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Biochemie 1. Blut AUFGABEN 1. Transport und Kommunikation (Nahrungsstoﬀe, Sauerstoﬀ, Metabolite wie Glucose, Lactat, AS, Fettsäuren…, Abfallstoﬀe wie CO2, NH3, Harnstoﬀ, Harnsäure, H+, Elektrolyte, Hormone) 2. Puﬀerfunktion: H+ —> Konstanterhaltung des pH-Werts 3. Abwehr und Schutz 4. Hämostase: Blutstillung und Blutgerinnung 5. Regulationsfunktion (Temperatur, Wasserhaushalt) a) Zelluläre Bestandteile: Erys, Leukozyten, Thrombozyten b) Blutplasma: 90% Wasser, 10% gelöste Bestandteile Blutserum + Fibrinogen = Blutplasma Erys: 5 Mio / microliter Leukos: 4-10 000 / microliter Thrombos: 150-400 000 / microliter Protonenbildung im Stoﬀwechsel CO2 + H2O H2CO3 HCO3- + H+ CO2-Bildung führt zur Bildung von Säureäquivalenten (in Form von freien H+) Gesamtmenge pro Tag: 13-20 mol (= 850 mmol/h) Das entspricht einer H+-Menge, die in 13-20 Liter einer 1 molaren Salzsäure enthalten sind. Herkunft der H+ 1) CO2-Produktion 2) Anhäufung von H+ aus dem Intermediärstoﬀwechsel (flüchtige organische Säuren wie Laktat) 3) Bildung von Netto-Protonen (=nicht flüchtige anorganische Säuren wie Schwefel und Phosphorsäure) 1) Kohlenhydrate Glucose + 6 Sauerstoﬀ —> 6 CO2 + 6 Wasser 6 HCO3- (Hydrogencarbonat) + 6 H+ Lipide Palmitat- + H+ + 23 Sauerstoﬀ —> 16 CO2 + 16 Wasser 16 HCO3- + 16 H+ Proteine Alanin + 3 O2 + 2 Wasser —> 3 CO2 + 3 Wasser + NH3 3 HCO3- + 2 H+ + NH4+ 2 NH3 + CO2 —> Harnstoﬀ 2) Abbau des Zuckers unter anaeroben Bedingungen Glucose —> 2 Milchsäure 2 Lactat- + 2 H+ Palmitat- + H+ + 5 O2 —> 4 beta-OH-Buttersäure 4 beta-OH-Butyrat- + 4H+ 1 Anaerobe Glykolyse bei O2-Mangel: Milchsäure —> Lactat —> Gluconeogenese in Leber und Niere —> Glucose —> Milchsäure normal: 1 mM Fettsäuren —> Ketogenese (Leber): Acetessigsäure —> Aceton (Ketolyse) —> Ketonkörper —> CO2 und Wasser normal: < 0,5 mM Erhöht bei verstärktem Fettabbau / Fasten / Diabetes mellitus 3) S-haltige AS Phospholipide, Nucleotide, Nucleinsäuren Protonenelimination aus dem Stoﬀwechsel CO2 —> Lunge (Abatmung von CO2) Ketonkörper —> Lunge (Oxidation —> CO2 + H2O) Lactat —> Lunge (Lactat-Oxidation —> CO2 + H2O) / Leber (Gluconeogenese: Glucose) Netto-Protonen —> Niere (Oxidation von Stoﬀwechselbasen Lactat, Maltat, Citrat) —> Nahrung und Stoﬀwechsel liefern eine H+-Menge von 60 +/- 20 mmol, die täglich über die Nieren ausgeschieden werden muss. —> Der Gesamtbestand des Körpers an H+-Ionen beträgt etwa 105 mmol. Diese sind an Basen gebunden, die als Puﬀer wirken. —> Insg. sind rd. 700 mMol Puﬀerbasen vorhanden. Bedeutung der Protonen > Reaktionspartner vieler Reaktionen > Einfluss auf Enzymaktivität > Atmung, Lungen- u. Nierenfunktion (zB Sauerstoﬀbindungsfähigkeit des Hämoglobins) > Verbindung mit System der Körperelektrolyte > H+-Gradient treibt ATP-Synthese voran (ADP3- + HPO4^2- + H+ ATP + Wasser) pH-Wert des Blutplasmas Normbereich Azidose Alkalose Überlebensbereich t t ________________________________________________ Versuch I 1.) Photomertrische pH-Bestimmung pH in Abhängigkeit des Verhältnisses Base : Säure p-Nitrophenol (farblose Säure) —> p-Nitrophenolat (gelb) 2 Extinktion bei 405 am höchsten (blaues Licht wird absorbiert -> gelbe Farbe) (Man sollte eine Absorption wählen, bei der Phenol nicht absorbiert) Den pH-Wert einer Lösung, die p-Nitrophenol und p-Nitrophenolat enthält, berechnet man mit der Henderson-Hesselbach-Gleichung: pH = pK + lg * (p-Nitrophenolat / p-Nitrophenol) DeltaE = Extinktion des Nitrophenolats DeltaEmax = Extinktion wenn Nitrophenol vollständig umgewandelt bzw. neutralisiert wurde DeltaEmax — DeltaE = proportional der Konzentration des nicht dissoziierten Nitrophenols ÄP (Äquivalenzpunkt) => Punkt an dem 100% Base vorliegt (am Diagramm = 2. Umkehrpunkt des Steigungsverhaltens) pK (ÄP/2) => Punkt an dem das erste Mal das Steigungsverhalten ändert (Säure:Base = 1:1) Wichtige Formel: Um die Konzentration des p-Nitrophenols zu messen, sieht man sich zunächst den ÄP an, und blickt auf die Konzentration und das Volumen der hinzugegebenen NaOH-Lösung. Man kann am Diagramm nun V (NaOH ablesen). Bei c = 1 mol/l und V= 1,9 ml liegt das p- Nitrophenol nun zu 100% als Base vor. Man verwendet die folgende Formel, da man weiß, dass man am Anfang 100 ml Säure hatte: c1 * V1 = c2 * V2 2) Modellversuch zum Co2-Bicarbonat-Puﬀer Im Gegensatz zum HCO3—Puﬀer, wirken nicht Bicarbonat Puﬀer (25%) auch bei respiratorischen Azidosen/Alkalose bei denen vermehrt/vermindert CO2 abgeatmet wird. NBP: Hämoglobin, Plasmaproteine, Phosphat 4 Küvetten werden begast: - 1 und 2 respiratorische Azidosen - 3: metabolische Azidose (Zugabe von Milchsäure —> es entsteht zusätzlich CO2) - 4: NBP (Phosphatpuﬀer) Astrup-Methode: mit 3 pH-Messungen kann eine unbekannte CO2-c gemessen werden. (Begasen mit Patientengasgemisch, dann mit 2 bekannten CO2-Gehalten begast). Ablesen beim halblogarythmischen Diagramm. 2. Proteine I 1. Funktionen - Baustoﬀe der Zelle (zB Aktin -> Cytoskelett) - bilden definierte Strukturen - kontrollieren Wachstum und Diﬀerenzierung - ermöglichen Bewegung (Mikrotubuli —> Spindelapparat) - verleihen Immunität (Antikörper) - wirken als Katalysatoren (Hexokinase (Enzym der Glykolyse) - transportieren und speichern Moleküle (Hämglobin, Ferritin = Eisenspeicherung) - ermöglichen Stoﬀaustausch (Porine = Transportmembranproteine von Mitochondrien, Aquaporine) - übermitteln Signale (Insulin und Glukagon: Peptidhormone zur Regulation des BZS) - tragen zur Energiegewinnung bei: AS können wie Fette oxidiert werden —> die dabei anfallenden Elektronen tragen zum Energiestoﬀwechsel bei. 3 2. Grundlagen Proteine sind lange, lineare Polymere aus monomeren Untereinheiten (—> 21 proteinogene AS) Alle Proteine / Peptide in den menschlichen Zellen werden aus den 21 proteinogenen AS gebildet. Posttranslationale Modifikation: zB Glykosilierung Primärstruktur = Abfolge der miteinander verknüpften AS (wird in der Protein-Biosynthese hergestellt = Translation) Sekundärstruktur = regelmäßige, lokale Strukturen innerhalb des Proteins; Proteine falten sich zu einer bestimmten dreidimensionalen Struktur (durch Wasserstoﬀbrücken zwischen benachbarten AS) > Entstehen durch H-Brücken zwischen benachbarten AS > Reste sind nicht an Brückenbildung beteiligt > es gibt alpha-Helix (rechtgängig, pro Windung 3,6 AS-Reste, 0,15 nm Abstand, Ganghöhe von 0,54 nm, Seitenketten zeigen nach außen, inneres dicht gepackt, Prolin unterbricht alpha-Helix —> Peptidbinung besitzt kein H-Atom, Serin, Aspartat und Asparagin stören ebenfalls die alpha-Helix) beta-Faltblatt (0,35 nm Abstand, Seitenketten in entgegengesetzte Richutngen, 4-5 beta-Stränge pro Faltblatt, Antikörper nahezu ausschließlich in beta-Faltblatt-Struktur, antiparallel / parallel) beta-Schleife (bewirken einen Richtungswechsel im Protein, stets an der Oberfläche von Proteinen, wichtig für Interaktion mit anderen Molekülen) omega-loop Spezielle Formen der alpha-Helix: 1. Coiled Coil-Proteine = supraspiralisierte Helix, 100 nm+ zb: Intermediärfilamente, Desmin, Keratine, Lamine, Vimentin, Myosin, … Keratin: vWK und ionische Wechselwikrungen: Dehnbarkeit, Kovalente Vernetzungen durch -S-S-Brücken: Festigkeit Tertiärstruktur = komplexe räumliche Struktur einer kompletten AS-kette (durch zahlreiche, verschiedene Wechselwirkungen) > hydrophobe und ionische Wechselwirkungen > Disulfidbrücken (intra/intermolekular) > H-Brücken > van-der-Waals-Kräfte > hydrophobe AS im Inneren des Proteins > polare, geladene AS exponiert, außen „Supersekundärstrukturen“ zB Zinkfinger, Helix-Schleife-Helix, Leucin-Zipper —> Proteindomänen von 30-400 AS, modular aufgebaut, spez. Funktion Quartärstruktur = Besteht ein Protein aus mehreren Polypeptidketten, wird deren räumliche Anordnung zueinander als Quartärstruktur beschrieben (Entsteht durch Wechselwirkungen der Protein-Untereinheiten (=Polypeptidketten) 4 3. Aminosäuren - Bausteine der Protein - Substrate der Glukoneogenese - können zu Metaboliten des Citratzyklus und der Glykolyse umgebaut werden - Vorstufe der Signalmoleküle (zB Histamin, Dopamin, Adrenalin) - sind NH3+-Donatoren für die Biosynthese Stickstoﬀ-haltiger Vebrindungen —> Purine und Pyramidine (DNA- und RNA-Bestandteile) - NH3-Gruppe zeigt in der Fischer-Projektion nach links - es gibt 21 proteinogene AS (welche in den Proteinen vorkommen) - mehr als 100 nicht-proteinogene AS (zB Ornithin, Citrullin als Zwischenprodukt des Harnstoﬀzyklus, Homocystein, Homoserin, Hippurat als Zwischenprodukte des AS-Abbaus) - Synthese zahlreicher N-haltiger Moleküle (sämtlicher Basen der Nucleinsäuren, fast alle Neurotransmitter, das Häm des Hämoglobins) In natürlich vorkommenden Proteinen kommen in der Regel L-AS vor. —> Außer: in D-Alanin und D-Glutamat der bakteriellen Zellwand Alle AS weisen folgende Merkmale auf: > eine Aminogruppe > eine Carboxylgruppe > ein zentrales C-Atom > ein Wasserstoﬀatom > einen Rest (Aminosäure-spezifische Seitenkette) Die Aminogruppe exponiert ein freies Elektronenpaar, welches leicht ein Proton (H+) aufnehmen kann (—> NH3+). Die Carboxylgruppe ist für den sauren Charakter der AS verantwortlich und gibt leicht ihr Proton ab. Die unterschiedliche Aﬃnität mit der die Gruppen der AS Protonen binden, kann experimentell durch Titrationskurven demonstriert werden. > AS sind bei niedrigem pH-Wert positiv geladen (weil die beiden Gruppen protoniert vorliegen) > Bei steigendem pH-Wert wird die AS negativer (H+ werden abgegeben) Amino- und Carboxalgruppen sind bei einem bestimmten, für die jeweilige Gruppe charakteristischen pH genau zur Hälfte protoniert, d.h. die Hälfte der Moleküle der Lösung weist bei diesem pH eine protonierte Gruppe auf, die andere Hälfte hat das Proton abgegeben. Diesen pH-Wert bezeichnet man als pKs-Wert der chemischen Gruppe. Durch die Aﬃnität der AS zu Protonen ändert sich bei einer Titration der pH-Wert in der Nähe des pKs-Wertes nur sehr verzögert. Steigt zB nach einer Zugabe von Säure die Anzahl der Protonen im Probegefäß, werden diese in der Nähe des pKs-Wertes bevorzugt an die AS binden, sodass sich die Konzentration in freier Lösung kaum ändert. = Puﬀerwirkung (Optimale Puﬀerkapazität in Nähe der pKs-Werte) AS mit mehreren Amino-/Carboxylgruppen (zB Glutaminsäure, Histidin, Lysin) haben mehr als 2 pK-Werte (Histidin zB 3). In natürlich vorkommenden Proteinen kommen in der Regel L-Aminosäuren vor (Ausnahme: D- Alanin und D-Glutamat im Murein der bakteriellen Zellwand). Die NH3+-Gruppe der AS zeigt in der Fischer-Projektion also nach links. Die Enantiomere der AS verhalten sich also Bild und Spiegelbild = inkongruente Spiegelbilder & nicht