Método Directo en Fresco PDF

MÉTODO DIRECTO EN FRESCO Montaje en fresco y observación de bacterias (tinciones simples y diferenciales)  Objetivo Objetivo general Conocer metodologías que permitan diferenciar las características morfológicas, estructurales...

MÉTODO DIRECTO EN FRESCO Montaje en fresco y observación de bacterias (tinciones simples y diferenciales)  Objetivo Objetivo general Conocer metodologías que permitan diferenciar las características morfológicas, estructurales y funcionales de los microorganismos. Objetivos específicos  Adquirir conocimientos que le permitan al estudiante tener un buen desempeño al momento de elaborar una tinción.  Aprender el fundamento de tinciones simples y diferenciales.  Introducción Los microorganismos son seres unicelulares o pluricelulares muy pequeños, que pueden estar presentes en diferentes ambientes; debido a su tamaño solo pueden ser observados por medio de un microscopio, herramienta de gran importancia para su observación e identificación. Existen algunos procedimientos utilizados para observar bacterias, hongos o estructuras a través de la microscopía directa sin utilizar tinciones, pero al ser casi incoloros en algunos casos es necesario recurrir a diferentes técnicas de tinción. Esta foto de Autor desconocido está bajo licencia CC BY-SA  El montaje en fresco se utiliza para observar suspensiones microbianas sin colorear, evitando daños por fijación y tinción. Esta técnica permite ver microorganismos vivos y funciones fisiológicas como la motilidad y la fisión binaria, así como sus formas, tamaños y agrupaciones. Montaje Es útil para visualizar bacterias, en Fresco hongos unicelulares, protozoos y helmintos. La muestra se coloca en una gota de agua o solución salina isotónica sobre un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos. Debido a la transparencia de las células, se recomienda usar la menor iluminación posible para una mejor visualización.  Las técnicas de tinción son fundamentales para identificar estructuras celulares y la morfología de los microorganismos. Estas técnicas se basan en la capacidad de las células para retener colorantes, que depende de la carga de la célula y del colorante. ¿Qué es un colorante? Un colorante es un compuesto orgánico que consta de tres partes principales: Anillo de benceno: Solvente orgánico incoloro. Cromóforo: Grupo químico que proporciona el color. Tinciones Auxocromo: Grupo químico que intensifica la capacidad del cromóforo para absorber el colorante.  Tipos de colorantes Tinciones COLORANTES ÁCIDOS COLORANTES BÁSICOS (ANIÓNICOS): TIENEN CARGA (CATIÓNICOS): TIENEN CARGA NEGATIVA Y SE UNEN A POSITIVA Y SE UNEN A COMPONENTES CELULARES COMPONENTES CELULARES NEGATIVOS. EJEMPLOS: CRISTAL POSITIVOS. EJEMPLOS: EOSINA, VIOLETA, AZUL DE METILENO, FUCSINA ÁCIDA, NIGROSINA. VERDE MALAQUITA, SAFRANINA. Tinciones simples Tinciones PROPÓSITO: RESALTAR TODO EL MICROORGANISMO PARA OBSERVAR SU FORMA Y ESTRUCTURA BÁSICA. COLORANTES UTILIZADOS: GENERALMENTE BÁSICOS. TIPOS DE CÉLULAS: BACILOS (VARILLAS), COCOS (ESFÉRICOS), ESPIRALES (SACACORCHOS). Tinciones diferenciales Tinciones Propósito: Distinguir entre diferentes tipos de bacterias o estructuras bacterianas. Componentes: Colorante primario, agente mordiente, agente decolorante, colorante secundario.  Tinciones diferenciales Tinciones Tinción de Gram La tinción de Gram es una técnica utilizada para diferenciar dos tipos principales de bacterias según la estructura de sus paredes celulares: Gram positivas y Gram negativas. Esta diferenciación se basa en cómo las bacterias retienen ciertos colorantes durante el proceso de tinción. Procedimiento de la tinción de Gram Colorante primario (Cristal violeta): – Todas las células se tiñen de color violeta. Agente mordiente (Yodo): – El yodo se une al cristal violeta, formando un complejo que se adhiere más firmemente a las células. Agente decolorante (Alcohol acetona): – Las células Gram positivas retienen el complejo de yodo y cristal violeta, permaneciendo de color púrpura. – Las células Gram negativas pierden el complejo de yodo y cristal violeta, quedando incoloras. Colorante secundario (Safranina): – Las células Gram negativas, ahora incoloras, se tiñen de rosa o rojo. – Las células Gram positivas retienen el color púrpura del cristal violeta.  