Mikrobiologie Vorlesung: Bakterienzelle, Plasmide, Immunsysteme (PDF) - Hochschule Geisenheim

MIKROBIOLOGIE VORLESUNG TEIL 12 BAKTERIENZELLE, DNA-TRANSFER, PLASMIDE, BAKTERIELLE IMMUNSYSTEME Hochschule Geisenheim University Institut für Mikrobiologie und Biochemie Prof. Dr. Jürgen Wendland 1 Topi...

MIKROBIOLOGIE VORLESUNG TEIL 12 BAKTERIENZELLE, DNA-TRANSFER, PLASMIDE, BAKTERIELLE IMMUNSYSTEME Hochschule Geisenheim University Institut für Mikrobiologie und Biochemie Prof. Dr. Jürgen Wendland 1 Topic of the day ▪ Die Bakterienzelle: Sporenbildung, Sporenkeimung ▪ DNA-Transfer: Transformation, Konjugation ▪ Plasmide ▪ Bakterielle Immunsysteme: Restriktionsenzyme, CRISPR/Cas ▪ Endosymbionten 2 Die Bakterienzelle: Kapsel 3 https://microbeonline.com/bacterial-capsule-structure-and-importance-and-examples-of-capsulated-bacteria/  Die Kapsel als Virulenzfaktor Das Griffith Experiment 1928: Transformation Frederik Griffith 1879–1941 4 https://upload.wikimedia.org/wikipedia/en/thumb/f/f4/Griffithm.jpg/140px-Griffithm.jpg https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/6/6a/Griffith_experiment.svg/250px-Griffith_experiment.svg.png Bakterienkapsel 5  Microbe of the day Streptococcus pneumoniae Gram-positiv, meist in paaren auftretend (Diplococcus) Bildet keine Sporen - Nicht beweglich Besiedelt die oberen Atemwege gesunder Menschen ohne Symptome Hauptursache für von Mensch-zu-Mensch übertragener Pneumonie Hauptursache für Sepsis in HIV-Infizierten 90 Serotypen Impfstoffe: Pneumovax 23, Prevenar 13 2.56 Million Menschen starben an Pneumonie in 2017, mehrheitlich Kinder unter 5 Jahren bzw. Erwachsene über 70 Jahre in Entwicklungsländern 6 https://www.rki.de/SharedDocs/FAQ/Impfen/Pneumokokken/FAQ04.html Pneumonie ▪ Pneumonie (Lungenentzündung) ▪ Die Lungenentzündung (Pneumonie) ist eine Entzündung des Lungengewebes. ▪ Die meisten ambulant erworbenen Lungenentzündungen entstehen durch Bakterien. ▪ Diese Lungenentzündungen sind nach Durchfallerkrankungen die zweithäufigsten Infektionskrankheit. ▪ Die Übertragung erfolgt via Tröpfeninfektionen (Husten, Niesen). ▪ Es wird geschätzt, dass in Deutschland pro Jahr und pro 1.000 Einwohner 1 bis 11 Menschen erkranken. ▪ In Altenheimbewohnern ist die Inzidenz deutlich höher. ▪ Insgesamt erkranken in Deutschland pro Jahr etwa eine halbe Million Personen an einer solchen Lungenentzündung. ▪ Ungefähr ein Drittel muss im Krankenhaus behandelt werden, etliche davon auf der Intensivstation. ▪ 2020: 15287 Tote in Deutschland 7 Bestimmung der Zellzahl in einer Lösung 8  World Pneumonia Day Nov. 12 th ▪ In 2021, pneumonia claimed the lives of 2,2 million people including 502,000 (23%) children aged less than 5 years and 152,000 (7%) newborn babies. ▪ The pneumonia burden remains unacceptably high, especially as most deaths are preventable. ▪ In addition, early life pneumonia may lead to poorer health through life and contribute to the development of chronic respiratory disease in adulthood. 9 https://ginasthma.org/world-pneumonia-day-2024/#:~:text=In%202021%2C%20pneumonia%20claimed%20the,as%20most%20deaths%20are%20preventable. 