1. Historia IHQ - Respuesta Inmune. 2024.pdf

Introducción a la Inmunohistoquímica 2024 Dr. Ronald Pérez L. Tecnólogo Médico. Definición “Protocolo de laboratorio que “Método de estudio de mediante el uso de distribución tisular de un anticuerpos, permite...

Introducción a la Inmunohistoquímica 2024 Dr. Ronald Pérez L. Tecnólogo Médico. Definición “Protocolo de laboratorio que “Método de estudio de mediante el uso de distribución tisular de un anticuerpos, permite identificar antígeno de interés en antígenos en cortes condiciones normales y histológicos”. patológicas”. Sistema de Detección Anticuerpo 2º Anticuerpo 1º Observación morfológica de una inmunotinción Si la muestra es positiva Si la muestra es negativa para el antígeno para el antígeno Método de detección de Antígenos in situ Se puede aplicar sobre: Células Animales y Vegetales. Bacterias. Microorganismos, larvas, e insectos. Cortes Histológicos. ¿Sobre qué células animales se puede aplicar? Centrifugados o líquidos corporales extendidos. FFIP. Cortes Histológicos. Cortes por congelación. Muestras Citológicas. Cultivos Celulares. ¿Qué diferencia hay con la Histoquímica? ¿Por qué? Porque la concentración requerida de los Mayor antígenos que identifica la técnica es especificidad. menor a la que se requiere en técnicas de HQ. Moléculas diferentes pero con similares propiedades fisicoquímicas → no son distinguibles por tinciones histoquímicas. La IHQ e HQ entregan diferente información Identificación de fibras colágenas con tricrómico de Masson Biebrich scarlet → tiñe todo lo que sea acidófilo. Acido fosfotungstico/fosfomolíbdico → Induce que Biebrich Scarlet difunda del colágeno pero no del citoplasma (menos permeable que el colágeno). Azul de anilina → Se intercala en fibras de colágeno. Resultados Tintoriales Biopsia renal. Esclerosis nefrítica Lúpica. Tricrómico de Masson ¿Qué información se obtiene de la tinción? ¿Qué se observa teñido con azul en la biopsia anterior? ¿Qué tipo de Colágeno?. Fibras colágenas ¿Sólo colágeno?. ¿Pueden estar teñidas otras proteínas que sean químicamente similares al colágeno?. Tinción Histoquímica es SELECTIVA. Inmunotinción o Inmunomarcaje es ESPECIFICA. ¿Qué ¿Quéinformación información se obtiene obtienedel delinmunomarcaje? inmunomarcaje? Biopsia renal. Esclerosis nefrítica Lúpica. Inmunotinción contra Colágeno IV ¿Qué información se obtiene del inmunomarcaje? ESPECIFICIDAD DE LA TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA Anticuerpos que reconocen sitios Interacción antígeno específicos de anticuerpo → CLAVE una DE LA TECNICA. determinada molécula. PAS (+) en Glomérulo. Laminina 5 (+) en Glomérulo. Componentes indispensables de la técnica Proteínas o péptidos. 1. Antígeno. (Más frecuente) (Muestra biológica) Lípidos y Azúcares. + (Menos frecuente) 2. Anticuerpo Específico. Sustratos cromógenos: DAB y derivados, sales de diazonio. + 3. Sistema de Fluorocromos: Moléculas con capacidad Detección. fluorescente (fluoresceína, rodamina). Sales metálicas: átomos de alto peso molecular utilizados en microscopía electrónica. Requerimientos procedimentales If you search for: “Immunohistochemistry”. Conceptos asociados a inmunomarcajes Inmuno-Histoquímica Inmuno-Citoquímica Inmuno-Fluorescencia Historia de los Procedimientos Inmunohistoquímicos Primeras Descripciones de una “sustancia” en el plasma, capaz de neutralizar agentes infecciosos. Emil von Behring. 1890 Kitasato Shibasaburo. 1890 Paul Ehrlich. 1891 – 1900. Introducción del Concepto “Anticuerpo” y teoría de las cadenas laterales. Historia de los Procedimientos Inmunohistoquímicos Primeras Teorías Sobre la Estructura y Procesos de Formación de Anticuerpos. Alfred Nisonoff. 1963 Linus Pauling. 1940 Identificación de los idiotipos de los Introducción a la anticuerpos. Inmunofluorescencia. Albert Coons. 