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Hit Discovery HTS screening Hit: una molecola organica iniziale capostipite di una nuova classe di prodotti in un programma di ricerca – Attività micromolare verso il target biologico – Basso peso molecolare (es: MW 150-250) – Assenza di gruppi funzionali indesiderati – Trattabilità chimica ed espan...

Hit Discovery HTS screening Hit: una molecola organica iniziale capostipite di una nuova classe di prodotti in un programma di ricerca – Attività micromolare verso il target biologico – Basso peso molecolare (es: MW 150-250) – Assenza di gruppi funzionali indesiderati – Trattabilità chimica ed espandibilità – Spazio brevettuale sufficiente Lead: una molecola organica già parzialmente sviluppata (nel corso dell’hit-to-lead process) che abbia la potenzialità di essere testata in vivo – Attività submicromolare verso il target biologico – Attività in sistemi cellulari e possibilmente in modelli in vivo – Proprietà chimico-fisiche predittive di buon comportamento in vivo (drug-likeness) – Alcune proprietà ancora da ottimizzare per farne un prodotto di uso clinico (es. Solubilità, legame alle proteine del plasma (PPB), stabilità metabolica, etc.) Screening e high-throughput screening (HTS) Cos’è un saggio? Un Sistema artificiale per determinare e quantificare l’attività biologica di un composto Esempi: Inibizione enzimatica Agonismo/antagonismo recettoriale Proliferazione cellulare/inibizione della crescita Blocco/attivazione di un canale ionico Screening biologico: L’uso di un saggio per identificare e caratterizzare composti con un’attività biologica. HTS: screening biologico applicato ai grandi numeri 104-105 composti al giorno E’ richiesto un elevato grado di automazione Collezione di composti per lo screening Una collezione e’ un insieme di composti, di diversa origine, che possono essere utilizzati per lo screening. Questi composti possono derivare da: - Composti proprietari sintetizzati nel corso degli anni per diversi progetti - Composti commerciali acquistati da vari fornitori Collezione di composti Collezioni derivanti da progetti di chimica farmaceutica: I composti tendono ad essere correlati (analoghi per le SAR) Ben caratterizzati (spesso drug-like) La “storia” insegna che hits per nuovi targets spesso derivano da altri composti target Composti naturali, prodotti di fermentazione, estratti Complessita’ delle miscele Riproducibilita’ nell’ottenimento dei campioni o nel far crescere gli organismi Forniscono farmaci molto importanti (antitumorali, malattie infettive) Ingegnerizzazione di microrganismi per la sintesi dei composti naturali (biologia combinatoriale) Composti derivanti dalla chimica combinatoriale Vantaggi: le collezioni possono essere progettate e possono essere anche molto La grandi collezioni di numerose composti delle grandi Svantaggi: problemi della qualita’ della libreria industrie farmaceutiche sono state costruite in questa maniera Costruzione della collezione di composti per lo screening Una collezione di composti viene “filtrata” prima dello screening Lo screening della collezione dovrebbe fornire buoni composti di partenza (hit) per lo sviluppo/ottimizzazione successivi Evitare falsi positivi Evitare composti che possono presentare problemi di varia natura (proprieta’ chimico-fisiche sfavorevoli, tossicita’ etc) Complessita’ molecolare Peso molecolare Lipofilia Gruppi funzionali che conferiscono reattivita’ o tossicita’ Ad es. Upon selection of a target, a lead generation strategy is defined HTS processing of a primary assay secondary assays for hit confirmation and hit validation. The overall objective is the generation of a large number of validated hit compounds with a wide chemical diversity the identification of several lead series with well-defined structureactivity relationships. These compounds then enter a lead optimization process Target dei saggi Recettori accoppiati a proteine G Binding assays detect compounds that are ligands of the receptor Functional assays probe the signaling of the receptor within the cell. Direct measurement of G-protein activation using the