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Introducción a la Histología Histología: rama de la Anatomía que estudia los tejidos de animales y plantas. Anatomía microscópica Embriología: ciencia que estudia el desarrollo embrionario desde la fecundación hasta la formación de órganos y sistemas. Estudios de Virchow Propone a la célula como...

Introducción a la Histología Histología: rama de la Anatomía que estudia los tejidos de animales y plantas. Anatomía microscópica Embriología: ciencia que estudia el desarrollo embrionario desde la fecundación hasta la formación de órganos y sistemas. Estudios de Virchow Propone a la célula como la unidad básica estructural y funcional de los seres vivos. "Toda célula se origina de otra célula" Origen de la Histología  Inicia en 1600 con el desarrollo de M. Óptico y con técnicas sencillas para examinar material biológico  Marcelo Malpighi es considerado el fundador de la Histología  En 1665 Hooke inventó el M. Óptico Compuesto y descubre la célula en tejido vegetal.  Tejido: células con una misma función.  Órganos: unidad funcional mayor formado de tejido  Sistemas: varios órganos con funciones relacionadas  Sistemas difusos: grupos celulares con funciones relacionadas, ubicados en órganos distintos.  Radioautografía: localiza material radioactivo en el tejido  Historadiografía: imagen de rayos X de cortes histológicos Técnicas Histológicas 1. Toma de Muestra: Extirpación de fragmentos de tejido (2-3 mm). 2. Fijación: Detiene procesos vitales (autolisis) con Formol 10% o congelación. 3. Deshidratación: Ayuda con la penetración de solventes, se hace con Etanol en concentraciones crecientes. 4. Aclaración: Ayuda a la penetración de parafina, se usa Xilol o Benzol. 5. Inclusión en parafina: Se sumerge en Parafina fundida (45 a 60 °C). 6. Preparación del taco: Se solidifica con enfriamiento lento de 10 a 15 °C obteniendo un bloque de tejido.  7. Orientación del bloque: Se orienta el bloque según el tipo de corte que se vaya a realizar, contando con que la cara inferior es la superficie del corte. 8. Corte: Se usa un micrótomo con cuchilla de acero (3-8 µm). 9. Montaje: Se coloca sobre un portaobjetos con una capa de albúmina o gelatina. 10. Desparafinación: Ayuda a la penetración del alcohol, se usa Xilol o Benzol. 11. Hidratación: Se usa Etanol en concentraciones decrecientes hasta agua deshidratada. 12. Coloración: Da contraste a las estructuras, se usa Hematoxilina-Eosina. 13. Deshidratación: Se usa Etanol en concentración creciente. 14. Aclaración: Da transparencia al tejido con Xilol o Benzol. 15. Montaje de cubreobjetos: Se coloca una gota de Bálsamo de Canadá y luego el cubreobjetos. Durante la preparación:  Se disuelven lípidos neutros  No se conserva la estructura de la membrana celular  Se pierde Glucógeno y Proteoglucanos En la técnica de M. Óptica:  Fijador muy ácido = gránulos coloreados  Meladuras en la cuchilla = rayas  No se entiende bien = pliegues y arrugas Preparación de tejidos para Microscopía Electrónica de Transmisión 1. Toma de muestra: extirpación de fragmentos de tejido (1mm³) 2. Fijación: proteínas con Glutaraldehído, lípidos Paraformaldehído o Tetraóxido de Osmio y en otros Permanganato de Potasio. 3. Deshidratación: Etanol y/o Acetona en concentraciones crecientes 4. Aclaramiento: se usa óxido de propileno 5. Inclusión en resina: materiales plásticos y Epoxirresinas como Araldite, resina Epon y Resina Spurr 6. Confección de bloques y cortes: se usa un Ultramicrotomo con cuchilla de vidrio o diamante (20-100nm). Se aumenta el contraste con una solución de acetato de uranilo.  7. Montaje: se coloca sobre un reticulado de cobre ("grilla") cubierto con una película plástica de sostén, delgada. 