deckungsgleich. (Ausnahme: Glycin ist achiral) 5 AS sind in Lösung bei neutralem pH-Wert vorwiegend ionisiert. Es liegt ein dipolares Zwitterion vor: - die Aminogruppe ist protoniert (NH3+) - die Carboxylgruppe ist dissoziiert/deprotoniert (COO-) AS sind demnach Ampholyte und wirken als Puﬀer. Der isoelektrische Punkt Ip einer Aminosäure … … ist der pH-Wert, an dem das Zwitterion keine Nettoladung mehr trägt. … es liegen gleich viele positive und negative Ladungen in einem Molekül vor. AS mit ungeladenen Seitenketten entspricht der Ip dem Mittelwert der pKs-Werte der COO- und der NH3+-Gruppe. Klassifizierung der 21 proteinogenen AS ( aufgrund chemischer Eigenschaften ihrer Seitenketten in 4 Gruppen) 1. Hydrophobe AS mit einer nichtpolaren Seitenkette 2. Polare As mit einer neutralen Seitenkette (mit unregelmäßiger Verteilung der Ladung) 3. Positiv geladene AS mit einer Seitenkette, die beim physiologischen pH-Wert eine positive Ladung trägt 4. Negativ geladene AS mit einer Seitenkette, die beim physiologischen pH-Wert einen negative Ladung trägt Gruppe AS Kürzel Besonderheit + Hydrophob Glycin Gly/G - nur H als Rest Die hydrophoben AS neigen Alanin Ala/A - eine Methylgruppe dazu eher miteinander zu Prolin Pro/P - Ringstruktur ohne freie Aminogruppe assoziieren, als mit Wasser in Valin Val/V Kontakt zu treten —> Leucin Sie bilden kompakte Strukturen Isoleucin Ile/L mit wenig Zwischenräumen —> Methionin Met/M - Schwefelhaltige Thioestergruppe Wasser wird abgeschirmt bzw. soll abgeschirmt werden —> Phenylalanin Phe/F - Aromatische Seitenkette Vorkommen: oft im Inneren Tryptophan Trp/W - Aromatische Seitenkette löslicher Proteine (in Membranen eingebettet) Polar Serin Ser/S - Hydroxylgruppe (erhöht Hydrophilität) OH-Gruppe kann reversibel Threonin Thr/T - Hydroxylgruppe (erhöht Hydrophilität) phosphoryliert werden (Wichtig Tyrosin Tyr/T - Hydroxylgruppe (erhöht Hydrophilität) bei der Regulation von Proteinen - Enzyme und Signaltransduktion) Asparagin Asn/N Glutamin Glu/Q Cystein Cys/C - Enthält eine reaktive Wichtig für Stabilisierung von Sulfhydrylgruppe Proteinen, Disulfidbrücken können gebildet werden. Selenocystein - Wie Cystein nur Selen statt Schwefel Positiv Lysin Lys/K - kann posttranslational modifiziert … binden sehr leicht an (basisch)* werden (Acetylierung, Methylierung) Protonen (basischer Charakter) Arginin Arg/R - kann posttranslational modifiziert werden (Acetylierung, Methylierung) Histidin His/H - bei physiologischem pH-Wert teilweise protoniert —> Der Imidazolring kann Protonen leicht aufnehmen/abgeben —> gute Puﬀerfähigkeit —> bindet oft an Metallionen 6 Gruppe AS Kürzel Besonderheit + Negativ Aspariginsäure Asp/D Die zusätzliche Carboxylgruppe verliert (sauer)* Glutaminsäure Glu/E sehr leicht das Proton. —> Es entstehen die Anionen Aspartat bzw. Glutamat. —> saurer Charakter *bei physiologischem pH-Wert —> Schwefelhaltige Aminosäuren: Methionin, Cystein > alpha-C Atom trägt Aminogruppe > kovalente Modifikation fast aller AS, va. Glykosilierung (Anhängen von Zuckerketten); während oder nach der Translation (= co/ posttranslational) > AS werden sonst noch benötigt bei: a) Energiegewinnung (Oxidation —> Beitrag zum Energiestoﬀwechsel) b) Synthese zahlreicher N-haltiger Moleküle - sämtliche Basen der Nucleinsäuren - fast alle Neurotransmitter - Häm des Hämoglobins Proteinogene AS sind 20/21 AS, die bei der Proteinbiosynthese, d.h. der Translation, als Proteinbausteine zum Einsatz kommen. 21 mit Selenocystein (in 25 Proteinen des menschl. Körpers integriert. Entsteht durch Modifikation von tRNA-gebundenem Serin) Nicht-proteinogene AS (nicht zum Einbau in Proteine geeignet) haben teilweise wichtige Funkionen im Stoﬀwechsel: —> L-DOPA (Synthese aus Dopamin) —> Ornithin, Citrullin (Zwischenprodukte des Harnstoﬀzyklus) —> Taurin (in manchen Gallensäuren enthalten) = Sulfonsäure + Aminogruppe Isoelektrischer Punkt: Bei physiologischen pH im neutralen Bereich nimmt die Aminogruppe immer ein H+ auf, die Carboxylgruppe gibt immer eines ab. Die AS liegen deshalb als Zwitterion vor. Der pH, bei dem die Nettoladung gleich 0 ist, wird als IP = isoelektrischer Punkt bezeichnet. Hier gleichen sich die positiven und negativen Ladungen aus. Er lässt sich auch für Proteine bestimmen. Wenn Proteine beim IP in ein elektrisches Feld gebracht werden, wirkt auf sie keine Kraft. Außerhalb des IPs werden sie zur Anode/Kathode gezogen. > Bei basischen AS liegt der IP genau zwischen den pKs-Werten ihrer basischen Gruppen > Bei sauren AS liegt der IP genau zwischen den pKs-Werten der beiden Carboxylgruppen > Bei ungeladenen AS —> zwischen den pKs der alpha-Amino/Carboxygruppe Niedriger pH = mehr H+ in Lösung —> AS sind positiv geladen Nicht-essenzielle AS können im Stoﬀwechsel synthetisiert werden (zB durch Transaminierung = Übertragung einer Aminogruppe von einer AS - zB. Alanin - welche dann Ketogruppe erhält) 7 3. Proteine II AS können modifiziert werden > post-translational = nach der Translation > co-translational = während der Translation (im bzw ins ER) zB.: Hydroxyprolin —> Kollagen gamma-Carboxyglutamat —> Blutgerinnungsfaktoren Glykolysiertes Asparagin —> Glykoproteine (Extrazelluläre Matrix, Antikörper Phosphoserin —> Enzymregulation, Signaltransduktion Acetyllysin —> Lysin und Arginin können posttranslational acetyliert und/oder methyliert werden => Wichtige Rolle für die Chromatin-Struktur und bei der Genexpression Metabolismus und AS - AS-Abbau vor allem in der Leber - Umwandlung in Glukose-Vorstufen = glukogene AS - in Intermediate des Citratzyklus = ketogene AS a) Essenziell: Valin, Leucin, Isoleucin, Methionin, Phenylalanin, Tryptophan, Threonin, Lysin b) Semi-Essenziell (Fehlen in der Nahrung, Säuglinge): Arginin, Histidin c) Semi-Essenziell (bei Fehlen von Phenylalanin bzw. Methionin): Tyrosin (aus Phe), Cystein (aus Met) 1) Biogene Amine - sind Abbauprodukte von AS mit Mediatorfunktion - entstehen durch Decarboxylierung (PALP als Cofaktor) AS Biogenes Amin Funktion Histidin Histamin Neurotransmitter Mediator allergischer Reaktionen Glutamat GABA Neurotransmitter Tryptophan Serotonin Neurotransmitter L-DOPA (aus Phe->Tyr) Dopamin Neurotransmitter Aspartat beta-Alanin Bestandteil von Coenzym A Cystein Cysteamin Bestandteil von Coenzym A Serin Ethanolamin Phospholipidbestandteil 3) Abbauprodukte mit physiologischer Bedeutung Stickstoﬀmonoxid — NO - Abbauprodukt von Arginin - vielfältige physiologische Wirkung Arginin —> (O2, NADPH, NO-Synthase*) —> Citrullin und NO 8 *NO-Synthase: Isoenzyme = nNOS, eNOS,iNOS S-Adenosylmethionin — SAM - Methionin und ATP reagieren miteinander - wichtiger Überträger von Methylgruppen (Phosphat wird abgespalten) - Substrate/Bedeutung: DNA (Cytidine —> Genexpression), Kreatinsynthese (Kreatinphosphat), Synthese von Cholin und Adrenalin - Weitere Methylgruppen-Donoren = Tetrahydrofolsäure, Cobalamin VitB12 4) Peptidbindung - eine Säureamidbindung - eben, starr, planar, da mesomierstabilisiert (=oszilliert zwischen einer Einfach und Doppelbindung) - Rotation nicht möglich - zwei Konfigurationen: cis (nur bei X-Prolin-Verbindungen, energetisch ungünstig), trans (bei nahezu allen AS) - Disulfidbrücken: Querbrücken in der linearen Polypeptidkette (durch Oxidation zweier Cysteinreste, H weg) = kovalente Bindung - Bildung (=Bruch und Neubildung) wird durch Proteindisulfid-Isomerasen (PDI) katalysiert - PDIs sind im oxidierenden Milieu des ERs zu finden 5. Spezielle Formen der alpha-Helix: KOLLAGEN - besondere Primärstruktur - jede dritte AS ist Glycin - sehr oft: Prolin und Hydroxyprolin aber auch Hydroxylysin - KLINK: Fehlende Hydroxylierung v. Prolin = Skorbut (VitC abhängig) - linksgängig - keine H-Brücken innerhalb eines Stranges - geringe Stabilisierung durch sterische Abstoßung d. Prolin-Ringe - Bildung einer Triple-Helix (über H-Brücken) - Glycin im Inneren, Prolin und HP außen - KLINIK: Austausch v. Gly mit anderen AS: Glasknochenkrankheit 6. Membranproteine - ca. 30% aller Proteine, interagieren mit hydrophober Lipidschicht - va. alpha-Helices mit exponierten hydrophoben AS sind für die Wechselwirkungen wichtig - —> Transmembranhelix, durchspannt die Membran vollständig - 7 Typen werden unterschieden Typ 1 und 2: nur eine Transmembranhelix, untersch. Orientierung der N- und C-Termini Typ III: mehrere Helices, 7 Rezeptoren (ca. 20000 identifiziert), beta-adrenerge Rezeptoren (Hormonwirkung, Signaltransduktion, G-Proteine), zB. Duftstoﬀrezeptoren, Geschmacksrezeptoren, Rhodopsin Rezeptoren 9 Typ IV: mehrere Membranproteine lagern sich zu Quartärstruktur zusammen Typ V: Proteine enthalten einen Lipidanker, der die Verankerung in der Membran ermöglicht - kovalent, posttranslational angeheftet, zB Farnesylrest, GPI-Anker Typ VI: Lipidanker: kovalent und post-translational angeheftet, zB Farnesylrest (ein Isoprenoid), GPI-Anker Periphere Membranproteine: Sind an der Oberfläche der Membran angelagert, binden nicht- kovalent entweder an Transmembranproteine oder an die hydrophilen Kopfgruppen der Membranlipide. Porine: hydrophobes Äußeres, hydrophiler Kanal wird aus beta-Strängen gebildet: Stoﬀaustausch großer Moleküle (5000 Dalton) Vorkommen: äußere Mitochondrienmembran, in Bakterien 7. Glutathion ein atypisches Tripeptid Besteht aus Glutamat — Cystein — Glycin - Cystein kann durch SH-Gruppe Disulfidbrücke bilden - Glutamat ist über eine Isopeptidbindung mit Cystein verbunden => gamma-Glutamylpeptid - Es wird nicht an Ribosomen translatiert (=nicht gentisch codiert). Die AS werden unter zweimaligen ATP-Verbrauch kovalent miteinander verbunden. Funktionen: 10 ein wichtiges Antioxidans in allen Zellen in Erythrozyten der wichtigste Schutz vor O2- Radikalen auch wichtig bei Entgiftungsreaktionen —> Glutathion-Peroxidase enthält Selenocystein —> Glutathion-Disulfid muss regeniert werden zu => 2x GSH Glutathion-Reduktase => benötigt NADPH als Elektronendonator Dieses wird va. im Pentosephosphatweg produziert ________________________________________________ Praktikum II Versuch 1 Bestimmung des Hämatokrit Männer: 42 - 52%, Frauen: 37 - 47% Heparin: Mucopolysaccharid (Leber, Lunge, Mastzellen, basophilen Granulozyten) aus Glucuronsäure und Glucosamin Stark negativ geladenes Polyanion —> gerinnungshemmend —> verstärkt Hemmwirkung von Antithrombin III um das 1000-fache —> hemmt also indirekt II, X, IX, XI, XII und längerkettig auch direkt Thrombin Wirkung kann durch Polykation Protamin aufgehoben werden Versuch 2 Anreicherung der gamma Globuline durch Aussalzen Aussalzen: Salzionen konurrieren um Hydratisierung durch Wasserionen. Spezifische Ladung ist für Salzionen höher als für Proteine —> Protein fällt aus. Plasmaelektrophorese Löslichkeit ist von Struktur der Proteine und der Salzkonzentration der Lösung abhängig Fällung ist reversibel (mit Puﬀer) —> Anreicherungsfaktor —> Ausbeute Versuch 3 Quantitative Proteinbestimmung Plasma des Blutes: 7,5 g/dl Proteine Die meisten Plasmaproteine werden in der Leber synthetisiert (außer Immunglobuline: Plasmazellen). 