Approfondimento Biomedico 1 PDF - 20/03/2024

Maddalena Albertin 20/03/2024 Anna Benetti Biologia generale, lezione 11 Sara Boccolacci...

Maddalena Albertin 20/03/2024 Anna Benetti Biologia generale, lezione 11 Sara Boccolacci Prof. Moro APPROFONDIMENTO BIOMEDICO 1 In questa lezione si approfondisce quali possono essere le applicazioni cliniche e biomediche delle informazioni che si ricavano dallo studio del genoma, e come si può intervenire qualora si trovino casi clinici legati a difetti dei meccanismi cellulari. La prima cosa che fa il medico è individuare l’anamnesi, ovvero la raccolta dei dati clinici. Dopodiché effettua la diagnosi, che consiste nel delineare una malattia a partire dai sintomi. Diverse cause, però, possono determinare lo stesso sintomo; perciò, oggi per arrivare ad una diagnosi è importante studiare anche i meccanismi cellulari che causano quel determinato quadro clinico. Successivamente si fa una prognosi, che descrive l’evoluzione della malattia. Infine, si individua una terapia. Il primo gruppo di malattie che verranno affrontate riguarda la lamina e il poro nucleare (nucleoporinopatie). Progeria o Sindrome di Hutchinson-Gilford (HGPS) Il primo caso affrontato è quello di Sammy Basso, un ex studente dell’università di Padova, affetto da progeria, di cui ci è giunta testimonianza diretta. Il professore presenta un’intervista effettuata da Fanpage a Sammy, intervista che può essere ascoltata integralmente al seguente link https://www.youtube.com/watch?v=mUPE4mtv9I8. La progeria è una laminopatia, ovvero una patologia che colpisce la lamina nucleare. Le laminopatie sono associate a difetti delle lamine o delle proteine che interagiscono con esse. Sono un gruppo comprendente molte patologie, molto diverse tra loro per quanto riguarda il quadro dei sintomi. Ad esempio, la distrofia muscolare di Emery-Dreifuss (EDMD) colpisce i muscoli ed è causata da un difetto legato ad una proteina che interagisce con la lamina nucleare, mentre la lipodistrofia parziale è legata a fenomeni di ridotta formazione di tessuto adiposo e di insulino resistenza, che porta ad una precoce insorgenza di diabete. Ciò che accomuna queste patologie è un problema strutturale legato alla lamina nucleare, che determina la comparsa di una struttura irregolare nella lamina nucleare dovuta al suo stesso collasso, causato a sua volta da difetti nella sua integrità. 1 La progeria è definita anche sindrome di Hutchinson-Gilford (HGPS). Il suo codice OMIM è 176670, di cui è data una descrizione a fine lezione. È una patologia ultra-rara, con un’incidenza attorno a 1 su 4 milioni e meno di 150 individui malati attualmente nel mondo. Si stima che il numero dei casi sia superiore: questo è dovuto al fatto che in certi Paesi non ci sono sistemi necessari per fare diagnosi molecolare. Il nome della sindrome deriva dal pediatra, Jonathan Hutchinson, che a fine ‘800 descrisse per la prima volta questa sindrome progeroide, termine che indica una vecchiaia anticipata, ovvero l’insorgenza di caratteri tipici della vecchiaia in età molto precoce. I bambini affetti da questa patologia nascono infatti apparentemente sani, ma già nei primi 2 anni di vita si comincia a modificare la forma del viso, che diventa più allungata, e a perdere i capelli. All’età di 7 anni il tessuto adiposo si riduce drasticamente, provocando la presenza di vene cutanee prominenti. Nel giro di pochi anni è evidente come gli individui raggiungano l’aspetto di un ultraottantenne. La maggior parte degli affetti non supera l’adolescenza. È necessario agire precocemente per evitare fenomeni di calcificazione a livello di vasi sanguigni e valvole cardiache. La morte spesso è causata da infarto del miocardio o infarti cerebrali. È una patologia sistemica che colpisce tanti tessuti: l’epitelio cutaneo, il tessuto osseo, il sistema cardiovascolare, il tessuto adiposo. Questa patologia provoca calvizie precoce, vene cutanee prominenti, disproporzione cranio-facciale (allungamento del visus), sclerodermia, ovvero ispessimento dello strato corneo del tessuto cutaneo e osteolisi. Nei soggetti affetti da progeria si verifica lo stesso fenomeno che si verifica negli anziani: si riscontra una sproporzione tra la sintesi e la degradazione della matrice ossea, che vengono svolte rispettivamente da osteoblasti e osteoclasti. Tuttavia, questo fenomeno è così marcato che si creano delle lacune ossee (osteolisi) molto dolorose cbe causano debolezza ossea e problemi di movimento. 