Tinciones diferenciales Tinciones Tinción Ácido-Resistente La tinción ácido-resistente es una técnica utilizada para identificar bacterias que tienen un material ceroso en sus paredes celulares, conocido como ácido micólico. Este material ceroso es un lípido complejo compuesto por ácidos grasos y alcoholes grasos con largas cadenas de hidrocarburos. Debido a esta composición, estas bacterias no se tiñen fácilmente con métodos de tinción comunes. Procedimiento de la tinción ácido-resistente Colorante primario (Carbol fucsina): – Se utiliza una tinción de color rojo oscuro en fenol al 5%, que es soluble en los materiales lipoidales de la pared celular micobacteriana. – La aplicación de calor mejora la penetración del colorante en la pared celular y el citoplasma de las bacterias. Agente decolorante (Alcohol ácido): – Las bacterias ácido-resistentes retienen la carbol fucsina y permanecen rojas. – Las bacterias no ácido-resistentes pierden la carbol fucsina durante la decoloración, quedando incoloras. Colorante secundario (Azul de metileno): – Las bacterias no ácido-resistentes, ahora incoloras, se tiñen de azul. – Las bacterias ácido-resistentes permanecen rojas. Resultados Bacterias ácido-resistentes: Aparecen de color rojo bajo el microscopio. Bacterias no ácido-resistentes: Aparecen de color azul bajo el microscopio.  Tinciones diferenciales Tinciones Tinciones para observar estructuras bacterianas 1. Tinción de endosporas Endospora: Es una estructura latente y resistente formada dentro de una célula bacteriana, que protege a la bacteria de condiciones ambientales adversas. Dificultad de tinción: Las endosporas no se pueden teñir con métodos ordinarios como la tinción simple o la tinción de Gram, porque los tintes no penetran en su pared. Método de Schaeffer-Fulton: Colorante primario (Verde de malaquita): Se utiliza para teñir las endosporas. Calor: Se aplica para mejorar la penetración del colorante en la endospora. Agua destilada: Se usa para eliminar el exceso de colorante. Contratinción (Safranina): Se utiliza para teñir las partes de las células que no se tiñeron anteriormente.  Tinciones diferenciales Tinciones Tinciones para observar estructuras bacterianas 2.Tinción de cápsulas Cápsula: Es una capa extracelular similar a un gel que rodea la pared celular de algunas bacterias. Puede variar en su composición química y está compuesta principalmente por polisacáridos complejos. Dificultad de tinción: Los materiales capsulares son solubles en agua y pueden desprenderse durante el lavado. Método: Suspensión coloidal: Se mezclan las bacterias en una solución con partículas coloreadas (generalmente tinta china o nigrosina) para proporcionar un fondo de contraste. 3. Tinción de flagelos Flagelos: Son estructuras delgadas que permiten la movilidad de las bacterias y suelen ser difíciles de observar con el microscopio óptico y tinciones comunes. Método de Leifson: Ácido tánico: Se utiliza inicialmente para recubrir el flagelo y aumentar su grosor. Solución de rosanilina: Se aplica para teñir los flagelos, permitiendo observarlos al microscopio con una coloración rosa o azul.  Equipos Microscopio, centrífuga. Insumos y materiales Portaobjetos, cubreobjetos, papel absorbente, suspensión de levaduras, tubos de ensayo, hisopos de algodón estériles, asa microbiológica, mechero, bandeja de tinción, solución salina isotónica al [0.9%], azul de metileno, cristal violeta, carbol fucsina, safranina, verde de malaquita, tinta china, rosanilina, acido tánico, agua destilada, alcohol etílico al 95% (500 ml) y acetona (300 ml), Lugol. Medios y organismos Cepa bacteriana en agar nutritivo (Staphylococcus aureus - Escherichia coli), cepa bacteriana de Bacillus sp, cepa bacteriana Klebsiella sp en agar nutritivo. Montaje en Fresco Procedimiento 1. Tome un microscopio y colóquelo sobre la mesa o espacio de trabajo, verifique que la plataforma esté completamente hacia abajo y que el objetivo de escaneo esté en su lugar. 