1941 Caracterización de los fragmentos F(ab’)2 1964 mediante digestión enzimática. La OMS propone el primer sistema de nomenclatura para los Alfred Nisonoff. 1960 anticuerpos.  Generalidades del Sistema Inmune Del latin immunis Libre de. Exento de → agentes infecciosos, células tumorales, cuerpos extraños. ¿Qué es la inmunidad? En mamíferos En organismos pluricelulares → 1. Inmunidad Innata. Capacidad para enfrentar agresiones por organismos patógenos, células neoplásicas o antígenos propios. 2. Inmunidad Adaptativa. Mecanismos de Defensa Barreras físicas y reacciones químicas de alta y baja especificidad que reconocen lo propio de lo “no propio”.  Mecanismos de Inmunidad Inmunidad Innata Inmunidad Adaptativa 1. No específica. 1. Específica. 2. Primeros sistemas en 2. Reconocimiento de actuar. Más rápida. moléculas patógenas. 3. Incluye mecanismos Nuevas o pre-existentes. físicos, bioquímicos y 3. La respuesta se ejecuta celulares. posterior a la 4. Mecanismos pre- exposición. Más lenta. existentes a la infección. Efectores: -Barreras físicas y químicas. Efectores: -Células Fagocíticas y -Linfocitos T y B. Células NK. -Células Presentadoras de -Proteínas plasmáticas. Antígenos. (APCs). -Citoquinas pro- inflamatorias. Sistemas Interdependientes 1. Barreras Físicas y Mecanimas de la Inmunidad Innata Primera Línea de Defensa. 1. Compactación de las células epiteliales y producción de CKs. (Impermeabilidad epitelial). 2. Efecto de “arrastre” de glándulas sudoríparas y lagrimales. 3. Existencia de esfínteres y sistemas de drenaje. [Movimiento gastrointestinal longitudinal]. 4. Tight junctions y focal adhesions → compactación de los revestimientos. 5. Barrido físico del mucus y presencia de cilios. 2. Barreras Químicas de la Inmunidad Innata Segunda Línea de Defensa Ataque químico inespecífico pero con eficiencia. 3. Inflamación en Respuesta Inmune Innata  4. Sistema del Complemento El sistema del complemento es una cascada de reacciones enzimáticas en el plasma sanguíneo de defensa contra infecciones. Estos componentes son: Proteínas de suero Proteínas que como precursores residen en enzimáticos superficies inactivos celulares. (cimógenos) Se considera un puente entre la Inmunidad Innata y Adaptativa: -Destruye microorganismos. Desencadena la escisión de C3 en C3a y -Modula la respuesta de linfocitos y la C3b. producción de Anticuerpos.  4. Sistema del Complemento La activación del Sistema del Complemento tiene un poderoso efecto antimicrobiano 4. Vías de Activación del Sistema del Complemento Vía Clásica: Vía de las Vía Alternativa: Lectinas: -Dependiente de la -Activación por activación de C1. -Independiente reconocimiento -Se iniciar con de la Presencia de presencia de de Anticuerpos. componentes anticuerpos. -Lectina de de superficie de unión a manosa MO. Dependiente de Ac: (MBL) reconoce -Estructuras -Ag-IgM o Ag-IgA. azúcares de la Moleculares pared celular conservadas Independiente de Ac: bacteriana. entre MO. -Polianiones (DNA, -Escisión de C3 (PAMPs). RNA), bacterias gram -, independiente -Vía regulada proteína C reactiva. de Ac, pero por factor H, [Todos interactúan influida por properdina y directamente con C1] complejos (Ag- CD55. Ac) de IgG. 4. Resultados de Activación del Sistema del Complemento Todas las vías de Activación del Sistema del Complemento convergen en la creación del MAC (Membrane Attack Complex – Componente Citotóxico del Sistema del Complemento). 4. Resultados de Activación del Sistema del Complemento Lesiones (poros) de membrana. Representación esquemática de la conformación del Complejo de Ataque de Membrana (MAC) 5. Activación de la Respuesta Inmune Adaptativa  5. Inflamacióm Signos Cardinales de la Inflamación 1. Tumor / Edema: por aumento de la permeabilidad vascular, se acumulan células y agua en la MEC. (Trastorno 5. Pérdida o hemodinámico). Disminución de la Función: 2. Rubor: por aumento de consecuencia permeabilidad vascular e hiperemia final de la por vasodilatación o hemorragia. lesión 3. Calor: La vasodilatación promueve acumulación de sangre y aumenta el metabolismo del tejido dañado. 