○ eficiència de reconeixement més baixa 45  ○ entre un 5 i un 10% del genoma s’empaqueta a partir de cada regió pseudo-pac ○ l’eficiència de l’empaquetament disminueix a mida que ens allunyem de la seqüència → Problemes en les transduccions Empaquetament erroni: Les partícules transductants són minoria respecte el total de virons “normals”. Baixes freqüències de transducció. Ara bé, les progènies víriques poden arribar a 1012 pfu/mL. Considerant que les partícules transductants només són un 0.001% del total, això representa 107 partícules transductants/mL. Cadascuna amb una regió de genoma de l’hoste a punt per a infectar un receptor. Apart existeixen mutants amb elevades freqüències de transducció (nucleases víriques mutants que “s’equivoquen” més!). Infecció amb un virió normal: cicle viral normal Infecció amb un virió transductant: recombinació, episoma, degradació, etc... Generació de bacteris transductants que han incorporat el gen transferit. Atenció, els virions “normals” contenen gens del fag, en canvi a una partícula transductant, hi ha gens de l’hoste 46 Les partícules transductants es generen per un error en el procés de formació de la progènie vírica: en alguns virions s’incorpora DNA del bacteri enlloc de DNA del virus 3. Transducció especialitzada només en bacteriòfags que s’integren al genoma de l’hoste (cicle lisogènic). Només es poden transferir aquells gens adjacents al lloc d’integració del fag al genome de l’hoste les partícules transductants contenen DNA viral i DNA bacterià Origen: errors durant l’escisió del profag (DNA viral integrat al genoma). Aquest error provoca l'excisió d’un fragment de DNA bacterià (adjacent al profag) que serà encapsidat. p.e., fag λ en E. coli infecció circularització del DNA víric al citoplasma (episoma) integració al genoma de l’hoste per un lloc concret (attP X attB) → un cop integrat, el profag romandrà latent durant generacions, replicant-se juntament amb el genoma de l’hoste i perpetuant-se amb ell 47  Aquestes partícules defectives no poden portar a terme un cicle viral complet ja que han perdut gens virals. Ara bé, sí poden infectar un nou hoste sense problemes. Queda clar que les partícules defectives λdgal o λdbio són minoritàries en un lisat (10–6) i que si infectem un cultiu bacterià, el nombre de bacteris que s’infectaran amb un d’aquests transductants serà molt baix. Això fa que els lisats d’aquest tipus s’anomenin de baixa freqüència de transducció (LFT). En aquests lisats el nombre de partícules transductants és de 10–6–10–7. El 99,9999% dels virions són normals! Infectant una E. coli Gal– amb lisat de λ transductant amb una multiplicitat d’infecció (moi) alta ([λ]↑↑, [λdgal]↓,[λdbio] ↓) Efecte de la MOI en les freqüències de transducció La MOI és un paràmetre que ens diu quants virions (de mitjana) rep cada cèl·lula durant la infecció. Depèn del nombre de cèl·lules del cultiu i del nombre de fags que porten a terme la infecció MOI = nº fags / nº cèl·lules ○ MOI = 1 ○ MOI= 10 ○ MOI= 100 Quan fem un experiment de transducció in vitro és important infectar amb una MOI alta per facilitar que les cèl·lules rebin algun dels fags transductants (que són molt minoritaris) 48  4. Inducció del cicle lític i excisió del profag Per activar el cicle lític és necessari que el genoma víric integrat es separi del genoma de l’hoste (excissió) 49 5. Conceptes a tenir clars Virus/Virió: Un virus és un agent infecciós molt petit que només es pot reproduir dins d'una cèl·lula hoste. El virió és la partícula vírica completa i infectiva, formada per material genètic (ADN o ARN) envoltat per una càpsida proteica. Hoste: És l'organisme o la cèl·lula que el virus infecta per replicar-se. Rang d’hostes: És el conjunt d'organismes o tipus de cèl·lules que un virus pot infectar. Bacteriòfag (fag): És un tipus de virus que infecta bacteris específicament. Lisi: És el procés de trencament de la cèl·lula hoste a causa de la replicació massiva de virus dins d’ella, alliberant els nous virions. Calba de lisi: És una zona clara en una placa de cultiu on s'han destruït les cèl·lules per l'acció dels virus, formant una "calva" visible. Mida d’explosió (rendiment): És el nombre de virions produïts per cada cèl·lula infectada abans de la lisi. Progènie: Fa referència als nous virions generats a partir d'una infecció vírica d'una cèl·lula hoste. 50