DNA Replication in Eukaryotes PDF

‫‪DNA Replication‬‬ ‫همانند سازی ‪DNA‬‬ ‫یوکاریوت ها‬ ‫‪1‬‬  ‫مبدا همانند سازی و پروتئین های آغازگر در مخمر(یوکاریوت ساده)‬ ‫‪ ‬مبداهای همانندسازی در مخمر‪ ،‬توالی همانندساز خودمختار یا ‪ARS‬‬ ‫( ‪ ( Autonomously Replicating Sequence‬نام دارد‬...

‫‪DNA Replication‬‬ ‫همانند سازی ‪DNA‬‬ ‫یوکاریوت ها‬ ‫‪1‬‬  ‫مبدا همانند سازی و پروتئین های آغازگر در مخمر(یوکاریوت ساده)‬ ‫‪ ‬مبداهای همانندسازی در مخمر‪ ،‬توالی همانندساز خودمختار یا ‪ARS‬‬ ‫( ‪ ( Autonomously Replicating Sequence‬نام دارد‬ ‫‪ ، ARS ‬قطعه کوتاه با طول ‪ ،bp150-100‬غنی از ‪ A/T‬است و در آن ‪ 4‬بخش‬ ‫شناسایی شده است‬ ‫‪ ‬بخش ‪A‬یا توالی توافقی ‪)ARS Consensus Sequence( ARS‬این ناحیه‬ ‫‪14‬زوج باز طول دارد‬ ‫‪ ‬بخش ‪A‬و ‪ B1‬محل اتصال کمپلکس شناساگر مبدا )‪ (origin recognition complex‬یا‬ ‫‪ ORC‬می باشد و معادل موتیف ‪ 9‬نوکلئوتیدی در ‪coli.E‬است که توسط ‪DnaA‬‬ ‫شناسایی می شود‪.‬‬ ‫‪ ‬بخش ‪ :B2‬محل باز شدن دو رشته ‪DNA‬می باشد و معادل موتیف ‪13‬‬ ‫نوکلئوتیدی در ‪coli.E‬است‪.‬‬ ‫‪ ‬بخش ‪ :B3‬محل اتصال پروتئین های(‪ (ARS binding facor-1 ()ABF1‬می‬ ‫باشد که تحریک کننده شروع همانندسازی است‪.‬معادل این پروتئین در یوکاریوت‬ ‫های عالی ‪Cdc6‬می باشد که وقتی در ‪G1‬به مبدا های همانندسازی متصل می‬ ‫شود باعث اتصال پروتئین های دیگر و تشکیل کمپلکس پیش همانندساز میشود‪.‬‬ ‫‪2‬‬  ‫عناصر توالی همانندساز خودمختار یا ‪:ARS‬‬ ‫ناحیه ‪ ARS‬در مخمر دارای یک توالی ‪ 11‬بازی توافقی است که در ‪ARS‬ها بشدت حفظ شده است‬ ‫(توالی توافقی ‪ ARS‬یا بخش مرکزی ‪)ARS‬وجایگاه اتصال ‪ ORC‬است‬ ‫سه بخش ‪B1, B2‬و ‪ B3‬به تنهایی کارگر نیستند ولی همراه همدیگر در عملکرد ‪ ARS‬نقش دارند‪.‬‬ ‫ناحیه ‪ B2‬به نام ‪ DUE‬یا ‪ DNA Unwinding element‬خوانده میشود برای ایجاد تک رشته میباشد‪.‬‬ ‫‪ OBR‬یا ‪ origin of bidirectional replication‬معرف مبدا همانندسازی دو سویه است‪.‬‬ ‫‪3‬‬  ‫‪DNA‬هلیکازها و پروتئین های مستقر کننده هلیکاز در یوکاریوت‬ ‫‪ ‬در سلول های یوکاریوتی پروتئین‬ ‫‪(Mini chromosome maintenance protein complex ( MCM‬‬ ‫دارای نقش هلیکازی است‪.‬‬ ‫‪ MCM ‬شامل ‪ 6‬پلی پپتید به هم مرتبط (‪ )MCM7-MCM2‬میباشد که تشکیل‬ ‫ساختار حلقه ای می دهد‬ ‫‪ ‬این هلیکاز در جهت ‪ 3 5‬و بر روی رشته پیشرو (‪ )leading‬حرکت می کند‪.