4. Dolor: por estimulación de terminales nerviosas de dolor. Producción masiva de mediadores de inflamación. 5. Relevancia de la Inflamción en la Respuesta Adaptativa (Humoral) La inflamación en el contexto de la Respuesta Inmunológica, corresponde al Vasodilatación y Aumento de la primer paso de una reacción local para permeabilidad vascular. la activación del sistema humoral y reparación del daño causado por la infección Liberación de Citoquinas pro- inflamatorias. Expresión de Moléculas de La inflamación es un mecanismo Adhesión Celular MACs, que primitivo de Defensa, que involucra: permiten que Fagocitos se adhieran al endotelio y migren al sitio de infección por quimotaxis. [Integrinas, Selectinas y Quimioquinas]  6. Inmunidad Adaptativa Genera respuestas altamente específicas dependiendo del patógeno (exógeno o endógeno) que se haya identificado. Funciones: -Detectar y eliminar agentes patógenos. -Eliminar células alteradas. [Degeneradas o neoplásicas]. -Montar una respuesta inmunológica de memoria.  6. Inmunidad Adaptativa [RIA]. Efectores. Respuesta Humoral Linfocitos. Estas células se encuentran en la sangre y Mediada por la producción en la linfa e intervienen en: de Anticuerpos por parte de Linfocitos B. Respuesta enfocada en eliminar antígenos Respuesta Celular extracelulares. Evitar diseminación de Mediada por Linfocitos T. patógenos intracelulares. Linfocitos T poseen Receptores de membrana capaces de reconocer Ag Reconocimiento → Propiedad adosados a la superficie de otras células. Fundamental de la RIA. 6. RIA Humoral. La respuesta Humoral está mediada por los linfocitos B. 1º - Reconocimiento de un Ag por un linfocito B. [Receptor BCR] Esta unión por sí sola no es capaz de activar la respuesta del linfocito B. 2º - El linfocito B debe ser estimulado por el linfocito T helper (LTh) 3º - La estimulación del LTh produce: Proliferación del Remanentes de la LB que produzca la Maduración de proliferación serán Ig contra el afinidad de las Ig. LB de memoria. antígeno. 6. RIA Humoral. Teoría de la Selección Clonal Del repertorio de LB en un individuo, solo reconocerá y se activará específicamente, aquel cuyo receptor tenga afinidad por el antígeno.  6. RIA Humoral. Tipos de antígenos. Antígenos T Antígenos T independientes dependientes No todos los antígenos tienen los mismos requerimientos al momento de su reconocimiento Lípidos y Antígenos proteicos polisacáridos. Lípidos y sacáridos Requieren estructurales. estimulación de Th2 para producir No requieren anticuerpos estimulación LT para producir Generan memoria anticuerpos inmunológica. No generan memoria inmunológica  7. RIA Celular. Se caracteriza por la Capacidad de participación de LT. Reconocer Ag en superficie de otras células. 4 tipos Identifican antígenos virales presentados en membrana de células LT citotóxico infectadas. Atacan y destruyen a las células infectadas. Identifican antígenos presentados por Células Presentadoras de LT colaborador Antígenos (APC). Secretan Interleuquinas que estimulan la proliferación de LT, la diferenciación de LB y activación de macrófagos. Generan memoria inmunológica. Se producen a partir de LT LT de memoria diferenciados. Inhiben la producción de anticuerpos tras la eliminación del patógeno o LT supresores resolución de la infección.  