La Réplication de l'ADN PDF

La réplication de l'ADN Répliquer infrmationon genetique pour transmettre prochaines générations - Réplication **efficace et fidèle** (3,3 milliards (x10\^9) de bases dans cell) - Mais obligatoirement des **imperfections** - Le modèle élaboré par Watson et Crick, basé sur la complément...

La réplication de l'ADN Répliquer infrmationon genetique pour transmettre prochaines générations - Réplication **efficace et fidèle** (3,3 milliards (x10\^9) de bases dans cell) - Mais obligatoirement des **imperfections** - Le modèle élaboré par Watson et Crick, basé sur la complémentarité des bases, est parfaitement compatible avec un mécanisme de copie du matériel génétique. Réplication conservative-semi-dispersive ======================================== Conservatif -\> l'**entier de la double hélice** est copié à la génération Semi -\> **2 brins hybrides et deux nouveaux** Dispersif -\> **synthétiser et mixer -\> mélange** Preuve (expérience de Meselson et Stahl) : ------------------------------------------ Les deux brins d'ADN (d'une bactérie) sont initialement cultivés dans un milieu contenant de l'azote **lourd (N^15^)** - Ensuite transféré dans milieu azote léger (N^14^) avant la réplication - Materiel utilisé pour la réplication prise dans le milieu (azote léger) Difficile de mesurer le poids de l'ADN = bonne idée Le modèle semi-conservatif gagne - Chaque brin est utilisé pour faire une copie - Compliqué d'imaginer une machinerie pour faire fonctionner les autres modèles  Quelle phase du cycle cellulaire ? -\> G1 puis S avec le cycle cellulaire puis G2 (cellule a le double de son génome) puis M en entrant dans la mitose et l'anaphase ainsi que la cytokinese (condensation des chromosomes et séparation) - Préparation duplication : **G1** - Réplication phase : **S** - Préparation mitose : **G2** - Division cellulaire : **M** Yeux, fourches et domaines de réplication  ==========================================  Points = **les histones** Yeux = **les fourches de réplication** Avancée de la réplication : on réplique de partout pas en trait continu - 8h pour réplication complète ---------------------------- **Le mix replicatif** --------------------- - Mettre tube à l'essai : - **ADN** : simple brin - **Nucleosides triphosphates** (pppT-G-A-C) - **Amorce** (primer) - Enzyme qui fractionne : **ADN polymérase** Arthur Kornberg -\> ADN polymérase La synthèse d'ADN AMP (monophosphate) -- ADP (diphosphate)- ATP (triphosphate) Plus de phosphates + d'énergie pour produire d'autres liaisons covalentes ATP -\> lâcher un groupe = ajouter un nucléotide dans une autre chaîne **Polymérisation directionnelle en 5' en 3'** Les pyrophosphates sont utiles pour leur **énergie** en formant **des liens avec les nucléotides** Un nucléoside triphosphate arrive et s'apparie avec sa base complémentaire. Il va rompre son groupe phosphate et relâcher le pyrophosphate (diphosphate) et procéder avec la formation de liens phosphodiester (sucre/phosphate) avec les autres nucléotides. L'**ADN polymerase** va catalyser le lien covalent entre le **nucleoside** (base + sucre) monophosphate dans son nouveau brin. L'ADN et les primers sont **faciles à** produire **chimiquement** 1. **Obtention d'ADN simple brin** -\> **Helicase** encercle un brin -\> **+ ATP** -\> transforme ATP en ADP -\> pas simple brin solo -\> **SSB** se lie et reconnaît -\> deux côtés de La Fourche 2. **Production de l'amorce** Les **ADN polymérases** ont **besoin de l'amorce** que la primase va synthétiser. La polymérase peut s'y lier et répliquer la région en aval. Ceci se fait des **deux côtés de la fourche**.  