non-hydrolyzable GTP analogue 35S-GTPgS. Fluorescent GTP analogues that show an enhancement of their emission upon binding to the Ga subunit. Determination of the concentration change of secondary messengers upon receptor activation due to the action of the effector proteins AC and PLC cAMP: detection of the cAMP produced by the cell in a competition assay with a labeled cAMP analogue (tracer) and a mono- or polyclonal cAMP antibody Ca2+: cell-based fluorimetric assays Come si misura l’attività? Both cell-free and cell-based assays can be performed in a heterogeneous or homogeneous format. Heterogeneous assays are multistep assays that can involve multiple additions, incubations, washings, transfer, filtration, and reading of the signal. These assays are labor-intensive, generally more difficult to automate, and in most cases only mediumthroughput assays. The homogeneous assays, also called “mix-and-measure assays” All components of the assays are added in a stepwise manner, or ideally as mixtures, and the signal is ultimately read by a plate reader. Molti formati differenti, comprendenti: Tracers radioattivi Sistemi fluorescenti, luminescenti e colorimetrici Sistemi cellulari che possono includere metabolismo, potenziali di membrana e misure di sistemi reporter accoppiati alla trascrizione Questi sistemi permettono di quantificare la funzione biologica Metodi di lettura in HTS Metodi radioattivi Prodotti o ligandi radiomarcati devono essere separati dal substrato radioattivo o dal radioligando libero per filtrazione, precipitazione o adsorbimento Altamente sensibili e quindi possono essere miniaturizzati Fasi di separazione e/o lavaggio possono essere laboriosi La preparazione di traccianti marcati puo’ essere difficoltosa Scintillation Proximity Assays sono metodi di seconda generazione Si dividono in saggi di binding e saggi funzionali (es. Misurazione dell’attivazione della proteina G usando l’analogo non idrolizzabile del GTP, 35S-GTP S) Scintillation Proximity Assay (SPA) Un agente di scintillazione viene incorporato su una microsfera e il target di interesse viene immobilizzato sulla sfera. 3H e 125I (emettono particelle b a bassa energia) No 14C, 35S o 33P (la radiazione  -arriva a distanze troppo elevate) Le microsfere sono fatte di yttrio silicato coperto con ioni di cerio come agente di scintillazione SPA bead SPA bead L’azione di enzimi come polimerasi, trasferasi e kinasi causano il trasferimento della Saggi di binding recettoriali: radiomarcatura sul substrato recettori immobilizzati e ligandi biotinilato. Dopo la reazione il radiomarcati prodotto radiomarcato viene catturato dalla streptavidina Aumento del segnale (Sintetasi): che riveste la perla, causando una aumento del substrato accettore biotinilato, segnale substrato donatore radiomarcato SPA bead SPA bead Diminuzione del segnale (enzimi idrolitici): substrato radiomarcato legato via biotina a microsfere ricoperte di avidina SPA bead P SPA bead Cattura del prodotto: prodotto radiomarcato catturato via anticorpo Nucleasi, proteasi, esterasi, fosfolipasi Peptidi fosforilati dall’azione delle kinasi FlashPlates - SPA senza microsfere Legame del recettore o del target sulla piastra Tracciante radiomarcato Solo il tracciante legato viene misurato Metodi di lettura in HTS With an appropriate substrate it is possible to measure the activity directly by recording the color change in the well that originates from the differences in the absorbance spectra between the educt and the product of Metodi colorimetrici the reaction. In cases where the educt and product are colorless, a further chemical reaction is carried out to produce a colored final product. I metodi colorimetrici usano la densita’ ottica della soluzione nel pozzetto o il suo cambiamento come parametro di lettura Saggi di assorbanza: Il NADH assorbe a 340 nm, NAD+ non assorbe….misurazione dell’attivita’ delle deidrogenasi Saggi cromogenici: un substrato contenente un cromoforo modificato durante una reazione Bassa sensibilita’ rispetto ai saggi fluorimetrici o radioattivi Interferenza da parte di composti colorati della libreria Metodi di