‬‬ ‫‪ ‬پروتئین های ‪Cdt1/Cdc6‬در یوکاروت ها عمل پروتئین مستقرکننده هلیکاز را‬ ‫انجام می دهد‪.‬‬ ‫اجتماع کمپلکس پیش همانند ساز‬ ‫‪4‬‬ ‫موقعیت هلیکاز ‪MCM‬‬ ‫‪5‬‬  ‫‪DNA‬پریماز و پروتئین های پایدار کننده تک رشته یوکاریوتی‬ ‫‪ ‬پروتئین همانندسازی ‪ )Replication Protein A =RPA ( A‬یک پروتئین‬ ‫متصل شونده به ‪DNA‬تک رشته ای می باشد که پروتئین هتروتریمری شامل‬ ‫زیرواحدهای ‪RPA3, RPA2, RPA1‬می باشد‬ ‫‪ ‬پریمازهای یوکاریوتی با ‪DNA‬پلی مراز آلفا‬ ‫یک مجموعه را تشکیل می دهد‬ ‫و پرایمری با طول ‪ 40‬نوکلئوتید می سازد‬ ‫که ‪ 10‬باز اول آن ‪RNA‬و ‪30‬‬ ‫نوکلئوتید بعدی آن ‪DNA‬است‬ ‫‪6‬‬  ‫آنزیم های ‪DNA‬پلیمراز یوکاریوتی‪:‬‬ ‫‪‬آنزیم الفا) ‪ /)α‬پریماز‪ :‬آنزیم ‪DNA‬پلی مراز ‪ α‬به همراه پریماز می باشد و بعد‬ ‫از ساخت پرایمر با طول‪10 nt‬از جنس ‪ ،RNA‬آنزیم ‪α‬وارد عمل می شود و قطعه‬ ‫کوتاهی از ‪DNA‬به طول ‪ 30 nt‬را به پرایمر اضافه می کند‪.‬‬ ‫‪ ‬این آنزیم فاقد گیره لغزنده (معادل زیرواحد ‪β‬در پروکاریوت ها) است بنابراین قادر به‬ ‫سنتز قطعات طوالنی ‪DNA‬نمی باشد‪.‬همچنین این آنزیم فاقد هر گونه فعالیت‬ ‫اگزونوکلئازی می باشد‪.‬به سم قارچ آفی دیکولین حساس است‬ ‫‪ ‬آنزیم دلتا (‪:(δ‬فعالیت ‪ 5‬به ‪ 3‬پلی مرازی‪ 3 +‬به ‪ 5‬اگزونوکلئازی (تصحیح کنندگی)‪.‬‬ ‫آنزیم ‪δ‬آنزیم اصلی همانندسازی می باشد و پس از آنزیم ‪،α‬ادامه سنتز ‪DNA‬با آنزیم ‪δ‬‬ ‫صورت می گیرد (همانندسازی رشته پیرو) ‪.‬به سم قارچ آفی دیکولین حساس است‪.‬‬ ‫‪7‬‬  ‫‪‬پروتئین های کمکی در تحریک فعالیت ‪DNA‬پلیمراز ‪:δ‬‬ ‫‪ --‬آنتی ژن هسته ای سلول تکثیری یا ‪)Proliferating cell nuclear antigen (PCNA‬‬ ‫معادل زیرواحد ‪β‬پروکاریوتی و نقش گیره لغزنده را ایفا می کند ‪ ،‬ساختار حلقه مانندی‬ ‫دارد که نقش نگهداری محکم آنزیم ‪ δ‬را در کنار رشته الگو بر عهده دارد و باعث‬ ‫افزایش پیوستگی آنزیم بر روی ‪DNA‬می شود‪.‬‬ ‫‪-‬فاکتور ‪ :)Replication factor C(RFC‬معادل کمپلکس ‪γ‬پروکاریوتی و به عنوان‬ ‫مستقر کننده گیره لغزنده عمل می کند‪.‬‬ ‫با فعالت ‪ATPase‬نقش بازکردن ‪PCNA‬و قرار دادن ‪PCNA‬را در محل اتصال‬ ‫پرایمر به الگو را برعهده دارد‪.