Préparation pour l'intégration des acquis Biologie-Chimie 2025 PDF

1 ACTIVITÉ D’INTÉGRATION BIOLOGIE-CHIMIE VADE-MECUM PRÉPARATION POUR L’INTÉGRATION DES ACQUIS THÉORIQUES BIOLOGIE-CHIMIE (15%) 5 FÉVRIER 2025 DE 8H00 À 9H15 Les évaluations du cours d’in...

1 ACTIVITÉ D’INTÉGRATION BIOLOGIE-CHIMIE VADE-MECUM PRÉPARATION POUR L’INTÉGRATION DES ACQUIS THÉORIQUES BIOLOGIE-CHIMIE (15%) 5 FÉVRIER 2025 DE 8H00 À 9H15 Les évaluations du cours d’intégration vérifient l’atteinte de l’énoncé de compétence du cours, qui est : Traiter un ou plusieurs sujets, dans le cadre des sciences de la nature, sur la base de ses acquis. Cet examen théorique (correspondant à 15 % de votre note de session) abordera les quatre cas de contaminations couverts cette session par vous et vos collègues de classe. Le questionnaire touchera tant aux aspects historiques des cas classiques associés aux contaminations qu’aux aspects techniques des quatre projets de cette session-ci. Un mélange de questions à choix multiples et de questions à court développement vous seront proposées. Le document qui suit présente les informations pertinentes à connaître et maîtriser concernant les cas classiques et les parties techniques des quatre projets de cette session. L’examen ne débordera pas des informations présentées dans ce document. BONNE ÉTUDE !  2 PROJET KOUDZOULOU CAS CLASSIQUE : INVASION DU KUDZU AUX ÉTATS-UNIS Une espèce est dite invasive ou envahissante lorsque, s’étant établie et se reproduisant naturellement dans un domaine géographique dont elle n’est pas originaire, elle devient un agent de perturbation et nuit à la diversité biologique. Ces « invasives » peuvent perturber les milieux naturels et être source de désagrément pour les activités humaines ou la santé publique. Le Kudzu (Pueraria montana) est une angiosperme d’origine asiatique considérée comme invasive en Amérique du Nord. Dans son milieu d’origine (en Asie), le Kudzu a de nombreux ennemis naturels connus permettant son contrôle tels que certains arthropodes, certaines moisissures, plusieurs types bactériens et l’homme qui l’utilise dans ces régions comme aliments, comme source de fibre textile et pour ses valeurs médicinales. Elle est cependant considérée en Amérique du Nord comme un parasite structurel en dépendant du support des autres végétaux pour atteindre les hauteurs du couvert végétal. Elle occupe maintenant plus de 30 000 km2 aux États-Unis et continue son expansion de plus de 500 km 2 annuellement! Voici quelques caractéristiques de cet envahisseur végétal : Taux de croissance de la tige : 3 à 19 cm/jour Adapté aux écosystèmes chauds et sensible au climat froid; les feuilles sont détruites par la première gelée de la saison. La reproduction de ce végétal est assurée par la production de semence (graine) très résistante, ayant un potentiel de germination très élevé. Le Kudzu a été introduit aux États-Unis lors de l’Exposition universelle de Philadelphie en 1876. Cependant, cette plante a été reconnue comme plante indésirable depuis 1997 par le gouvernement américain. La dispersion incontrôlée du Kudzu a été causée par un ensemencement massif soutenu par le gouvernement américain dans le sud du pays dans la première partie du 20e siècle. En effet, ce végétal était principalement utilisé comme plante ornementale dans les jardins, parcs urbains et autres terres publiques, comme nourriture pour le bétail et pour aider à contrer l’érosion des sols des terrains en forte pente. De plus, la culture du coton ayant été très difficile à cette époque à cause des sols pauvres et de la prolifération d’un insecte nuisible (charançon du coton), plusieurs fermiers abandonnèrent leur terre et se réfugièrent en ville, laissant ainsi plusieurs terres cultivables à l’abandon. Le Kudzu a donc profité de plusieurs décennies de croissance non contrôlée, lui permettant de prendre le dessus sur toutes les autres espèces endémiques de cette région. Les effets de la prolifération de Kudzu sur les écosystèmes sont nombreux. Étant une plante grimpante avec un taux de croissance extrêmement élevé, le Kudzu diminue de façon marquante la quantité de lumière disponible pour les autres espèces couvertes par cet envahisseur. Le Kudzu agit donc comme un compétiteur des espèces présentes dans l’écosystème. Une fois établi, le Kudzu prolifère et se répand très vite dans les écosystèmes voisins en ombrageant et en écrasant sous son poids les espèces compétitrices, éliminant ainsi à peu près tout sur son passage. Ce phénomène cause la mort des espèces régionales et résulte en une monoculture de Kudzu dans les milieux affectés. La biodiversité des sites envahis est donc fortement diminuée. Les effets dévastateurs du Kudzu causent aussi de nombreuses problématiques au niveau de la faune locale en éliminant la majorité des producteurs des écosystèmes affectés, influençant par le fait même tout le reste de la chaîne alimentaire. L’invasion de Kudzu aux États-Unis engendre aussi de nombreux effets économiques comme des pertes de productivité en foresterie et des coûts astronomiques