10 11 News of the day 12  Alkohol in Zahlen 131,1 Liter pro Kopf Im Jahr 2017 betrug der Pro-Kopf-Konsum an alkoholischen Getränken in der Bundesrepublik 131,1 Liter. Das entspricht 10,5 Liter reinem Alkohol. 74.000 Todesfälle jährlich 40 Milliarden € Krankheitskosten Die direkten und indirekten Kosten alkoholbedingter Krankheiten werden pro Jahr auf 40 Milliarden Euro geschätzt. 13.343 Unfälle im Straßenverkehr In 2017 ereigneten sich insgesamt 13.343 Alkoholunfälle mit Personenschaden. Bei diesen Unfällen wurden 13.463 Menschen verletzt. Insgesamt starben 231 Menschen durch Alkoholunfälle. Gewalttaten unter Alkoholeinfluss 2017 wurden insgesamt 46.697 Gewalttaten unter Alkoholeinfluss verübt. Das sind 26,8 Prozent aller Tatverdächtigen im Bereich der Gewaltkriminalität. 30,5% (574) der Tatverdächtigen der Straftatengruppe Totschlag und Tötung auf Verlangen standen unter Alkoholeinfluss. 13 https://www.aktionswoche-alkohol.de/presse/fakten-mythen/zahlen-und-fakten/ Essentielle Strukturen von prokaryoten Zellen Nucleoid: ▪ Der Ort, an dem sich das Bakterienchromosom befindet. ▪ Hat keine bestimmte Struktur, nimmt aber mehr als die Hälfte der Zell ein. ▪ Neben dem Chromosom sind hier auch die Plasmide 14 http://slideplayer.com/slide/6278116/21/images/12/Prokaryotic+Cells.jpg  Das Nucleoid 15 https://www.slideshare.net/SalmanAli83/bacterial-cytology Strukturen von prokaryoten Zellen Zellwand: ▪ Pilum/Pili: haarförmige Anhänge, Röhren mit 3-10 nm Durchmesser und einige µm lang ▪ Besitzen zentrale Funktion in der Konjugation 16 https://www.slideshare.net/SalmanAli83/bacterial-cytology Strukturen von prokaryoten Zellen ▪ Konjugation bei Bakterien wurde 1946 von Joshua Lederberg und Edward Tatum gefunden. ▪ Konjugation ist ein Mechanismus der DNA-Übertragung, der Zell-Zell Kontakt erfordert. Beadle ▪ Konjugation kann zwischen Bakterien verschiedener Arten stattfinden, d.h. es handelt Nobel prize 1958 sich dann um horizontalen Gentransfer Lederberg, 1958 Nobel Prize Tatum Nobel prize 1958 at the age of 33, for the discovery of bacterial conjugation 17 Lederberg Konjugation bei Bakterien ▪ Bacterien können in einem Konjugationsprozess genetisches Material übertragen. Dadurch verteilen sich z.B. Antibiotikaresistenzgene auch zwischen Bakterien verschiedener Arten. Gibt es auch bei Archaea: ▪ Konjugation braucht den Zell-Zell-Kontakt 18 https://www.youtube.com/watch?v=hm8SZaFmlWg Drei Methoden der DNA-Übertragung 19 Basic Bacteriology, Jeffrey K. Actor PhD, in Elsevier's Integrated Review Immunology and Microbiology (Second Edition), 2012  Plasmide: zirkuläre DNA Plasmide ▪ sind kleine zirkuläre doppelsträngige DNA Moleküle. ▪ sind extrachromosomale genetische Elemente. ▪ können sich unabhängig vom chromosomalen Genom replizieren. ▪ sind häufig bei Bakterien anzutreffen, manchmal auch in Archaea und selbst bei Eukaryoten, z.B. bei Saccharomyces cerevisiae. ▪ ECC-DNA als Zeichen der Seneszenz ▪ können Antibiotika-Resistenzgene tragen. ▪ können durch Horizontalen Gen Transfer schnell verbreitet werden auch über Artgrenzen hinaus. ▪ Künstliche Plasmide werden genutzt als Vektoren für Klonierungen. Sie dienen dazu bestimmte DNAs zu vermehren. E. coli wird als Wirtszelle für diese Arbeiten genutzt. ▪ Die Kopienzahl von Plasmiden kann sehr gering sein (1/Zelle) oder viele hundert /Zellen betragen. ▪ Joshua Lederberg bezeichnete diese genetischen Elemente 1952 als Plasmide. 