lettura in HTS Metodi fluorimetrici Altamente sensibili – adatti alla miniaturizzazione Fluorescence polarization (FP) Fluorescence Resonance Energy Transfer La fluorescenza e’ un processo ciclico di assorbimento ed emissione di fotoni da parte di un fluoroforo L’assorbimento di un fotone da una sorgente luminosa (lampada a incandescenza o laser) determina l’eccitazione del fluoroforo Passaggio da So a S1 Dopo pochi nanoseondi (parte dell’energia e’ dissipata come calore o con altri processi che dimunuiscono la probabilita’ che avvenga l’emissione di fluorescenza) il fluoroforo torna allo stato di riposo emettendo un fotone (ad una lunghezza d’onda diversa da quella di assorbimento Metodi fluorimetrici I fluorofori sono generalmente rigidi, planari ed estesamente coniugati attraverso sistemi . Grandezza e PM Solubilita’ in soluzione acquosa (evitare lo stacking) Differenza tra lunghezze d’onda di emissione e assorbimento Coefficiente di estinzione (probabilita’ di assorbimento) Efficienza quantica (probabilita’ di emissione) Tempo di vita dello stato eccitato …..con proprieta’ ottimizzate la sensibilita’ dei metodi fluorimetrici e’ da 100 a 1000 volte superiore rispetto ai saggi colorimetrici Saggi ad intensita’ di fluorescenza Viene letto un aumento o diminuzione dell’intensita’ di emissione Saggi fluorogenici: il reagente non e’ fluorescente e il prodotto e’ un fluoroforo o viceversa (reazioni enzimatiche) Quenching della fluorescenza: il cambiamento di fluorescenza origina dall’interazione fisica del fluoroforo con un un ambiente locale o con un marker non fluorescente quenching dinamico quenching statico The peptide substrate is labeled at the amino terminus with EDANS as a donor fluorophore and at the carboxyl terminus with DABCYL. In the intact peptide, fluorescence resonance energy transfer (FRET) from EDANS to DABCYL results in quenching of the EDANS fluorescence. Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) Il FRET e’ il trasferimento non-radiante di energia tra una molecola donatrice e una accettrice Sovrapposizione tra l’emissione del donatore e l’assorbimento dell’accettore Il trasferimento di energia dipende dalla distanza tra accettore e donatore Le distanze coinvolte sono quelle rilevanti in biologia The FRET donor is a coumarin dye, which is covalently linked to a phospholipid. The acceptor is a highly fluorescent, membrane-soluble anionic oxonol dye. When the cell membrane is loaded with the dyes, the phospholipid anchors the coumarin donor to the outside of the cell, whereas the oxonol dye is accumulated in the cell membrane. The distribution of the anionic oxonol in the membrane depends on the polarity of the membrane potential: if the oxonol dye is located on the extracellular side of the membrane in close proximity to the coumarin donor, FRET occurs and the emission is mostly at 580 nm. If the polarity changes, the oxonol rapidly translocates to the intracellular side of the membrane, too far from the coumarin donor for FRET, and the emission is mostly at 460 nm. Fluorescence polarization (FP) La tecnica FP usa una luce polarizzata di eccitazione per rilevare cambiamenti nella mobilita’ rotazionale di un fluoroforo. In seguito a illuminazione con una luce linearmente polarizzata il fluoroforo in soluzione ha la massima possibilita’ di assorbire un fotone quando ha una orientazione parallela al vettore della luce incidente Se la molecola fosse ferma l’emissione sarebbe anch’essa fortemente polarizzata In realta’ durante l’eccitazione il fluoroforo puo’ ruotare: diffusione rotazionale rho: Tempo di correlazione rotazionale (T, viscosita’ e volume molecolare) tau: tempo di vita dello stato eccitato Se rho > tau emissione polarizzata Se rho < tau emissione non polarizzata Tipi di saggi Aumento della grandezza: saggi di competizione ligando-recettore Diminuzione della grandezza: una molecola fluorescente grande viene degradata ad una piu’ piccola (proteasi etc) Saggi indiretti: saggio competitivo in cui un prodotto non marcato di una reazione enzimatica compete con un tracciante fluorescente per il legame ad un anticorpo specifico