Biologia Celular Past Paper 2006/2007 - FFUP

2006/2007 1º ANO 1º SEMESTRE BIOLOGIA CELULAR Jorge Paulos  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 Capítulo 1 - A evolução da célula 1. Do Procarionte ao Eucario...

2006/2007 1º ANO 1º SEMESTRE BIOLOGIA CELULAR Jorge Paulos  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 Capítulo 1 - A evolução da célula 1. Do Procarionte ao Eucarionte A identidade celular foi conseguida a partir do momento em que a primeira célula ganha uma membrana plasmática, com funções de protecção e regulação da entrada e saída de substâncias da célula. Isto fez com que o meio intracelular fosse diferente do meio externo, do ponto de vista fisico-químico. Porém, o grande avanço adaptativo sofrido pelas células foi a formação de vesículas, compartimentos e retículos originados da membrana primordial. Com isto, nasce a célula eucariótica, com o seu sistema de endomemranas. Este sistema possibilitou: Maior crescimento celular; Maior especialização, divisão de tarefas entre componentes celulares e eficiência metabólica; Maior protecção do material hereditário; Maior diversidade de rotas metabólicas; Facilidade no contacto e na aglomeração intermolecular. As células procarióticas são muito diferentes das eucarióticas. A sua principal característica é, então, a ausência de membrana celular, individualizando assim, o núcleo. Para além disso, não têm alguns organelos, o que lhes confere um tamanho bastante reduzido. O DNA que possuem encontra-se na forma de um anel não-associado a proteínas. Eubactérias – verdadeiras bactérias Arqueobactérias – células primitivas, geralmente anaeróbias, que vivem nos ambientes mais inóspitos. As células eucarióticas são mais complexas que as procarióticas. Possuem membrana nuclear individualizada e vários tipos de organelos. A maioria dos animais e plantas a que estamos habituados estão dotados deste tipo de células. Fungos Células animais Protozoários Células vegetais 2 Capítulo 1 - A evolução da célula |  Procariontes Eucariontes Organismos Bactérias, Cianobactérias Protistas, Fungos, Plantas, Animais Medida 10 μm 10 - 100 nm Metabolismo Anaeróbio, Aeróbio Aeróbio Núcleo, Complexo de Golgi, Organelas Ausentes Mitocôndria, Retículo Endoplasmático, etc. RNA sintetizado no núcleo; RNA e Ambos sintetizados no mesmo local Proteínas sintetizadas no proteínas citoplasma Ribossomas Tipo 70S Tipo 80S Não tem citosqueleto: correntes Tem citosqueleto: correntes Citoplasma citoplasmáticas, exocitose e citoplasmáticas, exocitose e endocitose ausentes endocitose presentes Organização Principalmente unicelular Principalmente multicelular Necessitam de uma fonte de C e de Requerem uma grande quantidade Fontes N de compostos e alguns iões 2. Do RNA ao DNA No processo de evolução celular, atravessaram-se as seguintes fases: RNA capaz de dirigir a sua auto-replicação; RNA capaz de intervir na síntese de proteínas (ribossomas); Aparecimento da membrana celular; Aparecimento do DNA como molécula mais estável do que o RNA, e com capacidade para dirigir a sua própria replicação (replicação semi-conservativa). O DNA é mais estável do que o RNA porque: Tem um a desoxirribose em vez de um a ribose.A ribose tem um grupo O H no carbono 2’que pode sofrer hidrólise; O DNA é constituído por 2 cadeias anti-paralelas, sendo mais difícil ocorrerem mutações; O DNA possui a base timina, em vez do uracilo. Este último é mais instável pois pode sofrer metilação; O DNA possui um mecanismo de auto-reparação de erros. Assim, o RNA foi progressivamente substituído pelo DNA, que ganhou uma importância vital para os organismos vivos.  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 3. Aparecimento de novos genes Mutação Intragénica Duplicação Génica Troca de segmentos de DNA entre dois genes Mutação Horizontal Genes Ortólogos – genes considerados homólogos que apresentam a mesma função em organismos diferentes mas provenientes do mesmo organismo progenitor (genes alterados dentro de linhagens específicas, após diferenciação). Genes Parálogos – genes considerados homólogos, presentes num mesmo organismo , que não apresentam a mesma função. Assim, estes genes são duplicados dentro de uma mesma linhagem, não importando se têm a mesma função ou não. 4 Capítulo 1 - A evolução da célula |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 Genes Homólogos – são genes que apesar de pertencerem a diferentes organismos, são estruturalmente semelhantes e cumprem funções idênticas. 4. Alterações celulares em células animais Necrose – todo o conteúdo intracelular é expulso para o exterior, sendo associada a vários tipos de células simultaneamente. A necrose abrange alterações regressivas reversíveis que, em algum ponto e por algum estímulo descohecido, passam a ser irreversíveis. Instalada a irreversibilidade e a necrose propriamente dita, inicia-se um processo de desintegração celular (autólise). | Capítulo 1 - A evolução da célula 5  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 Apoptose – também designada por morte celular programada é um tipo de auto-destruição celular que requer energia e síntese proteica para a sua execução. Está relacionada com a homeostase na regulação fisiológica do tamanho dos tecidos, exercendo um papel oposto ao da mitose. Portanto consiste numa morte desejável e necessária que participa na formação dos órgãos. Autofagia – neste processo, a célula elimina organelos envelhecidos através da formação de autofagossomas. O objectivo deste processo é converter os componentes da célula em alimento para prolongar a sobrevivência do organismo. Morte autofágica – induzida em algumas células, é considerada uma morte celular programada e associada a células isoladas. 