2 Un marcatore diagnostico utile a costruire una diagnosi precoce della progeria è costituito da una venatura evidente tra le orbite. Inoltre, già nei primi anni si nota una ridotta mobilità articolare, fino ad arrivare alla perdita dell’uso delle gambe. Le cause La progeria è legata a mutazioni nella lamina A, formata come tutte le lamine da due domini globulari e una struttura ad α elica centrale. La lamina A è prodotta a partire da un precursore, che in condizioni normali va incontro a 4 modifiche post- traduzionali principali: 1) Farnesilazione: aggiunta di un gruppo farnesilico alla porzione C-terminale della pre-lamina A, effettuata dall’enzima farnesil-transferasi; 2) Rimozione di 3 amminoacidi dalla porzione C-terminale da parte dell’enzima endopeptidasi; 3) Aggiunta di un gruppo metilico alla cisteina C-terminale da parte di una metiltransferasi; 4) Rimozione di 15 amminoacidi a livello C-terminale da parte di un’endopeptidasi. Nella sindrome di Hutchinson-Gilford, invece, la mutazione (a livello del DNA) c.1821G>A crea un fenomeno aberrante che consiste nell’attivazione di un sito di splicing criptico, che determina una perdita di 50 amminoacidi, cioè una delezione, non una sostituzione. L’apparato di maturazione dei trascritti riconosce il punto dove è presente la mutazione come il confine tra un introne ed un esone che però non dovrebbe essere riconosciuto come tale; dunque, l’apparato di splicing rimuove 50 amminoacidi come se essi costituissero un introne. In questo modo, una singola mutazione può causare una così vasta gamma di sintomi. Domanda: “Cosa significa sito di splicing criptico?” Risposta: “Lo splicing non avviene in maniera casuale: lo spliceosoma, una ribonucleoproteina implicata nella maturazione dell’mRNA, riconosce specifiche sequenze dell’mRNA e le taglia. Il confine tra introne, regione di mRNA da tagliare, ed esone è dettato da particolari sequenze chiamate consensus (GU e AG), cioè sequenze di riconoscimento che stanno a monte (GU) e a valle dell’introne (AG). Una singola sostituzione di un nucleotide (ad esempio da GG ad AG) può attivare lo spliceosoma che taglia una regione che non dovrebbe tagliare. Si chiama “sito di splicing criptico” perché normalmente non rappresenta un sito di taglio, ma una singola mutazione può attivare lo spliceosoma." Questa delezione amminoacidica causa inibizione dei passaggi successivi delle modificazioni post- traduzionali del precursore della lamina-A. Rimane quindi il precursore dotato del gruppo farnesilico e del gruppo metilico (perché vengono aggiunti ma non rimossi durante le modifiche), che costituisce una forma aberrante della lamina A che viene chiamata progenina. 3 Essa causa anche altre patologie, tra cui la Dermopatia restrittiva (RD) e la Displasia Mandibuloacrale (MAD). Inoltre, la progenina compare anche in soggetti sani anziani; da ciò si capisce l’importanza dello studio di malattie rare, che può permettere di migliorare condizioni in questo caso tipiche della vecchiaia. Per dimostrare che il difetto nel precursore della lamina A provoca la progeria bisogna capire cosa questo difetto provochi, cioè una deformazione della lamina nucleare, che determina a sua volta un cambiamento nella distribuzione cromatinica e dunque anche una modifica del profilo trascrizionale. Possiamo notarlo in laboratorio grazie all’utilizzo di coloranti specifici, che mettono in risalto