liés aux méthodes de contrôle de l’envahisseur. Notamment, les compagnies de production d’électricité doivent assurer le désherbage des infrastructures de distribution électrique, alors que les compagnies ferroviaires doivent assumer celui des voies ferrées pour prévenir les déraillements de train. De leur côté, les parcs nationaux et régionaux se doivent de contrôler l’invasion pour assurer l’intégrité de plusieurs écosystèmes naturels. Depuis 1950, plusieurs méthodes de contrôle ont été employées pour tenter de circonscrire l’invasion de Kudzu et ainsi limiter les impacts négatifs dus à sa prolifération incontrôlée. Les résultats ont été mitigés, la plante s’avérant très difficile à contrôler. Cependant, quelques méthodes ont quand même eu des résultats encourageants. Principalement, le désherbage, les herbicides et les moyens de biocontrôle naturel par les insectes, les champignons pathogènes du Kudzu ou les bactéries pathogènes du Kudzu sont toutes des méthodes ayant été utilisées pour contrôler l’envahisseur.  3 PARTIE TECHNIQUE Principe global d’analyse Évaluer différentes méthodes de contrôle pour contrer l’invasion d’une plante dans un écosystème à l’aide de tests de croissance en serre et de l’analyse statistique des données recueillies. La croissance de plante en serre o Une serre est une structure qui peut être parfaitement close destinée en général à la production agricole. Elle vise à soustraire aux éléments climatiques les cultures pour une meilleure gestion des besoins des plantes et pour en accélérer la croissance ou les produire indépendamment des saisons. o La photosynthèse est définie comme la transformation du gaz carbonique et de l’eau à l’aide de la lumière en composés organiques et en oxygène. La photosynthèse est essentielle au développement de tous les végétaux. Lors de la croissance de ces derniers dans un environnement fermé tel qu’une serre, plusieurs paramètres doivent être contrôlés pour favoriser la photosynthèse et ainsi maximiser la croissance des végétaux. 1. Température favorisant ainsi les nombreuses réactions enzymatiques du métabolisme végétal. 2. Ventilation et circulation de l’air assurant l’échange de l’air à l’intérieur de la serre par de l’air provenant de l’extérieur. Ceci permettra d’enlever le surplus d’humidité et d’approvisionner la serre en CO2 3. Système d’approvisionnement en eau et contrôle de l’humidité assurant le bon développement des végétaux. Un approvisionnement inadéquat en eau (en surplus ou insuffisant) empêchera la croissance optimale des végétaux à l’intérieur de la serre. De plus, si l’humidité est trop élevée, le développement de moisissures sera favorisé et empêchera la croissance des plantes en risquant même de les tuer en les contaminant. Au contraire, une humidité trop faible assèchera les végétaux, empêchant tout autant leur croissance. 4. Luminosité assurant un taux de photosynthèse optimal, l’apport en lumière est un autre élément essentiel à considérer lors de la réalisation d’une serre. Le système d’éclairage permet aussi d’optimiser l’apport lumineux lors des changements de saison, car il permet de garder la photopériode constante tous les jours de l’année. L’utilisation de témoin (contrôle) Lorsqu’on désire comparer la croissance de différents groupes de plantes selon certaines variables, il est nécessaire d’avoir un point de comparaison pour ainsi apprécier l’effet de la variable étudiée. Les plantes formant les groupes témoins lors d’une telle expérience seront arrosées avec de l’eau seulement et seront soumises aux mêmes conditions que les plantes des groupes expérimentaux traitées avec les différentes méthodes de contrôle. Sans ces groupes témoins, aucune statistique ne peut être calculée, ils sont donc indispensables à votre expérimentation! De plus, ils permettent de s’assurer que les conditions de croissance dans la serre sont idéales pour toutes les plantes analysées et ainsi nous informer d’un problème éventuel lors de l’expérimentation. Les témoins servent ainsi à valider en partie les résultats obtenus lors de l’expérimentation. Tests faits en laboratoire pour quantifier la croissance des plantes Le pourcentage de germination permet d’évaluer le potentiel germinatif des graines d’une spermatophyte (plante à graine). En effet, la graine d’une spermatophyte nécessite des conditions environnementales spécifiques pour induire sa germination. La germination est donc un indicateur de la santé d’une plante. Pour évaluer ce paramètre quantitatif, on utilise la formule suivante : Pourcentage de germination = Nombre de graines germées X 100% Nombre total de graines Une des données nous donnant le plus d’information sur la santé d’une plante est la mesure de la hauteur des plants. Cette mesure quantitative permettra de juger de la croissance d’une plante sur une période donnée. Généralement, on mesure la distance entre le niveau de la terre et la feuille la plus haute du plant.  