5. Organização molecular 6 Capítulo 1 - A evolução da célula |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas 1. Aminoácidos Um aminoácido é qualquer molécula que contém simultaneamente grupos funcionais amina e ácido carboxílico. Um aminoácido é constituído por: Carbono α Grupo amina Grupo carboxilo Átomo de hidrogénio Cadeia lateral radical que influencia: O ponto isoeléctrico do aminoácido; O próprio aminoácido (porque varia de aminoácido para aminoácido); O tipo de aminoácido formado quanto à polaridade, porque existem aminoácidos apolares, polares neutros ou polares com carga. Os aminoácidos apresentam um determinado estado de ionização que se encontra dependente do pH do meio. Assim, podem existir na forma ionizada – ião dipolar ou zwiterião – que para um determinado valor de pH, tantas cargas positivas como negativas. Este valor é designado por ponto isoeléctrico. Quando o pH do meio é básico (pH do meio superior ao ponto isoeléctrico), o aminoácido comporta-se como um ácido, ficando carregado negativamente, por perda de protões. Quando o pH do meio é ácido (pH do meio inferior ao ponto isoeléctrico), o aminoácido comporta-se como uma base, ficando carregado positivamente, por ganho de protões. Aminoácidos essenciais – são aqueles que não existem no nosso organismo, tendo portanto que ser obtidos através da alimentação. São todos da forma L, excepto os que são da forma D (alguns antibióticos e nas paredes das bactérias). | Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas 7  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 2. Hidratos de carbono Os hidratos de carbono (ou glícidos) são substâncias sintetizadas pelos organismos vivos. Têm função energética e estrutural pois participam da arquitectura corporal dos seres vivos. Para além disso, também têm função anticoagulante, lubrificante e participam na sinalização celular. A fórmula geral da estrutura dos hidratos de carbono é (CH2O)n, sendo que cada um deles possui na sua estrutura: Grupo aldeído (CHO) – aldose Grupo cetona (C = O) – cetose Os hidratos de carbono podem dividir-se em: monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos. Os monossacarídeos ou açúcares simples constituem as moléculas dos carboidratos, as quais são relativamente pequenas, insolúveis em água e não hidrolisáveis. Em geral, obedecem à fórmula básica dos hidratos de carbono. Os oligossacarídeos ou açúcares pequenos são constitídos por duas a dez moléculas de monossacarídeos, como os dissacarídeos que têm duas. (Ex.: maltose, lactose e sacarose.) Os polissacarídeos ou açúcares múltiplos são formados pela união de mais de dez moléculas monossacarídeas, constituindo, assim, um polímero de monossacarídeos, geralmente de hexoses. Ao contrário dos anteriores, são insolúveis em água, não alterando assim o equilíbio osmótico das células e prestando-se muito bem às funções de armazenamento e reserva nutritiva. (Ex.: celulose, amido e glicogénio.) 3. Lípidos Os lípidos (ou lípideos) são biomoléculas insolúveis em água, e solúveis em solventes orgânicos, como o álcool, benzina, éter ou clorofórmio. A maioria dos lípidos são moléculas anfipáticas, isto é, possuem uma cabeça que é polar ou hidrofílica, e uma cauda constituída por uma parte apolar ou hidrofóbica, isto é, que repele a água. Assim, de todos os lípidos enunciados acima, apenas os triglicerídeos não são moléculas anfipáticas. 3.1. Ácidos Gordos Os ácidos gordos são ácidos monocarboxílicos de cadeia normal hidrocarbonatada e que possuem um grupo carboxílico (COOH) que permite a ligação a outras moléculas. São armazenados no citosol sob a forma de gotículas de gordura, os triglicerídeos. Ao longo de uma cadeia hidrocarbonatada de um ácido gordo, existe sempre uma ligação dupla que lhe confere uma quebra extremamente importante para as membranas biológicas. 8 Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 3.2. Triglicerídeos (ou Triacilgliceróis) Os triglicerídeos são lípidos formados pela ligação de três moléculas de ácidos gordos com uma de glicerol, através de ligações éster. Normalmente, os ácidos gordos que participam na estrutura de um triglicerídeo são diferentes entre si. Quando necessário, os ácidos gordos são libertados das moléculas de triglicerídeos e quebrados em unidades com dois átomos de carbono. 