Cycle Cellulaire et Mitose Cours L1S2 Biologie2 2023 PDF

Licence 1 Sciences Biomédicales – UE Biologie2 Cycle Cellulaire et Mitose Dr. Clément Ricard, PhD Maître de Conférences des Universités Saints-Pères Paris Institut des Neurosciences (UMR8003)  Division Cellulaire - Au niveau de la ce...

Licence 1 Sciences Biomédicales – UE Biologie2 Cycle Cellulaire et Mitose Dr. Clément Ricard, PhD Maître de Conférences des Universités Saints-Pères Paris Institut des Neurosciences (UMR8003)  Division Cellulaire - Au niveau de la cellule, la croissance se réfère à une augmentation du nombre de cellules et non à une augmentation du volume et de la taille. - Toutes les cellules proviennent de la division d’une cellule-mère en 2 cellules filles. - Si l’on considère un organisme unicellulaire (protistes, levures, …), chaque division va donner 2 nouveaux organismes identiques. - Si l’on considère un organisme pluricellulaire, les divisions vont être finement régulées pour permettre la formation de l’individu et le remplacement des cellules mortes. Vie cellulaire  Division Cellulaire - Toutes les cellules ne se divisent pas à la même vitesse. Chez l’homme par exemple : ▪ Les cellules des cryptes intestinales sont renouvelées tous les 3 jours. ▪ Certaines cellules du système nerveux ne se divisent pas. - On qualifie de quiescentes les cellules qui ne se divisent pas. - Les cellules qui se divisent ne le font pas de manière illimitée, au bout d’un certain nombre de divisions (une centaine in vitro), elles rentrent en sénescence. - Il existe des cellules avec un potentiel prolifératif illimité : les cellules souches. Durée de vie de plusieurs types cellulaires.  Cycle Cellulaire : Définition Le cycle cellulaire est l’ensemble des étapes au cours desquelles les cellules dupliquent leurs constituants (ADN, organites, …) avant de les diviser en 2 parties égales. Définition : Ces différentes étapes sont finement régulées et conservées chez tous les eucaryotes. Des défauts de régulation peuvent entrainer la cancérisation où la cellule va se diviser de manière anarchique.  Cycle Cellulaire - Le cycle cellulaire se décompose entre 2 grandes phases : ▪ La phase M (Mitose + Cytokinèse) qui dure environ 1h. ▪ L’interphase (phase G1, S et G2) d’une durée variable (10h à plusieurs années). - Les différentes étapes du cycle cellulaire vont avoir lieu selon un ordre précis, une étape ne peut pas avoir lieu si la précédente ne s’est pas correctement déroulée et n’a pas été terminée. Cycle cellulaire  Cycle Cellulaire - L’interphase est caractérisée par : ▪ Une duplication du génome. ▪ Une duplication des organites. ▪ Un accroissement du volume cellulaire. - La mitose est l’étape au cours de laquelle les chromosomes sont répartis entre les cellules filles. Le patrimoine génétique de chaque cellules filles sera donc identique à celui de la cellule-mère. Evolution de la masse cellulaire au cours du cycle  Interphase - L’interphase est divisée en 3 étapes : G1, S et G2. - Les phases G1 et G2 sont des phases intermédiaires. La phase S correspond à la réplication de l’ADN. Cycle cellulaire Duplication du centrosome  Phase G1 - La phase G1 également appelée phase pré-réplicative commence à la fin de la mitose précédente et se termine au moment où la cellule attaque de répliquer son ADN. - Sa durée est variable en fonction du type cellulaire et de l’environnement (notamment la présence de facteurs de croissance). - La phase G1 renferme un point de contrôle majeur baptisé point de restriction. Au-delà de ce point, la cellule s’engage irréversiblement en phase S et le cycle cellulaire est enclenché jusqu’à la prochaine phase G1. Les cellules ne pouvant pas y arriver meurent. - Les cellules qui ne dépassent pas ce point de restriction rentrent en phase de quiescence encore appelée phase G0.  