11 > Methode: Quantitave Bestimmung der Proteine beruht auf Bestimmung der Anzahl der Peptidbindungen. Cu2+ bilden im alkalischen Milieu mit Proteine violette Komplexe (können 4 Elektronenpaare einlagern) —> Biuret Versuch 4 Serumelektrophorese Trennung der Proteine durch unterschiedlich starke Wanderung in einem elektrischen Feld. Ladungszustand der Seitenkette ist vom pH abhängig. pH = 8,6 —> Alle AS sind negativ geladen. Werden auf Kathodenseite (-) aufgetragen. Wichtig: Unterscheidung zwischen absoluter und realtiver Erhöhung der Fraktionen. 4. Proteine III ENZYME —> meist Proteine —> Auch RNA-Moleküle können enzymatisch aktiv sein = Ribozyme (zB Ribosomen Untereinheiten) - sind Biokatalysatoren - erhöhen die Reaktionsgeschwindigkeit - Wirkungsspezifität - gehen unverändert aus Reaktion hervor - Benötigen oft Cofaktoren - Beschleunigen Reaktionen - reduzieren Aktivierungsenergie - keinen Einfluss aufs Gleichgewicht Katalysezyklus eines Enzyms: E + S —> ES —> EZ —> EP —> E + P Substrat bindet spezifisch (+ Cosubstrat) an aktivem Zentrum und bildet Enzym-Substrat- Komplex (Übergangszustand) —> Enzyme bringen die Substrate in korrekte Orientierung zueinander. Enzymkinetik = Michaelis-Menten-Kinetik … Beschreibung der Reaktionsgeschwindigkeit einer Enzym-katalysierten Reaktion in Abhängigkeit von der Substratkonzentration. > die v einer Reaktion wird definiert als: „v = Wie viele Substratmoleküle pro Zeit umgesetzt werden = (S)/t > v ist dabei abhängig von … der Enzymkonzentration … Substratkonzentration … Äußere Faktoren wie T, pH, Salzkonzentration > v ist proportional zur Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes (=ES) 12 > v = k(cat) * (ES) … k(cat) ist die Wechselzahl (Maß für die katalytische Potenz) … Je höher die Wechselzahl, desto eﬀektiver das Enzym > kcat = Anzahl der Substratmoleküle, die von Enzym pro Zeiteinheit umgesetzt werden. Bei der vollen Sättigung der Enzymmoleküle ist die maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht (v(max) ist damit proportional zur Gesamtkonzentration des Enzyms) > Km-Wert (v(max)/2) = halbmaximale Reaktionsgeschwindigkeit, Enzym ist zur Hälfte mit Substrat beladen. > Km: Maß für die Aﬃnität des Enzyms zu einem Substrat —> Konzentrationsangabe. Je kleiner Km, desto höher die Substrataﬃnität (da dann bei kleineren Mengen schon eine hohe v besteht) Enzymhemmung a) Reversibel - Kompetitiv zB bei Substratanaloga wie Lovastatin oder Methotrexat - vmax bleibt gleich - Km erhöht sich Hemmung kann durch Erhöhung der Substratkonzentration überwunden werden. b) Irreversibel - Nicht-kompetitiv zB Inaktivatoren wie ASS (Acetylsalicylsäure) hemmt die Cyclooxygenase - vmax wird reduziert - Km bleibt unverändert Allosterische Enzyme - Meist aus mehreren Untereinheiten - oft Schlüsselenzyme - zB: Phosphofruktokinase 1 (Glykolyse), Pyruvat Dehydrogenase (verbindet Glykolyse und Citrat-Zyklus) - negativer allosterische Eﬀektor stabilisiert die T-Form - positiver allosterischer Eﬀektor stabilisert die R-Form Isoenzyme - Katalysieren die gleiche Reaktionen, sind jedoch strukturell verschieden Enzymklassen Enzymklassen Funktion 1) Oxidoreduktasen - Übertragen Elektronen (bzw. Wasserstoﬀ) - Redoxreaktionen - Cofaktoren: NAD+, NADP+, FAD 13 Enzymklassen Funktion 2) Transferasen - Übertragen chemische Gruppen - Übertr. v. Phosphatgruppen = Phosphotransferasen / Kinasen (Hexokinase, Phosphofruktokinase, Pyruvatkinase, Serinkinase …) - Übertr. von Aminogruppen = Aminotransferasen / Transaminasen - Übertr. von Carboxyl-/Methyl-/Acyl-Gruppen 3) Hydrolasen - Spalten Bindungen mit Hilfe von Wasser - Phosphatasen, Glykosidasen, Peptidasen / Proteasen, Lipasen 4) Lyasen - Eliminieren funktionelle Gruppen wobei Doppelbindungen entstehen - Addieren funktionelle Gruppen an eine Doppelbindung - keine ATP-Hydrolyse notwendig 5) Isomerasen - Katalysieren eine Umlagerung innerhalb eines Moleküls - zB Aldose-Ketose-Isomerase, Mutasen 6) Ligasen / Synthetasen - Knüpfen neue Bindungen unter Spaltung von Nukleotidtriphosphaten Cofaktoren … für die Aktivität eines Enzyms wichtig … keine Proteine Können Metallionen oder Coenzyme sein. Coenzyme wiederum können einerseits als prosthetische Gruppe kovalent mit dem Enzym verknüpft sein (FAD) oder als Cosubstrat reversibel ans Enzym gebunden sein (NAD+, NADP+, ATP —> von mehreren Enzymen umgesetzt. Die Vorläufer von Coenzyme sind (Pro-)Vitamine: 1. Niacin B3 —> NAD(P)+ —> Elektronen/Wasserstoﬀ 2. Riboflavin B2 —> FMN, FAD —> Elektronen/Wasserstoﬀ Proteinabbau > Negative Regulation (Abschalten biologischer Vorgänge) > Positive Regulation (Aktivierung von Proteinen) > Quantitative Regulation (Neusynthese- und Abbaurate bestimmen das Fließgleichgewicht) Da Proteasen eine potentielle Gefahr für ihre Umgebung darstellen, ist ihre Aktivität streng kontrolliert. (regulierte Aktivierung, spezifische Proteasen-Inhibitoren, extra- und intrazelluläre Kompartimentierung) Extrazellulär: GI-Trakt (Verdauungsenzyme), Plasmamembran und Matrix (Sekretasen und Kollagenasen), Blutgefäße (Blutgerinnung und Fibrinolyse Intrazellulär: Lysosome (Verdauungsenzyme), nicht-lysosomale Kompartimente (Signalpeptidasen), Proteasom im Cytosol, Kern (Qualitätskontrolle, Signaltransduktion) —> Hydrolyse ist zwar thermodynamisch begünstigt, Peptidbindung ist kinetisch jedoch relativ stabil. = mesomeriestabilisiert Mesomerie erschwert nucleophilen Angriﬀ Vorgehensweise der Proteasen um diese Stabilisierung zu umgehen: 14 —> Aus der Peptidbindung wird erst eine Esterbindung, die sich dann hydrolytisch spalten lässt. A) Serin Proteasen zB. Chymotrypsin; im katalytischem Zentrum sitzt Serin - Serin bindet mit seiner -OH Grupppe an das -C=O und bildet eine kovalenten Ester. - Hydrolyse des ES-Intermediats - Die Spaltprodukte entstehen —> Wieso ist die OH-Gruppe der Serin-Seitenkette so reaktiv? Benachbarte AS bilden mit Serin eine katalytische Triade. Katalytische Triade im aktivem Zentrum: Asp (-) - His (+) - Ser (-) zB: Trypsin, Chymotrypsin, Elastase (Pankreas) Gerinnungsfaktoren und Fibrinolysefaktoren (Plasma) Proteasom (Cytosol) B) Cystein-Proteasen - Aus der Peptidbidnung wird durch -SH zunächst eine Thioesterbindung. - Hydrolyse des ES-Intermediats - Spaltprodukte zB. Kathepsine (Lysosome) Caspasen (Apoptose) —> C-asp-ase (C für Cystein-Protease, asp für Spaltung hinter Aspartat) für Apoptose programmierter Zelltod einzelner funktionsfähiger Zellen aufgrund von äußeren und 15 inneren Signalen —> Apoptose: a) Extrinsischer Weg (durch Todesrezeptor an der Zelloberfläche) b) Intrinsischer Weg (Cytochrom C; Freisetzung aus den Mitochondrien) > Initiator-Caspasen werden durch beide Wege aktiviert > Eﬀektor-Caspasen > Abbau von Proteinen der Kernmembran, Zytoskelett > Aktivierung von Nukleasen C) Aspartat-Proteasen Wasser wird durch Aspartat polarisiert — spaltet direkt. —> kein Zwischenprodukt zB: Pepsin (Magen) BACE = beta-Sekretase (Zusammenhang mit Alzheimer) Presenilin = gamma-Sekretase beta- und gamma-Sekretasen sind Asp-Proteasen, die APP (Amyloid Plaques Protein) in das A-beta Peptid spalten. APP-Bildung aus A-beta spielt eine entscheidende Rolle in der Alzheimer-Krankheit D) Zink-Proteasen Wasser wird als Ligand mit Zn2+ polarisiert - spaltet direkt —> kein Zwischenprodukt zB Carboxypeptidase A+B (Pankreas) Matrix-Metalloproteasen (Extrazelluläre Matrix) ZF I 1. Peptid-Bindung ist mesomeriestabilisiert und hydrolisiert nicht spontan 2. Proteasen spalten die Peptid-Bindung mittels einer reaktiven Seitengruppe (-OH, -SH) oder eines stark polarisierten H2O-Moleküls 3. Nach dem Katalysemechanismus unterscheidet man Serin-, Cystein-, Aspartat-, und Zink-Proteasen. 4. Benachbarte as bilden eine katalytische Triade und stabilisieren die Ladungen 5. Caspasen sind Cystein-Proteasen, deren Aktivierung Apoptose auslösen 16 Proteasen werden unterteilt nach a) Katalysemechanismus b) Substratspezifität Man unterscheidet: > Exopeptidasen (spalten am N- oder C-Terminus des Proteins) - Aminopeptidase — spalten 1-2 AS vom N-Terminus ab - Carboxypeptidasen — spalten 1 AS vom C-Terminus ab Es besteht eine Substratpräferenz für bestimmte Seitenketten (Substrabindungstasche). Funktionelle Gruppen benachbart zu der Spaltstelle des Substrats treten über eine Substrat-Bindungstasche mit der Protease in Wechselwirkung. Funktionelle Gruppen in der Substrat-Bindetasche kontrollieren den Zugang und bestimmen die Substrat-Spezifität der Protease Glycin — große, hyddrophobe (Phe, Trp, Tyr) — Chymotrypsin Aspartat — positiv geladene (Arg, Lys) — Trypsins Valin — kleine, neutrale (Ala, Gly, Val) — Elastase > Endopeptidasen (spalten innerhalb des Proteins) 1. Vollständige vs. limitierte Proteolyse 1. Vollständige Proteolyse durch nicht Substrat-spezifische Proteasen oft auch nicht spezifisch für bestimmte AS zB Verdauungsproteasen oder lysosomale Proteasen (Lysosom = Kathepsin, Proteasom) bzw. extrazellulär = Kollagenasen 2. Limitierte Proteolyse Limitierte Proteasen sind hochspezifisch für das Substrat und für die zu spaltende Peptidbindung. zB. pankreatische Verdauungsproteasen, Blutgerinnungsfaktoren, Peptidhormone > Spaltung zwischen zwei basischen oder hinter einer basischen AS. > Aktivierung von Proenzymen: im Darm (Verdauungsenzyme) oder im Plasma (Gerinnung) —> hohe Substratspezifität —> hohe Spezifität für Spaltstelle —> oft flankiert von basischen AS —> Bedarfsabhängige Aktivierung: Aktivierung von Zymogenen und Hormonen (aus einer Hormonvorstufe), Aktivierung von Gerinnungsfaktoren, Fibrinolyse-Enzyme, Aktivierung von Verdauungsenzymen, Prozessierung von Sekretproteinen (ER) und Abspaltung von Signalpeptiden, Programmierter Zelltod. 