20 https://www.slideshare.net/SalmanAli83/bacterial-cytology  Plasmide als Werkzeuge in der Biotechnology ▪ Plasmide sind einfache extrachromosomal DNA Elemente ▪ Künstliche Plasmide werden zum Klonieren von DNA-Fragmenten verwendet. 21 https://www.slideshare.net/basimks/p-bluescript Plasmide als Werkzeuge in der Biotechnology ▪ Plasmide müssen einen Selektionsmarker tragen: z.B. das Ampicillin-Resistenzgen, ampR. ▪ Zur Erinnerung: Penicillin inhibiert die Transpeptidase für die Zellwandsynthese. ▪ Plasmide benötigen einen Replikationsursprung: origin of replication (ori). Hier beginnt die Replikation, d.h. Die Neusynthese zur Verdoppelung der DNA. ▪ Eine Multiple Cloning Site – oft kombiniert mit einem lacZ Gen, das für eine b- Glucosidase kodiert. 22  Plasmide als Werkzeuge in der Biotechnology ▪ Die multiple cloning site ist eine Region des Plasmids, welche eine Folge von Erkennungsstellen für DNA-Restriktionsenzyme trägt. 23 http://www.xenbase.org/reagents/vectorAction.do?method=displayVectorSummary&vectorId=1221262  Restriktionsenzyme ▪ Ein Restriktionsenzym oder eine Restriktionsendonuclease ist ein Enzym, das DNA an (oder neben) einer spezifischen Erkennungssequenz schneidet. ▪ Restriktionsenzyme weren in drei Klassen eingeteilt, die sich in ihrer Struktur unterscheiden oder ob sie ihr DNA Substrat an der Erkennungssequenz schneiden oder nicht. ▪ Alle Restriktionsenzyme machen zwei Schnitte, einen in jedem DNA Strang. Sie erzeugen also Smith einen Doppelstrangbruch. ▪ Restriktionsenzyme findet man in Bakterien und Archaea. Sie evolvierten als ein Verteidigungsmechanismus ggü eindringenden Viren. ▪ Type I Restriktionsenzyme: schneiden zufällig mit einem Abstand zur Erkennungssequenz ▪ Type II Restriktionsenzyme schneiden spezifisch an der Erkennunssequenz Arber ▪ Der Nobelpreis für Physiologie oder Medizin 1978 wurde für die Entdeckung der * 3. Juni 1929 Restriktionsenzyme und ihre Anwendung in der molekularen Genetik vergeben. ▪ Type III Restriktionsenzyme erkennen zwei separate nicht-palindromische Sequenzen. Sei schneiden etwa 20-30 bp nach der Erkennungssequenz 24 Nathan https://www.thefamouspeople.com/profiles/thumbs/hamilton-o-smith-1.jpg http://www.sciforum.hu/cms/upload/pictures/people/2009/Werner_Arber.jpg http://147.33.74.135/knihy/uid_es-002/nobeliste/Nathans_Daniel.jpg  Type II Restriktionsenzyme ▪ Restriktionsenzyme erkennen eine spezifische Nukleotidsequenz und generieren einen Doppelstrang-Schnitt in der DNA, d.h. sie hydrolysieren das Phosphodiester Grundgerüst. ▪ Die Erkennungssequenz ist meist 4-8 Basen lang. ▪ Das bestimmt die Wahrscheinlichkeit, mit der diese Sequenz in irgendeiner Dna vorkommt: Eine 4 Basen Sequenz erscheint theoretisch alle 44 or 256 bp; Daisy Roulland- 6 Basen = 46 or 4,096bp, und 8 Basen = 48 or 65,536 bp. Dussoix PhD mit Werner ▪ Recognition sites/Erkennungssequenzen sind palindromisch und meist inverted repeats. Arber 1962 ▪ Restriktionsenzyme werden nach ihrer Herkunft benannt. wikipedia 25 https://www.deviantart.com/chid0/art/EcoRI-lineart-291916782  Type II Restriktionsenzyme: z.B. EcoRI Schnitt Palindrom Schnitt Einzelstrang “sticky” ends, 26 Überhänge © 2012 Pearson Education, Inc.  