‬عالوه بر این زمانی که همانندسازی به پایان می رسد‪،‬‬ ‫‪RFC‬می تواند ‪PCNA‬را از روی ‪DNA‬جدا کند‬ ‫‪-‬‬ ‫‪8‬‬ 9  ‫آنزیم های ‪DNA‬پلیمراز یوکاریوتی‪:‬‬ ‫فعالیت ‪5‬‬ ‫‪‬آنزیم اپسیلون ‪ : ε‬این آنزیم در سنتز رشته پیشرو نقش دارد‪.‬عالوه بر‬ ‫به ‪ 3‬پلی مرازی دارای فعالیت ‪ 3‬به ‪ 5‬اگزونوکلئازی (تصحیح کنندگی)‪.‬به سم قارچ آفی‬ ‫دیکولین حساس است‪.‬‬ ‫‪ ‬آنزیم‪ : γ‬همانند سازی و ترمیم(دارای فعالیت ‪ 3‬به ‪ 5‬اگزونوکلئازی است) ژنوم‬ ‫میتوکندری و کلروپالست را انجام میدهد‪.‬‬ ‫‪ ‬آنزیم ‪ DNA‬پلیمراز ‪ :β‬کوچکترین آنزیم ‪ DNA‬پلیمراز یوکاریوتی است ‪.‬این آنزیم‬ ‫فاقد فعالیت اگزونوکلئازی و فعالیت تصحیح است و نسبت به سم قارچ آفی دیکولین‬ ‫حساس نیست‪.‬وجود این آنزیم برای سلولهای مخمر ضروری نیست ولی غیرفعال شدن‬ ‫آن در موش سبب مرگ در دوران نمو رویان میشود‪.‬‬ ‫‪--‬این آنزیم در فعالیت ترمیم برشی باز(‪)BER‬و در ترمیم جفت شدن اشتباهی ‪ G:U‬نقش دارد‪.‬‬ ‫‪ --‬در سلولهای سرطانی انزیم ‪ DNA‬پلیمراز ‪ β‬دچار تغییر شده است‪.‬‬ ‫‪ ‬از دیگر ‪ DNA‬پلیمرازهای یوکاریوتی می توان آنزیم های‪ ,ζ,η,θ,κ,μ,λ,σ,ι‬را‬ ‫نام برد که در ترمیم نقش دارند‬ ‫‪10‬‬  ‫همانندسازی در یوکاریوت ها‬ ‫‪ ‬تعداد مبدا همانندسازی و رپلیکون ها بسیار زیادند‪.‬‬ ‫برخی از رپلیکون ها در اوایل فاز ‪S‬همانندسازی می کنند (سانترومرها و مناطق فعال‬ ‫رونویسی)‬ ‫برخی دیگر در اواخر فاز ‪S‬همانندسازی می کنند (تلومرها و مناطق غیرفعال رونویسی)‬ ‫‪11‬‬  ‫همانندسازی در یوکاریوت ها‬ ‫‪ -1‬در فاز ‪ G1‬یک کمپلکس چند پروتئینی به نام کمپلکس تشخیص مبدا (‪ATP -)ORC‬به‬ ‫مبداهای همانندسازی متصل می شود‬ ‫‪- -2‬سپس دراواسط فاز ‪ G1‬پروتئین های تنظیم کننده ‪ Cdc6‬و‪( Cdt1‬به عنوان‬ ‫مستقرکننده هلیکاز) به مبداهای همانندسازی متصل میشود که موجب می شود پروتئین‬ ‫‪Mcm‬هلیکاز به دنبال آن به مجموعه متصل شود و کمپلکس پیش همانندساز یا‬ ‫‪ Pre-RC = Pre- replication complex‬را می سازد‬ ‫‪ -3‬در اواخر ‪ G1‬و ابتدای ‪ S‬در ‪ ،Pre- RC‬دوکیناز(‪Cdk-S‬و‪ ،)Ddk‬اجزای‬ ‫کمپلکس ‪Pre- RC-‬را فسفریله می کنند‬ ‫‪ -4‬فسفریله شدن این پروتئین ها باعث جذب ‪ Cdc45‬به مجموعه ‪ Mcm‬و سپس باعث‬ ‫اتصال پریماز ‪DNA /‬پلی مراز ‪α‬می شود‬ ‫ نکته‪ Cdc45 :‬از پروتئین های ضروری برای شروع همانندسازی است‪.