Phase S - La phase S (Synthèse) correspond à la réplication de l’ADN. - Cette étape est la + courte de l’interphase. - Les histones ne sont synthétisées que pendant cette phase afin de pouvoir répondre aux besoins de compaction de l’ADN suite à la réplication. - Les centrioles commencent également à être dupliquées au cours de la phase S. Réplication de l’ADN  Phase G2 - La phase G2 débute à la fin de la phase S et se termine au déclenchement de la mitose. Elle est beaucoup + courte que la phase G1.  Mitose - La mitose est divisée en plusieurs étapes : ▪ Prophase ▪ Prométaphase ▪ Métaphase ▪ Anaphase ▪ Télophase - La Cytodiérèse fait partie de la phase M mais pas de la mitose. - La régulation principale se fait lors de la transition entre la métaphase et l’anaphase. Figures de mitose  Prophase - Durée : 20-30 min. - La chromatine diffuse se condense progressivement en chromosomes. - Les chromosomes apparaissent alors sous la forme de 2 chromatides sœurs parfaitement individualisées. - Le cytosquelette de microtubules s’est dépolymérisé. On retrouve par la suite des microtubules émis par deux centrosomes qui forment le fuseau mitotique. Prophase  Prophase : Formation du Chromosome Mitotique - Les fibres de chromatine que l’on trouve dans le noyau interphasique sont extrêmement longues et réparties dans tout le volume nucléaire. - Cet allongement de la chromatine est idéal pour la réplication et la transcription mais pas pour la ségrégation en 2 cellules filles. - Au début de la prophase la chromatine va donc être condensée. - Les chromosomes sont constitués de fibres de chromatine, la condensation n’altère pas la nature de ces fibres. Compaction de l’ADN  Compaction de la Chromatine - La molécule d’ADN eucaryote va être dans un premier temps condensée dans la répétition de structures appelées nucléosomes. - Un nucléosome est constitué par l’enroulement de 146 pb d’ADN autour d’un octamère composée de 2 molécules de chaque histones (H2A, H2B, H3, H4). On les appelle histones de cœur. Nucléosomes  Compaction de la Chromatine - Les nucléosomes sont reliés entre eux par un fragment d’ADN de liaison (ADN internucléosomique) qui interagit avec une autre protéine histone, l’histone de liaison H1, qui va permettre une compaction des nucléosomes pour former une fibre de 10nm. - Une compaction dans une hélice hélicoïdale de 30nm peut ensuite être réalisée. - Les fibres de 30nm vont s’organiser en domaines qui composent les chromosomes. Nucléosomes  Structure du Chromosome Mitotique - Présence d’une échancrure bien marquée (constriction primaire) qui montre la position du centromère. - Le centromère regroupe des séquences très répétées d’ADN qui servent de site de fixation à des protéines spécifiques. Chromosome en MET Chromosome en MEB  Structure du Chromosome Mitotique - Présence d’une structure en forme de plaque située à la face externe du centromère : le kinétochore. - Le kinétochore se forme durant la prophase, il sert : ▪ de site de fixation du chromosome aux microtubules. ▪ de site de localisation de plusieurs protéines motrices impliquées dans le déplacement des chromosomes. ▪ d’élément du système de transmission d’un point de contrôle mitotique. Kinétochore  Prophase : Formation du Chromosome Mitotique - Si l’on traite un chromosome mitotique par des solutions permettant de solubiliser les histones, on observe une ossature formant la base du chromosome. - Cette ossature est composée de protéines non-histones auxquelles s’attachent les boucles d’ADN. Ossature du chromosome mitotique  Prophase : Formation du Chromosome Mitotique - Il existe un complexe multiprotéique abondant, la condensine, impliqué