3.3. Fosfoglicerídeos / Fosfolípidos Os fosfoglicerídeos são lípidos constituídos por uma molécula de glicerol, duas cadeias de ácidos gordos (uma saturada e uma insaturada), um grupo fosfato e uma molécula polar ligada a ele (serina, etanolamina, colina ou inositol). Assim, a sua designação depende da molécula polar presente (Ex.: serina – fosfatidilserina). As suas principais funções são no processo de sinalização celular e na constituição das membranas biológicas  Cada membrana é constituída por uma dupla camada fosfolipídica organizada de modo a que as cabeças hidrofílicas fiquem viradas para o lado exterior da membrana e as caudas hidrofóbicas para o interior. Esta organização permite tornar a membrana selectiva pois só atravessam a membrana por difusão simples as substâncias lipossolúveis. | Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas 9  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 3.4. Esfingolípidos Os esfingolípidos provêm da esfingosina que é um aminoálcool, e cujo grupo amina se pode ligar a um ácido gordo formando a ceramida. Existem dois tipos de esfingolípidos: Esfingofosfolípidos – são as ceramidas que contêm fosfato. Um exemplo é a esfingomielina que é o componente principal da mielina das células nervosas. São constituídos por: Fosfocolina ou Fosfoetanolamina Ceramida Glicolípidos – são as ceramidas que contêm açúcares. Podem ser de dois tipos: Cerebrosídeos – constituídos por ceramida e 1 a 4 moléculas de açúcar Gangliosídeos – constituídos por ceramida e n moléculas de açúcar (contém, para além de outras moléculas, o ácido N-acetilneuramínico). Nos animais, os glicolípidos são derivados da ceramida, enquanto que nas plantas são derivados do glicerol. Assim, nas membranas das células animais: Camada interna – fosfatidilserina e fosfatidiletanolamina Camada externa – fosfatidilcolina e esfingomielina Nota: A fosfatidilserina é uma molécula negativa, sendo importante porque dificulta ou facilita a passagem de determinado tipo de moléculas. 3.5. Glicolípidos / Grupos sanguíneos Antigénios O – Glicose + Galactose + N-Acetilgalactoseamina + Galactose +... Antigénios A – Antigénio O + N-Acetilgalactoseamina Antigénios B – Antigénio O + Galactose 4. Nucleótidos Os nucleótidos são compostos ricos em energia que auxiliam os processos metabólicos na maioria das células. São constituídos por: Uma base azotada (purina / pirimidina) Uma pentose (ribose / desoxirribose) Um ou vários grupos fosfato As principais funções dos nucleótidos são: Transferência de sinais químicos (ex.: CoA) Constituição de ácidos nucleicos 10 Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 Constituição de moléculas que permitem efectuar o armazenamento de energia (ex.: ATP) Controlo das reacções intermoleculares (ex.: AMP cíclico)  Bases azotadas Purinas – Adenina (A) e Guanina (G) Pirimidinas – Uracilo (U), Timina (T) e Citosina (C)  Pentoses β-D-Ribose β-D-Desoxirribose Nota: Nucleótido – base + pentose + fosfato Nucleósido – base + pentose Base Nucleósido Adenina Adenosina (A) Guanina Guanosina (G) Citosina Citidina (C) Timina Timidina (T) Uracilo Uridina (U) 5. Proteínas As proteínas são compostos orgânicos de estrutura complexa, sintetizadas pelos organismos vivos através da condensação de um grande número de moléculas, através de ligações peptídicas. | Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas 11  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007  Ligação peptídica As ligações estabelecidas entre aminoácidos numa determinada proteína denominam-se ligações peptídicas e estabelecem-se entre o grupo carboxilo de um aminoácido e o grupo amina do aminoácido seguinte. Estas ligações podem ser quebradas por enzimas ou através de tratamentos drásticos como a adição de ácidos ou bases fortes a temperaturas elevadas, pelo facto de serem ligações extremamente fortes. Tendo por base o mecanismo de ligação conclui-se que o primeiro aminoácido da cadeia polipeptídica tem o grupo amina livre e o último tem o grupo carboxílico livre.  Composição Quanto à sua composição molecular, as proteínas podem ser classificadas em: Simples – proteínas constituídas unicamente por aminoácidos Conjugadas – proteínas que apresentam a cadeia de aminoácidos ligada a um radical diferente (grupo prostético). Dependendo do grupo prostético, as proteínas podem ser classificadas em: Glicoproteínas – glícido (ex.: mucina) Cromoproteínas – pigmento (ex.: hemoglobina) Fosfoproteínas – ácido fosfórico (ex.: vitelina) Nucleoproteínas – ácido nucleico Lipoproteínas – lípido  Forma Quanto à sua forma, as proteínas podem ser classificadas em: Globulares – presentes no sangue e solúveis em água, com estrutura compacta, o que permite o transporte de lípidos Fibrosas – proteínas estruturais, cuja forma se define segundo um eixo, sendo insolúveis em água (ex.: colagénio) 12 Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007  Estrutura Primária – é dada pela sequência de aminoácidos ao longo da cadeia polipeptídica. É o nível estrutural mais simples e mais importante, por ser dele que deriva todo o arranjo espacial da molécula. Esta estrutura é específica para cada proteína, sendo determinada geneticamente. Como a sua constituição só é definida pela sequência de aminoácidos, a orientação espacial da molécula não tem qualquer relevância. Secundária – é dada pelo arranjo espacial de aminoácidos próximos entre si na sequência primária da proteína. É o último nível de organização das proteínas fibrosas, mais simples estruturalmente. Esta estrutura ocorre graças à possibilidade de rotação das ligações entre os carbonos dos aminoácidos e os seus grupos amina e carboxilo. Existem dois tipos de estrutura secundária: α – define-se entre pequenas zonas da cadeia entre aminoácidos adjacentes. β – estabelecimento de pontes de hidrogénio entre diferentes cadeias peptídicas. Terciária – resulta do enrolamento da proteína no espaço, sendo mantida por pontes de hidrogénio e pontes dissulfito. Basicamente, esta estrutura confere actividade biológica à proteína. Enquanto a estrutura secundária é determinada pelo