‬با پروتئین‬ ‫های ‪ MCM3,MCM6‬و ‪MCM7‬و ‪ORC1L‬و ‪ ORC6L‬انترکشن دارد‬ ‫‪12‬‬  ‫همانندسازی در یوکاریوت ها‬ ‫‪-5‬فسفریله شدن برخی از اجزاء کمپلکس پیش همانندساز از جمله ‪Cdc6‬و ‪Cdt1‬‬ ‫باعث جداشدن آنها از مجموعه ‪ ORC‬می شود‬ ‫‪-‬نکته‪ -‬فسفریله شدن ‪ Cdc6‬و ‪ Cdt1‬آنها را برای تخریب نیز نشانه گذاری می کند و‬ ‫تا شروع چرخه سلولی بعد به مجموعه ‪ ORC‬اضافه نمیشود‪.‬بنابراین در هر چرخه‬ ‫سلولی از هر مبدا همانندسازی فقط یک بار همانندسازی صورت می گیرد‪(.‬تنها پس از‬ ‫تفکیک کروموزوم ها و تکمیل مراحل تقسیم سلول‪ Cdk ،‬غیرفعال شده و کمپلکس‬ ‫جدید ‪ RC-pre‬تشکیل می شود‪).‬‬ ‫‪13‬‬  ‫همانندسازی در یوکاریوت ها‬ ‫‪-6‬هلیکاز باز کردن دو رشته را انجام می دهد و پروتئین همانندساز‪(RPA( A‬به‬ ‫‪DNA‬تک رشته ای متصل می شود و از دو رشته ای شدن جلوگیری می کند‪.‬‬ ‫‪ -7‬کمپلکس پریماز ‪DNA/‬پلی مراز ‪ α‬در ابتدای همانندسازی رشته پیشرو و ابتدای‬ ‫همانندسازی هر قطعه اکازاکی وارد عمل می شود که به دنبال ساخت پرایمر قطعه‬ ‫کوتاهی از ‪ DNA‬توسط آنزیم ‪ α‬ساخته می شود ‪.‬‬ ‫‪-8‬انتهای ‪ 3OH‬پرایمر توسط‪( RFC‬مستقر کننده گیره لغزنده) شناسایی شده و باعث‬ ‫قرار گیری ‪(PCNA‬گیره لغزنده) می شود‪.‬‬ ‫‪ -9‬آنزیم پریماز ‪ DNA/‬پلی مراز ‪α‬جدا شده و آنزیم ‪ DNA‬پلی مراز دلتا‪/δ‬اپسیلون ‪ε‬‬ ‫جایگزین آن می شود و همانندسازی رشته پیشرو و پیرو را انجام می دهد ‪.‬‬ ‫‪14‬‬ ‫همانندسازی در یوکاریوت ها‬ ‫‪15‬‬  ‫ادامه همانندسازی در یوکاریوت ها‬ ‫برای حذف پرایمر ‪ RNA‬و اتصال قطعات اکازاکی برخالف پروکاریوت ها ‪،‬آنزیم ها ی‬ ‫یوکاریوتی نقش اگزونوکلئازی ‪ 5‬به ‪ 3‬ندارند ‪.‬‬ ‫‪-1‬ابتدا با فعالیت ‪RNA ، RNaseH‬هیبرید با ‪ DNA‬حذف می شود‬ ‫‪-2‬ریبو نوکلئوتید آخری متصل به ‪ DNA‬و حتی چند نوکلئوتید از ‪( DNA‬که توسط‬ ‫‪DNA‬پلی مراز ‪ α‬ساخته شده) توسط فعالیت نوکلئازی ‪ FEN1‬برداشته می شود‪.‬‬ ‫‪-4‬سپس آنزیم ‪ DNA‬پلی مراز ‪ ε /δ‬فضای خالی را پر می کند‬ ‫‪-5‬اتصال قطعات اوکازاکی توسط آنزیم ‪ DNA‬لیگاز صورت می گیرد‬ ‫‪16‬‬ 17  ‫ختم همانندسازی در یوکاریوت ها‬ ‫‪ ‬در کروموزم یوکاریوتها‪ ،‬در هر دور سنتز‪ ،‬بعد از برداشتن پرایمر‪ ،‬انتهای ‪3‬‬ ‫رشته الگو به صورت تک رشته باقی مانده و رشته مکمل آن نسبت به الگو کوتاه تر خواهد‬ ‫بود‬ ‫‪ ‬در صورتی که از این مولکول در دور بعدی همانندسازی‪ ،‬به عنوان الگو استفاده‬ ‫شود‪ ،‬مولکول های حاصل بعدی باز هم کوتاه تر خواهند شد ‪.