06 Additionele LM 24-25 PDF

06 SELECTIE MODERNE MICROSCOPEN en TECHNIEKEN Multiplex immunokleuringen spinning disk confocale microscoop 2-foton excitatie microscopie total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) Förster reso...

06 SELECTIE MODERNE MICROSCOPEN en TECHNIEKEN Multiplex immunokleuringen spinning disk confocale microscoop 2-foton excitatie microscopie total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) Förster resonance energy transfer (FRET) super-resolutie microscopie:  Structured illumination microscopy (SIM)  Stimulated emission depletion microscopy (STED)  Photoactivated localization microscopy (PALM) lichtveld-microscopie Volume electronenmicroscopie: SBF-SEM & FIB-SEM 1 RNAscope: laten zien hoe deze probes zijn opgebouwd 18 - 25 nucleotiden gaan daar binden Je hebt duo nodig omdat dan het andere deel gaat kunnen binden en dan krijg je veel fluorochromen die daar aanwezig zijn. 1  Mouten: afdekken met dekglaasje Mounten van een kleuring Redenen om te mounten: Op plaats houden van te bekijken material Uitdrogen voorkomen Gebruik van juiste refractieve index Voorkomen van fading (fluorochroom opgebruikt) Langer bewaren Einde practicum, gaan we gelukte DAB-kleuringen mounten mbv ander mounting medium http://www1.biologie.uni-hamburg.de 2 What are mounting media (website thermofisher) Mounting medium is the medium that your sample is in while it is being imaged on the microscope. The simplest type of mounting medium is air, or a saline-based buffered solution, such as PBS. Because most people use the term mounting medium when referring to fixed-cell imaging performed with immunofluorescence labeling, during live- cell imaging, the term imaging medium is more often used to refer to the medium that samples are in while they are being imaged. There are several reasons to place your fixed-cell sample in a mounting medium while you image: To help hold a specimen in place while you are imaging To prevent your sample from drying out To more closely match the refractive index for the objective you will use To prevent photobleaching To preserve your sample over time for long-term storage The choice of mounting medium is largely dependent on your sample type, how you will image, and which fluorophore or fluorescent proteins you use. There is a wide variety of mounting media to choose from, whether you buy commercially available versions or want to “brew” your own, and they can differ widely in composition. Some are based on organic solvents such as toluene or xylene, others are water-based or aqueous mounting media. 2 Multiplex immunokleuringen 3 3  Glass et al, 2009 4 Figure 3 Simultaneous visualization of five antigens in mouse cerebellum. (A) Adult mouse brain was counterstained with hemotoxylin, then sequentially probed with polyclonal antibodies to calbindin, S100-b, and GFAP, and monoclonal antibodies to MAP2 (AP18) and neurofilament (NF-M) 2H3. (B) The images were individually pseudocolored and overlaid. (C) The small boxed area in the left panel is shown magnified at right. The resultant image reveals the morphology of different cell types and fine details of interactions of Purkinje cells, Bergmann glia, astrocytes, and basket cell terminals that would not be obvious with single or dual labeling. Bar 5 50 mm. 4  kleuren, wegwassen, kleuren, wegwassen -> deze beelden op elkaar leggen Antibody elution in acidified permanganate stripped of AEC precipitate in ethanol Glass et al, 2009 5 Figure 1 SIMPLE strategy. Formalin-fixed, paraffin-embedded sections are dewaxed, rehydrated, and counterstained before initial probing. Tissue is imaged and then subjected to antigen retrieval, removing the counterstain. Each staining round is conducted using standard immunohistochemical protocols with the alcohol-soluble red peroxidase substrate 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC). After each round of staining, the tissue is imaged and then stripped of AEC precipitate in ethanol. Antibody is then eluted in acidified permanganate, and the tissue is subjected to the next round of staining. 