l’assetto cromatinico. Per dimostrarlo empiricamente, è necessario sovra esprimere una particolare mutazione in una cellula sana: nel giro di poche ore il nucleo cambia di aspetto e diventa irregolare. Conseguenze della mutazione Da un punto di vista meccanicistico, dunque, l’impalcatura della lamina nucleare viene meno e con essa cambia anche l’assetto della cromatina. Bisogna ricordare che tra lamina nucleare e cromatina c’è infatti una correlazione sia fisica/strutturale che funzionale. Le conseguenze del difetto dell’organizzazione della cromatina sono: 1) Le cellule diventano meno resistenti a fenomeni meccanici. Questo è molto grave soprattutto nelle cellule muscolari e cardiache; 2) Le cellule non riescono più ad espletare alcune funzioni di base: la progenina interferisce con la replicazione e il differenziamento cellulare (cellule staminali); 3) Vengono meno alcune vie intracellulari di segnalazione, ad esempio esse diventano più refrattarie a stimoli funzionali e ciò può causare un maggior differenziamento, una maggiore proliferazione e un maggior rischio di morte per apoptosi. Ricerca della terapia Per ricercare la terapia adatta ad una patologia genetica è necessario effettuare prima di tutto una caratterizzazione dei suoi aspetti clinici, per poi individuare il gene difettoso e infine determinare il ruolo della proteina e/o delle sue forme mutate. La mutazione del gene difettoso può provocare 2 principali problematiche: - loss of function: una perdita di funzione (esempio: nella fibrosi cistica una mutazione del canale del cloro impedisce il corretto passaggio dello ione attraverso le membrane); - gain of function: l’acquisizione di una nuova funzione da parte della proteina (esempio: nella corea di Huntington, la proteina mutata è l’huntingtina, che si distribuisce in zone della cellula che non le competono e tende a formare aggregati). Il farmaco che si va a sviluppare serve quindi o a correggere la funzione della proteina mancante o ad inibire l’attività della proteina difettosa. 4 Terapia della progeria (HGPS) La progerina interferisce con la corretta formazione della lamina nucleare; dunque, un possibile tentativo di approccio terapeutico deve mirare a bloccare la formazione della progerina. Per fare ciò, si possono utilizzare degli inibitori delle farnesil-transferasi [NdS Le farnesil-transferasi, viste in precedenza, sono coinvolte nella maturazione del precursore della lamina A]. Durante uno studio, si è notato che, interferendo con la farnesilazione, è possibile prevenire la formazione della progerina. Fu testato Lonafarnib, un farmaco inibitore delle farnesil-transferasi, su cellule del derma di un soggetto affetto da progeria. Si è notato che, a dosi crescenti di farmaco, le cellule riacquistano la loro normale morfologia (come si può notare nell’immagine a lato). A seguito di questa scoperta, fu fatto il primo trial clinico nel 2009, il primo per i soggetti affetti da progeria. Sammy fece parte del trial clinico, probabile motivo che potrebbe spiegare la lunga durata della sua vita, rispetto alle aspettative che questa patologia comporta. Il trial clinico del 2009 ha permesso di aprire una prima strada verso una terapia per la sindrome di Hutchinson-Gilford, anche se, soprattutto nei casi in cui la malattia si era già affermata, non fu possibile tornare indietro. In caso di trattamento precoce, invece, questa terapia potrebbe garantire la prevenzione di alcuni sintomi. Negli anni il numero di farmaci in studio per la progeria si è ampliato notevolmente, anche grazie all’impegno di Sammy e della sua fondazione. L’intento di Sammy si sta concretizzando, offrendo opzioni di terapia valide. Domanda: “Per quanto riguarda il trial clinico del 2009, inibendo la farnesil-transferasi, non viene a mancare anche la maturazione del precursore della lamina fisiologica?” Risposta: “Potenzialmente potrebbe essere un rischio, infatti il farmaco non è esente da effetti collaterali. In ogni caso, la lamina nucleare è formata da tanti tipi di lamine, come la lamina C o la lamina B. L’intento del farmaco è quello di prevenire la comparsa della progerina, che ha effetti devastanti.” Sindrome della Tripla A La sindrome della tripla A è una patologia del complesso del poro nucleare, ancora più rara di quella vista in precedenza; infatti, ne sono stati descritti meno di 100 casi. Caso clinico Un ragazzo di 11 anni si presenta in ambulatorio dal medico di base, esponendo quelli che sono i sintomi della sua malattia. 