8. Coloración: en la fijación y deshidratación (Osmio, Nitrato de Uranilo) y en la inmersión secuencial acetato de uranilo y citrato de plomo. Histoquímica  El fundamento de los métodos de tinción depende de la capacidad que tienen los tejidos para incorporar los colorantes. Colorantes Básicos o Catiónicos:  Carga positiva  Reaccionan con células y tejidos aniónicos  Hematoxilina  Fuscina básica  Tiñen el núcleo Ácidos o Aniónicos:  Carga negativa  Reaccionan con células y tejidos catiónicos  Eosina  Fuscina ácida  Tiñen el citoplasma Neutros:  Carga neutra  Colorean diversas estructuras  Giemsa Metacromáticos:  Algunas estructuras  Tiñen de color contrario al del colorante.  Azul de metileno Indiferentes:  Tiñen por impregnación  Impregnación de Plata  Acidofilia: reacción de grupos catiónicos con un colorante ácido  Basofilia: reacción de grupos aniónicos con un colorante básico  Metacromasia: reacción de algunos colorantes básicos con el tejido, cambiando de azul a púrpura o rojo  Ortocromasia: capacidad de los colorantes de teñir de su mismo color. Reacción de Feulgen: muestra el ADN en rojo magenta. Reacción de PAS (ácido peryódico-Schiff): el ácido rompe los enlaces de carbono, permitiendo reaccionar al reactivo Schiff y tiñendo los carbohidratos, mucoproteínas y proteoglicanos de rojo magenta. Reacción de Van Gieson: tiñe el colágeno de rojo, el citoplasma de amarillo y los núcleos y las fibras elásticas de negro. Reacción de Orceína: tiñe las fibras elásticas de negro. Reacción de Sudán Rojo: tiñe los lípidos simples de rojo. Azán: tiñe de rojo el núcleo, de rosa el citoplasma; de rojo-anaranjado las fibras musculares y hematíes; de azul el mucinógeno y las fibras de colágeno. Inmunohistoquímicos: detecta antígenos mediante anticuerpos marcados "in situ". Directa: reacciona el anticuerpo con el preparado (fluoresceína, peroxidasa, ferritina) y luego reacciona el anticuerpo con el antígeno. Indirecta: reacciona el anticuerpo primario con el preparado luego con el anticuerpo secundario y este último con el antígeno. Técnicas Inmunohistoquímicas  Inmunofluorescencia: tiñe de verde con fluoresceína o de rojo con rodamina.  Inmunoenzimáticas: tiñe de rojo-anaranjado el producto de la reacción enzimática con peroxidasa.  Inmuno-oro: impregna de ferritina al antígeno y se logra ver en el microscopio. Microscopía Microscopio: instrumento que aumenta el tamaño de una imagen permitiendo observar con mayor detalle. Microscopio Óptico Compuesto de Campo Claro PARTES MECÁNICAS - Cabezal - Brazo - Revólver - Platina - Carro - Tornillos macrométricos - Tornillos micrométricos - Base PARTES ÓPTICAS - Lámpara (Foco) - Condensador - Objetivos - Oculares Aumento: relación entre el tamaño de la imagen y el objeto en medidas lineales Am = Aobjetivo x Aocular Poder de resolución: distancia mínima que debe existir entre dos puntos del objeto para que se visualicen separados. \[ D = \frac{0.61 \lambda}{A} \] USOS - Académico - Diagnóstico clínico - Investigación SE OBSERVAN - Preparados al fresco - Frotis o extendidos  - Cortes histológicos IMPORTANTE la luz atraviesa el objeto examinado y el objetivo capta la luz directa de la fuente luminosa. Microscopio Óptico de Campo Oscuro USOS - Examinar preparados autoradiográficos. - Examinar muestras no coloreadas. - Identificar Espiroquetas. IMPORTANTE Los rayos refractados en las estructuras son los que penetran al objetivo. Proporcionan mayor contraste y se observa el campo oscuro y sobre este resaltan las estructuras. Microscopio Óptico de Contraste de Fases USO - Visualización de organismos vivos sin uso del colorante (parasitología). IMPORTANTE - Usa la diferencia de índice de refracción de las estructuras, resaltando