5 verschillende strippingtechnieken getest zorgen dat weefsel en eiwitten niet beschadigd geraken 6 Figure 6: Multi-round immunofluorescence from three rounds of staining, separated each by a BME elution. Each round included an anti-Ms and anti-Rb primary antibody and a stripping control. Round 1 also included NeuN (yellow) developed with AF647. Each round was coverslipped with Hoechst33342 (blue). In panels A-G, NeuN is yellow and Hoechst33342 is blue. In green, panel A has CP13, B has MC1, C has TMEM119, D has T18, E has PHF-1, and F has GFAP. In panel G, blue is Hoechst33342, green is GFAP, pink is TMEM119, yellow is NeuN, red is MC1, gray is T18, cyan is PHF-1, and CP13 is orange. Because of the high overlap between tau inclusions, CP13, MC1, T18, and PHF-1 cannot be distinguished in the composite and appear as white.. Scale bar: 10 μm 6  Informatie uit hoofdstuk 4 (Culturing and Visualizing Cells) Molecular Cell Biology, Lodish et al, 8ste druk (2016) 4.2 Light Microscopy: Exploring Cell Structure and Visualizing Proteins Within Cells Light microscopy (LM) resolution is limited by light wavelength; new super-resolution microscopy approaches increase effective resolution. LM of cells is enhanced by exploiting differences in refractive index, staining, or fluorescent labeling specific components with dyes or fused fluorescent proteins. Deconvolution, confocal, and TIRF microscopy greatly improve fluorescent image clarity by removing out-of-focus light. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and Förster resonance energy transfer (FRET) reveal molecular mobility and interaction dynamics. Relevante figuren in deze PPT en de bijbehorende tekst in aparte PDF-file (blz 147-156 ingescand) 7 7  basis vd verschillende microscopen kennen De basisopstelling van verschillende lichtmicroscopen FIGURE 4-9 Optical microscopes are commonly configured for bright-field, phase- 8 contrast, or fluorescence microscopy. a) (bottom right) In a typical compound light microscope, the specimen is usually mounted on a transparent glass slide and positioned on the movable specimen stage, and several lenses magnify the image of a specimen. The total magnification (1000x) is a product of the magnification of the individual lenses: the objective lens (100x max) closest to the specimen and the projection lens (usually 10x) that focuses the image on a camera or ocular (eyepiece). b) In bright-field light microscopy, light from a tungsten lamp is focused on the specimen (usually stained with dyes to enhance contrast) by a condenser lens below the stage. c) In phase-contrast (and differential-interference; DIC) microscopy , which increases contrast of biological specimens, incident light passing through an annular diaphragm focuses a circular annulus (ring) of light on the specimen. Light passing unobstructed through the specimen is focused by the objective lens onto the thicker gray ring of the phase plate, which absorbs some of the direct light and alters its phase by one-quarter of a wavelength. If a specimen refracts (bends) or diffracts the light because of the refractive index of the material, the phase of some light waves is altered (green lines), and the light waves pass through the clear region of the phase plate. The refracted and unrefracted light is recombined at the image plane to form the image. d) In fluorescence microscopy, a beam of light from a mercury lamp (gray lines) is directed to the excitation filter, which allows only the correct wavelength of light to pass through (green lines). The light is then reflected off a dichroic mirror and through the objective lens, which focuses it on the specimen. The fluorescent light emitted by the specimen (red lines) passes up through the objective lens, then through the dichroic mirror, and is focused and recorded on the detector at the image plane. 8 Labelen van eiwitten en/of onderdelen van de cel dmv fluorescentie 9 EXPERIMENTAL FIGURE 4-15b Double-label fluorescence microscopy can visualize the relative distributions of two proteins. Upper panels show the fluorescein-stained tubulin (left) and Rhodamine-stained actin (right), and the lower panel shows the electronically merged images. begrijpen wat fluorescentie is en hoe we tot deze dubbelkleuringen kunnen komen 9  Confocale microscopen 1 laser dat over dat beeld gaat in 1 keer heel dat veld overzien kost tijd 20.0000 punten, snelle analyse, 1 punt, traag dynamische processen 10 FIGURE 4-18 Light paths for two types of confocal microscopy. Confocal microscopy uses optical methods to obtain fluorescence images from a specific focal plane and exclude light from other planes. a. The point-scanning confocal microscope light path of a single-wavelength point of light from an appropriate laser reflects off a dichroic mirror and bounces off two scanning mirrors and passes through the objective lens to illuminate a spot in the specimen. The scanning mirrors rock back and forth in such a way that the light scans the specimen in