dans la condensation des chromosomes. - Avant la réplication, l’ADN interphasique s’associe à différents endroits à un complexe protéique, la cohésine. La cohésine fonctionne comme un pont qui maintient ensemble les 2 chromatides sœurs pendant la phase G2 et jusqu’au moment où elles se séparent en mitose. Rôle de la condensine et de la cohésine dans la formation des chromosomes mitotiques  Prophase : Formation du Chromosome Mitotique - La cohésine se sépare des chromosomes en 2 étapes : ▪ La plus grande partie se sépare des bras des chromosomes au moment de la condensation lors de la prophase. Par la suite les chromatides sont maintenues de façon lâche sur les bras mais plus fermement au niveau du centromère. ▪ La séparation de la cohésine des centromères a lieue à l’anaphase. Chromosome mitotique en IHC (bleu : ADN, vert : kinétochores, rouge : cohésine)  Prophase : Formation du Fuseau Mitotique - Rappel : les microtubules s’organisent au niveau du centrosome. - Au cours du cycle cellulaire, existence d’un cycle du centrosome : ▪ Lorsqu’une cellule est en G0/G1, elle possède un seul centrosome avec 2 centrioles perpendiculaires. Organisation du centrosome  Prophase : Formation du Fuseau Mitotique ▪ Au début de la phase S, chaque centriole va commencer sa réplication dans le cytoplasme. Ecartement des centrioles. Apparition d’un centriole fils perpendiculaire à chaque centriole préexistant. Allongement ultérieur des microtubules du centriole fils. ▪ Au début de la mitose, le centrosome se scinde en 2 centrosomes contigus chacun contenant une paire de centriole (un ancien et un nouveau). Cycle du centrosome  Prophase : Formation du Fuseau Mitotique ▪ La duplication des centrosome à la transition G1/S est déclenchée par la cyclineE/Cdk2 (voir cours Régulation du cycle cellulaire). ▪ Des erreurs de duplication du centrosome peuvent aboutir à une division cellulaire anormale et à des phénomènes de cancérisation. Cellule de cancer mammaire de souris (bleu : ADN ; vert : microtubules ; rouge : centrosome) Centrioles fils (flèches)  Prophase : Formation du Fuseau Mitotique - Lorsque la cellule entre en mitose, les microtubules se dissocient rapidement pour se réassembler afin de former une structure complexe : le fuseau mitotique. - Cette dissociation est médiée par l’inactivation des protéines qui stabilisent les microtubules et par l’activation des protéines qui les déstabilisent. - La 1ere étape de la formation du fuseau mitotique est l’apparition de microtubules disposés en aster autour de chaque centrosomes (début de prophase). - Après la formation de l’aster, les centrosomes se séparent et migrent ensuite le long du noyau vers des endroits opposés de la cellule. Cette séparation est possible grâce aux protéines motrices associées aux microtubules. - Les 2 centrosomes atteignent des points opposés et déterminent les 2 pôles du fuseau mitotique. Formation de l’aster  Prophase : Dissolution de l’Enveloppe Nucléaire - Disparition progressive du nucléole. - A la fin de la prophase, on note une rupture de l’enveloppe nucléaire. Cette dernière se disperse en une multitude de vésicules membranaires qui ne sont plus distinguées de celles venant du réticulum endoplasmique ou de l’appareil de Golgi. - L’évènement majeur responsable de la fragmentation de l’enveloppe nucléaire et la phosphorylation des lamines constituant la lamina nucléaire. - Les éléments constitutifs des pores nucléaires passent également en solution. - Certains organites comme les mitochondries, les lysosomes et les peroxysomes restent intacts pendant la mitose. Phosphorylation des lamines  Prométaphase - Durée : quelques minutes. - Cette phase débute lors de la rupture de l’enveloppe nucléaire lorsque