5 Il ragazzo presenta:  Iperpigmentazione e disidratazione a livello della lingua, delle nocche delle mani e della pelle;  Assente capacità di lacrimazione: spesso presenta occhi arrossati ed infiammati;  Difficoltà nella deglutizione, anche di liquidi;  Astenia (debolezza) degli arti, affaticamento costante e comparsa di movimenti incontrollati. Dalle analisi del sangue si notò che tiroide, glicemia, funzione renale, emoglobina e ionemia erano nella norma. Comparvero, però, bassi livelli di cortisolo, ormone dello stress. Venne effettuato un esofagogramma, una radiografia dell’esofago, eseguita mentre l’individuo assume cibo marcato. Emerse una dilatazione dell’esofago durante la deglutizione, detto anche megaesofago. Il medico, Jeremy Allgrove, non conoscendo questo caso clinico, lo coniò con il termine di “Sindrome della tripla A”, oggi chiamata anche “Sindrome di Allgrove", in onore del medico che la scoprì nel 1978. Il codice della malattia è 231550. Questa patologia fu chiamata sindrome della tripla A per la presenza di 3 caratteristiche cliniche evidenti:  Alacrima: mancanza di lacrimazione (sintomo più precoce);  Achalasia: incapacità a deglutire, dovuto ad un difetto della peristalsi dell’esofago (chiamato megaesofago);  ACTH insensitivity: insensibilità dell'ormone adrenocorticotropo (ACTH). Negli anni lo studio più dettagliato di questa malattia ha portato a scoprire che si tratta di una malattia caratteristica del complesso del poro nucleare, dunque è stata definita una nucleoporinopatia. La sindrome della tripla A non è l’unica patologia del complesso del poro nucleare, ne esistono altre:  “Infantile bilateral striatal necrosis”: necrosi striatale (coinvolge la regione dello striato all’interno del sistema nervoso) infantile bilaterale (coinvolge entrambi gli emisferi). Si tratta di una forma neurodegenerativa precoce, causata dalla mutazione della proteina NUP62 (nucleoporina); 6   “Acute necrotising encephalopathy”: encefalopatia acuta necrotizzante, patologia neurodegenerativa causata dalla mutazione della proteina RANBP2 (RAN Binding Protein 2). La sindrome della tripla A è una patologia complessa, caratterizzata anche da problematiche che riguardano il sistema nervoso autonomo, come movimenti incontrollati. É una malattia progressiva, che ha un esordio precoce e porta a perdere l’uso funzionale e il controllo dei movimenti. Nelle nucleoporinopatie è possibile osservare un quadro di caratteristiche cliniche riconducibili a molte malattie neurodegenerative, come la polineuropatia (patologia multipla che interessa diversi distretti del sistema nervoso), ritardo mentale, parkinsonismo, atrofia del nervo ottico, demenza, distonia, contrazioni muscolari involontarie e Corea di Huntington. Patogenesi della Sindrome della Tripla A La patologia è causata da mutazioni a carico del gene AAAS, che codifica per una proteina denominata ALADIN (ALacrima Achalasia aDrenal Insufficiency Neurologic disorder) o ADRACALINA. Si tratta di una proteina relativamente corta, formata da 546 aminoacidi, di cui inizialmente non si sapeva nulla. In figura è possibile notare delle X, ossia dei punti in cui sono state individuate delle mutazioni nei soggetti affetti. Queste mutazioni sono distribuite lungo tutta la proteina, dunque non esiste una correlazione tra la localizzazione della mutazione e il fenotipo. Ciò ha reso difficile effettuare una