17 Proteasen des Verdauunggstraktes Magen: > Endopeptidase = Pepsin Pankreas: > Endopeptidase = Trypsin, Chymotrypsin, Elastase > Exopeptidase = Carboxypeptidasen A + B Synthese als inaktive Vorstufe = Zymogene Limitierte proteolytische Spaltung = Aktivierung Aktivierung erfolgt streng reguliert zB: Magen Magenmukosa Magen pH = 7 pH 1 Pepsinogen (42,6 kDa) = Inaktiv —> Pepsinogen —> Pepsin (34,5 kDa) autokatalytische Aktiv Aktivierung *Autoaktivierung von Pepsin wird durch Aufbrechen von Salzbrücken (mit Peptid = Pepsin- Inhibitor) im sauren Milieu des Magens ausgelöst zB. Pankreas Pankreas Duodenum (pH = 8) Trypsinogen Trypsin Chymotrypsinogen Chymotrypsin Proelastase Enteropeptidase Elastase Procarboxypeptidase A Trypsin Carboxypeptidase A Procarboxypeptidase B Carboxypeptidase B = Inaktiv = Aktiv Proteasen des Verdauungstrakts: - Funktion: Pepsin und Pankreas-Proteasen spalten ihre Substrate nahezu unsepzifisch und komplett = vollständige Proteolyse - Regulation: Ihre Aktivierung erfolgt aber durch limitierte Proteolyse durch Abspaltung von Peptiden aus inaktiven Vorstufen (=Zymogene) - Aktivierung: autokatalytisch (Pepsin, Trypsin) oder durch andere Proteasen (zB Endoepeptidasen) 18 2. Kontrolle durch Protease-Inhibitoren a) Pepsininhibitor Spaltprodukt von Pepsinogen bindet an Pepsin über Salzbrücken (bei neutralem pH) b) Pankreas-Trypsininhibitor Substrat-Analogon hohe Aﬃnität für Trypsin c) alpha-1-Antitrypsin (Serpin = serin-Protease-Inhibitor) bindet an Trypsin, Elastase kovalente und irreversible Bindung starke Konformationsänderung **Proease-Inhibitoren ähneln Substrate und binden oft irreversibel an die Protease (Ausnahme: Pepsin-Inhibitor über Salzbrücken) 3. Beispiel f. intrazelluläre, vollständige Proteolyse: Das Proteasom Das Proteasom: intrazelluläre Abbaumaschinerie Kompartiment-ähnlicher multimerer Komplex - zylindrische Tonne (20S) - regulierbarer Deckel (19S) - Protein-Entfaltungsenzyme (ATPasen) > Zentraler Teil (20s, core) - 2 Ringe mit je 7 alpha-Untereinheiten, 2 Ringe mit je 7 beta-UE —> nur beta-Einheiten sind proteolytisch aktiv - Chymotrypsin-ähnliche Aktivität - Trypsin-ähnliche Aktivität - PGPH (Peptidyl-glutamyl-Peptid-hydrolysier Aktivität > Deckel (19S, lid) - Erkennung von Substanzen, Protein-Entfaltungsenzyme (ATPasen) Die Substrate werden zunächst mit Ubiquitin markiert Ubiquitin - hochkonserviertes 76 AS Protein - in allen eukaryotischen Zellen (ubiquitär) - globuläre, stabile Proteinstruktur (ubiquitin-fold) - 3 AS-Unterschiede zwischen Mensch und Hefe - kovalente Verknüpfung über C-terminale Gly-Seitenkette an das Substrat Ubiquitin wird über eine Enzym-Kaskade aktiviert: Es gibt 3 Enzymklassen > Enzym 1: ATP-abhängige Aktivierung > Enzym 2: Übertragung (Konjugation) > Enzym 3: Substratbindung (Ligation) 19 Ubiquitin wir über ATP-Verbrauch aktiviert —> energiereiche Thioesterbindung mit E1 (Aktivierungsenzym) —> Übertragung auf E2 (Konjugationsenzym) (Thioester geht verloren) —> Bindung durch E3 (Ubiquitin-Ligase), Übertragung durch E2 —> Kovalente Bindung an Lysin-Seitenkette (Substrat) —> Kettenverlängerung durch interne Lysin-Seitenketten (Ub) Erkennung durch das Proteasom: nur poly-ubiquitierte Substrate werden erkannt. Bindung von Poly-Ub an Proteasom-UE, Abspaltung der Poly-Ub-Kette. Funktionen des Ubiquitin-Proteasom-Systems Abbau von - durch Hitze und Stress - geschädigten Proteinen DNA-Schäden-Reparatur regulierte Proteolyse —> Signaltransduktion Proteinfaltung: Qualitätskontrolle —> Regulation von p53 = „Wächter des Genoms“ p53 wirkt als Tumorsuppressor und Transkriptionsfaktor Aktiviert durch DNA-Schäden stoppt Zellzyklus > Zeit für Reparatur induziert Apoptose > wenn Schaden Überhand nimmt in 50% aller menschlichen Krebs-Erkrankungen mutiert … konstitutiv ubiquityliert & abgebaut … keine Akkumulation in der Zelle … DNA-Schäden iniziieren Signalkaskade … Phosphorylierung von p53 … Es wird nicht mehr von E3 erkannt … akkumuliert in der Zelle und aktiviert Genexpression Assoziierte Krankheiten: - DDB1 — DNA damage-binding-protein — Hautkrebs - Parkin — Ubiquitylierung v. mitochondrialen Proteinen, vermittelt deren Abbau > Parkinson’sche Krankheit bei Defekt - CUL3-KBTBD8 — Ubiqit. reguliert Translation, Diﬀerenzierung von Zellen während Gesichtsbildung. Mutationen > craniofasziale Dysmorphien: Treacher-Collins-SyndromeI ZF: Proteasomaler Abbau Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) ist der Hauptabbauweg für intrazelluläre Proteine Substrate werden durch Ubiquitin markiert und damit einem Proteasekomplex (Proteasom) zugeführt Die Ubiquitylierung erfolgt über eine dreistufige enzymatische Kaskade (E1-E2-E3) Die Ubiquitin-Ligase (E3) ist maßgeblich für die Substratspezifität verantwortlich Das UPS entfernt fehlgefaltete Proteine und kontrolliert wichtige Funktionen während des Zellzyklus, der DNA-Reparatur und der Zelldiﬀerenzierung 20 Gesamt-ZF: 1. Polypeptidbindungen werden häufig über ein kovalentes Ester-Zwischenprodukt gespalten. 2. Proteasen werden nach ihrem Katalyse-Mechanismus in Serin-, Cystein-, Aspartat- und Zink- Proteasen unterteilt. 3. Vollständige Proteinverdauung erfolgt durch unspezifische Proteasen mit geringer AS- Präferenz. 4. Llimitierte Proteolyse ist hochspezifisch für Substrat und Spaltstelle 5. Proteasen des Verdauungstraktes und des Gerinnnungssystems werden durch limitierte Proteolyse aktiviert. 6. Das UPS ist der Hauptabbauweg für intrazelluläre Proteine und am Abbau fehlgefalteter Proteine und Aktivierung von Signalketten beteiligt. 5. Hämoglobin Hb = Apoprotein (Globin) + prosthetische Gruppe (Häm) Häm besteht aus Protoporphyrin IX und Fe2+ Fe-Koordinationsstellen: 4x Häm, 1x Polypeptid (prox. His F8), 1x O2 Häm in hydrophober Bindungstasche His E7 stabilisiert mit H-Brücke O2-Bindung Es verhindert Oxidation von Häm und Produktion von Sauerstoﬀradikalen Die Hb-Familie Je 1 Gen-Cluster für alpha und beta-Ketten - alpha-Cluster: alpha1 + 2 - beta-Cluster: epsilon, Ggamma, Agamma, delta, beta 21 Hb-Typen werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten exprimiert Hb Gene sind Resultate mehrerer Genduplikationen. Wozu benötigen wir verschiedene Varianten? —> HbF hat höhere Aﬃnität für O2. O2 wird in der Plazenta vom mütterlichen HbA an das höheraﬃne, fetale HbF abgegeben. —> 2,3-BPG bindet weniger stark an HbF als an HbA (im zentralen Loch). Weil HbF = 2alpha und 2 gamma-Ketten. gamma-Kette —> beta-His143 wird zu Ser (His ist positiv geladen, Ser hingegen negativ) Konservierte AS in Hb und Mb —> As, die wichtig für die Erhaltung der Struktur sind. Sie können nicht verändert werden, ohne dass es zu Funktionsverlusten kommt. - Proximales His F8 (Hämbindung) - Distales His E7 (Stabilisiert O2) - Hydrophobe AS der Häm-Tasche (Stabile Hämbindung; Phe CD1, Val, Leu) - Verklammerung von F- & H-Helix (H-Brücke stabilisiert die Deoxy-Form: Tyr HC2) Funktionen 1. O2-Transport: Lunge —> Gewebe 2. CO2-Transport: Gewebe —> Lunge 3. H+-Transport: Gewebe —> Lunge 4. Puﬀerung 1. Sauerstoﬀtransport —> Lunge zum Gewebe - 5 Liter Blutplasma binden 14 ml O2 - Herzzeitvolumen: 6-20 Liter Blut pro Minute - < 60 ml O2 pro min - Verbrauch des menschl. Körpers: 300-3500 ml O2 pro Minute —> Hb erhöht O2 Bindekapazität 70-fach —> 5 L Blut binden 1000 ml O2 Hämoglobin & Myoglobin - Hb: O2-Transport im Blut aller Wirbeltiere (außer Eisfisch), Hohe O2-Sätigung in der Lunge, erleichterte Abgabe im Gewebe - Mb: Sauerstoﬀspeicher im Muskel, intrazellulärer O2-Transport von der Zellmembran zu den Mitochondrien —> f. rote Farbe von Herz- und Skelettmuskel verantwortlich Sauerstoﬀbindekurve: Hb: sigmoid - Tetramer (2 alpha und 2 beta Ketten = 574 AS) - 64 kDa - 4 Häm Mb: hyperbol - Monomer (153 AS) - 17 kDa - 1 Häm —> Da Sauerstoﬀ schlecht löslich in Blut ist, benötigt es Transporter. Hb und Mb besitzen ca. 25% Sequenzidentität, Ähnliche Sekundär- und Tertiärstruktur, 80% alpha-Helices. > Inneres: hydrophob (AS-Reste: Leu, Ile, Phe, Met, …)—> Einlagerung des hydrophoben Häm > Äußeres: vorwiegend hydrophil (AS: Glu, Asp, Lys, Arg, Asn, Gln) —> Löslichkeit Die beiden hydrophilen und geladenen Propionyl-Reste des Häms sind nach außen gerichtet. 22 Bindung von erstem O2 am schwersten —> dann immer leichtere Bindung der anderen O2 = O2-Bindung an die vier Untereinheiten ist kooperativ (durch Konformationsänderung = Verdrehung der Ketten um 15° —> Untereinheiten rücken näher zusammen, zentrales Loch wird im Oxy-Hb kleiner) Fe rutscht bei O2-Bindung (R) dann in Hämebene —> Drehung des Histidin F8 (prox. Histidin) um 8°. —> Bewegung der F-Helix; wird nachgezogen —> Hebelarm —> Interaktion mit der Hämgruppe Deoxy-Hb —> T tense Oxy-Hb —> R relaxed —> Kooperativität nur möglich bei mehreren Untereinheiten —> Kooperativität ist verantwortlich für sigmoide Bindungskurve Häm-Gruppe Protoporphyrinring IX —> Eisen bindet in der Mitte > Fe2+ - Ferro-Form, Häm > Fe3+ (oxidiert) - Ferri-Form, Hämin Aromatische Scheibe (planar) Konjugiertes System mit delokalisierten Elektronen Chromophore (rote Farbe des Blutes) Gruppen d. Häms: - Methyl (CH3) - 4 - Ethenyl / Vinyl (CH2CH3) - 2 - Proprionyl / Carboxyethyl (CH2CH2COO-) - 2 - 4 Pyrolringe (verbunden durch Methinbrücken) Insgesamt ist das Molekül hydrophob. Der hydrophile Teil konzentriert sich auf eine Seite: Propionylgruppe Fe Bindung an Protoporphyrin durch 4 Koordinationsstellen (=N-) HÄM hat 2 freie Koordinationsstellen: - 1.-4. Koordinationsstelle: Fe an Ring gebunden - 5. Koordinationsstelle: Protein (Hb oder Mb) —> proximaler Histidinrest der Globinkette (F8) - 6. Koordinationsstelle: O2 (H-Brücke mit distalen Histidin E7) Hb-Form Ox-Stufe d. Fe 6. Koordinationsstelle Farbe Deoxyhämoglobin 2+ leer blau-violett Oxyhämoglobin 2+ O2 —> oxygeniert hellrot Methämoglobin 3+ (oxidiert) H20 oder CN- gelb-braun CO-Hämoglobin 2+ CO kirschrot -> Sauerstoﬀ kann nur an Fe2+ binden -> CO2 bindet nicht an Häm! Es kann aber an Hämoglobin binden Distales His E7 stabilisiert die Oxy-Hb/Mb - Form. - es verhindert die Freisetzung von Superoxidanionen - es verhindert die Bildung von Met-Hb (Fe3+) 23 CO und Häm CO bindet stärker an Häm als O2 (bindet 25 000 Mal stärker an freies Häm) Durch HisE7 entsteht ein forcierter Winkel, der die CO-Bindung schwächt, zudem stabilisiert es die O2-Bindung (CO bindet dann 200 Mal besser). CO erschwert die Abgabe von O2 - Bindung von CO an Hb erhöht Aﬃnität von O2 für Hb. Bei 50% CO-Hb wird a. weniger O2 gebunden b. O2-Bindungskurve hyperbolisch (wie Myoglobin) c. P50 Wert sinkt d. O2 kann nicht mehr an Gewebe abgegeben werden e. Therapie: Gabe von reinem Sauerstoﬀ 2,3-Bisphosphoglycerat (BPG) Normale Konzentration: 4,7 mM BPG: - sehr negativ geladen - Bildung aus 1,3-BPG als Seitenweg der Glykolyse (Bisphosphoglycerat-Mutase) - 1 BPG pro Hb-Tetramer (also pro vier Untereinheiten) - Bindestelle: zentrales Loch - = „Allosterischer Eﬀektor“ (da er an anderer Stelle als der O2 bindet) - wird bei Oxygenierung herausgeworfen (Bindungsstelle wird zu klein) - springt bei Deoxygenierung in die Lücke und zwingt O2 zum Verlassen des Hb-Moleküls (erniedrigt Sauerstoﬀaﬃnität des Hb, leichtere Abgabe ans Gewebe) BPG macht im Deoxy-Hb Salzbrücken zu den positiv geladenen Seitenketten (Lys, His) der beta- Ketten und verklammert es durch diese zusätzlich —> dies stabilisiert die Deoxy/ T-Form. Erys: BPG erniedrigt O2-Aﬃnität des Hbs —> leichtere Abgabe ans Gewebe —> Rechtsverschiebung der O2-Bindungskurve Blutkonserven: bei Lagerung steigt die O2-Aﬃnität, da BPG zerfällt. Verhindert wird dies durch Zugabe von stabilen Analoga: Glukose, Inosin. Hypoxische Zustände: zB Obstruktion der Bronchialwege, Asthma, Emphysem, BPG-c kann auf 8 mM steigen. Höhenadaption: Kurzzeitiger Anstieg von BPG, dann erhöhte Bildung von Erys. Transport von H+ und CO2 durch Hb —> BOHR-Eﬀekt - Stoﬀwechsel verursacht Anreicherung von H+ und CO2 im Gewebe - HbO2 + H+ + CO2 Hb-H+-CO2 + O2 Gewebe: höhere H+ und CO2-Konzentration verstärken O2-Abgabe —> Aﬃnität sinkt (Rechtsverschiebung) Lunge: niedrigere H+ und CO2-C verstärken O2-Aufnahme —> Aﬃnität erhöht (Linksverschiebung) Was ist die molekulare Basis des Bohr-Eﬀekts? 