a raster fashion (see green lines in the specimen). The fluorescence emitted by the specimen passes back through the objective lens and bounces off the scanning mirrors onto the dichroic mirror passing through a pinhole, which excludes light from out-of-focus focal planes. b. The spinning disk confocal microscope light path from the laser is spread to illuminate pinholes on the coupled spinning disks, the first consisting of microlenses to focus the light on pinholes in the second disk. The excitation light passes through the objective lens to provide point illumination of a number of spots in the specimen. The fluorescence emitted passes back through the objective lens and through the holes in the spinning disk, and is then bounced off a dichroic mirror into a sensitive digital camera. The pinholes in the disk are arranged so that as it spins, it rapidly illuminates all parts of the specimen several times. As the disk spins as fast as 3000 rpm, very dynamic events in live cells can be recorded. 10  Confocale microscopen: signaal vanuit 1 vlak 11 FIGURE 4-19 Confocal microscopy produces an in-focus optical section through thick cells. a) A conventional fluorescence microscope image of the mitotic spindle from a fertilized sea urchin (Psammechinus) egg that was labeled indirectly with a tubulin antibody and a fluorescein-tagged secondary antibody is blurred, because of background fluorescence from tubulin above and below the focal plane. b) The confocal microscopic image is sharp, particularly in the center of the mitotic spindle, because fluorescence is detected only from molecules in the focal plane, generating a very thin optical section. 11  Spinning disk confocale microscoop: dynamische microtubuli 12 EXPERIMENTAL FIGURE 4-20 The dynamics of microtubules can be imaged on the spinning disk confocal microscope. Spinning disk confocal microscopy reveals dynamics (in six frames from a movie) of microtubules in two rod-shaped cells of fission yeast expressing GFP-tubulin. 12  niet 1 lichtstraal maar verschillende lichtstralen worden Uitleg techniek (studenten pres) gevormd Spinning disk confocale microscopie Verbeteringen tegenover de klassieke confocale microscoop Werking Variatie in het bekomen beeld Voordelen tegenover andere microscopen Snelheid 3D structuur bekijken over een langere periode Via: https://www.photometrics.com/learn/spinning- disk-confocal-microscopy/what-is-spinning-disk- 13 confocal-microscopy In het artikel wordt gebruik gemaakt van een spinning disk confocale microscoop (SDCM). De SDCM is net als de confocale laser scanning microscoop (CLSM) een confocale microscoop. De SDCM biedt tal van voordelen tegenover de ‘standaard’ confocale microscoop. Het is namelijk zo dat 3D structuren heel snel geanalyseerd kunnen worden. Waar bij de klassieke confocale microscoop gebruik wordt gemaakt van 1 pinhole per keer, worden er bij de SDCM verschillende pinholes per keer gebruikt. De SDCM fotobleached de cellen in veel mindere mate en; de analyse van een 3D structuur gaat vele malen sneller. Er zijn in 2 disks aanwezig, 1 die de pinholes bevat en 1 die als microlens dient. De eerste disk bevat honderden pinholes die geschikt liggen in Archimediale ringen. Deze disk draait snel rond. De pinholes hebben een specifieke diameter D, deze diameter dient nauwkeurig te worden bepaald. Bij een te kleine diameter wordt er licht verspild, bij een te grote diameter is er slechts geringe diffractie. De tweede disk verhoogt de transmissie van het doorgelaten licht. Deze disk is een microlens, het licht dat al door de eerste disk ging, zal door de tweede disk gefocusseerd worden. De eigenlijke detectie gebeurt via een ingebouwde CCD-camera, wat veel hogere resolutie oplevert dan de fotomultiplier buizen. Geavanceerde software zorgt voor het samenbrengen van de verschillende lagen, waardoor de 3D structuur gereconstrueerd kan worden op een computerscherm. Het beeld kan gevarieerd worden door de diameter, afstand tussen de pinholes en de rotatiesnelheid van de disk te variëren. De grootste voordelen van deze detectiemethode zijn de snelheid waarmee een beeld kan genomen worden en de mogelijkheid om 3D structuren over een langere periode te kunnen waarnemen. 