Synthétise de l'ARN -\> Duplex avec de l'ADN et de l'ARN. 3. **Initialisation de la réplication** On trouve un lieu propice à la réplication. Puis, des **protéines d'initiation** se chargent et déstabilisent les sequences en attendant que l'**hélicase** vienne avec sa **protéine de chargement** puis elle s'active et commence avec sa fourche bidirectionnelle. L'**hélicase** (DnaB) a besoin d'ATP. Elle prend l'ATP et la transforme en ADP. Les **SSB** vont sur le brin simple (**60/fourche**). **L'ADN polymérase 3** débute la synthèse du brin précoce, Les deux polymérases se chargent. **Démarrage de la polymérisation** La polymerase 3 commence la synthèse sur le brin **précoce**. La primer à une fin **3'OH libre.** Le nucléotide arrivant a un **5'triphosphate.** Puis, un diphosphate est relâché quand le nucléotide est ajouté à la chaîne. -\> Nucleotide + triphosphate se lie -\> fin 3' OH du primer -\> diphosphate relâché Un lieu **propice à la réplication :** - Une séquence riche en **AT** (2 ponts donc + facilement déstabilisable) - **Forme non canonique** (Non-B) - **G quadruplex** =\> rend plus difficile la déposition d'histone **Réplication : 5'-3'** -\> une partie doit se faire dans le sens contraire avec les fragments d'Okazaki Très peu d'ADN simple brin et s\'il y a -\> couvert de protéines SSB **[L'élongation de la réplication ]** Une partie doit se faire **dans le sens inverse** **Primase** -\> synthétise amorce d'ARN **Poly 3** -\> étend l'amorce ARN dans le fragment d'Okazaki **Fragment d'Okazaki** suivant synthétiser **Poly 1** utilise le trou pour remplacer l'amorce ARN en ADN - **Activité 5'-3' exonucléase** **Ligase** -\> lie les deux fragments d'ADN (okazaki) ----------------------------------------------------- Elle **consomme de l'ATP**. L'ATP vient amener l'énergie nécessaire. Il reste que AMP à la fin et il part. - Assez d'énergie pour former le brin continu Chez les eukcaryotes : système très similaire --------------------------------------------- - Procéssivité de la polymerase : enzyme capable d'enchaîner les actions **[La fidélité de la réplication]** 10^3^ bases -\> 1 erreur donc trop ---------------------------------- 1. **Correction sur épreuve** (proofreading) (**Réplication en cours**) - L'ADN polymérase a une activité : **5'-3' polymerase et 3'-5' exonucléase** - Exonucléase enlève plus souvent une mauvaise qu'une bonne - Une erreur chaque 10^6^ maintenant Retrait nucléotide -\> appariement correct 2. **Réparation des mésappariements** (mismatch) (**Réplication finie**) - Protéines de réparation coupent l'ADN, enlèvent (et recopient) ------------- - Complexe de protéines reconnaît et lie les mésappariements de l'ADN - Comment reconnaître le brin matrice ? **La méthylation (GATC) -\>** est méthylé mais pas le groupe AC Brin non méthylé est dégradé - Synthèse d'ADN répare le brin que chez les procaryotes ! Pas très clair -\> petits trou ? Une erreur chaque 10^9^ 1. **[Problème topologique]** Le déroulement de l'ADN crée des surenroulementstensions -\> enroulements -\> réduire tension - Pour relacher les tensions on utilise un topoisomérase I **[Le stress de torsion de l'ADN ]** Relâché par la **rotation libre** de l'ADN autour des liens phosphodiesters de l'autre cote de la cassure simple brin. -\> **Les Topoisomérases I répareront la cassure.