24 1. Protonierung von beta-His146 Salzbrücke zu beta-Asp94 = 40% des Bohr-Eﬀekts —> H+ sind allosterische Eﬀektoren beta-His146 ist protoniert bei pK = 8,0 —> Höhere H+-c, Deoxy-Hb stabilisiert, pH geringer, Salzbrücke zu Asp94 > Bindung & Transport von CO2 N-terminale Aminogruppen können CO2 binden, CO2 bindet nicht an die Hämgruppe! R-NH2 + CO2 R-NH-COO- + H+ Carbamat = R-NH-COO- CO2-Bindung stabilisiert ebenfalls Deoxy-Hb (T) Form —> Freisetzung von O2 begünstigt —> CO2 ist ebenso ein allosterischer Eﬀektor CO2 Transport vom Gewebe zur Lunge: Gewebe Lunge pCO2 = 46 mm Hg pCO2 = 40 mm Hg pO2 = 30-40 mm Hg pO2 = 100 mm Hg CO2-Transport im Plasma: CO2-Transport im Ery: - in physik. Lösung ca. 10% - als Carbamino-Hb ca. 15% - als Bicarbonat Plasma ca. 50% - als Bicarbonat ca. 25% - Allosterischer Eﬀektor: Beeinflusst Aﬃnität für Liganden obwohl er an anderer Stelle bindet. - 2,3-BPG erleichtert O2-Abgabe ans Gewebe, bindet und stabilisiert Deoxy-Hb durch Salzbrücken, wichtig für Höhenadaption, Normal: 4,7 mM, bei Hypoxie bis zu 8 mM 25 - Bohr-Eﬀekt: beschreibt die Abhängigkeit zwischen der O2-Bindungsaﬃnität von Hämoglobin und dem Säuredruck der Umgebung (H+ und CO2). Der Bohr-Eﬀekt und die kooperative Bindung von O2 machen Hb zum idealen Sauerstoﬀtransporter. Bei sinkendem pH (Azidose), und steigendem CO2-Partialdruck sinkt die Bindungsaﬃnität von Hb und die Sauerstoﬀfreisetzung wird begünstigt. Eine hohe CO2-c sorgt dabei für eine Verminderung des pH-Wertes und hat damit indirekten Einfluss. Niedriger pH —> stabilisiert Deoxy-Hb —> fördert O2-Abgabe > Salzbrücken zwischen protoniertem beta-his146 und beta-Asp94 > Rechtsverschiebung Erhöhtes CO2 stabilisiert Deoxy-Hb und fördert O2-Abgabe > Bildung von N-terminalen Carbamat > Rechtsverschiebung 6. Hämoglobinopathien - zählen zu den häufigsten Erbkrankheiten —> mehr als 1000 Genmutationen bekannt 1. Hb mit abweichender AS Sequenz (Protein) a) Met-Hb Bindung (HbM; Fe2+ —> Fe3+) b) Erhöhte O2-Aﬃnität (meiste Variante) c) Erniedrigte O2-Aﬃnität d) Instabilität e) Veränderte Löslichkeit: Aggregation 2. Verminderte Synthese einer Globin-Kette (Genexpression) a) Thalassämien a) Methämoglobinbildung (Hämiglobin, Ferrihämoglobin) > Normal: ca. 1% > Oxidiertes Eisen: Fe3+ —> braune Farbe > kann kein O2 mehr binden > Oxidativer Stress (Superoxidanion, H2O2) > Denaturierung der Proteinketten —> Aggregation —> Heinz’sche Innenkörper: Präzipitate aus denaturiertem Hb in Erythrozyten Auslöser: 1. Genetisch bedingt (Problem mit Met-Hb/Cytochrom b5 Reduktase, Glukose-6-Phosphat Dehydrogenase, Mutation: HbM) Enzymdefekte: Met-Hb Reduktase = Cytochrom b5 Reduktase > Autosomal rezessiv > Typ 1: Kein Enzym in Erys, blaue Hautfärbung > Typ 2: Kein Enzym im ganzen Körper —> Entwicklungsstörungen > Therapie: Ascorbinsäure, Riboflavin, Methylenblau Mutationen des Hb: HbM HbM Boston - Distales His E7 wird von Tyr E7 ersetzt. His - Fe Interaktion aufgehoben 26 HbM Iwate - Proximales His und Tyr F8 sind 5. u. 6. Ligand der Hämgruppe, (kein Platz für O2. 2. Erworben (Alimentär, Toxisch/Medikamentös) Auslöser: Nitrate (NO3-) & Nitrite (NO2-) —> Oxidationsmittel In Düngemittel, Trinkwasser bei Säuglingen - überlasten Enzyme Aromatische Nitro- und Aminoverbindungen … in Farbstoﬀen, Lokalanästhetika, Sonnenschutz, Klebstoﬀ Einige Medikamente …Antibiotika, Antimalaria, Paracetamol Führt zu: Zyanose —> Kopfschmerzen, Dyspnoe, Schwindel, Benommenheit, Brustschmerzen —> Herzrasen, Koma, Azidose —> Tod (>70%) Reduktion (Antioxidatien): Erythrozyten enthalten Methämoglobinreduktase (Enzym zur Rückwandlung von Met-Hb) Met-Hb Reduktase = Cytochrom b5 Reduktase Prosthetische Gruppe: Häm & Flavin Benötigt NADH für Katalyse (Welches aus der Glykolyse hervorgeht) Fe3+-Reduktion durch Glutathion (GSH) GSH ist ein atypisches Tripeptid: Glu (E) - Cys (C) - Gly (G) > Amidbindung von Glu - Cys durch gamma-Carboxygruppe des Glu (nicht alpha) Reduktion von Met-Hb führt zu Bildung von GSSG (= Glutathion Disulfid) aus 2 Molekülen GSH via Cys Disulfidbrücken Therapie: - Absetzen von oxidierenden Substanzen - Methylenblau, Ascorbinsäure, Riboflavin - Glucose: Quelle für Produktion von NADH & NADPH - Bluttransfusion (bei schlimmen Fällen) Therapeutische Auslösung der Met-Hb-Bildung - Behandlung v. Cyanidvergiftungen (Met-Hb bindet CN- anstelle der Cytochrom C Oxidase) b-d) Pathologische Hb Mutationen > HbM > Mutationen des beta146His zerstören Bohr-Eﬀekt & erhöht O2-Aﬃnität > Mutationen in hydrophober Häm-Tasche erniedrigt O2-Aﬃnität e) Sichelzellanämie - häufigste Hb-pathie - besonders häufig in Afrika - Autosomal rezessiv vererbt - Lebenserwartung: 40-50 Jahre bei optimaler Therapie Heterozygote: kaum Symptome Homozygote: breites Spektrum an schweren Symptomen 27 Symptome: Atemnot & Herzklopfen, Akute abdominale Schmerzen, Pneumonie, Priapismus, Milztumor, Ikterus, Hämaturie, Niereninsuﬃzienz, Knochennekrosen … Hämolytische Anämie (Blutarmut auf Grund v. Zerstörung d. Erys)—> Mikrothrombosen Pathomechanismus - Bildung von Sichelzellen im peripheren, venösen Bereich - Mehr Deoxy-Hb —> aggregiert und bildet Faserstrukturen —> Zerstörung d. Erys —> Hämolyse - Mutation in beta-Kette von Hb: beta6Glu —> Val (GAG —> GTG) - Sichelzellen sind weniger flexibel, die O2-Bindung ist dabei nicht gestört - Verstopfen Kapillaren unter Ausbildung von Mikrothrombosen Aggregation von deoxygeniertem HbS: 1. Bindung zwischen zwei HbS Tetrameren 2. Bildet Kettenmolekül aus vielen HbS-Molekülen —> Aggregation —> HbS Fasern (14 Ketten) 3. Erys mit HbS-Fasern haben veränderte Flusseigenschaften —> Aggregation d. Erys —> Mikrotrhombosen 4. Membran der Erys wird geschädigt: Hämolyse & Anämie —> HbSS (homozygot) wandert nicht weit in der Elektrophorese, da Glu6-Austausch zu Val zu einem Verlust der negativen Ladung führt. Mögliche biochemische Schutzmechanismen von HbAS gegen Malaria 1. Vermehrte Entfernung infizierter Zellen 2. Produktion von O2 Radikalen 3. Produktion von miRNAs (Inhibieren Translation von Parasiten mRNAs Therapie 1. Symptomatische Behandlung 2. Hydroxyurea (Zytostatikum, Vermehrte Bildung von HbF) 3. Stammzellentransplantation 4. Gentherapie 2a) Thalassämien Verminderte Synthese einer Globin-Kette (alpha oder beta) Auch Thalassämie verleiht realtiven Schutz gegen Malaria > beta-Thalassämie Über 200 versch. Mutationen bekannt Heterozygot (häufig symptomlos) Homozygot (Cooley’s Anämie) LE: 50-60 Jahre (ohne Therapie: Tod im Kindesalter) Keine oder weniger beta-Ketten alpha-Ketten alleine können keine Tetramere bilden —> freie alpha Ketten aggregieren —> binden an Ery-Membran und zerstören sie (Knochendeformation, Hämolytische Anämie, Hämolyse) Manifestation nach der Geburt wenn HbF durch HbA ersetzt wird Kompensation: Hereditäre Persistenz des HbF —> mildere Symptomatik 28 > alpha-Thalassämie Synthese der alpha-Ketten gestört Adult: HbH (beta-Tetramer) Fetus: HbBart (gamma-Tetramer) —> Keine Kooperativität, höhere Aﬃnität, kein Bohreﬀekt, Instabil, verklumpt, Erys haben bizarre Form, kurze Lebensdauer, hämolytische Anämie Bis 2/4 mutante Allelen: asymptomatisch (da 4 alpha-Globin Allele existieren) 7. Eisenstoﬀwechsel —> Eisen ist ein essentielles Spurenelement 1. Einteilung des Körpereisens Einteilung Wo mg % Funktionseisen - Hämoglobin 2500-3000 mg 65% - Myoglobin 200-300 mg 8% - Enzymeisen 350-400 mg ca.10% > Hämenzyme Cytochrome, Fe/S ZB Katalase, Met-Hb Reduktase, Cyt c Oxidase Speichereisen - Ferritin 700 - 800 mg ca. 20% - Hämosiderin variabel Transporteisen - Transferrin 4 -7 mg < 1% Gesamt 3500 - 4500 mg —> 45 - 60 / kg Resorption: 1-2mg/Tag —> Speicherung von 4mg im Plasma 29 2. Erythrozyten … haben keinen Zellkern (fehlende Genexpression), keine Mitochondrien (kein Citratzyklus, Atmungskette), kein ER (keine Glykosilierung, Sezernierung von Proteinen), keine Ribosomen … Energiegewinnung: aus anaerober Glykolyse & Pentosephosphatweg … Lebensdauer: 100-120 Tage —> Diﬀerenzierung von Blutzellen wird von Zytokinen gesteuert (EPO —> Erythropoese) Stammzelle —> Proerythroblast —> Makroblast —> Normoblast —> Retikulozyt —> Ery … Zellkernverlust ab Normoblast … Verlust des Retikulum/Ribosomen, Mitochondrien ab Retikulozyt DIﬀerenzierungszeit: 7-10 Tage Gesteigerte Erythropoese: - Blutverlust - Gabe von EPO - Absinken von pO2 im Gewebe mehr EPO im Plasma Mehr Retikulozyten im Blut EPO > Glykoprotein - produziert in der Niere > stimuliert durch O2-Mangel > Ohne EPO können keine Erys gebildet werden > EPO verhindert Apoptose von Vorläuferzellen > Doping 3. Aufnahme, Transport, Speicherung & Umsatz von Eisen a) Intestinale Resoption von EIsen > Orale Eisenaufnahme: ca 10 mg/Tag (davon werden 1 mg resorbiert) Fe2+: Fisch, Fleisch, Geflügel Fe3+: Gemüse, Hülsenfrüchte, Getreide, Nüsse (Nicht-Häm Eisen) —> Häm-Eisen (Fe2+) Aufnahme in Enterozyten: Heme Carrier Protein (HCP1) ua Freisetzung von Eisen aus Häm durch Hämoxygenase > Freisetzung im Magen > Reduktion: Fe3+ —> Fe2+ im Magen- Darm Trakt Eintritt in Mucosazellen als Fe2+ 30 Reduktionsmittel fördern Resorption: Ascorbinsäure/Vit C Cystein-SH der Nahrung Ferrireduktase (Zellmembran) Resorption gehemmt: Oxalat (Kaﬀee, Tee) Phosphate (Eigelb) Calcium Polyphenole, Tannine (Wein) > Aufnahme über DMT1 Transporter (Cotransport mit H+) > Speicherung von Eisen als Ferritin Serum-Ferritin: Normal: 40-160 microgramm/l Erschöpfter Speicher: < 10 microgramm/l Überschüssiges Eisen: Nach 2-3 Tagen Desquamation der Darmepithelzellen (Mucosablock) - ca. 1 mg/Tag > Austritt in Kapillaren der Blutbahn Mobilferrin (Transport) IREG 1/Ferroportin (FPN) Hephaestin (oxidiert Fe2+) Ferritin als Speicher > Übergabe von Fe3+ an Transferrin im Blutplasma (beta-Globulin) —> Fe3+ bevorzugt zu Fe2+; Oxidation von Fe2+ zu Fe3+ verursacht Bildung von ROS —> Freisetzung aus Ferritin, Fe3+ —> Fe2+ durch Ferritin-Reduktase —> Ferritinspeicherung, Fe2+ zu Fe3+: Ferrioxidase I = Caeruloplasmin = Homolog zu Hephaestin b) Eisenausscheidung 1 mg/Tag über Darmepithel, Hautzellen, Urin, Galle, Schweiß …kann nicht gesteigert werden. Nur Resorption kann angepasst werden (mittels Hepcidin = Peptidhormon aus der Leber - bindet an Ferroportin und reduziert Eisenaufnahme) … Eﬃzienz der Resoprtion hängt von Eisenvorräten im Körper ab (Normal: 10-15%) bei der Menstruation: 15-30 mg / Monat 30-60 ml Blut Schwangerschaft: Eisenverlust bei Entbindung: Kind (300mg) + Placenta (100mg) + Blut (150mg) = 550 mg Bedarf: - Männer: 1 mg/Tag - Frauen (menstruierend): 2 mg/Tag - Frauen (Schwangerschaft): 2-3 mg/Tag +1 für Geburt und Kind = 3-4 mg Eisen/Tag c) Eisenmangel 31 Häufigster Mangelzustand: Verursacht durch Nahrungszufuhr, Resorption von Eisen, erhöhter Verlust durch Blutungen. Diagnostik: MCH - Mean Corpuscular Hemoglobin Hk - Anteil der Erys am Blutvolumen MCV - Mean Corpuscular Volume MCHC - Mean Corpuscular Hb Concentration Serum- Eisen Transferrin Transferrinbeladung Serumferritin —> mikrozytäre, hypochrome Eisenmangel-Anämie (Erys klein, zentrale Hb-arme blasse Zone) Eisenverlust: Biochemische und morphologische Veränderungen 1 Depletion der Eisenspeicher in Leber und Knochenmark 2 Serum-Ferritin sinkt ab 3 Hb sinkt —> Veränderung der Erys 4 Konzentration von Serum-Transferrin steigt —> Körper versucht mehr Eisen vom Blut in Zellen zu bringen 5 Sättigung des Transferrins sinkt: normal 21-50% 6 Depletion von eisenhaltigen Enzymen: Enzyme funktionieren nicht mehr richtig. Auch zum Einbau von Zink in Häm. KLINIK: Eisenmangelanämie Diagnose: Mikrozytose, Hypochromie, Fehlendes Speichereisen, Sehr niedriges Serumferritin, Erhöhtes Serum-Transferrin, Erniedrigte Transferrin-Beladung ( Apoferritin: 24 Untereinheiten à 20 kDa gesamt 480 kDa > bindet 4500 Atome Fe3+, Eisen hat etwa 25% Gewichtsanteil > Oxidation von Fe2+ zu Fe3+ durch Ferrioxidase I / Caeruloplasmin > Fe3+ freigesetzt durch Ferritin-Reduktase: Reduktion 3+ —> Fe2+ Transferrin: Blutplasmaprotein & Transport > Glykoprotein des Blutplasmas (beta1-Globulin) > M = 78 kDa > 200-300 mg/100ml Plasma > Transferrineisen: 70-180 mikrogramm/100ml Plasma > Nur teilweise beladen; 21—50% im Normalfall (Bindungsapazität: bis 360 mikorgramm) > Bindung von 2 Fe3+ und 3 HCO3- > 70-80% des Transferrineisens gehen an die roten Blutzellen 32 > Eisenaufnahme durch Transferrin-Rezeptoren Transferrin-Zyklus Regulation der Eisenhomöostase Feedback-Mechanismus: - Eisenkonzentration beeinflusst Translation von mRNAs - bei niedrigem Eisen verliert Aconitase Fe —> IRP1 (Iron Regulatory Protein 1) - IRP1 bindet an Iron Response Elements (IRE) und stabilisiert mRNAs von a) Transferrin Rezeptor (TfR) und b) DMT1 - IRP1 bindet an Iron Response Elements (IRE) und verhindert Translation von a) Ferritin und b) ALA Synthase (für die Häm-Synthese) Hämosiderose (=vermehrte Eisenablagerung - v.a. im Leberparenchym) Ursachen: Alkoholbedingte Leberzirrhosen, häufige Bluttransfusionen und dadurch Eisenüberversorgung. —> Hämosiderin: Speicher nach Anfüllen von Ferritinspeichern - Hämosiderin = abgebautes Ferritin; unlöslich/aggregiert - Assoziiert mit Zellbestandteilen (Lipide, Nukleotide) - Bis zu 33% Eisen als Eisenhydroxid (Fe(OH)3) - Kommt nur intrazellulär vor, v.a. in Makrophagen Hämochromatose - Genetische Krankheit - Defekt im HFE-Gen 33 - Autosomal-rezessiv (ca. 10% d. Nordeuropäer sind heterozygot, Homozygot: 25% haben manifestierte Hämochromatose) - HFE Protein reguliert Eisenaufnahme durch Bindung an den Transferrin Rezeptor Das überschüssige Eisen wird dann abgelagert in: —> Leber, Pankreas, Herzmuskel (Myokard), Haut, Gelenke Führt zu Leberzirrhose, Diabetes, Schäden am Myocard und Hoden Therapie: Ernährung anpassen, Aderlässe Zusammenfassung 1. Eisen im Körper: ca. 70% Hb/Mb ca. 10% Enzyme ca. 20% Speichereisen < 1% Transporteisen 2. Aufnahme von Eisen kann reguliert werden: —> Feedback: wenig Eisen —> +DMT1, +TfR, -Ferritin, -ALA Synthase (Hämsythese) 3. Bedarf: Männer 1 mg/Tag, Frauen 2-3 mg/Tag (bzw. 4-5 mg bei Schwangerschaft) 4. Ausscheidung: ca. 1 mg/Tag, kann nicht gesteigert werden 5. Eisen wird resorbiert 6. Eisenaufnahme vom Lumen als Fe2+ über DMT1 oder als Häm über HCP1 und Fe2+- Freisetzung durch Hämoxygenase. +++ > Transport durch Mobilferrin (Fe2+) & Austritt in Blut durch Ferroportin > Oxidation durch Hepheastin von Fe2+ zu Fe3+ > Transport im Blut durch Transferrin (Fe3+) —> bindet max. 2 Fe3+, Aufnahme via Transferrin Rezeptor (wird recycled) > Speicherung als Fe3+-Ferritin im Darmepithel/Blut (bis zu 4500 Atome Fe3+) > Zusätzlicher Speicher: Hämosiderin (abgebautes, aggregiertes Ferritin) 34 4. Häm: Anabolismus & Catabolismus EXKURS: Hämsynthese - 70% Körpereisen in Hämgruppe des Hb und Mb - Synthese hauptsächlich in Erythroblasten und Retikulozyten - Synthetisiert in Mitochondrien und im Zytosol - ALA Synthase katalysiert ersten Schritt der Häm-Synthese (Feedback-Mechanismus: Transkription stimuliert von EPO, Translation reguliert durch IRP1) —> Blei inhibiert ALA Synthase Exkurs: Bleivergiftung: - Quellen von Blei: Wasserrohre, Keramikglasur, Nahrung (Muscheln, Pilze), Tabakrauch - Führt zu Blutarmut und Enzephalopathie und neurologische Schäden Hämabbau - Abbau der Erys in Milz, Knochenmark und Leber - Globin: Proteinabbau - Wiederverwendung der AS - Hämkatabolismus - Wiederverwertung des Eisens (ca. 20 mg Eisen/Tag) - Abbau des hydrphoben Häm-Gerüsts —> Mobilisierung des Eisens rotes Häm —(Hämoxygenase)—> Biliverdin + CO + Fe2+ Biliverdin —(Biliverdinreduktase)—> gelbes Bilirubin (reduziert Methingruppe zu Methylen) - Bilirubin wird an Albumin gebunden und zur Leber transportiert - in der Leber (ER) —> UDP-Glucuronyltransferase: Verestert Proprionsäureketten mit Glucuronsäure: Bilirubin-Diglucuronid = konjugiertes/direktes Bilirubin - Konjugation mit Glucuronsäure macht Bilirubin wasserlöslich - Ausscheidung in die Galle durch aktiven Transport (Multispezifischer organischer Anionentransporter) - Weiterer Abbau im Darm (Urobilin —> Stercobilin) - Teil geht über enterohepatischen Kreislauf in die Niere 35 5. Krankheiten Hyperbilirubinämie: Ikterus bei über 2 mg/100ml —> Übertritt von Bilirubin ins Gewebe —> Gelbfärbung der Haut, Skleren (Lederhaut) a) Prähepatischen Ikterus (v.a. bei Hämolyse —> vermehrt indirektes Bilirubin) > Sichelzellenanämie, Thalassämie, G6PD-Mangel, Morbus haemolyticus neonatorum (Rhesus-Faktor: Mutter Rh- und Kind Rh+) b) Intrahepatischen Ikterus (Lebererkrankungen —> beide Arten, Leberenzyme erhöht) c) Posthepatischen Ikterus (Gallengangverschluss, Gallensteine —> konjugiertes Bilirubin) Eisenmangelanämie > Mikrozytäre und hypochrome Anämie, kein Speichereisen, -Serumferritin, +Transferrin, Transferrinsättigung niedrig Hämosiderose > Eisenablagerungen (Hämosiderin) durch Überversorgung Hämochromatose > Genetischer Defekt im HFE-Gen > Vermehrte Aufnahme von Eisen via Transferrin Rezeptor > Ablagerung in Leber, Pankreas, Myokard, Haut, Gelenken 8. Blutgerinnung Gleichgewicht: Blutgerinnung (Abdichtung von Gefäßverletzungen, Thrombosen, Infarkte) und Fibrinolyse (Auflösen von Blutgerinnseln, Hämorrhagische Diathese = Blutungsneigung) Hämorrhagische Diathese - Ursachen: > vaskulär: Vit-C-Mangel (vermindert Kollagensynthese) > zellulär: Thrombozytopenie (zB bei Leukämie) > plasmatisch: Mangel an Gerinnungsfaktoren (ua. Faktor VIII), Vit K Mangel Blutstillung - 4 Phasen 1) Vaskuläre Phase —> Vasokonstriktion 2) Zelluläre Phase —> Aggregation der Thrombozyten 3) frühe plasmatische Phase —> Blutgerinnung 4) späte plasmatische Phase —> Fibrinolyse Phasen entsprechen Mechanismen, die gleichzeitig nebeneinander ablaufen. 1) Vasokonstriktion - Kontraktion der glatten Muskelzellen (verletztes Gefäß) - Auslöser: Freisetzung vasokonstriktorischer Substanzen (Serotonin & Thromboxana A2) Serotonin — aktivierte Thrombozyten Thromboxan TxA2 — aktivierte Thrombozyten, verletzte Endothelzellen Noradrenalin — sympathische Nervenendigungen 36 - Folge: Verlangsamung des Blutstroms - Dauer: nur kurzzeitig (1-2 min), rascher Abbau Synthese von Thromboxan: aus Eicosanoiden (= mehrfach ungesättigte C20 Fettsäuren) —> ua. Arachidonsäure —> 1. Abspaltung von Arachidonsäure (durch Phospholipase A2) —> 2. Bld. zyklisches Peroxid Dioxygenase katalysiert 2 Reaktionen: COX = zyklisches Endoperoxid und Hydroperoxid —> 3. Reduktion COX: 2 enzymatische Aktivitäten: Dioxygenase & Peroxidase (Reduktion von Peroxid durch Verbrauch von Glutathion) —> 4. Bld. Prostanoide ! Trotz gleichen Entstehungsmechanismus haben Prostanoide unterschiedliche Wirkungen. zB wirken Prostacyclin und Thromboxan gegensätzlich. (vasodilatativ und -konstriktiv) ! Oxidation durch COX ist ein wichtiger Regulationsschritt der medikamentös von großer Bedeutung ist. —> nicht steroidale Entzündungshemmer (Aspirin) und steroidale Entzünungshemmer (Cortisol) —> Reversible Kompetition um Bindung an COX Substratbindungsstelle: Serin- und Argininrest nicht-steroidal: wirken direkt auf COX steroidal: indirekt über negative und positive Regulation der Gen-Expression von COX / Lipocortin ! ASS wird auf Serin-Rest in COX übertragen —> irreversibel Hemmung. Thrombose-Prophylaxe durch Langzeit-Therapie mit ASS *Thrombose-Prophylaxe durch Langzeit-Therapie mit ASS Cortisol (steroidal) hemmt die Genexpression von COX stimuliert Genexpression von Lipocortin = Inhibitor von PLA2 (Phospholipase A2) 2) Zelluläre Phase Thrombozyten: Entstehung aus Megakaryozyten —> kein Zellkern, LD: 8-10 Tage Granula: Serotonin, TxA2, ADP Membranrezeptoren: > Matrixproteine (Kollagen) > Sekretproteine des Endothels (vWF) > Gerinnungsfaktoren (Thrombin, Fibrinogen) > TxA2 37 Aktivierung erfolgt in 3 Stufen 1) Adhäsion - Ablagerung an subendothelialer Matrix 2) Formänderung - Ausbildung von Fortsätzen (Pseudopodien) 3) Aggregation - Verknüpfung von Thrombozyten über Pseudopodien Die Adhäsion an Kollagen erfolgt mittels Rezeptoren. TxA2 aus aktivierten Thrombozyten und Endothel bewirken Formänderung (Pseudopodienformierung). Aggregat noch reversibel, da Fibrinogen noch nicht aktiviert. Erst durch Blutgerinnungskaskade wird Fibrinogen zu Fibrin. Quervernetzung von Fibrin führt zu irreversiblen Aggregat —> weißer Thrombus 4) Frühe Plasmatische Phase - viele Gerinnungsfaktoren sind Serin-Proteasen - Bildung als inaktive Vorstufe = Zymogene - Aktivierung nacheinander = Kaskade durch limitierte Proteolyse - Ziel: Umformung von Fibrinogen (löslich) zu Fibrin (unlöslich) = roter Thrombus 2 Aktivierungswege: Extrinsisches / Exogenes System Intrinsisches / Endogenes System Gewebefaktor-Weg Kontaktfaktor-Weg - Verletzung des Bindegewebes der Gefäßwand - Verletzung des Endothels auf der Gefäßwand - Freilegen des Gewebefaktors = Thromboplastin - Kontaktfaktor = negative Ladungen auf - Schnell Strukturproteinen - Langsam 38 Extrinsisches / Exogenes System Intrinsisches / Endogenes System unspezifisch / spezifisch Protein-Protein-Wechselwirkung III Thromboplastin (Gewebefaktor) = Cofaktor (Thromboplastin, III) spaltet… IV Ca2+-Ionen VII —> VIIa V Cofaktor von Xa X* —> Xa Thrombin VI aktiverter Faktor V Fibrinogen I —> Fibrin (Vernetzung) VII bildet mit III Protease (extr. Tenase, X-Akt.) VIII Antihämophiliefaktor A = Cofaktor b) unspezifisch IX bildet mit VIII Protease (intr. Tenase, X-Akt.) X Stuart-Prower, aktiviert Thrombin = Protease Subendotheliale Matrix, Kontakt-Aktivierung, negative Ladungen XI aktiviert Faktor IX (Proteasen) XII aktiviert Faktor IX (Proteasen) XII* —> XIIa (*Hagemann-Faktor) XIII Fibrin-Quervernetzung = Transamidase XI —> XIa IX —> IXa Xa Thrombin Fibrinogen I —> Fibrin (Vernetzung) ** VIIa aktiviert zusätzlich XIa ***Thrombin sorgt für > Autokatalyse von VIIIa > V —> Va > XIII —> XIIIa (für Fibrinvernetzung) > Thrombozytenaktivierung —> Faktor II (Prothrombin) —> Thrombin Faktor I (Fibrinogen) —> Fibrin —> Vernetzung (Fibrinpolymer) - Gerinnungskaskade erfolgt über 2 Aktivierungswege: Gewebefaktorweg (über Thromboplastin) und Kontaktweg (über exponierte negative Ladungen) - Beide Wege münden gemeinsam in der proteolytischen Aktivierung von Faktor X - Faktor X spaltet Prothrombin zu Thrombin - Thrombin spaltet Fibrinogen zu Fibrin - Thrombin katalysiert außerdem seine eigene Aktivierung über Spaltung vorgeschalteter Gerinnungsfaktoren Ca2+ (Faktor IV) wird für Aktivierung benötigt > IX >X > VII > Prothrombin —> verankert Faktoren an Plasmamembran —> an Phospholipid (Phospatidyl-Serin) in Membranfragmenten Die Gerinnungsfaktoren sind gamma-carboxyliert ___________________________ 39 Extrinsischer Weg - durch Tissue Factor (Gewebefaktor = Thromboplastin = III) ausgelöster Aktivierungsweg der plasmatischen Gerinnung - Tissue Factor ist ein Transmembranprotein, das von subendothelialen Fibroblasten und glatten Muskelzellen gebildet wird - Er bekommt bei Gewebeverletzungen Kontakt zum Blut und aktiviert Faktor VII - Bildung einer extrinsischen Tenase: Faktor III und VIIa bilden mit Phospholipiden und Ca2+-Ionen einen Enzym-Komplex, die sog. extrinsische Tenase. 5) Späte Plasmatische Phase Fibrinogen —> Fibrinmonomer —> (ionische Verknüpfung)—> Fibrinaggregat —> Vernetzung durch XIII —> Fibrinpolymer —>… Fibrinolyse durch Plasminogen —> Plasmin - Plasmin ist eine Protease - Die Aktivierung von Plasmin ist an die Fibrin-Bildung gekoppelt tPA — tissue plasminogen activator uPA — Urokinase Enzym Art Aktivität tPA Serinprotease 1. Einwanderung in Thrombus mit Plasminogen 2. Analgerung an Fibrin > Aktivitätssteigerung = negative Rückkopplung der Blutgerinnung uPA Serinprotease - als Monomer kaum aktiv - Gefäßverletzung > Dimerisierung + Aktivierung = negative Rückkopplung der Blutgerinnung Streptokinase bakterielles 1. Anlagerung an Plasminogen > Aktivierung Protein ohne 2. keine Bindung an Fibrin nötig > entkoppelt von Enzymaktivität Fibrinbildung (keine Kinase) > Durch die Spaltung von V und VIII verhindert Plasmin die weitere Blutgerinnung (Inaktivierung durch Proteolyse bzw. neg. Rückkopplung) > Neg. Rückkopplung: Fibrin aktiviert tPA, welcher Plasminogen spaltet. uPA wird durch Gewebeverletzungen aktiviert > Serinproteasen-Inhibitor Antithrombin (AT) - hohe Aktivität für aktivierte Gerinnungsfaktoren (Proteasen) Antithrombin: = ein Serpin = Serin-Proteasen-Inhibitor durch Bindung mit Heparin wird die Wirkung aufs 1000-fache gesteigert (Lysin an Sulfat) 40 Heparin: ein Polyanion der Mastzelle aus Glucuronsäure und Glucosamin intrazelluläres Glykosaminoglykan (Mastzellen, Schleimhaut, Respirationstrakt) bindet Histamin in Granula kein physiologischer Regulator des Gerinnungssystems Heparansulfat: extrazelluläres GAG (Matrix von Gefäßbindegewebe), Grad der Sulfatisierung - Blutgerinnungssystem wird durch limitierte Proteolyse aktiviert - Signalwege stehen über positive und negative Rückkopplungsmechanismen in Verbindung - Diese dienen einer schnellen Aktivierung sowie der Feinregulation um Überschussreaktionen zu vermeiden - Informationsfluss erfolgt über ein Mehrstufenverstärkerprinzip 9. Nukleinsäuren, Genexpression I 1. Aufbau von Nukleotiden Sie bestehen aus einer organischen Base, einem Kohlenhydrat und einer Phosphatgruppe (n= 1-3) Nukleosid = Zucker und Base Zwischen Phosphat und Zucker: Esterbindung (5`) Zwischen Base und Zucker: N-glykos. Bindung (1`) —> Die Nukleobasen sind Purin- und Pyrimidinderivate. > Purine: Adenin und Guanin > Pyrimidine: Cytosin, Uracil und Thymin DNA: A-T und G-C RNA: A -U und G-C Basenpaare interagieren mit H-Brücken (G:C 3, A:T 2) - DNA mit hohem G:C Gehalt hat eine höhere Schmelztemperatur als A:T-reiche Sequenzen. - Bestimmte Chromosomenbereiche mit besonderer DNA Sequenz (Zentromere, Telomere, Promoter eines Genes ua.) haben dadurch andere Eigenschaften. 41 - Dies beeinflusst viele praktische Aspekte (zB PCR-Reaktionen) Der tägliche Energiebedarf des Menschen beträgt 2500-3000 kcal / Tag (bei mittelschwerer körperlicher Betätigung. (60% Kohlenhydrate, 25% Fette, 15% Proteine) —> 1 kcal = 4,2 J 1 J = Wärmemenge, die ein Strom von 1 Ampere Stärke in einer Sekunde beim Durchfluss durch einen Draht mit dem Widerstand 1 Ohm entwickelt. Grundlegende Reaktionen des Stoﬀwechsels: Zucker + Lipide: CxHyOz + nO2 —> CO2 + H2O + freie chemische Energie Proteine: CxHyOzNv + nO2 —> CO2 + H2O + NH3 + freie chemische Energie —> NH3 + CO2 —> Harnstoﬀ Die bei der Oxidation der Nahrungsstoﬀe gewonnene freie Energie wird in die chemische ENergie von ATP umgewandelt. ATP = eine energietransduzierende Währung. > Gesamtmenge im Körper: 60-80 g > Gesamtumsatz pro Tag: 40-70 kg 2. Replikationsgabel, Helikase & Topoisomerase Zentrales Dogma der Molekularbiologie: Bis in die 70er Jahre glaubte man, dass bei allen Organismen die genetische Information bei der Genexpression in eine Richtung fließt: DNA —> RNA —> Protein. Seit den 70ern ist jedoch eine Ausnahme bekannt: Retroviren, deren Genom aus RNA besteht, stellen eine DNA-Kopie ihres Genoms her (sog. reverse Transkription) und integrieren ihre DNA- Kopie in das Wirtsgenom. Das Prinzip der Replikation besagt, dass beide Stränge der DNA komplementär sind. Trennt man die Doppelhelix auseinander, geht keine Information verloren. Beide Stränge können als Vorlage verwendet werden. Replikation verläuft semikonservativ (=Tochterstrang besteht aus einem Elternstrang und einem neuen Strang) —> Die Replikation ist der Vorgang der identischen Verdopplung der DNA. - findet in der S-Phase d. Zellzyklus vor der Zellteilung statt (8-12 Stunden) - Syntheserichtung ist immer von 5’ nach 3’ - Die Enzyme, die die Replikation katalysieren, die DNA-Polymerasen, benötigen einen DNA- Matrizenstrang, Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) als Substrate, ein kurzes RNA-Stück mit freiem 3’-OH-Ende, den sog. Primer, um an die freie OH-Gruppe das dNTP anhängen zu können. 42 Ablauf 1. Erkennung d. Ursprungs: Beginn am ORI (Origin of Replication) - Trennung der beiden Stränge. Für Prokaryonten: Initiationsenzym DnaA bindet an DNA-Sequenz des ORI. Doppelhelix wird durch HELIKASE DnaB (ATP-abhängig) entwunden und die DNA-Stränge werden getrennt. Eine sofortige Reassoziation der Einzelstränge und die Bildung intramolekularer Haarnadelschleifen werden durch Anlagerung von Einzelstrangproteinen (single strand binding Proteins - SSB). verhindert. Entspiralisierung durch TOPOISOMERASE (Verringerung v. Torsionsspannung). > Typ-I-Topoisomerase — entspiralisieren superspiralisierte DNA ohne ATP-Verbrauch > Typ-II-Topoisomerase — verändert räumliche Struktur der Doppelhelix - Spaltung beider DNA-Stränge (vorübergehend) unter ATP-Verbrauch 2. Trennung der Stränge: Entstehung der Replikationsgabel. (Je nachdem ob sich vom ORI ein oder zwei Replikationsgabeln wegbewegen erfolgt die Replikation uni- oder bidirektional - bei Eukaryonten grundsätzlich bi). Ein DNA-Abschnitt, der von einem ORI aus repliziert wird, heißt Replikon. (Eukaryontische Chromosomen weisen mehrere ORIs und Replikons auf = ca. 30 000, dies verkürzt die Dauer des Vorgangs) 3. Synthese der Primer: DNA-Polymerasen benötigen ein Nukleinsäurestück mit freiem 3’-OH- Ende um mit der Synthese beginnen zu können. DNA-abhängige RNA-Polymerase können ohne Hilfsmittel anhand einer DNA-Matrize RNA synthetisieren. DNA-abhängige RNA-Polymerase = PRIMASE synthetisiert RNA-Oligonukleotid = Primer 4. Synthese der DNA-Tochterstränge - Hierbei entstehen an einem der beiden Eltern-Stränge DNA-Fragmente, sog. Okazaki-Fragmente. Alle Polymerasen (DNA-Polymerase) synthetisieren Nukleinsäuren vom 5’-Ende beginnend in Richtung 3’-Ende, dh. sie lesen die Matrize von 3’ nach 5’ ab. Am Leitstrang (3’-5’) entspricht die Syntheserichtung der Wanderungsrichtung der Replikationsgabel, sodass er in einem Stück repliziert werden kann. (ein Primer) 43 Bei Prokaryonten ist bis jetzt nur eine DNA-Polymerase III bekannt. Bei Eukaryonten wird die DNA-Polymerase alpha nach 20 Desoxynukleotiden am Leitstrang von der DNA- Polymerase epsilon und am Folgestrang von der DNA-Polymerase delta abgelöst. Am Folgestrang (5’-3’) ist dies hingegen nicht der Fall. Er wird deshalb diskontinuierlich in kurzen Stücken synthetisiert = Okazaki-Fragmente. (viele Primer) 5. Die Primer werden entfernt: Auﬀüllen der Lücken zwischen den Okazaki Fragmenten. Die RNA-Primer müssen schließlich noch entfernt und durch DNA ersetzt werden. Dies geschieht bei Prokaryonten durch die DNA-Polymerase I mit 5’-3’-Exonuklease Aktivität. Bei Eukaryonten erreicht die DNA-Polymerase delta durch Verdrängungs-Synthese eine Ablösung des RNA-Primers vom Matrizenstrang. Dann wird RNA durch FEN1 abgespalten. Bei der Synthesereaktion erfolgt ein nukleophiler Angriﬀ der 3’-OH-Gruppe am Ende des Nukleinsäurestrangs auf das alpha-Phosphoratom des einzubauenden Nukleotids. Pyrophosphat wird freigesetzt und es entsteht eine Phosphorsäure-Esterbindung. 