‬برای فائق آمدن بر این‬ ‫مشکل از آنزیم تلومراز و تلومرها استفاده می شود‬ ‫‪ ‬نکته‪ :‬در انسان با هر بار تقسیم سلولی‪ ،‬طول کروموزوم به اندازه ‪bp200-50‬‬ ‫کوتاه میشود‪.‬در بیماریهای پیری زودرس پیش از بلوغ به نام پروژریا (‪)Progeria‬‬ ‫بافتهای با تلومرهای کوتاهتر در انتهای کروموزم های خود دارند‪.‬‬ ‫‪18‬‬ ‫کوتاه شدن تلومر بعد‬ ‫از برداشته شدن‬ ‫پرایمر‬ ‫‪19‬‬  ‫تلومر‬ ‫‪ ‬تلومرها ساختارهایی در انتهای کروموزوم های خطی یوکاریوتی هستند که از نسخه‬ ‫های تکراری و پشت سرهم از یک توالی نوکلئوتیدی کوتاه (‪ 6‬تا ‪ )28‬جفت باز ساخته‬ ‫شده است (چند ده جفت تا ده ها هزار جفت)‬ ‫‪ ‬در مهره داران توالی تکراری تلومری ‪5-TTAGGG- 3‬می باشد که به صورت‬ ‫تکرارهای پشت سر هم در دو انتهای کروموزوم های یوکاریوتی یافت می شود‬ ‫‪ ‬طول تلومر‪ ،‬بین موجودات مختلف متفاوت است‪.‬در مخمر حدود ‪500-300‬باز و در‬ ‫انسان بین ‪ 2‬تا ‪ 30‬کیلوباز میباشد‬ ‫‪‬‬ ‫‪20‬‬  ‫آنزیم تلومراز‪:‬‬ ‫‪ ‬دارای بخش پروتئینی و ‪RNA‬می باشد‪.‬‬ ‫‪ ‬جزء ‪ RNA‬دارای ‪ 150‬نوکلئوتید است و توالی آن در انتهای ‪ 5' - CUAACCCUAAC-3 : 5‬می‬ ‫باشد که شامل ‪1/5‬کپی از توالی مکمل تلومر است ) توالی رنگی مکمل توالی تکراری‬ ‫تلومر ‪5-TTAGGG -3‬می باشد‪.‬‬ ‫‪ ‬بنابراین قسمتی از ‪RNA‬تلومراز با قسمتی از ‪DNA‬تک رشته در انتهای ́‪3‬‬ ‫کروموزوم جفت می شود و قسمتی از ‪RNA‬نیز به صورت تک رشته باقی می ماند‪.‬‬ ‫سپس آنزیم به کمک جزء پروتئینی خود با فعالیت ترانس کریپتازی معکوس از این‬ ‫‪RNA‬به عنوان الگو برای سنتز ‪DNA‬و اضافه کردن توالی های تکراری تلومر به‬ ‫انتهای ́‪ 3‬کروموزوم استفاده می کند‪.‬‬ ‫‪ ‬سپس ‪RNA‬الگو از ‪DNA‬جدا می شود و دوباره به ‪ 4‬نوکلئوتید انتهایی تلومر متصل‬ ‫می شود و این فرایند مرتب تکرار می شود‪.‬‬ ‫‪ ‬تلومراز قادر به سنتز رشته غنی از ‪G‬می باشد و رشته مقابل که غنی از ‪C‬است نیز‬ ‫با پرایمر گذاری و ساخت قطعات اکازاکی سنتز می شود اما باز هم کوتاه تر از رشته‬ ‫غنی از ‪G‬است اما طول کلی ‪DNA‬کروموزومی کاهش نمی یابد‬ ‫‪21‬‬ 22  ‫تلومر و پیری سلول‬ ‫‪ ‬آنزیم تلومراز فقط در سلول های زایشی‪ ،‬بنیادی (در بافت ها و ارگان‬ ‫ها به طور مداوم تقسیم می شوند وباعث بازسازی و حفظ عملکرد‬ ‫بافت ها می شوند‪ -‬مثال‪ :‬سلول های بنیادی خونساز مغز استخوان) و‬ ‫سرطانی فعال است‪.