les éléments du fuseau mitotique qui se trouvaient jusqu’alors à l’extérieur du noyau se trouvent dans l’espace qu’il occupait précédemment. - Le kinétochore est assemblé au niveau des centromères de chaque chromatide sœur. Il va lier les extrémités positives des microtubules provenant des extrémités du fuseau. - Les chromosomes vont avoir une série de mouvements oscillatoires avant de s’aligner selon l’axe équatorial du fuseau mitotique. Kinétochore Prométaphase  Prométaphase Conséquence de l’absence de protéine motrice Comportement des microtubues pendant pour l’alignement des chromosomes la formation de la plaque métaphasique  Métaphase - Durée : 20-40 min. - Les chromosomes sont stabilisés sur le plan situé à mi-chemin entre les pôles des cellules (plaque métaphasique). Une chromatide est connectée par son kinétochore à un pôle et sa chromatine sœur au pôle opposé. - Cette étape est également une phase de « vérification » pour la cellule. Métaphase  Métaphase - Les microtubules du fuseau mitotique de la cellule en métaphase peuvent être divisés en 3 groupes fonctionnels qui possèdent la même polarité : ▪ Les microtubules de l’aster : ils rayonnent du centrosome vers la région externe du fuseau. Ils jouent un rôle dans la mise en place du fuseau et déterminent le plan de la cytokinèse. Les 3 groupes de microtubules du fuseau mitotique  Métaphase - Les microtubules du fuseau mitotique de la cellule en métaphase peuvent être divisés en 3 groupes fonctionnels qui possèdent la même polarité : ▪ Les microtubules chromosomiques (également appelés microtubules du kinétochore) : ils s’étendent du centrosome au kinétochore des chromosomes. Chez les mammifères, chaque kinétochore est attaché à une fibre fusoriale (faisceau de 20-30 microtubules). Lors de la métaphase, les microtubules chromosomiques exercent une traction sur les kinétochores ce qui permet à ces derniers de rester dans le plan équatorial. Ils sont nécessaires pour le déplacement des chromosomes vers les pôles au moment de l’anaphase. Les 3 groupes de microtubules du fuseau mitotique  Métaphase - Les microtubules du fuseau mitotique de la cellule en métaphase peuvent être divisés en 3 groupes fonctionnels qui possèdent la même polarité : ▪ Les microtubules polaires (également appelés microtubules interpolaires) : ils partent du centrosome et passent à coté des chromosomes. Ils s’intercalent avec leurs partenaires venant de l’autre centrosome. Il forment une corbeille qui participe au maintien de l’intégrité du fuseau. Les 3 groupes de microtubules du fuseau mitotique  Métaphase Les 3 groupes de microtubules  Anaphase - Durée : 5-10 min. - Le début de l’anaphase est marqué par le clivage des centromères et donc la perte de cohésion des 2 chromatides sœurs. - Les chromatides sœurs vont se séparer et se diriger vers les pôles opposés du fuseau. - Le mouvement est permis grâce au rétrécissement des microtubules liés au kinétochore. - A la fin de l’anaphase les 2 ensembles de chromatides sœurs sont rassemblées aux 2 pôles de la cellule. Le matériel génétique est donc distribué en 2 lots identiques. Anaphase  Contrôle de l’Anaphase - Il existe 2 complexes multiprotéiques distincts APC et SCF qui permettent de fixer des ubiquitines aux protéines afin de les marquer pour qu’elles soient dégradées par le protéasome. - Ces complexes ne sont actifs qu’à certaines périodes du cycle cellulaire. - APC (Anaphase Promoting Complex) joue un rôle central dans la régulation de la mitose en permettant notamment de déclencher l’anaphase. - APC contient une douzaine de sous-unités ainsi qu’une protéine adaptatrice qui va permettre de choisir les protéines qui seront les substrats d’APC. - Deux de ces protéines adaptatrices vont jouer