las más densas. Microscopio Óptico de Fluorescencia USO - Localización de estructuras específicas en células y tejidos. IMPORTANTE Capta las diferentes longitudes de onda emitidas por los colorantes fluorescentes. Microscopio Electrónico de Transmisión PARTES - Cátodo (emite e^-) - Condensador (concentra el haz de e^-) - Objetivo (amplía el cono de proyección) - Ocular (aumenta la imagen) - Proyector (amplía la imagen) - Pantalla Fluorescente (recoge la imagen) IMPORTANTE - Se cambia la luz por e^- y el lente de vidrio por electroimanes. - Mayor poder de resolución (2nm) - Longitud de onda hasta 0.003nm - Distancia de separación de 0.003nm Permite ver estructuras de la célula con más detalle Microscopio Electrónico de Barrido - El haz de e^- rastrea la superficie (barre) quedando una imagen 3D del exterior de la célula. - La muestra se debe cubrir con metales pesados (oro o platino) que disperse los electrones. Tabla comparativa M. Óptico de luz M. Electrónico Iluminación Haz de luz Haz de e^- Longitud de onda 2000Å - 7500Å 0.037Å - 0.086Å Lentes Vidrio Electromagnético Medio Atmósfera Vacío Resolución 2000Å 3Å Magnificación 10x - 2000x 100x - 450000x Focalización Mecánica Eléctrica Contraste Absorción-Reflexión Scatteringt Morfología Celular  La célula es la unidad funcional y estructural de todos los seres vivos. Componentes inorgánicos  70-80% Agua  1% Sales Componentes orgánicos  Proteínas  Hidratos de carbono  Lípidos  Ácidos nucleicos Células Procariotas - Tienen el núcleo difuso (sin nucleolema). - No posee prácticamente ningún organelo. - Cuenta con pared celular que da forma y protege a la célula. - Bacterias. Flora bacteriana. Células Eucariotas - Tienen núcleo y citoplasma, ambos delimitados por estructuras membranosas. - Tienen organelos citoplasmáticos. - Células animales y vegetales. Células Eucariotas  Plasmalema: membrana que recubre la célula.  Citoplasma o citosol: contiene todos los organelos de la célula.  Nucleolema: membrana que recubre el núcleo.  Nucleoplasma: contiene toda la información genética de la célula (ADN). La forma de la célula está condicionada por su función. El tamaño de una célula puede variar de 10 a 60 μm. Características fisiológicas  Absorción: capacidad de captar sustancias del medio circundante.  Secreción: transforman las moléculas absorbidas en un producto específico que luego se puede expulsar con la excreción.  Excreción: descartan los productos de desecho.  Respiración: capacidad de producir energía con el oxígeno absorbido en la oxidación de nutrientes.  Irritabilidad: capacidad de reaccionar a un estímulo (células nerviosas).  Conductividad: capacidad de transmitir un impulso.  Contractilidad: capacidad de acortarse hacia una dirección determinada ante un estímulo (células musculares).  Reproducción: capacidad de renovarse por crecimiento o división celular. Inclusiones citoplasmáticas Los componentes celulares no indispensables como los pigmentos y los depósitos de nutrientes pueden: ser sintetizados por la célula o ser captados del medio extracelular, y permanecen en la célula por un tiempo limitado. Depósitos de Nutrientes - Hidratos de carbono (Glucógeno) - Gotas de lípidos Pigmentos  Exógenos: - Carotenos (piel) - Polvo de carbón (macrófagos alveolares)  Endógenos: - Hemoglobina - Lipofuscina Membrana Plasmática  Se encarga de dividir el medio externo de la célula con el medio interno. También controla los movimientos de sustancias hacia y desde el interior de la célula.  Está formada por una bicapa lipídica permeable.  