Tema 5. Mecanismos de Reparación de ADN (Continuación) PDF

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Comisión 15 14/11/2024 Comisionista 1: Sandro Anceaume Díaz Correctora: Lucía Rivero del Castillo Comisionista 2: María Díaz González Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz TEMA 5. MECANISMOS DE REPARACIÓN DE ADN (CONTINUACIÓN) 1. REPARACIÓN DE DOBLES ROTURAS DE ADN RECOMBINCIÓN HOMÓLOGA (HR): Consiste en la reparación de dobles roturas empleando una copia intacta de una cromátida, por lo que este mecanismo solo va a funcionar después de la replicación del ADN (con una cromátida hermana, este mecanismo puede funcionar). UNIÓN DE EXTREMOS NO HOMÓLOGOS (NHEJ): Sucede de forma previa a la síntesis de nuevas copias de ADN y se basa básicamente, tal y como indica su nombre, en la unión de extremos NO homólogos. Al contrario que en la recombinación homóloga, aquí no tenemos una cromátida hermana para poder solucionar esa rotura. El procedimiento es el siguiente: - Hay una serie de proteínas que reconocen el daño, interaccionan con esos extremos después de la doble rotura y forman un puente a través de un complejo multiproteico entre los extremos dañados. Por lo que hay proteínas que interactúan directamente con el ADN y otras que interactúan entre ellas (interacciones proteína-proteína para poder formar el puente) Es un proceso que debe ser rápido, ya que ante la existencia de la rotura, pueden distanciarse ambos extremos de forma más significativa, siendo más complicado para arreglar a posteriori. En el ejemplo que se presenta en la imagen, vemos una rotura exclusivamente. Pero en el caso de que existieran múltiples roturas, se podrían unir unos extremos con otros extremos 1  Comisión 15 14/11/2024 Comisionista 1: Sandro Anceaume Díaz Correctora: Lucía Rivero del Castillo Comisionista 2: María Díaz González Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz pero de forma errónea, es decir, se fusionarían extremos que no se corresponden. Para que esto no ocurra, debe de ser rápida la actuación de este mecanismo, formando ese puente. Luego aparecen unas proteínas con actividad nucleasa en el lugar de la rotura y van a degradar ambos extremos de una de las cadenas con mecanismo 3’-5’, para generar secciones de ADN monocatenarios o secciones de microhomología. Finalmente, se producirán puentes de hidrógeno por homología a nivel local entre ambas cadenas monocatenarias. Además, tenemos un extremo 3’-OH disponible con ADN monocatenario en la cadena complementaria, permitiendo el funcionamiento de las ADN polimerasas, que rellenarán esa sección, quedando como resultado una cadena bicatenaria con una cadena correspondiente a cada fragmento de ADN. Sin embargo, al degradar ambos extremos de la cadena (que pueden abarcar varias decenas de kilobases) existe pérdida de información a nivel local, pues la polimerasa generará un fragmento de ADN que encaje, pero no es exactamente igual al fragmento roto. Igualmente es importante que se dé este mecanismo para no perder toda la cadena completa o perder un brazo del cromosoma, porque a pesar de que se pierde un fragmento de la cadena (el correspondiente a la rotura), podemos mantener el resto de la estructura de la cadena intacta. Tal y como se ha explicado, este mecanismo de unión de extremos NO homólogos implica DELECIONES (que pueden ser mayores o menores). También implica que a la descendencia se le transmita información genética incompleta ante la pérdida de ese cacho de ADN roto. Estás roturas se producen al azar, es decir, puede suceder en estructuras que no sean tan importantes para la función de una célula en concreto o puede suceder todo lo contrario y hacer que esta pierda su funcionalidad. - Se destaca la importancia de las polimerasas para dejar la estructura completa prácticamente como nueva, pero asumiendo que hay pérdidas de información genética (deleciones). 2. RESPUESTA SOS Se trata de un mecanismo de último recurso en el que NO se arreglan daños de rotura (sino sería recombinación homóloga o de unión de extremos no homólogos). Depende de la cantidad de daño que se acumule en un genoma, por lo que en función del daño que haya, se llegará a usar este mecanismo o no. Pueden haber dímeros de timina-timina (las más frecuentes: 70%), timina-citosina o citosina-citosina (cualquier pirimidina). 