relacionamento estrutural de curta distância, a terciária é caracterizada pelas interacções de longa distância entre aminoácidos. Os aminoácidos apolares vão dispôr-se essencialmente no interior da molécula, porque têm de existir grupos polares à superfície para permitirem a dissolução em água. A estrutura terciária é, então, determinada e estabilizada por determinados factores como: Interacções hidrofóbicas – tendência dos am inoácidos apolares “fugirem ” da água. Ligações iónicas – forças de atracção entre aminoácidos com radicais carregados com cargas opostas. Forças de van der Waals Pontes de hidrogénio – ligações com tratamentos fracos que podem ser quebradas porque são covalentes. Ligações dissulfito – ligações não covalentes que resultam da oxidação, permitindo que duas cisteínas (aminoácidos não carregados) possam reagir entre si. Quaternária – existente nas moléculas com várias cadeias polipeptídicas. Depende da forma como as várias cadeias se organizam entre si, sendo que as interacções são as mesmas da estrutura terciária.  Desnaturação de proteínas A desnaturação consiste na perda de actividade biológica da proteína devido à quebra das ligações não covalentes e das pontes dissulfureto, que asseguravam a manutenção da sua estrutura terciária e | Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas 13  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 quaternária. No entanto, durante a desnaturação, a estrutura primária da proteína não se altera, ou seja, a sequência linear dos aminoácidos mantém-se constante. Os agentes desnaturantes mais comuns são: Ureia – agente desnaturante que corta as ligações não covalentes (ligações hidrofóbicas). β-mercaptoetanol – agente redutor que corta as pontes dissulfito. Através de um ensaio enzimático, foi concluído que a conformação de uma proteína está na sequência dos aminoácidos, ou seja, se a estrutura primária não for mantida, a proteína não volta a ter actividade. A diálise consiste na remoção dos agentes desnaturantes, permitindo que a proteína volte a adquirir a sua conformação nativa, readquirindo a sua actividade biológica (renaturação). No caso da proteína ser constituída por apenas uma cadeia peptídica, a actividade biológica é restabelecida quando a sua estrutura terciária é a correcta. Caso a proteína seja constituída por mais do que uma cadeia peptídica, ela só volta a adquirir a sua actividade biológica quando se apresenta na correcta estrutura quaternária. Não ocorre renaturação caso os agentes desnaturantes utilizados tenham sido: Enzimas (proteases) Meios de pH muito ácido ou muito básico, quando associados a temperaturas da ordem dos 180ºC. 5.1. Enzimas São específicas Apresentam um local activo para ligação do substrato Podem ou não ter um local alostérico Podem sintetizadas sob a forma de zimogénio Podem ter necessidade de coenzimas Não se consomem nas reacções São a maior e mais específica classe de proteínas Local activo da enzima – local de ligação da enzima ao substrato. Local alostérico – local de ligação da molécula efectora que pode activar ou inibir a enzima. Coenzima – enzima inicialmente inactiva (sintetizada no organismo), e que para se tornar activa tem que sofrer proteólise. Zimogénios – são formas precursoras das enzimas (forma inactiva) que também têm que sofrer proteólise para se tornarem activas. Constante de Michaelis (Km) – valor de concentração de substrato para o qual a velocidade da reacção atinge metade do valor máximo. Se Km for um valor baixo significa que a enzima é muito específica, e que se liga fortemente ao substrato. Se o valor de Km for elevado pode concluir-se que a enzima é pouco específica e que o substrato não se liga muito fortemente à enzima. 14 Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 Quanto mais substrato se adicionar à enzima, maior a velocidade de produção do produto da reacção. Quando a enzima entra em saturação, a velocidade de formação de produtos estabiliza.  Modos de actuação das enzimas Modelo chave-fechadura – o substrato encaixa perfeitamente no local activo da enzima, havendo uma total complementaridade entre ambos. Modelo do encaixe induzido – o substrato e o local activo têm conformações diferentes. O substrato induz uma alteração na conformação do local activo da enzima. Inibição – o centro activo não está apto para ligar-se a nenhum substrato. Se no local alostérico se ligar um efector positivo, induz-se uma alteração da conformação do local activo, que passa a poder ligar-se ao substrato. Se no local alostérico se ligar um efector negativo (inibidor), o local activo não vai permitir que nenhum substrato se ligue. 5.2. Anticorpos Anticorpos policlonais – população total de imunoglobulinas presentes num soro animal. São anticorpos que são sintetizados num animal, mas que reconhecem diferentes partes da proteína antigénica (diferentes determinantes antigénicos ou epítopos). Este tipo de anticorpos reconhecem sempre o antigénio, mesmo que este esteja sob a forma desnaturada. Anticorpos monoclonais – um tipo de imunoglobulinas sintetizadas por um único clone (célula) e que é específica para um único determinante. Epítopos – são sequências de aminoácidos relacionadas com a estrutura primária. Epítopos conformacionais – a proteína quando está no seu estado nativo, vai adquirir uma determinada conformação (estrutura terciária). Estruturas moleculares derivadas de modificações pós-tradução – estas modificações é que podem vir a conferir um reconhecimento aos anticorpos e permitir a activação das proteínas (ex.: glicoproteínas, adição de fosfatos, etc.) Imunogénio – qualquer substância capaz de induzir uma resposta imunitária. Imunoglobulina – proteína complexa, constituída por vários domínios (estrutura quaternária). Possui duas cadeias leves e duas cadeias pesadas, ligadas por pontes dissulfureto. 