No se observa en el Microscopio Óptico. Estructura Trilaminar: - Hojuelas interna - Zona clara - Hojuelas externa Cada hojuela está compuesta por lípidos anfipáticos y proteínas. Transporte de membrana - Difusión simple - Proteínas transportadoras: son muy selectivas y necesitan ATP. - Proteínas canal: son selectivas para los iones. Transporte vesicular Exocitosis - Constitutiva - Secreción regulada Endocitosis - Pinocitosis: es clatrina independiente - Endocitosis: es clatrina dependiente - Fagocitosis: es clatrina independiente y actina dependiente Organelos membranosos  Endosomas: - Endosomas tempranos: clasifican y reciclan las proteínas incorporadas por endocitosis - Endosomas tardíos: llevan estructuras a mayor profundidad en el citoplasma y se convierten en lisosomas  Lisosomas: no están presentes en todas las células. Se encargan de degradar macromoléculas incorporadas por endocitosis, así como también de la misma célula con la autofagia. Contienen enzimas digestivas  Retículo Endoplasmático Rugoso (rER): se encarga de la síntesis proteica. Está formado por cisternas. Es basófilo (H)  Retículo Endoplasmático Liso (sER): se encarga de la síntesis de esteroides, colesterol y triglicéridos, así como también de la desintoxicación de la célula. Es acidófilo (E)  Aparato de Golgi: se encarga de clasificar y empaquetar proteínas y lípidos para el transporte intra y extracelular. Está polarizado morfológicamente con una Cara Formadora (cis) cerca del rER y una Cara Madurativa (trans) lejos del rER. Se colorea por impregnación con Nitrato de Plata  Mitocondria: se encarga de realizar la respiración celular, producen energía (ATP), cuentan con su propio ADN y tiene una doble membrana (interna > crestas, externa > lisa). Se tiñe con Hematoxilina Férrica.  Peroxisomas: se encargan de degradar el peróxido de hidrógeno (H2O2) con ayuda de la catalasa, así como también desintoxican sustancias tóxicas de la célula. Organelos no membranosos  Microfilamentos: Formados por Actina y Miosina (proteínas de movimiento); sirven de anclaje para la célula; son móviles y contractiles; participa en la fagocitosis y tráfico de vesículas.  Microtúbulos: Formados por subunidades de la tubulina; poseen inestabilidad dinámica (polimerización y despolimerización con gasto de energía (ATP)); transporte vesicular (secreción) de organelas citoplasmáticas; Involucran la participación (endosomas, lisosomas, mitocondrias) de motores moleculares proteicos; mueve cromosomas en división y los fija al huso mitótico.  Filamentos Intermedios: Dan estabilidad, soporte structural; formados por queratinas, vimentina, desmina, monofilamentos y láminas nucleares; fibras trenzadas como cuerdas; da integridad a las uniones célula-célula y célula-citosol.  Centriolos: Son pequeños bastones que están cerca del núcleo; sirven de cuerpos basales para los cilios y flagelos; alinean el huso mitótico en la división celular.  Centrosomas: Es el centro organizador de microtúbulos; soporte estructural; fibras proteicas.  Proteosomas: Desintegran proteínas dañadas en polipéptidos y aminoácidos. El Núcleo Contiene casi todo el material genético de la célula, así como también produce ARNm, ARNt y ARNr. Generalmente, hay uno por célula, a excepción de: Hepatocitos; Osteoclastos; Músculo estriado. Tamaño Varía de célula a célula de 5 a 10μm. Forma Esférico en células cúbicas o redondeadas. Ovalado en células planas o cilíndricas. Lobulados o irregulares en los leucocitos. Las células que no poseen núcleo pierden la capacidad de síntesis de proteínas y de división celular. Nucleolema Microscopio Electrónico  Se observan dos membranas y una cisterna perinuclear formada por una capa externa (cubierta por ribosomas) y una capa interna (asociada a la Heterocromatina).  También se observan complejos de poros nucleares que se encargan de intercambiar sustancias entre el nucleoplasma y el citoplasma; representan el 15% de la superficie del nucleolema.  