Type II Restriktionsenzyme: z.B. EcoRI 27 https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/Cloning/Images/1115/ismb_re-basics-fig1.jpg  Plasmide als Werkzeuge in der Biotechnologie 28 Video: https://www.youtube.com/watch?v=KRpik9mNRm0 Or at this site: https://www.youtube.com/watch?v=Bz02Qlsu4XI Plasmide als Werkzeuge in der Biotechnologie ▪ E. coli cells werden mit einem Plasmidgemisch transformiert. ▪ Einige Plasmide enthalten ein Insert, andere nicht. ▪ Die E. coli Zellen, die überhaupt ein Plasmid erhalten haben, können auf den Selektivmedien mit dem Antibiotikum Penicillin wachsen, da sie mit dem Plasmid auch das ampR Resistenzgen erhalten haben. Dieses Resistenzgen kodiert für ein Protein, das das Antibiotikum inaktiviert. ▪ Das Medium enthält eine farblose Substanz: X-Gal. Lactose and X-Gal (5-Brom-4chlor-3indolyl-ß-D- galaktopyranosid) sind beides Substrate für das Enzyme b-galactosidase. ▪ X-Gal ist farblos. Wenn aber die b-galactosidase X-Gal spaltet, entsteht ein blaues Indigopigment. ▪ Der Trick bei der Sache: Zellen mit Plasmid und Insert können keine b-galactosidase produzieren, ergo bleiben die Kolonien WEISS. ▪ Zellen mit Plasmid, aber ohne Insert, produzieren b-galactosidase und damit werden die Kolonien BLAU. Blue/White selection in E. coli 29 Anwendung von Type II Restriktionsenzymen ▪ Restriktionsenzyme können dazu benutzt werden, um Allele eines Genes voneinander zu unterscheiden. Allele, die sich in ihrere Sequenz unterscheiden (nucleotide polymorphisms), besitzen evtl unterschiedlich viele Erkennungssequenzen eines Restriktionsenzyms. Nach Verdau entstehen dann u.U. verschiedene Bandenmuster. ▪ Hier wird dieses Verfahren verwendet, um den Ursprung der mitochondrialen DNA in Hefehybriden nachzuweisen. 30 Type II Restriktionsenzyme ▪ Restriktionsenzyme: ▪ Erkennen eine spezifische DNA Sequenz und schneiden an dieser Stelle ▪ Sie sind weit verbreitet unter Prokaryoten, aber selten in Eukaryoten ▪ Sie schützen Prokaryoten for feindlicher DNA, z.B. virale Genome ▪ Machen also einen Teil des bakteriellen Immunsystems aus ▪ Werden vererbt 31 Wie schützen Zellen ihre eigene DNA vor Restriktionsendonukleasen? ▪ Bakterielle Methylasen schützen die Wirts-DNA durch Methylierung innerhalb der Restriktionserkennungssequenzen. ▪ Restriktionsenzyme schneiden methylierte DNA nicht. ▪ Der Trick: Virale DNA, Bakteriophagen-DNA ist NICHT methyliert. ▪ Als Beispiel, das Enzym EcoRI erkennt die Sequenz: ▪ 5' - G A A* T T C - 3' 3' - C T T *A A G - 5’ ▪ Der Stern (*) markiert die Methylierungsstelle am 3’-Adenin. 