Chemioluminescenza e bioluminescenza Processi in cui la luce viene generata durante reazioni chimiche o biologiche (reazioni esotermiche in cui una parte dell’energia di reazione viene convertita in fotoni) Chemioluminescenza: la molecola e’ convertita in un prodotto finale stabile dopo decadimento di un intermedio instabile Bioluminescenza: include reazioni di fotoproteine come aequorin ed enzimi come le luciferasi - Flash luminescence: reazione veloce che produce un segnale luminoso molto intenso ma di breve durata - Glow luminescence: la reazione e’ piu’ lenta e il segnale luminoso ha una maggiore durata. The AequoScreenTM system developed by Euroscreen utilizes this bioluminescent Ca2+-indicator in cell-based assays. AlphaScreen This principle senses the proximity of two beads, a donor and an acceptor bead, which is mediated by the interaction of molecules on the surfaces of the two beads. The donor beads contain the photosensitizer phthalocyanine, which absorbs light at 680 nm and converts ambient molecular oxygen to the highly reactive, excited singlet-state oxygen The lifetime of the excited singlet state is 4 ms, corresponding to a diffusion length for 1O2 in aqueous solution of 200 nm. The acceptor beads contain a thioxene derivative, which reacts with 1O2 to generate chemiluminescence at 370 nm. In addition, the acceptor beads contain fluorophores, which immediately absorb the chemiluminescence and Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) Metodo per valutare interazioni proteina-proteina Una luciferasi bioluminescente viene fusa ad una proteina candidato Una green fluorescent protein (GFP) viene fusa all’altra proteina di interesse La reazione della luciferasi genera bioluminescenza blu Se le due proteine sono vicine si ha un trasferimento di energia alla GFP Il colore della luce di emissione cambia dalla bioluminescenza blu alla biofluorescenza eccitata verde Identificazione degli Hits Processo - Il risultato dello screening di un grande numero di composti e’ solitamente una tabella che riporta la % di inibizione di ogni composto - Da questa lista occorre selezionare quali composti inviare alla riconferma, che consiste nella determinazione del valore di IC 50 - La selezione puo’ anche essere basata su una percentuale soglia (cut off) di inibizione PAINS: Pan-assay interference compounds Triaging of hits must always be done with an awareness of the target class and the specific goals of the project in mind. For example, cysteine protease inhibitors require a reactive functional group, although those may be undesirable for other targets. The AIDS drug AZT (also known as zidovudine or ZDV) contains an azide functional group The anti-cancer drug ixabepilone contains an epoxide function both are reactive functionalities that would be eliminated by some filters. There is also a growing appreciation that careful installation of reactive functionalities in certain cancer drugs can lead to very effective enzyme inhibitors. By some estimates, approximately 25% of known drugs would be eliminated by these filters. Lo screening identifica composti attivi Quale strategia di screening? Gli aspetti da considerare Considerazioni tecniche Formato del saggio Approvvigionamento di reattivi, cellule e tessuti Costi Considerazioni biologiche/mediche Validazione dei biomarker per la predizione dell’efficacia clinica Il meccanismo è stato completamente elucidato? Valdiazione del target Fornitori e proprietà delle molecole da sottoporre a screening First in class vs classi già validate Differenza rispetto ad altri medicinali Saggio biochimico o cellulare? Saggio biochimico Saggio cellulare Target purificato (enzima, intereazione proteina/proteina, recettori (solubili o di membrana) Specificità SAR precisa Molti target contemporaneamente Promiscuità SAR influenzata da altre proprietà del composto Espressione e purificazione del targetCompatibilità delle cellule con il saggio HTS: formato del saggio Volumi: 3-15 uL Capacità delle piastre: 96 vs 384 vs 1536 Lo screening fornisce dati di IC50 o EC50 50 50 La curva dose-risposta dipende dal tipo di saggio Effetti di