** **[Les topoisomérases]** **Topoisomérase I:** coupure simple brin - Détecte l'enroulement - Vient avec une **tyrosine** au site actif - S'attache à un **phosphate** cassant un lien phosphodiester - Les deux fins de l'hélice **peuvent tourner** - L'énergie du lien phosphodiester va dans le lien phosphotyrosine - **Fait l'inverse :** casse tyrosine pour former lien phosphodiester - **Pas besoin d'énergie** contrairement aux T2 **Jon :** - Après un surenroulement causé par l'ouverture créée par l'hélicase, le top. I va couper un des brins de l'ADN pour relacher la tension - Il casse une liaison phosphodiester mais utilise l'E de la casssure pour former une liaison covalente avec le phosphatel'E stocké dans la liaison covalente est utilisée pour recréer la liaison phosphodiesterneutralité d'énergie / **énergie interne seulement utilisée** **Topoisomèrase** **II ** coupe un double brin pour enlever le nœud crée avec un autre double brin - Besoin d'énergie externe : **deux molécule d'ATP** car deux coupures qui vont devenir ADP apres l'hydrolyse 2 hélices sont entrelacées : -\> Topoisomérase 2 arrive -\> brancher à un brin d'ADN avec un **attachement covalent réversible** -\> crée une **cassure double** et une porte protéique -\> ouverture porte pour laisser passer l'autre hélice -\> se ferme et relâché la seconde hélice ( maintenir les deux bouts à une distance l'un de l'autre-\> l'autre brin passe-\> on ferme.) - L'attachement covalent est rétabli de manière intacte  **[Les extrémités : les chromosomes ]** - Sont composés de **séquences répétées** (TTAGGG) donc non codantes - La taille des télomères détermine l'âge des cellules somatiques. - La **télomérase** empêche la reduction de taille - Plus assez de place pour les fragments d'Okazaki donc télomères deviennent plus petits - Comment fait la **télomérase** ? Elle ramène un chablon qui augmente la fin du télomère-\> **primase** peut produire une amorce - Fragments Okazaki Moins en moins de télomères quand on vieillit. Si Télomères trop petits -\> cellules deviennent **sénescentes (**s'arrête de fonctionner et se diviser) Si mutation dans le promoteur du gène de la télomérase -\> + de télomérase produite - Les cellules cancéreuses pensent qu'elles sont jeunes =\> continuent à se reproduire **La réplication comme cible thérapeutique** Analogue de nucléosides **AZT** -\> azidothymidine ressemble à thymine à part groupe azote -\> **poison qui bloque élongation**. D'autres comme la **deoxycytidine et l acycloguasine** Inhibiteur d'enzyme crée une **instabilité génétique cytotoxique** : **T1** -\> anti-cancer (Irinotecan) **T2**-\> anti-biotique (Moxifloxacin) et anti-cancer (teniposide) **La PCR** Polymerase chain reaction -\> polymerase venant des fonds marins pour fonctionner à une temperature élevée. 1. **Chauffer** pour séparer les brins + **ajouter amorce** 2. **Refroidir** pour apparier les amorces 3. **Synthèse d'ADN** (difficile de trouver ADN poly) 4. **Production du premier cycle** Les amorces sont synthétisées chimiquement et spécifique à la région qu'on veut amplifier. Paires d'amorces -\> on lit dans les deux sens surtout dans la zone entre les deux Peu à peu on a le fragment cible. **2 premier cycle puis 4 puis 8** On rend les produits fluorescents afin de les suivre en temps reel. Augmentation rapide -\> bcp de produits Augmentation lente -\> peu de produits Pas d'augmentation-\> pas de produit  PCR - Principe - Besoin : - amorce -\> région à amplifier si le brin négatif et positif - Polymerase adn -\> adn dépendante - Nucleoside 3 phosphate 1)Fonctionner le système en chauffant -\> séparer 2\) refroidir -\> rehybrider -\> bcp d'amorce -\> amorce s hybrident en haut et en bas 3\) réchauffer un peu -\> adn polymerase plonge l'amorce -\> élongation -\> un cycle -\> refaire le cycle 30 à 40 fois Faire plein de fois Produit premier cycle - Après 4 1 cycle : 2 2 cycles : 4 3 cycles : 8 Particularité -\> amplifier une région précise - Patient dans une mutation dans le génome - Amplifier pur voir présence ou non - ADN difficile -\> travailler avec de grandes quantités Résolution -\> plusieurs manières avec crossing over -\> coupures dans plusieurs sens