6. Ácidos nucleicos Os ácidos nucleicos são ácidos orgânicos complexos formados por uma longa cadeia de nucleótidos, presente no núcleo e, por vezes, no citoplasma das células vivas. Os dois tipos, DNA e RNA, constituem a base da hereditariedade. Os nucleótidos, à medida que se vão organizando na cadeia de ácido nucleico constituem o código genético. | Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas 15  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 6.1. Ácido desoxirribonucleico (DNA) Dupla hélice (2 cadeias); Cadeias antiparalelas; Cadeias complementares (numa cadeia temos uma purina e noutra temos uma pirimidina): C ≡ G , A = T; Os nucleótidos ligam-se entre si por ligações fosfodiéster; A estabilidade é devida às ligações entre as bases: ligações de hidrogénio, interacções hidrofóbicas, forças de van der Waals e existência da dupla cadeia. A base azotada liga-se ao carbono 1’da respectiva pentose através de um a ligação glicosídica. A molécula de DNA possui um esqueleto constituído por desoxirribose+fosfato, sendo que as bases azotadas se encontram no seu interior. A síntese de DNA faz-se sempre da extremidade 5’para a 3’da cadeia. Um gene é uma porção de DNA que dá origem a uma molécula de RNA funcional.  Nucleossomas e a fibra de 30 nm A cromatina nos núcleos encontra-se organizada estruturalmente, e a um nível básico, em subunidades com a forma de esferas, com diâmetro de 10 nm, designadas por nucleossomas. Estes são proteínas carregadas positivamente, na medida em que o DNA tem grupos fosfato carregados negativamente. O estudo estrutural detalhado mostra que cada nucleossoma é constituído por um esqueleto central proteico, constituído pelo octâmero de histonas 2x (H2A, H2B, H3 e H4), em torno do qual o DNA se enrola duas vezes, sendo este duplo enrolamento estabilizado por uma outra quinta histona (H1). O comprimento do DNA corresponde a 146 pares de bases nucleotídicas. As histonas são proteínas altamente conservadas, ricas em aminoácidos carregados positivamente. Desta forma, significa que não sofreram quaisquer alterações durante a evolução. 16 Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007  Níveis de compactação da molécula de DNA Os nucleossomas são o primeiro nível de compactação do DNA. O nível seguinte consiste na concentração dos nucleossomas justapostos, com enrolamento helicoidal posterior, formando uma longa fibra de 30 nm. As histonas, com a sua forma alongada, interactuam contribuindo assim para a aproximação dos nucleossomas e para a sua justaposição. Com o prosseguimento do ciclo celular, a fibra de cromatina organiza-se em níveis, sucessivos de complexidade, ainda hoje pouco esclarecidos, até formar o corpo do cromossoma em metafase. Este é constituído, de acordo com a hipótese mais aceite actualmente, por uma única fibra de cromatina, composta por uma longa molécula de DNA, que percorre cada cromatídeo de um extremo ao outro.  Cromossomas Um cromossoma é uma molécula de DNA associada a proteínas histónicas e não histónicas. É constituído por dois cromatídeos ligados pelo centrómero que se caracteriza por ser uma zona altamente compacta. Para que um cromossoma seja funcional, tem de possuir: Origem de replicação – local onde se inicia a replicação do DNA; Centrómero – região especializada e complexa dos cromossomas que apresenta poucos ou nenhuns genes. É o ponto de união dos cromatídeos irmãos e contém uma estrutura (o cinetocoro) a que as fibras do fuso se ligam durante a mitose e a meiose, pelo que tem um papel importante no movimento dos cromossomas em direcção aos pólos; | Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas 17  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 Telómero – sequências de DNA existentes nas zonas terminais dos cromossomas, que impedem um encurtamento de DNA pela acção de uma enzima específica. O telómero pode ter o comprimento de algumas centenas de pares de bases e participa na estabilidade e na replicação do cromossoma. Um crom ossom a norm alpossuidois telóm eros. A enzim a que “protege” os telóm eros designa-se telomerase, que já não está presente na maioria das células adultas. Nas células embrionárias, existe sempre a telomerase, na medida em que estão em constante desenvolvimento. O genoma humano contém 23 pares de cromossomas, logo existem 46 moléculas de DNA.  Cariótipo O cariótipo é o conjunto dos cromossomas duma célula eucariótica, normalmente definido em termos do seu número, dimensões e morfologia (forma e estrutura). É característico de cada espécie como, por exemplo, o cariótipo humano. Este é constituído por 22 pares de cromossomas homólogos (autossomas) e um par de cromossomas sexuais (heterossomas). Bandas G – possuem baixo teor em GC (guanina + citosina) e são escuras devido à coloração de Giemsa. Bandas R – elevado teor em GC e apresentam cor mais clara. Correspondem a zonas com maior densidade de genes, especialmente genes que são expressos em todos os tipos de células. 