4 L’analyse statistique La plupart des données recueillies dans le cadre de recherches scientifiques en biologie sont très difficiles à interpréter en analysant seulement les données brutes. Chaque vivant étant unique et très différent, les biologistes utilisent très souvent une approche (l’analyse statistique) permettant le traitement et l’interprétation de données recueillies lors d’une expérience scientifique. Les biologistes utilisent normalement des populations (plusieurs individus) lors de l’élaboration d’une expérimentation ayant pour but d’analyser l’effet d’une substance sur un organisme vivant. Ceci permet à l’expérimentateur de s’assurer que l’effet observé est dû à la variable étudiée et non pas à la variabilité génétique. Les individus du même groupe (ayant subi le même traitement) se nomment réplicat. Comment évaluer l’effet d’un traitement (un herbicide, par exemple!) sur un organisme vivant? 1. Il faut choisir deux groupes de données à comparer. Pour déterminer l’efficacité d’une méthode de contrôle sur un groupe de plantes, nous devons choisir le groupe de plants ayant subi le traitement et le comparer à un groupe de plants témoins n’ayant pas subi le traitement (tous les autres paramètres de croissance doivent être identiques). 2. Comparer les pourcentages de germination de ces 2 groupes. Ceci permettra d’évaluer l’effet général du traitement en comparaison avec le groupe témoin. Appliqué avant la germination, un traitement efficace abaissera drastiquement le pourcentage de germination du groupe ayant subi le traitement par rapport à celui du témoin. 3. Effectuer l’analyse statistique par le test de Student (test T) permettant de comparer deux groupes de données (la hauteur des plants) afin de déterminer si ces groupes sont différents ou non. Cependant, si le nombre de données recueillies est inférieur à 30 par groupes de données, l’interprétation du test de Student pourrait être faussée par le trop faible nombre de données. Dans ce cas, le résultat du test ne sera pas statistiquement valide. Ceci constitue donc le critère de validité du test Student. Le résultat du test de Student nous donne la probabilité (P) que deux groupes de données soient identiques. Si P=1, les deux groupes de données sont identiques. Si P=0, les deux groupes de données sont différents. Donc, plus la valeur de P est grande, plus les groupes de données ont des chances d’être semblables. Au contraire, plus la valeur de P est petite, plus les groupes de données ont des chances d’être différents. On considère, lorsque P est inférieur à 0,05 (seuil de signification), qu’il y a une différence significative entre les deux groupes de données. Si P est supérieur ou égal au seuil de signification (0,05), les deux groupes de données sont considérés comme n’ayant aucune différence significative. 4. S’il y a une différence significative entre les 2 groupes de données selon le test de Student, il faut comparer leurs moyennes respectives pour déduire le sens de la variation (hausse ou baisse). La moyenne constitue une mesure commune pour évaluer la tendance centrale d’un groupe de données. Elle représente la somme des valeurs divisée par le nombre de valeurs. Ainsi, lorsque la hauteur moyenne des plants du groupe ayant subi le traitement est inférieure à celle du groupe témoin, nous pouvons déterminer que le traitement est significativement efficace pour ralentir la croissance de la plante (méthode de contrôle efficace). Dans tous les autres cas, le traitement étudié s’avère inefficace. ▪ La méthode de contrôle la plus efficace est celle inhibant de façon significative la croissance des plants et offrant le plus grand écart de moyenne de croissance avec le groupe témoin. ▪ Cependant, on doit toujours tenir compte de l’effet possible de la condition étudiée sur les autres plantes de l’écosystème. On voudrait de façon idéale éradiquer la plante envahissante sans que la perturbation introduite n’affecte la survie des autres espèces !  5 PROJET RASLEBOLA CAS CLASSIQUE : ÉPIDÉMIE DE VIRUS EBOLA Le virus Ebola est l’agent causal d’une fièvre hémorragique mortelle qui s’est manifestée particulièrement lors d’un épisode en Ouganda (2000-2001). Cette épidémie est maintenant célèbre, car elle a pu être contrôlée grâce à une collaboration de plusieurs organismes internationaux. De plus, cette épidémie fut particulièrement importante pour la recherche en épidémiologie du virus Ebola de par la quantité et la qualité des données recueillies durant l’épidémie. Le virus Ebola appartient à la famille virale des Filoviridae et a été identifié pour la première fois en République Démocratique du Congo et au Soudan en 1976. Depuis ces premiers épisodes connus, cette fièvre hémorragique s’est manifestée périodiquement dans plusieurs pays africains tels que la République Démocratique du Congo, le Zaïre, le Soudan, le Gabon, la Côte d’Ivoire et même en Afrique du Sud. Une souche du virus Ebola a même été identifiée aux États-Unis provenant de primates importés d’Afrique. Les principaux signes et symptômes de la fièvre hémorragique causée par le virus Ebola sont la fièvre aigüe, les saignements (yeux, bouche, oreille, vagin), la faiblesse générale, la