‬‬ ‫‪ ‬در بقیه سلول ها (سلول های سوماتیک تمایزیافته) آنزیم تلومراز‬ ‫وجود ندارد‬ ‫‪ ---‬بنابراین‪:‬‬ ‫‪ ‬توالی تلومری کوتاه می شود‬ ‫‪ ‬پروتئین های سرپوش بر انتهای کروموزم محلی برای چسبیدن ندارند‬ ‫‪ ‬بنابراین دو انتهای کروموزوم ها به وسیله آنزیم های ترمیم کننده ‪DNA‬شناسایی‬ ‫می شود و انتهای کروموزوم ممکن است توسط این آنزیمها تجزیه شوند‬ ‫‪ ‬سیگنال های توقف سیکل سلول فرستاده می شود و سلول دیگر قادر به تکثیر‬ ‫نیست و به پیری سلول (‪ (senescence Cell‬یا خودکشی سلول منجر می‬ ‫‪ 23‬شود‪.‬‬ ‫همانندسازی ژنوم میتوکندری‬ ‫ژنوم میتوکندری و کلروپالست به صورت دو رشته حلقوی می باشد‬ ‫که یک رشته ‪ L‬و دیگری ‪H‬نامیده میشود‪.‬‬ ‫‪ ‬ژنوم میتوکندری دارای دو مبدا همانندسازی‬ ‫یکی بر روی رشته ‪L‬و دیگری بر روی رشته ‪H‬می باشد‪.‬‬ ‫‪ ‬برای شروع همانندسازی توسط ‪DNA‬پلی مراز گاما‪،‬‬ ‫ابتدا دو رشته از هم باز شده و از روی مبدا همانندسازی‬ ‫که بر روی رشته ‪H‬قرار دارد همانندسازی شروع می شود‬ ‫‪.‬در این حالت رشته ‪L‬در ناحیه ای به طول ‪ 600-500‬باز‬ ‫از روی رشته سنگین کنار زده می شود و ساختاری‬ ‫به نام حلقه ‪D‬شکل می گیرد‪.‬‬ ‫‪ ‬همانندسازی تا نقطه شروع در رشته ‪L‬ادامه می یابد‬ ‫و در این زمان رشته ‪L‬نیز همانندسازی خود را آغاز می کند‬ ‫( همانندسازی رشته ‪L‬دیرتر و بعد از اینکه دو سوم‬ ‫رشته ‪H‬همانندسازی کرد شروع می شود)‬ ‫‪ ‬پس از پایان همانندسازی رشته ‪H‬دو رشته‬ ‫از هم جدا می شود و همانندسازی رشته ‪L‬ادامه می یابد‪.‬‬ ‫‪24‬‬  ‫هامنندسازی ژنوم کلروپالست‬ ‫‪ ‬در کلروپالست تکثیر در دو جایگاه بر روی دو رشته که حدود ‪kbp 7‬از هم دور‬ ‫هستند شروع می شود و دو تا ‪loop-D‬تشکیل می شود‬ ‫‪loop-D ‬ها به صورت یک جهته به سمت هم حرکت می کنند تا زمانی که چنگال ها‬ ‫از جایگاه شروع ‪D loop -‬بر روی رشته مخالف عبور می کند که در این نقطه تکثیر‬ ‫ناپیوسته شروع می شود و همانندسازی به صورت دو طرفه شروع می شود‬ ‫(‪)Bidirectional, semi- discontinuous replication‬‬ ‫‪ ‬در نهایت چنگال های همانندسازی‬ ‫در نقطه مقابل جایگاه شروع به هم‬ ‫می رسند و دو مولکول ‪DNA‬‬ ‫ایجاد می شود‪.‬‬ ‫‪25‬‬ Thanks 26 ‫همانندسازی در یوکاریوت ها‬ ‫‪27‬‬ 28 ‫ژنوم میتوکندری‬ ‫‪29‬‬