2  Comisión 15 14/11/2024 Comisionista 1: Sandro Anceaume Díaz Correctora: Lucía Rivero del Castillo Comisionista 2: María Díaz González Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz Si esta molécula tiene un daño que no ha sido reparado, cuando las dos cadenas se separen para que el genoma se duplique, las polimerasas van a seguir avanzando y cuando lleguen a esa región dañada, las polimerasas delta y epsilon no son capaces de reconocer ese dímero de timina, así que se liberan del complejo, ya que no es capaz de avanzar y se queda bloqueada la síntesis. Este mecanismo se basa en la aplicación de unas polimerasas especiales, llamadas translesionales: Estas polimerasas lo que hacen es entrar en el complejo y arreglar el daño existente, para así permitir la entrada de nuevo de las polimerasas de síntesis. Es una especie de “apaño” para que puedan avanzar las polimerasas encargadas de la síntesis del ADN. Estas polimerasas son capaces de incorporar nucleótidos en las cadenas de nueva síntesis sin leer el molde (al contrario que una polimerasa estándar que tiene que leer la cadena para poder realizar su función). Por lo tanto, este mecanismo es una fuente de mutación ya que la incorporación de nucleótidos va a ser “al azar”. La ADN polimerasa n (Eta) es capaz de reconocer de forma específica dímeros de pirimidina, incorporando adenina preferentemente, pues la formación de dímeros de timinas son las más específicas. En el caso de que tengamos dos citosinas y la polimerasa añadiese dos adeninas, se puede producir una mutación al no ser complementaria a la citosina. Si tenemos dos timinas y se añaden dos adeninas, no habría problema. 3. ENFERMEDADES CAUSADAS POR DEFECTOS DEL SISTEMA DE REPARACIÓN. El profesor comenta que no quiere que nos aprendamos nada de lo que se comenta en este punto ni de lo que sale en la tabla. Simplemente se quiere hacer énfasis en la importancia de estos procesos de reparación mediante ejemplos. 3  Comisión 15 14/11/2024 Comisionista 1: Sandro Anceaume Díaz Correctora: Lucía Rivero del Castillo Comisionista 2: María Díaz González Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz Destaca que en los mecanismos descritos, intervienen proteínas que proceden de genes específicos localizados en algún cromosoma y que cuando se transcriben y traducen pueden vigilar y reparar ese daño en el genoma. Esa tabla muestra las enfermedades causadas por esa fuente de mutación endógena y exógena afecta a los genes codificantes de proteínas Se destaca el impacto de la enfermedad de xeroderma pigmentosa, en la que no funcionaría el mecanismo NER y se manifestaría la enfermedad mediante fotosensibilidad de piel, predisposición a cáncer de piel y multitud de pecas. Podríamos generar enfermedades relacionadas con los mecanismos de reparación a lo largo de nuestra vida, es decir, por una razón somática. O bien que hayamos heredado y se esté manifestando, es decir, por razón germinal (heredada de nuestros padres). 4  Comisión 15 14/11/2024 Comisionista 1: Sandro Anceaume Díaz Correctora: Lucía Rivero del Castillo Comisionista 2: María Díaz González Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz TEMA 6. TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE LA VARIACIÓN GENÉTICA 1. INTRODUCCIÓN En este tema vamos a estudiar cómo se pueden detectar los diferentes tipos de variantes que son frecuentes en la población humana y cómo nos pueden ayudar esas técnicas a diagnóstico de riesgo de una patología o a detectar variantes que me permitan predecir cómo un paciente va a responder a una terapia. En el esquema podemos ver una escala con los números de bases, desde 109 (el tamaño del genoma haploide, 3 gigabases) hasta la resolución de un nucleótido. Hay técnicas que nos permiten analizar los cromosomas a esa escala. Ya hemos visto algún caso de un cariotipo con tres copias de cromosoma 21 que deriva en síndrome de Down. Hay cariotipos de más alta resolución en las que se afina la técnica para tener la capacidad de ver reestructuraciones a nivel cromosómico de menor tamaño o la presencia de aneuploidías. Sin embargo las variaciones puntuales son más frecuentes, siendo el daño ínfimo en comparación con las variaciones estructurales. Por lo tanto, para localizar este tipo de mutaciones, sería preciso emplear una estrategia diferente a los cariotipos (útiles para reestructuraciones cromosómicas). Las técnicas de análisis se basan en las propiedades intrínsecas de la doble hélice del ADN: - Absorbancia luz UV - Carga negativa - Complementariedad de bases (Guanina-Citosina; Adenina-Timina) - Desnaturalización - Renaturalización Estas propiedades nos permiten aplicar este tipo de técnicas para saber qué variantes hay en un individuo. 