douleur aux articulations, des vomissements, des maux de tête sévères, des douleurs musculaires, la difficulté à respirer, la perte d'appétit, la fatigue, la diarrhée, la diarrhée avec sang, la douleur thoracique et la toux. Principalement, voici les informations sur l’évolution de ce virus : Les réservoirs du virus restent encore inconnus pour l’instant, on suspecte principalement les chauves- souris, les gorilles ou autres primates, étant capable de porter le virus. Type de transmission : contact avec sang ou autres liquides corporels contaminés (particulièrement ceux présents dans les phases avancées de la maladie), consommation de viande contaminée Période d’incubation : 4 à 10 jours (peut aller jusqu’à un maximum de 21 jours) Temps entre infection et mortalité : de 10 jours à 8 semaines Pourcentage de mortalité lors de l’apparition des symptômes: 50 à 90% Seuls les symptômes peuvent être contrôlés, il n’y a aucun traitement connu contre la progression du virus Évidemment, une telle épidémie se doit d’être contrôlée pour éviter la propagation de ce pathogène destructeur. En seulement 4 mois et demi, l’épidémie de fièvre hémorragique causée par Ebola en Ouganda (2000-2001) a fait 224 morts sur les 425 cas identifiés de la maladie. Malgré ce taux de mortalité très élevé, la progression de la maladie a été contrôlée assez rapidement par de nombreuses mesures prises par les autorités en place. En voici quelques exemples : Coordination des actions sur le terrain par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) Diffusion de publicité pour informer le public de la situation et des mesures à prendre pour réduire la propagation de la maladie. Les rituels d’embaumement ont été bannis de même que les traitements par des guérisseurs. Création d’une unité d’isolement dans un hôpital afin de séparer les individus infectés du reste de la population. Du matériel de protection (masque, gants, tablier et botte de plastique) a été fourni au personnel hospitalier en contact avec les patients infectés Un site de sépulture près des lieux d’infection a été réservé seulement pour les victimes du virus Ebola. Un laboratoire médical a été érigé temporairement près de l’hôpital par le CDC américain (Center for Disease Control) permettant la détection en laboratoire du virus chez les patients. Une équipe de spécialistes a récolté plusieurs informations sur les contacts entre personnes infectées et les autres membres de la communauté pour permettre une détection de futur cas d’infection. Pour toutes ces raisons, l’épidémie de fièvre hémorragique a pu être contrôlée dans un délai assez court et ainsi permettre de sauver des milliers d’Ougandais d’une mort atroce, et ce, sans mettre une population entière en quarantaine.  6 PARTIE TECHNIQUE Principe global d’analyse Détecter la présence ou non d’un virus dans un échantillon sanguin par la technique du PCR et la visualisation des produits de PCR par électrophorèse afin d’évaluer l’ampleur d’une épidémie. Test de détection d’un virus par PCR o La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction ou Réaction en chaîne par polymérase) permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier. o Pour ce faire, une série de réactions permettant la réplication d’une matrice d’ADN double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant, l’amplification est donc exponentielle. o Pour avoir réplication d’un ADN double brin, il faut agir en trois étapes. À l’étape 1, la dénaturation, il faut dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices d’ADN simple brin. L’étape 2, l’hybridation, consiste à borner la séquence d’ADN spécifique à répliquer en fixant à ses extrémités des courts brins d’ADN spécifiques (appelés « amorces »). Finalement, l’étape 3, l’élongation correspond à réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire. À la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme d'ADN double brin. o Les trois étapes, constituant un cycle de PCR, sont effectuées à des températures différentes permettant de contrôler l’activité enzymatique. Pour effectuer ces transitions de températures, les microtubes contenant le mélange réactionnel sont placés dans un appareil programmable : un thermocycleur. Cet appareil permet d’exposer les tubes à des températures choisies et pour des durées déterminées par l’expérimentateur. La réaction PCR est extrêmement rapide et ne dure que quelques heures (2 à 3 heures pour une PCR de 30 cycles).  