7. Mecanismos de la RIA Celular. Presentación Antigénica. Los linfocitos T requieren del procesamiento previo de los antígenos por Células Presentadoras de Antígeno propias. Función realizada por CPAs y los Complejos de Histocompatibilidad I y II Los Ag son presentados a los LT en el contexto de MHCI o MHCII  7. Mecanismos de la RIA Celular. MHC El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) es un conjunto de proteínas extracelulares que cumple la función de marcar lo propio y presentar moléculas al sistema inmune. Función realizada por CPAs y los Complejos de Georg Snell, Jean Dausset y Bariy. Premio Nobel Histocompatibilidad de Medicina en 1980 por descubrimiento del I y II MHC. Los Ag son Los MHC se organizan en 4 familias presentados a los LT en el contexto de un 1. MHC Clase 1. MHC. 2. MHC Clase 2. 3. MHC Clase 3. 4. MHC Clase 4. 7. Presentación Antigénica. MHC Clase 1 Contiene 2 cadenas polipeptídicas denominadas ɑ (3 dominios) y β2 MHC Clase 1 se expresa en la microglobulina (1 dominio). mayoría de las células nucleadas. Presenta antígenos a los linfocitos LTCD8. Presenta antígenos de origen endógeno y exógeno. Hendidura de presentación del péptido contiene 2 cadenas ɑ y 8 cadenas β. “Dos plátanos en un plato”. 7. Presentación Antigénica. MHC Clase 2 Contiene 2 cadenas polipeptídicas MHC Clase 2 únicamente en denominadas ɑ (2 dominios) y β microglobulina (2 dominios). células presentadoras de antígenos profesionales. Presenta antígenos a los linfocitos LTCD4. Presenta antígenos de origen exógeno exclusivo previamente degradados vía lisosomal. Las APCs digieren los antígenos y a su vez co-estimulan a los LT para alertar de la presencia de la infección. Monocitos y macrófagos. Células dendríticas. Células de Langerhans (piel). Células B maduras. 7. Presentación Antigénica. MHC Clase 3 y 4 MHC Clase 3 → Incluye en su estructura moléculas del Complemento (C2 y C4). Son diferentes en estructura, organización y función en relación a las moléculas de MHC Clase 1 y 2. MHC Clase 4 → Sistema expresado en linfomas de células T y timocitos inmaduros. Relacionados con enfermedades autoinmunes. Genes asociados a MHC clase 4 se encuentran en regiones teloméricas de genes del MHC clase 3.  7. Sistema HLA HLA → “Antígeno Leucocitario Humano”. Cumple funciones en: Compatibilidad en Inmunidad Transplantes. adaptativa. Mecanismos de Enfermedades tolerancia Autoinmunes. neoplásica. Cluster de transcripción exclusivo para cada individuo entre 6p21.31 [Más de 200 cromosoma 6 y 15. genes descritos].  7. Presentación Antigénica. RESUMEN Ag endógenos y Ag exógenos exógenos se con presentan en el endocitados, contexto de digeridos y MHC I en todas presentados en las células contexto de nucleadas a los MHC II LTCD8. exclusivamente Generación de en CPAs. tolerancia o Identificación de citotoxicidad. lo “patógeno”.  8. Fases de la RIA 1. Reconocimiento: se identifica un área restringida del Antígeno. LB reconoce Ag de cualquier naturaleza a través de su receptor BCR. LT reconoce Ag exclusivamente proteicos en contexto de MCH II a través de su receptor TCR. 2. Activación: Proliferación de Linfocitos y Diferenciación. (Expansión clonal de LB). LB → se diferencia en célula plasmática (que secreta anticuerpos). LT → se diferencia en células reguladoras o citotóxicas. 3. Fase Efectora: Ejecución de la Respuesta Inmunológica. LB → producen anticuerpos y migran entre órganos linfoides. LT CD8 → destruyen células infectadas por agentes intracelulares. LT CD4 → al presentarse un Ag peptídico en contexto de MHC I libera citoquinas que activan macrófagos y modulan la diferenciación de LB 4. Declinación: Anergia de linfocitos T y B. Cese de la secreción de Anticuerpos e Interleuquinas. 5. Memoria Inmunológica: LT y LB seleccionados clonalmente migran a los órganos linfoides 2dos y entran en estado de anergia hasta una nueva exposición al Ag. 8. Fases de la RIA 9. Memoria Inmunológica Respuesta Secundaria: -Mejor Calidad. -Menor tiempo. 9. Memoria Inmunológica. Switch isotípico.  10. Cultura General Retrato de Adele Bloch-Bauer. (Vienna, Exponente del Modernismo Vienés de inicio de siglo XX. 1907) Expresión de emociones de alta intensidad a través del Autor: Gustav Klimt. uso del color y materiales.