6. Verknüpfung der Okazaki Fragmente (Ligation) Im letzten Schritt werden die Okazaki Fragmente kovalent miteinander verknüpft —> von der DNA-LIGASE Replikation eukaryontischer Chromosomen-Enden Die Primer Lücke am 5’-Ende jedes fertigen Tochterstranges lässt sich nicht füllen, weil ein freies 3’OH-Ende fehlt. So gehen bei jeder Replikation Nukleotide verloren. Eukaryontische Chromosomen Enden „Telomere“, weisen jedoch eine repetetive, nicht codierende Sequnez auf (GGGTTA). Zudem ist jeder 3’-Strang am Ende etwas länger als sein komplementärer Strang (= Einzelstrang-Überhang). Obwohl das 5’-Ende jedes Tochterstrangs mit jeder Replikation kürzer wird, gehen also zunächst keine codierenden Sequenzen zu Grunde. Erst nach 30-50 Zellteilungen sind kodierende Sequenzen betroﬀen. Dies begrenzt die Zellteilungsfähigkeit der meisten somatischen Zellen Nur die Zellen stark proliferierender Gewebe sowie Tumorzellen können dies durch TELOMERASE ausgleichen (=reverse Transkriptase): diese verlängert die Telomere. Sie lagert sich an den 3’-Überhang an und es kommt zur Basenpaarung (UAACCC). —> Synthese durch DNA-Polymerase. 3. Verpackung der DNA Gene sind im Zellkern angesiedelt. Das angefärbte Material heiß Chromatin. Chromatin besteht aus DNS und Proteinen. Die DNA/ DNS enthält die genetische Information. Die DNA in jeder Zelle ist ca 2m lang. Die Zelle selbst ist aber nur 5 mikrometer groß. Nukleosomen falten DNA in eine kompakte Struktur. Ein Nukleosom enthält ca. 146 Basenpaare DNA, 8 Proteine —> idR. jeweils 2 Kopien von den Histonen H2A, H2B, H3 und H4. Chemische Modifizierung des Chromatins regeln den Verpackungsgrad. 44 Wir kennen 2 Formen: a) Histon Modifikationen und b) DNA-Methylierung. Funktionen der Chromatinfaltung: - Schutz der DNA, verhindert ungewollte Interaktionen - Das gefaltete Chromatin bleibt zellulären Mechanismen zugänglich (zB. DNA Transkription, DNA Replikation, DNA Reparatur) - Diese Faltung erlaubt präzise Regulation der Genexpression. Funktionen der Chromatinmodifizierung - verändert chemische Eigenschaften (zb acetyl-Lysine verlieren pos. Ladung) - Es entstehen Bindungsstellen f. Enzyme und andere Proteine (zB Bromodomäne erkennen acetylierte Histonproteine) - Die Modifizierungen können sehr dynamisch sein oder stabil - Sie verkoppeln den zellulären Stoﬀwechsel mit der Chromatinmodifizierung (und daher zB Genaktivität) Das menschliche Genom: 23 000 Gene (3,2 x 10^9 bp) Die versch. Zelltypen in unserem Körper entstehen durch ein diﬀerenziertes Ablesen des Genomes und insbesondere der Proteinkodierenden Gene. Zelluläre Identität ergibt sich aus: der genetischen Vielfalt, aus dem selektiven Auslesen unseres Genoms, aus dem Aufrechterhalten der genetischen Programme, aus der zellulären Plastizität 10. Genexpression II, Proteinsynthese, posttransl. Prozessierung Genregulation: - Transkription ist regulierbar - die meisten Gene in einer Zelle sind inaktiv - es erfolgt selektive Transkription uns Translation - Epigenetisches Ein/Ausschalten von Genen - Umweltveränderungen ändern die Genaktivität Im Menschen bestehen die meisten proteinkodierenden Gene aus Introns und Exons. Das Zusammenstellen einer mRNA aus Exons nennt man Spleißen. Daraus ergibt sich die Möglichkeit verschiedene mRNAs zu bilden. —> Aus ca. 23000 Genen werden so Millionen von verschiedenen Proteinen hergestellt. Alternative Promotoren, Alternatives Spleißen, mRNA Editing und posttranslationale Modifizierung sind dafür verantwortlich. Transkription ist dabei die Synthese eines RNA Polymers anhand einer DNA als Vorlage. a) Der Promotor … die Nukleotid-Sequenz auf der DNA, die die regulierte Expression eines Gens ermöglicht (essentieller Bestandteil eines Gens). … er liegt am 5’-Ende des Nichtmatrizenstrangs des Gens und somit in Syntheserichtung vor dem RNA-codierenden Bereich. 45 … wichtigste Eigenschaft: spezifische Wechselwirkung mit bestimmten DNA-bindenden Proteinen, welche den Start der Transkription des Gens durch die RNA-Polymerase vermitteln und als Transkriptionsfaktoren bezeichnet werden. TF = Transkriptionsfaktoren erkennen Promotor und andere DNA Elemente die die Genexpression bestimmen —> zB „major groover“ Bindung, Interaktion mit Phosphatgruppen, spezifischen Basen, Beugung der DNA b) mRNAs: Open Reading Frame, Start/Stop-Codon, UTRs Open reading frame (ORF): Bereich der DNA bzw mRNA, dessen Leserahmen zwischen Startcodon und erstem Stopcodon im gleichen Leseraster ist. > ORFs kodieren potentiell für die AS-Sequenz eines Peptids oder Proteins. > ORFs werden von nicht-codierenden Bereichen eines Gens umgeben —> dem 5’UTR und dem 3’UTR-Bereich (UTR = untranslated region) > ORFeom: die Gesamtheit aller oﬀenen Leseraster eines Genoms CAP - 5’ - UTR — Exons & Introns — UTR - 3’ - PolyA Wo finden die Prozesse in der Zelle statt? - Zellkern: Transkription, Posttranslationale Prozessierung - Plasma: unreife RNA wirkt als andere RNA, tRNA oder mRNA, Translation und posttransl. Modifizierung. Vom Genprodukt zum fertigen Protein: - mRNAs sind polyadenyliert (polyA) - hnRNA (Heterogene nukleäre RNA) ist das primäre Transkript eukaryontischer Strukturgene - hnRNA (unreif) wird durch Capping (5’-Guanosin), Splicing und Polyadenylierung (50-250 AMP) zu mRNA (reif) - In einigen Fällen werden gezielt einzelne Basen verändert (RNA-Editing) - deren Export ist vom Zellkern reguliert - Jedem Codon (Basentriplett) steht über das Anticodon einer tRNA eine bestimmte AS zugeordnet - tRNA Synthetasen verbinden spezifische AS mit bestimmten tRNAs. (Anticodon) Die Alanyl-tRNA Synthetase erkennt sowohl die AS Alanin, wie auch die tRNA mit dem entsprechenden Anticodon für Alanin und verbindet die zwei Moleküle miteinander (= aktivierte AS) —> unter ATP-Verbrauch wird die AS der tRNA angehängt —> START: AUG (Methionin) —> STOP: UGA, UAA, UAG c) tRNA: Transfer-RNA Aufbau: T-Form; Anticodon-Schleife, TC-Schleife, Dihydrouridin-Schleife, 5’-Ende, 3’-CCA-Ende + gebundener AS Ribosom: EPA-Stellen (Anfang bei A) d) Transkription Ablauf der Transkription: 1) Initiation (Vorbereitung der RNA-Synthese) > Promotor muss von der RNA-Polymerase erkannt werden (TATA-Box) > Sie bindet daran und entwindet den Strang = Transkriptionsblase > Ein Oligopeptid aus ca. 10 Basen wird synthethisiert > Topoisomerasen verhindern coiling 46 Bei Eukaryoten: basale / proximale Promotoren Im Basalen bereich befinden sich allg. TF II 2) Elongation (RNA-Synthese am Matrizenstrang (codogener) > Matrizenstrang wird v. 3’ nach 5’ abgelesen, Elongation erfolgt v. 5’-3’ > Als Substrate werden die Nukleosidtriphosphate ATP, GTP, UTP und CTP benötigt. > Phosphorsäureesterbindung entsteht bei Synthese 3) Termination intrinsische (Terminator) oder p-abhängige Termination Die Enzyme die DNA in RNA kopieren heißen DNA-abhängige RNA-Polymerasen. Enzym Genprodukt RNA Polymerase I ribosomale RNA Produkte RNA Polymerase II proteinkodierende Gene (mRNA), snRNA, microRNAs ua. nicht-kodierende Transkripte (zB Xist-RNA) RNA Polymerase III 5s rRNA, tRNA, small nuclear RNAs (snRNA) Wie wissen RNA-Polymerasen wo ein Gen anfängt? —> Cis-Elemente an der DNA werden von der Transkriptionsmaschinerie erkannt (Enhancer / Promotor) Wie wird die Transkription von Genen gesteuert? —> TF werden synthetisiert, degradiert, lokalisiert, chemisch modifiziert und freigegeben. —> Co-Aktivatoren verbinden TF mit der generellen Transkriptionsmaschinerie. TFIID und Mediator-Komplexe sind dabei wichtige Ko-Aktivatoren Verschieden Arten von Spleißen: 47 - Konstitutiv - Exon-Skipping - Intron Retention - Mutually Exclusive Exons - Alternative 5’ Splice / 3’ Splice Site Nicht kodierende RNA-Typen zB rRNA und tRNA RNA-Moleküle mit katalytischer Aktivität werden Ribozyme genannt > rRNA mit Peptidyltransferase-Aktivität > RNase P — Synthese von tRNA > Spleißosom Als Enhancer bezeichnet man nicht-transkribierte Gensequenzen (meist vor einem Gen am 5’ Ende), die nach der Bindung der TF an den Promotor eines Gens dessen mRNA-Produktion verstärken können. (Steigerung der Transkription spezifischer Gene) Die gegensätzlichen Regulatorsequenzen werden Silencer genannt. —> Transkriptionsrate des Gens ergibt sich aus Zusammenspiel von Enhancern und Silencern. —> Damit die beiden aktiv werden können, müssen sie zuerst weitere TF binden Durch die Methylierung von Basen kann die Transkription zusätzlich beeinflusst werden. 11. Einführung in den Energiestoﬀwechsel Stoﬀwechsel = Metabolismus 1. chemische Reaktionen dienen dem Abbau von Stoﬀen zur Energieerzeugung oder zur Bereitstellung von Bausteinen für die Synthese von Biomolekülen 2. chemische Reaktionen dienen dem Aufbau von körpereigenen Energiespeichern und Körpersubstanz a) Katabolismus (abbauender Stoﬀwechsel) Bsp: Oxidation der Glucose (C6H12O6 + 6 O2 —> 6 CO2 + 6 H2O + 2850 kJ/mol) = Nährstoﬀe + Sauerstoﬀ —> Stoﬀwechselendprodukte Aufnahme der Nährstoﬀe > Abbau der Nährstoﬀe mit O2 (Oxidation) > Abgabe der Stoﬀwechselprodukte. Die Endprodukte sind energieärmer als die Nährstoﬀe —> Katabolismus ist eine energieliefernder Stoﬀwechsel (60% wird an Wärme frei, 40% chemische Energie) —> Er liefert zusätzlich Bausteine für den Anabolismus Die chemische Energie wird benötigt für: Homöostase, Biosynthese, Osmotische Arbeit, Mechanische Arbeit, Signaltransduktion, Aufbau von Körpersubstanz (Anabolismus). Nährstoﬀabbau Glycogen > Glucose TAG > Glycerin + Fettsäuren Proteine > AS Hydrolytischer Abbau zu den Bausteinen —> Abbau zum gemeinsamen zentralen Metabolyt des Stoﬀwechsels (Stoﬀwechselintermediat): Acetyl-CoA (C2-Körper, aktivierter Essigsäurerest). 48 Alle drei Nährstoﬀgruppen sind für die Energiegewinnung geeignet und austauschbar. Allerdings ist Glucose obligatorisch für Erythrozyten (da sie keine Mitochondrien besitzen), und Gehirn (+ Ketonkörper). Leber als zentrales Organ stellt Glucose zur Verfügung b) Anabolismus = Alle Prozesse, die dem Aufbau von Speichermolekülen und zellulären Baustoﬀen dienen. c) Intermediärstoﬀwechsel Stoﬀwechsel der Zwischenprodukte (zwischen Bausteinen und Endprodukten Energiumsatz: Messung der Energiezufuhr 1 kcal erwärmen 1l Wasser um 1°C 1 cal = Erwärmung v. 1 ml H2O um 1°C 1 kcal = 1000 cal 1 Joule (J) = 1 Newton*m = 1 kg*m^2*s^-1 1 kcal = 4,2 kJ Hess’scher Satz Die mit einer Zustandsänderung verbundene Energieänderung ist unabhängig vom Weg der Zustandsänderung. -> Aus einem Nährstoﬀ im Stoﬀwechsel maximal zu gewinnende Energie ist gleich der Wärme- menge, die im Kalorimeter bei der Verbrennung zu CO2 und H2O frei wird. physikalischer Brennwert (kj/g): Energiemenge, die bei vollständiger Verbrennung im Kalorimeter frei wird. physiologischer Brennwert: Energiemenge, die bei der Verbrennung im Körper frei wird Brennwert Proteine Kohlenhydrate Fette Ethanol (kJ/g) C, H, O, N, S C, H, O C, H, O C, H, O physikalischer

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