El complejo de poros nucleares cuenta con un anillo interno y un anillo externo, ambos compuestos por gránulos proteicos que se conectan con prolongaciones a un gránulo central. Microscopio Óptico Se observa una línea oscura alrededor del núcleo. Nucleolo  Es una organela nuclear ovalada o redondeada, que varía en número según sea necesitado o no en la célula.  Se encargan de la síntesis de proteínas, por ende, son de mayor tamaño en células que sintetizan proteínas y están ausentes en aquellas que no.  Son negativos a la reacción de Feulgen pero la cromátida asociada al nucleolo sí es positiva.  Son intensamente basófilos. Microscopio Electrónico Se forman en regiones organizadoras de nucleolos (RON) en las secuencias repetidas codificadoras de ARNm. Cuenta con un componente granular, que representa la mayor parte del nucleolo, y un componente fibroso formado por centros fibrilares y un componente fibrilar denso. Cromatina  Material nuclear que contiene ADN y proteínas histonas y no histonas.  Heterocromatina: es muy condensada; células metabólicamente inactivas.  Es altamente basófilo.  Eurocromatina: cromatina dispersa; células metabólicamente activas. Cromosomas  Fibras de cromatina que se condensan tanto que se logran observar en el Microscopio. (mitosis y meiosis) Muerte celular Neropsis: se da debido a una lesión en la célula. Se liberan enzimas - Cariopicnosis: se retrae el núcleo - Cariorrexis: se rompe en trozos el núcleo - Cariolisis: se disuelve el núcleo gradualmente Apoptosis: acción regulada del ciclo celular - Requiere energía  - Es controlada genéticamente - No se liberan enzimas Envejecimiento celular: es un fenómeno programado que se da por la cantidad de mitosis (limitada) que puede realizar una célula. Ciclo celular Proceso mediante el cual se reproducen células y se desarrollan organismos multicelulares. De una célula madre nacen 2 células hijas con el mismo material genético - Las células somáticas se dividen por mitosis - Las células sexuales se dividen por meiosis Interfase Fase G1: la célula hija aumenta su tamaño y su contenido de organelas. Sintetiza RNA y proteínas. Dura de 9 a 12 horas  Punto de restricción: es sensible al volumen celular  Punto de control del daño del DNA: verifica la integridad del DNA duplicado. Fase G0: es una fase estacionaria, cuando el punto de control de daño de DNA detecta un daño no permite que la célula entre en la fase S. Fase S: se duplica el DNA de la célula. Dura entre 7.5 a 10 horas.  Punto de control del daño de DNA en S: verifica la calidad del DNA. Fase G2: prepara la célula para la mitosis. Dura 1 hora aprox.  Punto de control del daño del DNA en G2: examina el DNA duplicado.  Punto de control del DNA no duplicado: si hay DNA no duplicado la célula no entra en Fase M. Mitosis Profase: los cromosomas duplicados se condensan, permitiendo que se observen las 2 cromátides hermanas unidas por los centrómeros y el complejo proteico especializado, cinetocoro. Prometafase: el nucleolema comienza a desintegrarse en pequeñas vesículas de transporte, aparece el cinetocoro en cada cromátide y los microtúbulos del huso mitótico se fijan a los cinetocoros. Metafase: los microtúbulos del huso mitótico mueven a los cromosomas al plano medio de la célula formando una placa ecuatorial. Anafase: las cromátides hermanas comienzan a separarse, siendo arrastradas a los polos opuestos de la célula por los microtúbulos. Telofase: se reconstituye el nucleolema, los cromosomas se desenrollan, ocurre la citocinesis y la cariocinesis formando 2 células hijas; el anillo contráctil de actina y miosina divide la célula formando la hendidura de escisión.