32  Virologie Gemeinsame Charakteristika: ▪ Die Vermehrung von Viren ist nur in lebenden Zellen möglich ▪ Am Ende der Vermehrung steht die Zerstörung der Zelle ▪ ****Lyse**** ▪ Die Folgen: Virusen sind eine Gefahr für alle Zellen: - Bakterien (Bacteriophagen) - Pflanzen (Tabakmosaikvirus, Tulpen) - Tiere (Tollwut) - Menschen (Erkältung – Rhinoviren/Coronaviren, Grippe – Influenzaviren AIDS, Herpes) Mikrobiologie 33  Virologie Ein Virus ist ein infektiöser Partikel: ▪ Es besteht Nukleinsäure, entweder DNA oder RNA (nicht beides) ▪ Das Virusgenom kann in eine Proteinhülle, das Capsid, eingeschlossen sein Bacteriophage DNA Capsid Tail sheath (Protein Coat) Envelope (Lipids & Glycoproteins) Tail fiber http://img.foodmate.net/foodmate/upimg/070706/15_170732.jpg Mikrobiologie https://sciencesampler.files.wordpress.com/2014/03/bacteriophage.png 34 https://slideplayer.com/slide/13937876/  Virologie Gemeinsame Charakteristika: ▪ Ein Virus kann nur ein bestimmte Zelltypen attackieren. ▪ Viren zeigen also Wirtsspezifität. ▪ Viren haben kein Zytoplasma, keinen Metabolismus, kein Wachstum. ▪ Viren reagieren nicht auf Umweltveränderungen ▪ Viren bestehen nicht aus Zellen. ▪ Viren sind Parasiten. ▪ Viren sind KEINE lebenden Organismen ▪ Viren besitzen genetisches Material (ein Kriterium von Leben) ▪ Das Erbgut von Viren kann mutieren. http://www.goatbiology.com/images/antigenrec.jpg Mikrobiologie 35  Virologie Gemeinsame Charakteristika: ▪ Viren kidnappen die Wirtsmaschinerie, um neue Viruspartikel zu produzieren. ▪ Viren sind Pathogene. Ein Pathogen ist ein Erreger, der Krankheit verursacht. https://slideplayer.com/slide/13937876/ Mikrobiologie 36  Virologie Eine Vireninfektion hat zwei mögliche Ausgänge: lytisch oder lysogen ▪ Lytisch: active Infektion, die Wirtszelle stirbt, es werden neue Viren freigesetzt. ▪ Lysogen: Ruhezustand. Die Virus-DNA integriert in das Wirtsgenom. Mikrobiologie https://www.sofatutor.com/biologie/videos/viren-lytischer-und-lysogener-zyklus 37  Virologie Eine Vireninfektion hat zwei mögliche Ausgänge: lytisch oder lysogen ▪ Lytisch: active Infektion, die Wirtszelle stirbt, es werden neue Viren freigesetzt. ▪ Lysogen: Ruhezustand. Die Virus-DNA integriert in das Wirtsgenom. https://visualsunlimited.photoshelter.com/galleries/I0000W_N5dKj.ImQ/350756-tif Mikrobiologie https://assets.in.gr/dGenesis/assets/Content166/Photo/148928.jpg 38  Virologie ▪ Phagen contra Wirt – Ein Wettrüsten ▪ Bakterien entwickelten Schutzmechanismen, ihr Immunsystem: Restriktionsenzyme and CRISPR/Cas Mikrobiologie 39  CRISPR/Cas9 ▪ CRISPR: clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat ▪ Cas9: CRISPR associated protein 9 ▪ Entdeckt als ein adaptiver Immunitätsmechanismus in Prokaryoten ist Jennifer Doudna inzwischen ein sehr populäres Werkzeug für das gezielte Editieren von Genomen >>>> Genomschere. ▪ Fortgeschrittener als Restriktionsenzyme. Emmanuelle ▪ CRISPRs sind weit verbreitet unter Bacterien und Archaea. Charpentier Nobel 2020 40 https://www.quantamagazine.org/crispr-gene-editing-pioneers-win-kavli-prize-for-nanoscience-20180531/  CRISPR/Cas9 ▪CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 41 https://mmbr.asm.org/content/78/1/74 Ruud Jansen et al. (2002): Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol. Microbiol. 43,1565-1575 CRISPR/Cas9 ▪CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ▪ Eine wichtige Entdeckung wurde 2005 gemacht: Drei Studien zeigten, dass die spacer extrachromosomalen, fremden DNA- Sequenzen entsprachen: von Phagen, Prophagen und Plasmiden [21–23] ▪ Mojica, F.J.; Díez-Villaseñor, C.; García-Martínez, J.; Soria, E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J. Mol. Evol. 2005, 60, 174–182. ▪ Bolotin, A.; Quinquis, B.; Sorokin, A.; Ehrlich, S.D. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology 2005, 151, 2551–2561. ▪ Pourcel, C.; Salvignol, G.; Vergnaud, G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology 2005, 151, 653–663. 42 CRISPR/Cas9 Der erste direkte Hinweis, dass CRISPR/Cas Bekterien gegen Phagen schützen kann wurde von zwei Studien erbracht (26,27). Barrangou et al. erhielten phagenresistente Streptococcus thermophiles nach einer Phageninfektion. Die resistenten Bakterien hatten neue Spacer angelegt, die zum Phagengenom passten. Das Entfernen dieser spacer resultierte in Phagensensitivität, das künstliche Einbauen zu Resistenz. Marraffini and Sontheimer zeigten, dass CRISPR/Cas Konjugation und Transformation verhindern kann in Staphylococcus epidermidis. In Streptococcus pneumoniae konnte CRISPR/Cas eine natürliche Transformation verhindern. Non- capsulated S. pneumonia, die mit CRISPRs so programmiert wurden, dass Kapselgene als Ziel dienten, konnten im klassischen Griffith-Experiment nicht in Kapselbildner transformiert werden.. 26. Barrangou, R.; Fremaux, C.; Deveau, H.; Richards, M.; Boyaval, P.; Moineau, S.; Romero, D.A.; Horvath, P. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 2007, 315, 1709–1712. 27. Marraffini, L.A.; Sontheimer, E.J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in Staphylococci by targeting DNA. Science 2008, 322, 1843–1845. 28. Bikard, D.; Hatoum-Aslan, A.; Mucida, D.; Marraffini, L.A. CRISPR Interference Can Prevent Natural Transformation and Virulence Acquisition during In Vivo Bacterial Infection. Cell Host Microbe 2012, 12, 177–186. 43  CRISPR/Cas9 44 https://www.youtube.com/watch?v=2pp17E4E-O8  CRISPR/Cas9 ▪CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 45 http://2.blogs.elcomercio.pe/expresiongenetica/wp-content/uploads/sites/252/2016/07/crispr-pathway-1024x466.jpg CRISPR/Cas9 Die Erkennung von Selbst und nicht-Selbst: Cas9 ist eine Endonuclease, es produziert einen Doppelstrangbruch in der DNA. Cas9 benötigt eine RNA Guide Sequence, um den Ziellokus ansteuern zu können. Damit Cas9 wirklich schneidet, muss am Zielort direkt neben der Guide Sequenz die PAM-Sequenz vorhanden sein. PAM = Protospacer Adjacent Motif. PAM ist enzymspezifisch und für das häufig verwendete Cas9 von Streptococcus pyogenes entspricht die Sequenz den Nukleotiden “NGG”. Das Fehlen der PAM Sequenz am CRISPR Lokus schützt das Genom vor dem Schneiden. Der CRISPR-Lokus wird vererbt!! Unterschied zu unserem Immunsystem!! 46 http://www.bioconcept.ch/KundenUpload/pdf/NEB%20Expressions%20Issue%20I%202017%20Promotion.pdf Klausurfragen: ▪ Beschreiben Sie zwei molekulare Mechanismen, die Prokaryoten verwenden, um sich vor eindringender fremder DNA (z. B. viraler DNA) zu schützen. Erläutern Sie die Wirkungsweise, insbesondere auch, wie sich die Mikroorganismen vor Schädigungen der eigenen DNA schützen. Welcher Unterschied in der bakteriellen Immunantwort besteht im Vergleich zum menschlichen Immunsystem hinsichtlich der Folgen für die nächste Generation? ▪ Erklären Sie drei Methoden der DNA-Übertragung. 47