18 Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 Politinização – há repetição da molécula de DNA mas não há separação. Existe o cromossoma polytene e é por isso que se consegue observar ao MOC.  Cromatina Nas células eucarióticas, a parte não nucleolar do núcleo é formada, na sua maior parte, por uma estrutura fibrosa, a que se dá o nome de cromatina. Esta é constituída por DNA associado a uma quantidade igual de proteínas básicas, as histonas, e proteínas não histónicas. A cromatina no núcleo em interfase está topologicamente compartimentada em domínios estruturais correspondentes a cada cromossoma e territórios, como por exempo, os dos centrómeros e os dos telómeros. Existem dois tipos de cromatina: Eucromatina – é a cromatina activa e a zona geneticamente mais activa do genoma, estando nela situadas as regiões do DNA com uma hipersensibilidade marcada à DNAase. Esta cromatina situa-se no interior do nucleoplasma. Heterocromatina – corresponde às regiões menos activas e inactivas do genoma, tem uma estrutura condensada e mantém o seu grau de condensação durante todo o ciclo celular. Localiza-se ao longo do interior do invólucro nuclear e junto dos poros nucleares. Facultativa – segmentos cromossómicos ou cromossomas inteiros que durante o período precoce do desenvolvimento embrionário se inactivam e condensam, continuando neste estado em todos os tecidos ou em muitos deles – ex.: um dos cromossomas X das células femininas. Constitutiva – caracteriza-se por ser constituído por sequências que se encontram altamente repetidas e organizadas lado a lado (em tandem). Assim, encontra-se em posições idênticas nos cromossomas homólogos. 6.2. Ácido ribonucleico (RNA) Possui, normalmente, uma cadeia simples e linear, mas que pode sofrer emparelhamento sobre si (por emparelhamento de bases), originando conformações espaciais mais complexas; Envolvido na síntese de proteínas; Consiste num grande número de nucleótidos unidos, cada um dos quais compreende o açúcar ribose, um grupo fosfato e uma de quatro bases azotadas; Existe em três formas principais, cada uma delas com função diferente na síntese das proteínas: mRNA, tRNA e rRNA. | Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas 19  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007  RNA de transferência (tRNA) Pequena molécula de RNA que se combina com um aminoácido específico e o transporta para o ribossoma durante a síntese de proteínas; Tem uma estrutura tridimensional específica; Inclui um tripleto de bases numa das extremidades (o anticodão) que é complementar de um outro conjunto de 3 nucleótidos do mRNA (o codão); N a extrem idade 3’tem o codão ACC que é o local onde se vai ligar o aminoácido; Os nucleósidos modificados são: pseudouridina, dihidrouridina, inosina e ribotimidina.  RNA mensageiro (mRNA) Cadeia linear; Sintetizado no núcleo; Possui uma sequência de 3 nucleótidos (codão), complementar do anticodão do tRNA; Actua como molde para a ligação de aminoácidos ao nível do ribossomas durante a síntese das proteínas.  RNA ribossómico (rRNA) Está presente nas subunidades dos ribossomas; Pode formar estruturas complexas, semelhantes a ganchos e ansas, estabilizados pelo emparelhamento de bases; Todo o rRNA (5S, 5.8S, 28S e 18S) é sintetizado no nucléolo, excepto a fracção 5S que é sintetizada no nucleoplasma; O poliribossoma existe nas células quando há síntese de proteínas citosólicas. As ribozimas são moléculas de RNA com funções catalíticas que permitem o corte de determinadas zonas de moléculas de RNA.  Ribossomas Constituídos por RNA associado a proteínas; São constituídos por duas subunidades (uma maior e outra menor); Nos procarióticos, os ribossomas são do tipo 70S, em que a subunidade maior é uma 50S e a subunidade menor é uma 30S. Nos eucarióticos, os ribossomas são do tipo 80S, em que a subunidade maior é uma 60S (que está associada a 49 proteínas) e a subunidade menor é uma 40S (que está associada a 33 proteínas). A subunidade maior é constituída por 3 fracções (5S, 5.8S e 28S) e a subunidade menor é constituída por 1 fracção (18S).  Código genético O código genético é a informação para a construção das proteínas, inscrita no material genético. Não tem vírgulas na sua escrita, ou seja, é lido na totalidade, sem quaisquer interrupções. Apresenta as seguintes características: 20 Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 Degenerado – existem várias codões que codificam o mesmo aminoácido; Universal – é lido da mesma maneira, desde as bactérias até aos mamíeros (com excepção das mitocôndrias, nas quais há algumas variações no modo de leitura); Possui 43 = 64 codões; Existem 3 codões stop ou de terminação, para os quais não há nenhum anti-codão complementar, sendo responsáveis por sinalizar o fim do processo de tradução (UAG, UGA, UAA); Existe um codão de iniciação que codifica a metionina e que sinaliza o início do processo de tradução (AUG). | Capítulo 2 – Componentes químicos celulares e Macromoléculas 21  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 Capítulo 3 – Métodos de estudo das células 1. Centrifugação Na centrifugação, o comportamento de uma partícula num campo de centrifugação, depende do seu peso e da resistência que encontra ao mover-se no meio da suspensão. A taxa de sedimentação é: Directamente proporcional ao tamanho da partícula; Directamente proporcional à diferença entre a densidade da partícula e a densidade do meio; Nula quando a densidade da partícula iguala a do meio; Inversamente proporcional à viscosidade. Directamente proporcional à força centrífuga. 