7 o Cette technique permet donc l’amplification d’une très petite quantité d’ADN en un très grand nombre de copies conformes en tout point à la molécule originale. De plus, étant une méthode très spécifique de par les amorces utilisées, la technique du PCR peut aussi servir à déterminer précisément l’espèce à laquelle appartient cet ADN. En effet, chaque espèce possède des gènes qui leur sont spécifiques et dont la séquence en nucléotides est unique. Ainsi, il est possible de fabriquer en laboratoire des amorces complémentaires à ce gène précis et donc de permettre uniquement l’amplification de cette séquence, même si l’échantillon de départ est constitué d’un mélange d’ADN provenant de plusieurs espèces. De cette façon, il est possible d’amplifier seulement un fragment d’ADN provenant du virus et ainsi permettre sa détection dans un échantillon sanguin. o Cependant, la technique d’amplification par PCR ne permet pas de visualiser le résultat de l’amplification (ou non) du gène d’intérêt. Une deuxième technique doit donc être utilisée en ce sens pour pouvoir observer le résultat du test de PCR. La méthode d’électrophorèse sur gel d’agarose est une méthode de choix pour faire cette visualisation des fragments d’ADN amplifiés par PCR. Cette méthode permet la migration de fragments d’ADN dans un gel solide formé d’agarose sous l’action d’un champ électrique. L’ADN étant chargé négativement de par les nombreux groupements phosphate retrouvés dans sa structure, il se dirigera vers la borne positive lorsqu’on le soumet à un champ électrique. De plus, si l’échantillon contient plusieurs fragments d’ADN de différentes tailles, les fragments les plus courts auront tendance à migrer plus rapidement dans le gel que les fragments les plus longs. En effet, plus le fragment d’ADN est long, plus il aura de la difficulté à traverser le gel. Finalement, suite à la migration de l’ADN, il est possible de visualiser ces molécules en colorant le gel. Les fragments d’ADN seront visibles sous forme de bandes et leur taille relative pourra être déterminée en comparant leur distance de migration à une échelle moléculaire standardisée contenant plusieurs fragments d’ADN de longueurs connues. Puits Notion de témoin (contrôle) o Lors de l’élaboration d’un test de détection par PCR, il est nécessaire d’avoir un point de comparaison pour ainsi confirmer la présence ou non de l’ADN viral dans l’échantillon sanguin analysé. o Il faut donc prévoir, lors de chacune des séries d’analyse par PCR, des groupes témoins permettant cette comparaison. Les groupes témoins utilisés seront nommés contrôle positif et contrôle négatif. Le contrôle positif sert à assurer le bon fonctionnement de la méthode et démontre ce à quoi devraient ressembler les résultats lors de la présence du virus dans un échantillon inconnu en permettant l’amplification de l’ADN viral. Son rôle est de confirmer l’efficacité du test de détection. Pour sa part, le contrôle négatif démontrera à quoi ressemblent les résultats de l’analyse PCR lorsqu’il y a absence du virus dans les échantillons sanguins (aucune amplification de l’ADN). Le contrôle négatif est essentiel, car il permet de vérifier que le test de détection par PCR est sélectif et qu’il ne réagit qu’avec un échantillon infecté par le virus étudié. o Sans ces groupes témoins, aucune analyse cohérente ne peut être faite à partir de vos résultats : ils sont donc indispensables à votre expérimentation! Finalement, l’analyse par PCR permet seulement la détection de la présence ou non du virus dans un échantillon sanguin. Cependant, malgré sa puissance, il doit être mis en contexte et une analyse plus approfondie des symptômes et de la multitude des données contextuelles recueillies pour chacun des patients doit être effectuée pour ainsi comprendre la progression de l’épidémie dans la population et évaluer les mesures à prendre pour la contenir efficacement.  8 PROJET PLOUMBWIT CAS CLASSIQUE : EXPÉDITION FRANKLIN L’expédition menée par Sir John Franklin, vétéran déjà de quatre expéditions en Arctique, eut lieu de 1845 à 1851 dans le nord-ouest de l’Arctique canadien. Ce fut la seule expédition britannique du genre où tous les participants (129) moururent lors de ladite expédition. Les Anglais, maîtres des mers au début du 19e siècle, voulaient trouver un moyen de passer, par le nord, de l’océan Atlantique à l’océan Pacifique, diminuant ainsi de beaucoup le temps requis alors pour faire ce passage en contournant l’Amérique du Sud. Les bateaux étaient superbement outillés pour l’époque et remplis d’aliments en conserve. Pris dans les glaces, les officiers décidèrent d’abandonner les bateaux et essayèrent, avec leurs hommes, de rejoindre la civilisation par les terres. Tous moururent à plus ou moins brève échéance de faim, de pneumonie et de tuberculose. La désorientation des membres d’équipage, les décisions souvent bizarres des officiers pendant leurs pérégrinations et la grande concentration de plomb dans les os des squelettes qui furent retrouvés lors des recherches subséquentes firent croire aux chercheurs que les participants à l’expédition Franklin auraient pu être victimes d’un empoisonnement au plomb (saturnisme). Le plomb (sous forme d’ion Pb2+) s’accumule dans le corps (notamment dans le cœur, les os, les intestins, le foie, les poumons, le cerveau et les reins) et affecte le système nerveux. Il est particulièrement toxique pour les enfants. L’accumulation de plomb dans le corps (plombémie, mesurée en g Pb / dL dans le sang) entraîne divers symptômes qui seront décrits plus loin. Il y avait deux sources principales de plomb à l’intérieur des bateaux. Les conserves étaient