13  exciteren met gepulseerd licht 2 pulsen van licht van golflenhgte van 960 meten 2-foton microscopie, analyse dikker (levend) materiaal Gebruik 2 fotons met halve energie (960 nm ipv 488 nm) 2 fotons die op 1 plaats moeten toekomen: no out-of-focus, minder photobleaching 14 minder phototoxicity licht komt maar op 1 punt toe, je kan met je licht dieper geraken FIGURE 4-21a Two-photon excitation microscopy restricts illumination to the focal plane to allow deep penetration for intravital imaging. Two-photon excitation microscopy minimizes damage by intense laser light in thicker samples by exciting fluorochromes with two photons with half the energy of a single excitation photon. a) Comparison of point-scanning and two-photon microscopy illumination: Conventional point-scanning confocal microscopy: absorption of a single photon of appropriate wavelength (e.g., 488 nm) excites an electron jump to the excited state. Vibrational relaxation to ground state emits one photon at a longer (lower-energy, 507 nm) wavelength. Two-photon excitation: two photons of the lower-energy wavelength (e.g., 960 nm) arriving almost instantaneously are both absorbed and induce the electron to jump to the excited state. Vibrational relaxation (black dashed arrow) back to the ground state emits a photon (507 nm), as in conventional point-scanning confocal microscopy. 14  2-foton microscopie, analyse dikker (levend) materiaal 15 FIGURE 4-21b Two-photon excitation microscopy restricts illumination to the focal plane to allow deep penetration for intravital imaging. b) Cuvettes of fluorescent material illuminated with 488-nm light (left), as in conventional confocal microscopy, or with intense 960-nm light, as in two-photon microscopy. Conventional single photon illumination produces a bright cone of excitation outside the focal plane, whereas two-photon excitation illuminates just one spot in the focal plane. 15  2-foton microscopie, analyse dikker (levend) materiaal 1 mm diep, muis moet wel stil liggen 16 FIGURE 4-21c Two-photon excitation microscopy restricts illumination to the focal plane to allow deep penetration for intravital imaging. c) Two-photon microscopy can be used to observe cells up to 1 mm deep within a living animal (“intravital imaging”) because it does not excite fluorochromes outside the plane of focus. 16  2-foton microscopie, analyse dikker (levend) materiaal 17 FIGURE 4-21d Two-photon excitation microscopy restricts illumination to the focal plane to allow deep penetration for intravital imaging. d) Intravital imaging of labeled neurons in a lobster. 17  licht komt van overal en heel de coupe/ cel is volledig belicht Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy: excitatie van een dun laagje in het preparaat Een nauwe, zeer schuin aankomende band van licht enkel bij cellen tegen kopstuk aan Mattheyses et al, 2010 18 EXPERIMENTAL FIGURE 4-22a Fluorescent samples in a restricted focal plane can be imaged by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. TIRF microscopy is best for fluorescence imaging in a thin focal plane adjacent to a surface. a) TIRF microscopy: only about 50–100 nm of the specimen adjacent to the coverslip is illuminated by directing light at an angle at which most is reflected from the glass-water interface of the coverslip rather than passing through it, but it also generates a very small region of illumination called the evanescent wave. 18 TIRF: excitatie van een dun laagje in het preparaat enkel ondergrond heel de cel groen, MT dicht bij coverslip 19 EXPERIMENTAL FIGURE 4-22b Fluorescent samples in a restricted focal plane can be imaged by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. b) Tubulin antibody immunofluorescence showed microtubules visualized by conventional fluorescence (top, Epi) and TIRF (middle) microscopies. The TIRF-EPI image (bottom) was created by merging false-colored EPI (red) and TIRF (green) images to highlight microtubules that are close to the coverslip (green). 19  Fluorescence recovery after photobleaching FRAP: analyse van dynamiek materiaal photobleachen (weg doen) en dan kijken hoe snel het terugkomt 20 EXPERIMENTAL FIGURE 4-23 Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) reveals the dynamics of molecules. Monitoring recovery of fluorescence signal by molecular diffusion into and out of an area or structure after photobleaching reveals molecular dynamics in living cell. a) FRAP: Irreversibly bleaching the GFP fluorochrome on GFP-proteins on the region of interest (ROI) with a short burst of strong laser light decreases intensity of the fluorescence signal, which is fully or partially restored over time as unbleached GFP-proteins move into the ROI (and bleached GFP- proteins move out). b) and c) FRAP of cells expressing either GFP-EBP50 or ezrin-GFP revealed the fluorescence of GFP-EBP50 returns very fast