1.1. Centrifugação Diferencial ou Fraccionada Consiste em aumentar progressivamente o tempo de centrifugação e a força centrífuga, de modo a que se separem diferentes compostos, sucessivamente menos densos. No caso da centrifugação diferencial de uma célula previamente homogeneizada, primeiro sedimentam os núcleos (zonas mais densas da célula); depois (com aumento da força centrífuga e do tempo de centrifugação) sedimentam mitocôndrias, cloroplastos, lisossomas e peroxissomas; posteriormente sedimenta a membrana plasmática, fracções microssomais e polirribossomas; em seguida, depositam-se ribossomas e o que resta são as porções solúveis do citoplasma. 22 Capítulo 3 – Métodos de estudo das células |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 1.2. Centrifugação Contragradiente A separação depende da densidade da partícula. As partículas vão movimentar-se até atingir uma densidade igual à do meio. É uma centrifugação isopíprica porque a densidade é rigorosa, o que obriga a um maior cuidado com a velocidade e com o tempo de centrifugação. Isto acontece pois se aumentarmos muito estes factores, todas as partículas acabam por sedimentar. Nesta experiência, utiliza-se um meio com um gradiente de concentração em sacarose, sendo que as partículas que se encontram mais no fundo do tubo têm maior concentração de sacarose.  Centrifugação por densidade moderada Aqui, efectua-se a separação por tamanho por e densidade, em que a zona de maior densidade tem uma densidade menor que a partícula a separar. Assim, o tempo e a velocidade de centrifugação têm de ser controlados cuidadosamente.  Centrifugação isopícnica Nesta centrifugação, a separação é efectuada apenas por densidade, sendo que a zona de maior densidade tem uma densidade maior que a partícula a separar. 2. Cromatografia A cromatografia é um método de purificação de proteínas. Neste método, é utilizada uma coluna cheia com uma matriz com características específicas de acordo com o tipo de cromatografia que se vai realizar. No cimo da coluna, coloca-se a amostra que é equilibrada com um tampão. Este tampão vai atravessando a coluna e à medida que isto acontece, a amostra vai descendo ao longo da mesma. | Capítulo 3 – Métodos de estudo das células 23  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 2.1. Cromatografia de filtração por gel Nesta cromatografia, utiliza-se uma matriz inerte e porosa para que se possam separar as proteínas pelo seu tamanho e peso molecular. As proteínas de grande peso molecular não entram nos poros e são eluídas em primeiro lugar. As proteínas mais pequenas penetram tanto mais profundamente nos poros, quanto mais pequenas forem, e necessitam de maiores quantidades de tampão para serem eluídas da coluna. Para concluir se uma determinada proteína se encontra num determinado líquido recolhido, procede-se a uma espectrofotometria a 280 nm. 2.2. Cromatografia de troca iónica Nesta cromatografia, as proteínas são separadas de acordo com a sua carga. Utilizam-se colunas que são carregadas positiva ou negativamente, atraindo as proteínas de carga negativa ou positiva, respectivamente. Quando uma coluna tem carga positiva, atraindo proteínas com carga negativa, diz-se que ocorre uma troca aniónica. Quando a coluna possui carga negativa, atraindo proteínas carregadas positivamente, diz-se que ocorre uma troca catiónica. As proteínas de carga contrária à matriz são atraídas por ela, sendo retardadas relativamente a outras que não sejam atraídas pela matriz, e que vão ser eluídas em primeiro lugar. A eluição da proteína vai ser efecutada por uma solução tampão, cujo pH altere a carga da proteína, de acordo como o seu ponto isoeléctrico. Podemos dar o exemplo de uma troca aniónica (proteína carregada negativamente e coluna carregada positivamente). Se adicionarmos uma solução com um pH muito baixo (abaixo do ponto isoeléctrico da proteína), a proteína tem que funcionar como uma base, aceitando H+ e ficando carregada positivamente. Neste caso, a proteína deixa de ter afinidade com a matriz e é eluída. 24 Capítulo 3 – Métodos de estudo das células |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 3. Electroforese (em gel de poliacrilamida) A electroforese é um método de separação e caracterização de proteínas. A acrilamida é uma substância neurotóxica que vaireagir com a N ,N ’-metileno-biscarilamida, formando uma rede porosa: a poliacrilamida. Quanto maior a concentração de poliacrilamida, mais finos serão os poros (que permitem separar as proteínas pelos seus pesos moleculares). Para além da poliacrilamida, também podem utilizar-se como suporte a nitrocelulose (usada em análises críticas) ou a agarose. Basicamente, a electroforese é um método útil para estudar patologias, para efectuar testes de controlo da qualidade e para verificação de doenças.  Electroforese nativa (PAGE) Nesta electroforese, não é utilizado nenhum desnaturante, sendo que as proteínas se movimentam e são separadas tendo em conta a massa e a carga (ponto isoeléctrico).  