5  Comisión 15 14/11/2024 Comisionista 1: Sandro Anceaume Díaz Correctora: Lucía Rivero del Castillo Comisionista 2: María Díaz González Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz 2. CONDICIONANTES EN LA APLICACIÓN DE LAS TÉCNICAS - Información previa: si las variantes son conocidas o son nuevas. Si no las conocemos, tendremos que optar por un tipo de técnicas diferentes. Por otro lado, si ya es conocida, no necesitaremos secuenciar todo el genoma, iremos directamente a esa región (análisis mucho más rápido y simple). - Localización de la variante: si la variante está localizada en línea germinal o somática. Si se encuentra en línea germinal, esta estará heredada de nuestros antepasados. Si hablamos de líneas somáticas, nos referiremos a variantes puntuales que aparecen en un pequeño conjunto de células del tejido. (Por ejemplo, en un raspado bucal extraemos células de línea germinal y en una biopsia tumoral se podrán observar células somáticas). - Tipo de variante: sustitución de un nucleótido por otro, una inserción deleción, repeticiones en tándem, variación en número de copias… (Ej. Si yo voy a una variante puntual, la técnica que usaré no será la misma que si es una inserción deleción). - Número de muestras y número de variantes que quiero analizar simultáneamente para cada muestra - Presupuesto disponible: los recursos económicos y humanos disponibles afectarán a las técnicas que podemos emplear. 2.1. HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU (FISH) ‘In situ’ quiere decir que analizamos directamente alteraciones a nivel genómico en el núcleo de las células de una muestra que hayamos obtenido. Por otro lado, ‘hibridación’ hace referencia a la formación de puentes de hidrógeno, y el término ‘fluorescente’ se utiliza ya que esas moléculas que hibridan para permitirnos hacer el genotipado, están marcadas con fluoróforo. En esta técnica se utilizan cebadores bicatenarios sintéticos marcados por moléculas que emiten fluorescencia para diseñar una sonda. Posteriormente se desnaturaliza tanto el DNA como la sonda y seguidamente se incuba a nivel del núcleo de un conjunto de células. Si la sonda está marcada fluorescentemente, veremos una señal fluorescente en el núcleo de la célula allí en donde se encuentre el cromosoma localizado. 6  Comisión 15 14/11/2024 Comisionista 1: Sandro Anceaume Díaz Correctora: Lucía Rivero del Castillo Comisionista 2: María Díaz González Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz Esta imagen es una imagen de microscopía de fluorescencia de una muestra de células de un paciente con cáncer de pulmón. La nube de puntos azules que vemos es la cromatina dentro del núcleo de una única célula de un paciente. Observamos una célula tumoral en la imagen de la derecha y una célula no tumoral (del mismo paciente) en la imagen de la izquierda. Los puntos de color rosa, azul y verde, son señales que están dirigidas a un cromosoma de todos los que hay en el genoma de este núcleo de esta célula, concretamente el cromosoma 2 (podemos ver dos copias de este ya que somos diploides). En el brazo pequeño del cromosoma 2, tenemos un gen denominado ALK (*). También a la derecha de este brazo pequeño del cromosoma 2, observamos el gen EML4 y en medio tendríamos otro gen llamado IB. Cada uno de los genes tiene su promotor (región de DNA en la que la maquinaria de transcripción reconoce una serie de secuencias clave para separar las dos cadenas y en una de ellas iniciar la transcripción). En una célula no tumoral de un tejido pulmonar, se espera que el promotor del gen ALK en células de un individuo adulto no será reconocido por la maquinaria de transcripción pues está silenciado, mientras que en el caso del EML4 sí, ya que este estará expresándose. * ALK: Gen que codifica a una quinasa importante en la proliferación celular (actúa como un estimulador de la división celular) que tiene que activarse durante el desarrollo embrionario. Es importante inducir la expresión de dicho gen en el estadio embrionario y de