scellées par des soudures contenant jusqu’à 30 % de plomb, et les conduites d’eau du bateau contenaient également beaucoup de plomb. Cependant, les chercheurs sont toujours divisés actuellement sur la contribution de ces deux sources de plomb à la plombémie des marins de cette funeste expédition. Toutefois, les deux épaves ont été récemment retrouvées (2014 et 2016) et on a pu remonter à la surface plus de 350 artéfacts qui permettront d’en apprendre davantage sur ce qui s’est passé. Les recherches se poursuivent actuellement ! PARTIE TECHNIQUE Principe global d’analyse expérimentale Déterminer la concentration en plomb d’un échantillon de plasma sanguin à l’aide de méthodes semi- quantitatives et quantitatives Paramètres de l’analyse des résultats o Solutions standards (témoins) : solutions de concentrations connues de l’analyte à doser (ici, l’ion Pb2+) et qui servent de témoins positifs (la concentration « 0 », soit de l’eau déminéralisée, sert de témoin négatif). Ces solutions sont préparées en transférant un volume désiré de solution-mère (concentration élevée d’ions Pb2+) d’une burette à une fiole jaugée, en y ajoutant de l’eau déminéralisée jusqu’au trait de jauge et en homogénéisant le tout. o Solutions à analyser (inconnus) : solutions dont on veut déterminer la concentration de l’analyte o Méthode semi-quantitative (précipitation au KI) ▪ Méthode : ajout de quelques grains de KI solide à 1 mL de solution d’ions Pb 2+ à analyser ▪ Espèces impliquées : Pb2+ (aq) + 2 I- (aq) → PbI2 (s)  (solide jaune) o Méthode quantitative (colorimétrie) ▪ Méthode : l’ajout d’une solution de cochenilles ou de fluorescéine à une solution d’ions Pb2+ crée une couleur caractéristique, et la teinte de celle-ci varie selon la concentration d’ions Pb2+. ▪ Cochenilles (insecte de la famille des Coccidés). L’écrasement de cet insecte séché fournit du carmin rouge, un colorant utilisé depuis l’Antiquité en Amérique centrale.  9 Analyse des résultats o Préparations des solutions standards ▪ Équation de base pour les calculs (+ calculs d’incertitudes) : c1V1 = c2V2 o Analyse semi-quantitative ▪ Les solutions très diluées d’ions Pb2+ montrent habituellement un liquide transparent incolore à ce test, alors que l’augmentation de la concentration d’ions Pb 2+ amène l’apparition d’une quantité de précipité jaune de PbI2 de plus en plus importante. ▪ La quantité de précipité obtenue pour chacun des échantillons inconnus est comparée aux solutions standards (témoins). Cette comparaison permet d’établir un intervalle de concentrations en ions Pb2+ pour chacun des échantillons inconnus. o Analyse quantitative (colorimétrie) ▪ On choisit une longueur d’onde d’analyse pour laquelle l’écart entre l’absorbance du complexe colorant-ions Pb2+ et l’absorbance du colorant seul est maximale. ▪ Préparation des cuvettes : rinçage préalable de la cuvette, vérification du colorimètre avec un « blanc » (eau déminéralisée), mélange d’un volume égal d’extrait de cochenilles et de solution aqueuse d’ions Pb2+, dans une cuvette, homogénéisation, mesure de l’absorbance à la longueur d’onde choisie. ▪ Chaque mélange est refait deux autres fois, de façon à obtenir pour chaque solution trois mesures d’absorbance (triplicata). On calcule ensuite la moyenne des absorbances pour une solution donnée (+ calcul d’incertitudes). ▪ Courbe de calibration : absorbance moyenne pour les solutions standards en fonction de leurs concentrations en ions Pb2+. On trace la meilleure courbe passant par le maximum de rectangles d’incertitudes, puis on réajuste le centre des rectangles sur cette courbe afin de tracer la courbe minimale et la courbe maximale, définissant ainsi un corridor de valeurs possibles. Les domaines d’absorbances obtenus pour les solutions inconnues permettent, par interpolation sur cette courbe, de trouver leurs domaines de concentrations en ions Pb2+. ▪ Tableau des valeurs de concentrations en Pb2+ obtenues par les trois méthodes précédentes (KI, extrait de cochenilles, fluorescéine) pour chaque échantillon inconnu. Ces valeurs sont comparées pour déterminer si elles sont égales physiquement. La zone d’intersection des valeurs obtenues fournit une plage de valeurs fiable pour la concentration en ions Pb2+ d’un échantillon donné. S’il n’y a pas égalité physique, une analyse de la fiabilité relative des trois méthodes d’analyse pour le domaine de concentrations étudiées devrait faire ressortir un résultat plus probant. ▪ Les résultats de plombémie sont alors analysés en fonction de la gravité des symptômes des patients (irritabilité et retard intellectuel dès les faibles concentrations ((10-25) g/dL), puis maux de tête, coliques, constipation, faiblesse générale, pertes de mémoire pour les concentrations « moyennes » ((25-100) g/dL), et enfin anémie, vomissements, tremblements,  10 encéphalopathie, lignes noires sur les gencives, convulsions et coma pour les concentrations élevées ( 100 g/dL). Tout symptôme incohérent avec la plombémie mesurée doit faire l’objet d’études pour identifier la présence d’autres maladies. ▪ Les