to the bleached ROI (green box), indicating a fast exchange rate, whereas the fluorescence of ezrin-GFP returns more slowly, indicating a slower exchange rate. 20 Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) is een techniek die wordt gebruikt om de mobiliteit van eiwitten binnen levende cellen te visualiseren aan de hand van een microscoop. Fluorescente moleculen in de region of interest (ROI) worden gebleached aan de hand van een high intensity laser (hierdoor daalt de fluorescentie op deze plaats, dit is als een donkere vlek waarneembaar op het scherm). Als de fluorescente moleculen mobiel zijn, worden de gebleekte moleculen binnen ROI gewisseld voor fluorescerende moleculen die er dicht bij liggen en verandert de fluorescentie intensiteit in de ROI. Aan de hand van een herstelcurve van de fluorescentie-intensiteit in de ROI kan de fractie aan mobiele moleculen en halfwaarde tijd van hun herstel gevisualiseerd worden. Hiermee is het mogelijk om metingen van proteïne diffusie en bindingsdissociatie ratio’s van elk deel van de cel te bekijken. Meestal worden confocale microscopen gebruikt. De confocale microscoop wordt meestal gebruikt in combinatie met fluorescentie- optica. Hierbij wordt één punt op een bepaalde diepte in het monster belicht en is er een zeer heldere lichtbron nodig. Dit is de reden waarom het aan een laser wordt gekoppeld. Er is een zeer smalle opening bij de detector zodat enkel de stralen die samen komen in het op voorhand gemonteerde brandpunt kunnen gedetecteerd worden. Het is mogelijk om met deze microscoop een 3D beeld te verkrijgen door elk punt in het gekozen brandvlak te scannen en vervolgens meerdere brandvlakken af te tasten. https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/fluorescence-recovery-after- photobleaching https://www.jove.com/t/57643/micromanipulation-technieken-waardoor-analyse-van- morfogenetische?frbrVersion=3&language=Dutch https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6170817/ 21  Rac bindt aan zijn partner, actief aan voorzijde fibroblast Förster resonance energy transfer FRET: voor het meten van afstanden 22 FIGURE 4-24 Protein-protein interactions can be visualized by FRET. Energy is transferred between different fluorochromes on different proteins by Förster resonance energy transfer (FRET) if/when the proteins interact. Excitation (433 nm) of the cyan fluorescent protein (CFP) fused to protein X emits 475 nm light, which can excite the fluorescent protein (YFP) fused to protein Y to emit 530 nm light (instead of 475 nm light), if the protein interaction brings the CFP and YFP close enough together. b) FRET reveals interaction (yellow-orange) between an active regulatory protein (Rac) and its binding partner at the front of a migrating mouse fibroblast cell. 22  FRET: Als biosensor protein kinase A 23 zien of eiwit gefosforyleerd is of niet EXPERIMENTAL FIGURE 4-25 FRET biosensors can detect local biochemical environments. FRET can reveal a conformational change in a protein responding to a biochemical signal. a) FRET biosensor: CFP and YFP fluorescent proteins that are linked in the same fusion protein by a region that responds to a signal by changing conformation are too far apart for energy transfer until the linking region ligand domain responds to a signal (phosphorylation by a kinase) by changing conformation and binding to the sensor domain. This brings the CFP and YFP close enough together for energy transfer. The biosensor signal reflects the ratio of kinase to phosphatase activity in the local environment. b) FRET biosensing of protein kinase A activity activated by elevation of cAMP was added to cells at t = 0. Images collected at various times after addition of forskolin, a drug that induces the generation of cAMP and its activation of PKA, shows both the localization of active PKA and its rate of activation. 23 FRET: Als biosensor (andere opstelling en weergave) Activatie van een G-eiwit start direct na de binding van een ligand aan zijn receptor. Hier dissociatie van het complex, energie transfer kan niet meer gebeuren, emissie van het gele licht daalt. 