prognosi e comprendere l’evoluzione della malattia. Ruolo della proteina ALADIN Per comprendere la funzione della proteina ALADIN, risulta necessario localizzarla all’interno della cellula. Per farlo è stato creato un anticorpo specifico per la proteina ALADIN, che permise di marcarla. Nell’immagine A, la proteina ALADIN è marcata in verde, mentre la nucleoporina Nup358 in rosso. È possibile notare che le due molecole si sovrappongono, dimostrando che ALADIN colocalizza con la nucleoporina Nell’immagine C, ALADIN è marcata in verde, mentre la proteina Tpr, che marca i filamenti nucleoplasmatici del NPC, è in rosso. Le due molecole non colocalizzano, il che conferma l’assenza di ALADIN nella matrice. Si è scoperto che ALADIN colocalizza con una nucleoporina, arrivando alla conclusione che si trattasse di una proteina associata al complesso del poro nucleare. 7 Dunque, ALADIN è una proteina che si localizza a livello dell’involucro nucleare, nel versante citoplasmatico del complesso del poro nucleare. In particolare, si trova nell’anello più esterno, dal quale si dipartono dei filamenti che prendono contatto con il citoscheletro. Localizzata la proteina, è importante capirne la funzione. Il complesso del poro nucleare regola il traffico bidirezionale tra nucleo e citoplasma. Un malfunzionamento di ALADIN potrebbe comportare problematiche nel trasporto di specifiche molecole. Si è scoperto che ALADIN è una delle prime proteine aggreganti il complesso del poro nucleare; dunque, è fondamentale per la sua costituzione. Osservando la struttura del nucleo (immagine a lato), contrariamente a quanto visto per la progeria, in questa patologia il nucleo appare identico ad un soggetto normale; infatti, non è presente un difetto nella struttura. Alcune mutazioni impediscono ad ALADIN di localizzarsi correttamente a livello del complesso del poro nucleare, impedendo, dunque, un corretto traffico bidirezionale. Dunque, esistono delle molecole che non possono svolgere correttamente la loro funzione a causa di un difetto del complesso del poro nucleare, come, ad esempio, la proteina APTX, coinvolta nella riparazione del DNA, o l’enzima DNA ligasi, coinvolto nella replicazione del DNA. In soggetti che presentano questo tipo di mutazione, sono presenti difetti nella replicazione e riparazione del DNA. Oltre al trasporto trans-membrana, alcune mutazioni possono alterare anche il fuso mitotico, provocando problematiche nella divisione cellulare. Nella figura a lato è possibile osservare in blu i cromosomi e in verde le fibre del fuso mitotico. Nella mutazione il fuso mitotico appare alterato, provocando problematiche nella divisione cellulare. Purtroppo, non si è ancora scoperta una terapia per la sindrome della tripla A. Attualmente vengono effettuate cure palliative: per l’Alacrima si somministrano lacrime artificiali; per l'Acalasia si interviene a livello chirurgico, per risolvere il problema della peristalsi; per l’insufficienza surrenalica, deficit di glucocorticoidi, si somministrano cortisone o idrocortisone (corticosteroidi), che però con il tempo possono generare fenomeni come resistenza all’insulina, diabete e problematiche metaboliche. Codice OMIM Il codice OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) è una raccolta online di tutte le malattie, in cui sono descritte:  Caratteristiche cliniche;  Aspetti molecolari, ossia i geni mutati che sono stati identificati; 8   Eventuali caratteristiche legate all'eterogeneità clinica di una malattia, come differenze di mutazione. Inserendo nel sito www.omim.org i codici delle malattie è possibile ottenere tutte le informazioni inerenti a una determinata patologia. Domanda: “Il codice assegnato alle malattie ha un senso o semplicemente è in ordine di scoperta?” Risposta: “Esiste una commissione internazionale che si occupa dell’attribuzione di questo codice, non ne conosco il meccanismo alla base, ma sicuramente è molto efficiente" 9