résultats de plombémie doivent aussi être reliés aux sources de plomb possibles pour l’individu. Ces sources sont habituellement : ✓ l’eau potable (vieux raccord en plomb avec l’aqueduc municipal); ✓ la vieille peinture sur les maisons (céruse : pigment blanc au plomb) : les enfants mangeant des flocons de peinture de façon compulsive sont dits atteints de pica; ✓ la peinture au minium (pigment rouge au plomb) des peintres, dont certains ont la mauvaise habitude de lécher leur pinceau; ✓ le khôl (fard à paupières traditionnel au Moyen-Orient). o Analyse quantitative (chromatographie en phase gazeuse) ▪ Cette technique permet de séparer des substances organiques volatiles d’un échantillon inconnu et de déterminer leur pourcentage relatif. ▪ L’échantillon inconnu est injecté dans l’appareil à l’aide d’une seringue, et il est transformé en vapeur qui est entraînée dans une colonne par un gaz porteur. Chaque substance est détectée à la sortie de la colonne et apparaît comme un pic distinct sur un chromatogramme. ▪ Les conditions expérimentales (la pression du gaz porteur qui entraîne les substances dans la colonne et la température de la colonne) sont optimisées pour maximiser la distance entre les pics dans un temps raisonnable. ▪ Chaque pic est défini par son temps de rétention (temps que met la substance à parcourir toute la colonne), comme dans l’exemple ci-dessous. Une augmentation de la température de la colonne et/ou de la pression du gaz porteur ont tendance à le diminuer. ▪ L’intégration par le logiciel de traitement de données de la surface sous chacun des pics du chromatogramme permet de déterminer le pourcentage relatif des substances présentes dans le mélange initial. ▪ Dans le cadre de ce projet, pour les patients ayant une concentration élevée en ions Pb 2+ ( 100 g/dL), les pourcentages relatifs des substances volatiles présentes dans la sueur des patients permettent de déterminer si la contamination est due au plomb terrestre ou au ploumbwit.  11 PROJET SPRÉENNEPOGNE CAS CLASSIQUE : CATASTROPHE DE BHOPAL La compagnie américaine Union Carbide Corporation a installé en 1978 une filiale à Bhopal (800 000 habitants), en Inde. Cette usine était chargée de fabriquer des pesticides en utilisant de l’isocyanate de méthyle (MIC) (CH3-N=C=O), une substance très volatile (température d’ébullition : 39oC), lacrymogène, à l’odeur âcre, peu soluble dans l’eau, plus lourde que l’air et qui s’enflamme facilement. Dans la nuit du 2 au 3 décembre 1984, une fuite de gaz se produit à l’usine de pesticides d’Union Carbide de Bhopal. Le nuage empoisonné provenant de l’usine couvre une zone de plus de 20 kilomètres carrés lorsque les habitants réalisent ce qui se passe et commencent à s’enfuir. Le résultat fut catastrophique : il y eut des milliers de morts la nuit même (entre 16 000 et 30 000 dans les jours qui suivirent); les médecins, débordés et mal formés pour ce genre de contamination, donnèrent aux malades du sirop et des gouttes pour les yeux. On estime aujourd’hui qu’il y eut plus de 300 000 personnes affectées dans les années suivantes d’une façon ou d’un autre. Les effets sur la santé des gens furent multiples : - À court terme : œdème pulmonaire et hémorragie des voies respiratoires, causés par la réaction exothermique de l’eau dans les muqueuses avec la vapeur d’isocyanate de méthyle, photophobie, diarrhée - À moyen terme et long terme : conjonctivite chronique, kératopathie, asthme, capacité pulmonaire réduite, douleurs abdominales, incidence plus élevée de cancers Aujourd’hui, plus de quarante ans plus tard, l’ancienne usine de pesticides rouille tranquillement sans que le site comme tel ait été nettoyé : beaucoup de composés ayant un impact majeur sur la santé y sont encore présents. PARTIE TECHNIQUE Principe global d’analyse Évaluer la capacité de composés appelés chalcones à inhiber l’action de l’enzyme impliqué dans la pigmentation de la peau. Paramètres de l’analyse des résultats Les chalcones agissent comme intermédiaires dans la biosynthèse des flavonoïdes végétaux, qui sont les pigments responsables de la coloration jaune, bleu et rouge des fleurs et des fruits. Elles sont composées de deux cycles aromatiques liés par une chaîne carbonée comportant une cétone et un alcène conjugués. La conjugaison étendue impliquant les deux cycles aromatiques, la cétone et l’alcène explique la coloration spécifique (jaune-orangé) de ces composés. Les chalcones peuvent être substituées en de nombreuses positions sur les cycles aromatiques (positions 2 à 6 ainsi que 2’ à 6’), ce qui permet de moduler leur effet  12 Synthèse d’une chalcone o La synthèse de chalcones se fait en mélangeant une acétophénone substituée (R 1) (ou non) et un benzaldéhyde substitué (R2) (ou non), en présence d’une solution aqueuse concentrée de NaOH et d’éthanol. Cette réaction, appelée condensation aldolique, crée d’abord un aldol, qui est ensuite déshydraté dans les conditions expérimentales pour former une chalcone. o Les substituants R1 et R2 le plus souvent utilisés sont OH (hydroxy) et OCH3 (méthoxy). ▪ Les étapes de la synthèse d’une chalcone sont les suivantes : mélange des substrats, reflux (15 minutes), refroidissement à T pièce, ajout d’acide aqueux pour neutraliser l’excès de NaOH, et pour transformer les phénolates en phénols, filtration sous vide du précipité jaune-orangé (chalcone). ▪ Pourcentage de rendement de la réaction : (masse chalcone obtenue / masse chalcone attendue) x 100 % o Recristallisation (purification) de la chalcone : transfert d’une certaine quantité de chalcone brute dans un bécher, ajout d’un minimum d’éthanol chaud pour assurer la dissolution complète de la chalcone, refroidissement graduel de la solution (réapparition du solide), filtration sous vide, rinçage à l’éthanol froid et obtention d’une chalcone purifiée. Le principe de cette méthode est que la chalcone recristallisée (ou purifiée) ne devrait contenir que des molécules de la chalcone tandis que les impuretés (réactif en excès ou autres) demeurent en solution. Indices de l’efficacité du processus de purification de la chalcone (distinction chalcone purifiée / chalcone brute) o Aspect du précipité : plus cristallin. o Chromatographie sur couche mince : diminution ou disparition sur le chromatogramme des taches mineures accompagnant la tache associée à la chalcone. o Température de fusion : augmentation de la température de fusion, car la présence d’impuretés empêche le cristal de bien se former. Identification de la chalcone (distinction chalcone purifiée / composés de départ) o Couleur du précipité : le système  très conjugué des chalcones leur confère une couleur jaune- orangée qui les distingue clairement des composés de départ utilisés (habituellement incolores ou jaune pâle) o Chromatographie sur couche mince : présence d’une seule tache distincte n’ayant pas la même hauteur (mesurée par le Rf (hauteur de la tache / hauteur parcourue par le solvant)) que celles des composés de départ. Il peut cependant arriver que le R f de la chalcone soit identique à celui de l’un ou l’autre des composés de départ, dans lequel cas il faudrait alors essayer de changer de solvant d’élution pour essayer de créer une différence. o Température de fusion : température de fusion généralement plus grande que celle des composés de départ, car elle dépend en grande partie de la masse molaire des composés : or, la chalcone synthétisée est une combinaison (moins une molécule d’eau) des composés de départ ! o Spectroscopie UV-visible : augmentation, par rapport aux composés de départ, de la longueur d’onde où l’on retrouve un maximum d’absorption, car les chalcones ont un système π plus conjugué que dans les composés de départ. Toutefois, la longueur d’onde au maximum d’absorption ne change pas entre la chalcone brute et la chalcone pure. o Spectroscopie infrarouge : Bandes présentes dans les composés de départ ET dans la chalcone : (C=C aromatiques, C=O carbonyle, H-C=C sp2). D’autres bandes peuvent être présentes selon les substituants R1 et R2. Lors de la synthèse : disparition du C-H aldéhyde et apparition d’un C=C alcène (et disparition des H-C sp3 de l’acétophénone si ces bandes ne sont pas présentes dans les substituants).  13 Efficacité d’une chalcone comme antioxydant o La tyrosinase est une enzyme de la catégorie oxydo-réductase que l'on retrouve à la fois dans le règne animal (où elle catalyse la formation de la mélanine; elle est donc impliquée dans la formation de la pigmentation) et dans le règne végétal (où elle est responsable du brunissement des fruits lorsque leur pulpe est soumise à l'action de l'air). Dans ce laboratoire, la tyrosinase est extraite de pommes et catalyse l’oxydation du catéchol (substrat) en o-quinone (produit), qui polymérise et crée un composé brunâtre, selon l’équation suivante : o On peut évaluer la vitesse initiale de cette réaction (v o) en mesurant à l’aide d’un colorimètre la variation d’absorbance de la solution pendant une minute, selon l’équation suivante : Vo (en min-1) = ((absorbance à 1 min) – (absorbance à 0 min)) / 1 min o Certaines substances, appelées inhibiteurs, empêchent la tyrosinase de bien catalyser la réaction en se liant à son site actif ou à son site allostérique. Il y a alors diminution de la vitesse initiale de réaction. o Les chalcones sont insolubles dans l’eau, mais très solubles dans un solvant polaire, le diméthylsulfoxyde (DMSO). Or, la tyrosinase doit être testée en milieu aqueux. On dissout donc une certaine masse de chalcone dans un volume minimal de DMSO et on entreprend une série de dilutions avec de l’eau qui se poursuit tant qu’il y a précipitation de la chalcone. o La meilleure chalcone-médicament sera celle qui, pour une même quantité de chalcone utilisée, causera la plus grande inhibition. Il faudra donc tenir compte à la fois de l’effet inhibiteur noté, mais également de l’ampleur des dilutions qu’a subi l’échantillon. Par exemple, si on observe pour deux chalcones différentes le même pourcentage d’inhibition, mais que l’une des deux est dix fois plus diluée que l’autre, celle qui est la plus diluée sera un bien meilleur inhibiteur !