un rôle clé au moment de la mitose : Cdc20 et Cdh1. Activité d’APC au cours du cycle cellulaire  Contrôle de l’Anaphase - Deux de ces protéines adaptatrices vont jouer un rôle clé au moment de la mitose : Cdc20 et Cdh1. - APCCdc20 est activé à la limite entre la métaphase et l’anaphase. ▪ Il fixe des ubiquitines à la sécurine, un inhibiteur de l’anaphase qui sécurise la liaison entre les chromatides sœurs. ▪ Cette destruction de la sécurine permet la libération de la séparase, une protéase qui scinde la sous-unité de la cohésine qui maintient les chromatides sœurs ensemble. ▪ C’est la scission de la cohésine qui déclenche la séparation des chromatides sœurs. Rôle d’APCCdc20  Contrôle de l’Anaphase - A la fin de la mitose, Cdc20 est détruite et l’autre adaptateur, Cdh1, va permettre la sélection du substrat à marquer pour la dégradation. - APCCdh1 fixe des ubiquitines aux cyclines mitotiques (voir cours Régulation du Cycle Cellulaire). - La destruction de ces cyclines fait chuter l’activité des Cdk mitotiques et entrer la cellule dans la phase G1 du cycle suivant (voir cours Régulation du Cycle Cellulaire). Rôle d’APC  Déroulement de l’Anaphase - Les chromosomes de la plaque métaphasique se scindent de manière synchrone permettant la séparation des chromatides (NB : n’étant plus attaché à leur partenaire, les chromatides deviennent des chromosomes). - Les chromosomes migrent vers les pôles, centromère en tête et bras chromosomiques en arrière. - La vitesse de déplacement est assez lente (1µm/min) qui permet une séparation correcte des chromosomes en empêchant l’enchevêtrement. - Le déplacement des chromosomes vers les pôles est accompagné par un raccourcissement des microtubules chromosomiques. Anaphase en ME  Déroulement de l’Anaphase - On distingue 2 types de mouvements au cours de l’anaphase : ▪ Le mouvement des chromosomes en direction des pôles est appelé Anaphase A. ▪ Le mouvement qui écarte les 2 pôles du fuseau est appelé Anaphase B. ▪ Ces 2 mouvements sont simultanés. Anaphase A et B  Télophase - Durée : 10-30 min. - La télophase est marquée par le désassemblage du fuseau mitotique, la décondensation des chromosomes et la reformation de l’enveloppe nucléaire. - Les microtubules kinétochoriens disparaissent et les kinétochores commencent à se désassembler. - L’enveloppe nucléaire se reconstitue autour des paquets de chromosomes selon un processus inverse à celui observé en fin de prophase. - Les chromosomes se décondensent et retournent à une structure chromatinienne. - Les nucléoles réapparaissent au niveau des différents organisateurs nucléolaires avant de fusionner en un nombre limité de structures (1 ou 2). - La partie nucléaire de la division cellulaire est alors terminée. Télophase  Télophase - La télophase est le stade durant lequel la cellule retrouve son état interphasique. Telophase d’une cellule de la granulosa de l’ovaire en ME  Cytodiérèse (Cytocinèse) - La mitose sépare les chromosomes dupliqués dans les noyaux fils ; la cellule se divise par un processus distinct : la cytokinèse. - Cette étape correspond à la formation du sillon de division grâce à un anneau contractile d’actine qui clive le cytoplasme et sépare les 2 cellules filles. - Chaque cellule fille hérite d’un stock complet d’organites et de molécules. Cytodiérèse  Déroulement de la Cytokinèse - La première manifestation visible de la cytokinèse intervient à la fin de l’anaphase par l’apparition d’une invagination de la surface cellulaire dans une étroite bande entourant la cellule. - Le plan du sillon correspond à celui qui était occupé par les chromosomes de la plaque métaphasique. - La membrane plasmique s’allonge grâce aux vésicules cytoplasmiques qui fusionnent avec le sillon en