24 24  hoge resolutie verkrijgen Resolutie fluorescentie microscopie: 200 nm Patroon aanbrengen in excitatielicht: SIM: 100 nm je licht komt in streepjes op je materiaal terecht STED: 30 nm -> streepjespatroon draaien 25 EXPERIMENTAL FIGURE 4-26a Super-resolution microscopy can generate light- microscope images with up-to-nanometer resolution. New approaches to super-resolution microscopy circumvent the light microscope theoretical limit of resolution (ability to distinguish two close objects). a) Structured illumination microscopy (SIM): the sample is illuminated by a pattern of light and dark stripes and several images are taken as the illumination is rotated, generating interference patterns that can be mathematically reconstructed to generate a higher-resolution image. The images on the right show the similar fields of the nucleus (lamin, green; DNA, magenta) imaged by conventional point-scanning confocal microscopy and by SIM, which improves resolution about twofold. 25 Uitleg techniek (studenten) Moiré patroon Verschillende afstand van lijnen lijnen onder kleine hoek 26 Structured illumination microscopy (SIM) wordt gebruikt om de ruimtelijke resolutie te verbeteren bij zeer kleine objecten en fluorescente monsters. We sturen licht (afkomstig van een laser) door een gegraveerde glasplaat waardoor er gestreepte belichting ontstaat. Deze belichting is nodig want indien de verlichting homogeen zou zijn (zonder gestreept patroon) kan het objectief 2 objecten niet onderscheiden die op kleine afstand van elkaar staan. Deze belichting (high frequency structured illumination) valt op de structuur in het monster waardoor een moiré patroon onstaat. (= interferentiepatroon dat ontstaat als twee sets met lijnen over elkaar heen gelegd worden onder een iets verschillende hoek, of als zij een iets verschillende lijnafstand hebben.) Combinatie tussen hoge frequentie organisatie van het object binnenin het monster en hoge frequentie van de verlichtingsstrepen, creëert een laag frequentie patroon. Door meerdere afbeeldingen te maken (15 verschillende beelden, samengesteld uit 3 hoeken en 5 verschillende fasen) met het gestreepte patroon over elkaar heen in verschillende posities, is het mogelijk om onscherp licht te verwijderen en door berekening toegang te krijgen tot informatie met een hogere resolutie in het monster. Er zijn dus computers nodig die de afbeelding reconstrueren en alle informatie die aanwezig is extraheren en ontcijferen. 26  nog betere resolutie gebruik van 2 lasers wegbleachen met depletion beam enkel binnenste signaal krijg je te zien Resolutie fluorescentie microscopie: 200 nm Patroon aanbrengen in excitatielicht: SIM: 100 nm STED: 30 nm 27 EXPERIMENTAL FIGURE 4-26b Super-resolution microscopy can generate light- microscope images with up-to-nanometer resolution. b) Stimulated emission depletion microscopy (STED): the sample is scanned as in point-scanning microscopy with a very small point of light generated by an emission laser and confined by a donut-shaped stimulated emission depletion zone. The sample at the right shows part of a cell stained for actin fibers after imaging by point-scanning microscopy and by STED. 27  (nobelprijs 2018) met curve: dit is hoogtepunt, signaal zit daar Resolutie fluorescentie microscopie: 200 nm Single molecule detective PALM: 75nm 28 EXPERIMENTAL FIGURE 4-26c Super-resolution microscopy can generate light- microscope images with up-to-nanometer resolution. c) Photoactivated localization microscopy (PALM): A variant of GFP that can be photoactivated by a wavelength different from its excitation wavelength. When a small number of GFP molecules are first activated and then excited, each will emit thousands of photons that can be collected as a Gaussian curve centered on the location of the emitting GFP; the center provides the location of the GFP to nanometer accuracy. Reiteration hundreds of times to excite other GFP molecules generates a high-resolution image. At the right, a confocal image of microtubules is compared with a corresponding super- resolution image in which the three-dimensional arrangement of the microtubules is color coded. 28  Licht veld microscopie: bekijken van dikkere samples 29 FIGURE 4-27a Light-sheet microscopy can image rapid events in living tissue. Light-sheet microscopy: a tissue sample is illuminated from the side by a focused laser beam that scans the sample to generate a sheet of light, which is observed orthogonally though the detection objective. Moving the illuminating and detection objectives coordinately throughout the depth of the sample generates a 3D image. live-cell lattice light-sheet microscopy: levende-cel rooster-lichtvelmicroscopie 29  30 https://imb.uq.edu.au/facilities/microscopy/2020-microscopy-resources/image-capture/single-plane-illumination-techniques-light-sheet-microscopy 30  31 FIGURE 4-27b Light-sheet microscopy can image rapid events in living tissue. The GCaMP Ca2+ biosensor has the N- and