competizione possono spostare la curva dose-risposta in condizioni di equilibrio Slow Binding Kinetics can Limit Competition in Non-equilibrium Systems Il meccanismo di azione molecolare (MMOA) MMOA: meccanismo biochimico attraverso il quale le interazioni strutturali tra il farmaco e il suo target determinano una risposta funzionale include aspetti cinetici e i cambiamenti conformazioni che forniscono scpecificamente una risposta terapeuticamente utile E’ diverso dal meccanismo di azione: Definizione del sistema in cui i farmaci agiscono antiinfiammatorio antiistaminico antivirale MMOA-pharmacological hot spot Aspirina e ibuprofene: due medicinali, un target, differenti meccanismi molecolari, utilizzi diversi L’acido acetilsalicilico ha attività antipiastrinica mentre gli altri FANS non ce l’hanno efficace nella prevenzione delle malattie atero-trombotiche Entrambi si legano al sito attivo delle cicloossigenasi 1 e 2 L’acido acetilsalicilico causa una inattivazione irreversibile per acetilazione della Ser530 L’ibuprofene e altri FANS sono reversibili L’azione irreversibile dell’aspirina nelle piastrine determina effetti anti-trombotici a lungo termine le piastine non hanno la capacità di risintetizzare nuova proteina Modulatori del recettore per gli estrogeni: un target, meccanismi molecolari diversi, utilizzi diversi Il ligando induce cambiamenti conformazionali che reclutano coattivatori e corepressori in maniera contesto-specifico Il differente utilizzo terapeutico dipende sulle conformazioni uniche e specifiche indotte dal ligando Estradiolo: agonista deficienza ormonale post-menopausa Tamoxifene SERM (modulatore selettivo del recettore degli estrogeni) cancro al seno Raloxifene SERM osteoporosi Il meccanismo dell’imatinib L’affinità del Gleevec è ottenuta per spostamento di un equilibrio di induced fit che viene anche distrutto dalla mutazione T315I che causa resistenza clinica The binding/unbinding step is similar between weak and strong binders Affinity and selectivity are provide by the induced fit step Science. 2015 Feb 20; 347(6224): 882–886. doi: 10.1126/science.aaa1823 Il paradosso del meccanismo Il MMOA definisce l’utilità dei medicinali collegando le interazioni molecolari con la fisiologia collegando il genotipo al fenotipo ….ma il MMOA è difficile da prevedere a priori Screening target-based o fenotipico? Definizioni Screening fenotipico: qualunque screening in cui il MMOA che fornisce un indice terapeutico accettabile non è noto o prevedibile In questo contesto lo screening fenotipico è sinonimo di empirico Utilizzando questa definizione molto ampia lo screening fenotipico include qualunque saggio che non sia target-based Il valore di un saggio fenotipico è quello di scoprire nuovi MMOA che sono difficili da predire a priori L’identificazione di un MMOA (hot spot farmacologico) fornisce informazioni per la strategia di screening Approccio target-based Punti di forza Fornisce un approccio razionale Allinea il genotipo con il fenotipo Da informazioni sulla selezione dei pazienti nei trials clinici Usa approcci di progettazione razionale per l’ottimizzazione Stabilisce le dosi cliniche sulla base dell’occupazione del target Fornisce una valutazione del rischio Punti deboli Identificazione e validazione del target Composti attivi sul target potrebbero non funzionare nei saggi fenotipici Screening fenotipico Punti di forza Saggi fisiologicamente rilevanti Minori assunzioni sul meccanismo Valutazione precoce della sicurezza Punti deboli Sviluppo di saggi fenotipici che siano predittivi della patologia* Identificazione di marker fenotipici validati* Meccanismo di azione non noto Non si possono applicare approcci di design razionale per l’ottimizzazione Problemi nella selezione dei pazienti nei trial clinici Determinazione della dose Letture di approfondimento Nature Reviews Drug Discovery volume 13, pages588–602 (2014) Phenotypic screening in cancer drug discovery — past, present and future Case study Nature volume 519, pages102– 105 (2015) Axitinib effectively inhibits BCR-ABL1(T315I) with a distinct binding conformation Phenotype-led vs Target-led