progression. - Le sillon s’approfondit et forme un pont entre les 2 cellules filles appelé corpuscule central. - Les faces opposées fusionnent et la cellule est coupée en 2. Cytokinèse de cellules de mammifère (bleu : noyau ; vert : microtubules)  Déroulement de la Cytokinèse - La force nécessaire à la scission de la cellule est produite dans le cortex (mince bande de cytoplasme située sous la membrane au niveau du sillon). - Dans le cortex, présence de filaments d’actine ainsi que de myosine II. - La présence de myosine II est nécessaire au déroulement de la cytokinèse. - L’assemblage du système contractile actine/myosine est réalisé grâce à une protéine G : RhoA. - Comme lors de la contraction musculaire, le glissement des filaments d’actine de l’anneau contractile va tirer le cortex et la membrane plasmique vers le centre de la cellule. L’anneau contractile va donc étrangler la région équatoriale de la cellule. Actine (rouge) et Myosine II (vert) Bilan Cycle Cellulaire Bilan Mitose Bilan Mitose  Bilan Mitose Prophase Métaphase Anaphase Microscopie à contraste de phase Télophase  Méthodes d’Etude du Cycle Cellulaire - De nombreuses méthodes permettent d’étudier le cycle cellulaire, parmi elles (liste non exhaustive) : ▪ Microscopie (après marquage des noyaux). ▪ Cytométrie de flux. ▪ Incorporation de BrdU. ▪ Ki67. ▪ 3H-Thymidine ▪ FUCCI (Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator).  Méthodes : Marquage des Noyaux au DAPI - Le DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) est un agent intercalant de l’ADN qui se fixe préférentiellement dans le sillon mineur de l’ADN dans des zones riches en A/T. - Il fluoresce principalement dans le bleu (450-480nm) lorsqu’il est excité par des UV (350nm). - Autres alternatives : Hoechst (bleu), Iodure de Propidium (rouge). Spectres d’excitation (bleu) et d’émission (rouge) du DAPI Marquage au Dapi de cellules à différents stades du cycle cellulaire  Méthodes : Immunocytochimie - Utilisation d’anticorps dirigés contre des protéines impliquées dans le cycle cellulaire. - Observation en microscopie. Principe de l’immunocytochimie Vert: anti-Tubuline ; Rouge : Marqueur mitochondries Immunomarquage anti-lamines  Méthodes : Cytométrie de Flux - L’iodure de propidium est un marqueur de l’ADN. Principe de la cytométrie de flux Détermination de la phase du cycle  Méthodes : BrdU / Ki67 - Le BrdU (Bromo-desoxy-uridine) est un nucléoside synthétique, analogue structurel de la thymidine. Il s’incorpore au moment de la réplication de l’ADN. On peut ensuite réaliser un marquage immunohistochimique (anticorps anti-BrdU) afin de visualiser les cellules qui étaient en phase S lors de la mise en présence du BrdU. Gliome murin (traitement au Bev) - L’antigène Ki67 fait partie des marqueurs de prolifération. Il est présent sur une protéine nucléaire de 360kDa présent au niveau du noyau des cellules prolifératives. Immunomarquage anti-Ki67 sur un carcinome (ovaire) Méthodes : 3H-Thymidine Principe du pulse-chase Autoradiographie Utilisation de la 3H-Thymidine sur cellules HeLa  Méthodes : FUCCI - On transfecte les cellules avec des plasmides codant pour 2 protéines de fusion Geminin-GFP et Cdt1-RFP. - En G1, la Geminin-GFP est dégradée (= rouge). - En fin de S, G2 et M, Cdt1-RFP est dégradée (= vert). - Sur la transition G1/S, les 2 protéines sont présentes (= jaune). Principe du FUCCI  Quelques Eléments de Bibliographie - Biologie Moléculaire de la Cellule : B. Alberts, Médecine Sciences Publications. - Biologie Cellulaire et Moléculaire : Karp, deBoek. - Biologie Moléculaire de la Cellule : Lodish, deBoek. - Biologie Cellulaire UE2 PACES : A. Fradagrada, EdiScience. Tous ces ouvrages sont disponibles à la Bibliothèque Universitaire.