2. Tome un cubre y portaobjetos, límpielo para eliminar cualquier residuo y prepare montajes húmedos de las muestras disponibles, siguiendo los diagramas de procedimientos que se encuentran más adelante dependiendo de cada muestra 3. Enfocar la muestra con el aumento 10X y 40X, que le permita ver la estructura que desea completa. 4. Al terminar, deseche los cubre y portaobjetos en el guardián. 5. Pase los hisopos por el mechero antes de desecharlos. Preparación de Frotis Bacterianos Preparación del portaobjetos: - Lavar con agua y jabón. - Limpiar con alcohol al 95% para eliminar grasa o residuos. Marcar: - Escribir las iniciales del organismo y el número del grupo en los bordes del portaobjetos. Frotis: Evitar frotis espesos; usar una pequeña cantidad del cultivo bacteriano. Cultivos en caldo: - Resuspender el cultivo golpeando el tubo. - Aplicar uno o dos trazos llenos al centro del portaobjetos con un asa de inoculación estéril. - Extender en espiral para cubrir un área del tamaño de una moneda. Cultivos en medio sólido: - Colocar una gota de solución salina fisiológica (0.9% NaCl) en el centro del portaobjetos. - Transferir las células con un asa de inoculación estéril o una aguja. - Esparcir las células en un movimiento circular en la gota de agua. - El frotis debe ocupar un área del tamaño de una moneda y aparecer como una película blanquecina translúcida o semitransparente. - Dejar secar al aire.  Tinción de Gram 1. Colocar el portaobjetos en la bandeja de tinción y agregar el cristal violeta, durante 1 minuto. 2. Lavar con agua por 1 minuto, de la llave o destilada, para retirar el exceso de colorante. 3. Agregar lugol, dejar actuar y, posteriormente, lavar para retirar excesos. 4. Agregar la solución decolorante (alcohol acetona) durante 30 segundos. Luego, lave para retirar el exceso. Si al terminar este tiempo no se ha decolorado completamente se puede repetir la operación hasta que quede decolorado. 5. Agregar la safranina durante 30 a 60 segundos, dejar actuar y lavar para retirar excesos. Secar a temperatura ambiente. Gram Gram negativa positiva  Tinción ácido-alcohol resistente o Ziehl- Neelsen 1. Cubrir el frotis con carbol fucsina y realizar la técnica de emisión de vapores durante 5 minutos pasando el mechero o asa encendida cubierta con algodón y mojada en alcohol, posteriormente, dejar enfriar y lavar el exceso con agua de la llave. 2. Decolorar completamente con alcohol ácido y lavar añadiendo agua gota a gota para eli- minar excesos. 3. Agregar azul de metileno y lavar durante 2 minutos. 4. Dejar secar al aire y observar al Observación de la tinción ácido-alcohol resistente, las microscopio con aceite de inmersión y bacterias azules corresponde a S. aureus y las objetivo de 100 X rosadas a Mycobacterium.  Tinción de esporas 1. Agregar verde de malaquita al frotis y realizar la técnica de emisión de vapores durante 8 minutos, posteriormente, dejar enfriar y lavar el exceso con agua de la llave. 2. Aplicar safranina para la contratinción durante 1 minuto. Retirar el exceso con agua desti- lada. dejar secar a temperatura ambiente. 3. Observar al microscopio con aceite de inmersión Tinción de cápsulas o tinción negativa 1. Deposite una gota de solución salina sobre el portaobjetos limpio y, luego, añada tinta china. 2. Tome una colonia, adiciónela al portaobjetos y emulsiónelo. 3. Coloque una lámina cubreobjetos. 4. En uno de los sitios menos densos de la muestra observe en 10x. 5. Observe sobre el mismo sitio, pero con el objetivo a 40x. 6. Observe en el microscopio con aceite de inmersión y coloque a 100x,  Tinción de flagelos 1. Se fija la suspensión bacteriana mediante formol y se hace la extensión en un portaobjetos. 2. Se deja secar al aire, sin calentamiento alguno. 3. Se añade una mezcla de ácido tánico y el colorante rosanilina. 4. Se retira el colorante con agua y se deja secar al aire antes de su observación al microscopio. CONSEJO PARA LA PRÁCTICA: tenga en cuenta que los tiempos pueden variar de acuerdo con el reactivo.