C-termini of GFP separately fused to a spacer polypeptide that inhibits GFP fluorescence. The Ca2+-binding protein calmodulin sensor domain is fused to the GFP N-terminal domain and a calmodulin ligand domain, to which Ca2+-calmodulin binds, is fused to the GFP C-terminal domain. In the presence of Ca2+, calmodulin binds four Ca2+ ions and undergoes a conformational change that allows it to bind the ligand domain, which brings the two parts of GFP into close proximity so that the GFP fluorescence is restored. FIGURE 4-27c Light-sheet microscopy can image rapid events in living tissue. Transient increases in Ca2+ are revealed (false-colored red) in living zebrafish brain cells. 31 Volume elektronenmicroscopie: SBF-SEM & FIB-SEM 32 microtoom zit in microscoop 32 Wanner et al., 2016 33 33 Traction Force Microscopy Uitleg techniek (studenten) (TFM) Hiermee worden krachten gemeten die door cellen worden uitgeoefend op oppervlak waaraan ze worden gehecht Methode: Immunofluorescent gelabeld elastisch substraat : elastomere micronaalden Grootte van de kracht toegepast op de cel-cel contacten berekenen  doorbuigingen micronaalden (Matlab)  Verplaatsing van het zwaartepunt  Kracht berekenen via veerconstante Grootte AJ berekenen: anti-β-catenine immunofluorescentiebeelden  Laterale verplaatsing van de naalden  Beelden vergelijken van substraat met uitgevoerde kracht en zonder Micronaalden = blauw door kleuring met DiI Celnuclei = rood door kleuring met DAPI Adherens junctions= groen door kleuring anti-β-catenin 34 TFM ,traction force microscopy, meet de trekkrachten die gegenereerd worden door adherente cellen tijdens fysiologische processen. Deze krachten worden niet direct gemeten op de cellen, maar via de vervorming van elastische substraten zoals micropillar array deflection. Hierbij worden endotheelcellen op immunofluorescent gelabelde micronaalden geplaatst en worden de krachten op de cellen berekend via de kracht van de cellen op de naalden. De doorbuigingen van micronaalden worden berekend met behulp van Matlab (technische software) om de verplaatsing van het zwaartepunt van de micronaaldpunt te bepalen. Krachten werden vervolgens berekend via de veerconstante van de micronaald. De AJ-grootte wordt gekwantificeerd op basis van anti-β-catenine-fluorescentiebeelden. De laterale verplaatsing (afbuiging) van de naalden op deze beelden worden vergeleken met fluorescentiebeelden wanneer de cel geen kracht uitoefent op de naalden. De gemiddelde pixelintensiteit van kleuring werd gemeten om te bevestigen dat toenames in het AJ-gebied niet ten koste gingen van de intensiteit van kleuring. Dit kan gevisualiseerd worden op de figuur aanwezig op deze dia. Blauw geeft de micronaalden weer, rode kleur verwijst naar de celnuclei en de groene kleur verwijst naar de AJs. opname maken van cellen en micronaalden 34 Traction Force Microscopy (TFM) Lekka et al, micron 2021 35 Fig. 1. (A&B) An illustration of traction forces in 2D (A) and 3D (B) environments for single cells and multicellular systems. C) The idea of traction force microscopy (TFM). A cell is cultured on an elastic substrate (typically polyacrylamide gel) with embedded fluorescent beads. The cell generates traction forces that deform it (D). Generated traction forces (arrows) within the focal adhesions (FA) are transmitted to integrins causing the bead displacement. An optical microscope records the displacement of the beads at the focal plane. The deformation is measured as a displacement of fluorescent beads embedded in the gel. Taking the bead images with (E) and without the cell (F), a displacement map can be calculated by comparing the positions of the beads (G*H) (E-F images were reprinted under creative commons license from Li et al. Sensors 10 (2010) 9948). Małgorzata Lekka, Kajangi Gnanachandran, Andrzej Kubiak, Tomasz Zieliński, Joanna Zemła, Traction force microscopy – Measuring the forces exerted by cells, Micron, Volume 150, 2021, 35 Rondleiding, on campus, dinsdag 10 december namiddag, inschrijven Ufora TEM, Ledeganck Confocale, farmacie Infinity Microteaching, 12 december 36 36 Microteaching, 12 december Donderdag 12 december dienen jullie een wetenschappelijk artikel in 50 minuten uit te leggen, hierna krijgen jullie 15 min vragen. Jullie publiek zijn mensen die de kennis hebben van een beginnende 2de bach student biomedische wetenschappen. Artikel komt in groepskluis In de inhaalweek maak ik alle PPTs en artikels beschikbaar voor alle studenten. Best bekijken voor examen, mooie voorbeelden & extra uitleg. 37 37