desarrollo, pero en organismos adultos, este gen debe estar silenciado. Si hay una doble rotura en el punto que afecta a la secuencia codificante del gen ALK y otra doble rotura en otro punto que afecta a la secuencia codificante del gen EML4, el bloque intermedio de DNA se invierte; esto sería una de las cuatro posibilidades de reestructuración a nivel cromosómico. Si esto ocurre, ahora el punto de rotura que afecta al gen ALK y EML4, el hecho de que se invierta, sitúa parte del gen ALK bajo el promotor de 7  Comisión 15 14/11/2024 Comisionista 1: Sandro Anceaume Díaz Correctora: Lucía Rivero del Castillo Comisionista 2: María Díaz González Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz EML4, y parte del gen EML4 bajo el promotor de ALK. Al suceder esto, ALK, el cual debe estar silenciado en el adulto, empieza a expresarse. Esto no nos interesa porque es un gen que estimula el desarrollo acelerado a nivel celular y que puede derivar en la formación de un tumor en el paciente. En células no tumorales la distribución de las señales de fluorescencia implica que los colores estén muy distanciados entre ellos y siguiendo el orden mostrado en la imagen de la izquierda (verde, azul, rosa), mientras que en las células tumorales estos aparecerán bastante unidos y habrá cuatro señales ya que tenemos cuatro cromosomas de tipo 2 en este tipo de células (las células tumorales se caracterizan por estar en continua división). Comi X 1. Mecanismos de reparación de ADN. Seleccione una: a. El Sistema SOS revierte el daño mediante la acción de proteínas específicas que son capaces de metilar el ADN. b. El Sistema MMR de humanos requiere la acción de una polimerasa translesional para cortar la cadena de nueva síntesis. c. Salvo los sistemas BER y NER, el resto de mecanismos requieren la acción de polimerasas para reparar el daño. d. El Sistema NER requiere de la acción de secuencial de un complejo de múltiples proteínas, incluyendo proteínas que inducen la degradación del ADN monocatenario. e. Tras la acción del Sistema NHEJ el cromosoma queda reparado asumiendo pérdida de fragmentos de ADN. 2. Respecto a las mutaciones cromosómicas. Seleccione una: a. Se clasifican en SNVs, reordenaciones cromosómicas, aneuploidías y poliploidías. b. La no disyunción en Meiosis I puede dar lugar a un 50% de embriones trisómicos y un 50% de embriones monosómicos. c. La Translocación Robertsoniana entre el cromosoma 14 y 18 podría dar lugar al Síndrome de Down familiar. d. Las aneuploidías consisten en cambios en el número de dotaciones cromosómicas presentes en la célula, dando lugar principalmente a individuos triploides y haploides. e. Las aneuploidías viables en humanos son las que afectan únicamente a los cromosomas autosómicos con mayor número de genes. 3. Mutaciones cromosómicas. Seleccione una: a. Un organismo aneuploide posee un juego completo (N) o un múltiplo exacto de juegos cromosómicos (2N, 3N...), mientras que un organismo euploide presenta un aumento o pérdida de cromosomas individuales. 8  Comisión 15 14/11/2024 Comisionista 1: Sandro Anceaume Díaz Correctora: Lucía Rivero del Castillo Comisionista 2: María Díaz González Genética Humana Docente: Fabián Lorenzo Díaz b. A causa de la no disyunción en la Meiosis II, se generan un 75% de embriones trisómicos y el resto monosómicos (25%). c. Las aneuploidías viables en humanos son las trisomías que ocurren en cromosomas autosómicos con mayor número de genes, o las que afectan a los cromosomas sexuales. d. Los tipos más frecuentes de poliploidias son causados por inversiones, deleciones, inserciones y translocaciones cromosómicas. e. Ciertas enfermedades, causadas por desregulación en la impronta genética parental, pueden aparecer a causa de la disomía uniparental. 4. Mecanismos de reparación del ADN: a.Tras la acción del Sistema NHEJ el cromosoma queda reparado manteniendo la secuencia original de ADN. b.El Sistema NER repara daños poco voluminosos por modificación química de las bases. c. Todos los mecanismos de reparación requieren la acción de polimerasas para reparar daños. d. El sistema MMR de humanos requiere de un corte como punto de referencia en la cadena molde de ADN. e. El Sistema de Reparación Directa revierte el daño mediante la acción de proteínas específicas que son capaces de eliminar grupos etilo en el ADN. Respuestas: 1D, 2B, 3E, 4A 9