Electroforese com desnaturante (SDS-PAGE) Nesta electroforese, utiliza-se um detergente – o SDS (sódiododecilsulfato) que é fortemente aniónico, logo vai desnaturar as proteínas e fazer com que elas adquiram carga negativa. Por vezes, juntamente com o SDS pode utilizar-se um agente redutor (β-mercaptoetanol) que tem a capacidade de quebrar as pontes dissulfureto da proteína. As proteínas são colocadas no tanque de electroforese, misturadas com o SDS. Como adquirem carga negativa, são atraídas para o pólo positivo que está situado no lado oposto do tanque. Neste processo, as proteínas migram ao longo do gel de poliacrilamida de acordo com o seu peso molecular, sendo que quanto mais pequenas forem, mais rapidamente vão descer ao longo do tanque, ficando mais próximas do pólo positivo (neste caso, as proteínas migram ao contrário da cromatografia em gel, sendo que as proteínas mais pequenas são recolhidas em primeiro lugar). Depois de realizar a electroforese, fixam-se as proteínas ao gel com ácidos ou álcoois e procede-se à sua coloração. Na coloração, podem utilizar-se três substâncias diferentes: Azul de Comassie Nitrato de prata – é mais sensível que o anterior porque detecta proteínas mais pequenas. Específicas – no caso de as proteínas serem enzimas. | Capítulo 3 – Métodos de estudo das células 25  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007  Focagem isoeléctrica A focagem isoeléctrica permite separar as proteínas segundo a sua carga, sendo útil para determinar rigorosamente o ponto isoeléctrico de uma dada proteína. Como se analisa a carga, o meio de suporte pode ser a poliacrilamida ou a agarose. O gel usado possui anfólitos que são moléculas cujo ponto isoeléctrico é conhecido. Assim, neste método, é necessário aplicar uma corrente eléctrica para que os anfólitos se desloquem e criem um gradiente de pH. Estes anfólitos devem possuir um conjunto de características: Condutividade no ponto isoeléctrico; Interacção mínima com as proteínas; Inertes com as proteínas em estudo; Baixo peso molecular. Capacidade tampão para não alterar o pH do meio; Solúveis no ponto isoeléctrico; A proteína vai deslocar-se ao longo da matriz, sendo atraída pelo pólo de carga contrária à sua. Num determinado momento, a proteína atravessa a zona da matriz onde estão situados os anfólitos, cujo pH é igual ao seu ponto isoeléctrico. Aqui, as cargas positivas da proteína vão ser iguais às cargas negativas, ficando a proteína neutra. Assim, ela vai deixar de ser atraída para um dos pólos e fica estática junto aos anfólitos com o mesmo ponto isoeléctrico. Nota: Como o ponto isoeléctrico dos anfólitos é conhecido, então vai ficar a conhecer-se esse mesmo atributo nas proteínas. 4. Imunocitoquímica A imunocitoquímica é uma técnica que permite localizar proteínas num determinado local do interior da célula. Para isso, utilizam-se moléculas específicas para as proteínas – os anticorpos – que localizam antigénios nas células. Por esta razão, este método é a base para a maioria dos processos que utilizam anticorpos no seu procedimento. A visualização é conseguida através de um processo de marcação do anticorpo feita com enzimas ou fluorocromos (substâncias fluorescentes). Como não é possível marcar todos os anticorpos (porque existe um número muito elevado de proteínas), inicialmente vão ser utilizados os anticorpos que não estão marcados. 26 Capítulo 3 – Métodos de estudo das células |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 Os antigénios primários são produzidos directamente pelo organismo receptor do anticorpo e os antigénios secundários são originários de um outro organismo. No entanto, estes são marcados, inseridos no interior do primeiro organismo e vão permitir o reconhecimento da região constante dos anticorpos. 5. Citometria de fluxo Este método de estudo permite identificar células através de dois mecanismos: ou pela luz que as células difundem, ou pela fluorescência emitida quando atravessam um feixe de raios laser. Aqui, a separação das células pode ser efectuada tendo em conta três factores: Marcadores; Tamanho das células; Conteúdo de DNA. 6. Microscopia Uma vez que as células têm dimensões muito pequenas, ou seja, têm uma dimensão inferior ao poder de resolução da visão humana, torna-se obrigatória a utilização de aparelhagem adequada para a sua observação: os microscópios. Consoante os microscópios, pode estudar-se: Processos in vitro – células em cultura, ou seja, a morfologia de células isoladas ou de tecidos (identificar os determinados tipos de células que fazem parte do tecido); A localização de determinadas substâncias desejas; Processos in vivo – seleccionar células vivas e injectar-lhes determinadas substâncias no seu interior observando, por exemplo, um determinado momento do ciclo celular. No caso do estudo de células em tecidos ou do estudo da sua morfologia, recorre-se usualmente a microscópios ópticos. Por outro lado, no caso de se estudarem as células isoladas ou mesmo um determinado organismo, procedem-se a ensaios in vitro e in vivo. 6.1. Microscópio de fluorescência Estes microscópios são usados para estudar processos biológicos na célula e a localização de determinadas substâncias no seu interior, utilizando-se para o efeito corantes especiais, designados fluorocromos. Estes têm a capacidade de localizar os constituintes desejados no interior das células, existindo vários tipos: Vermelhos – rodamina Verdes – fluoresceína Consoante o fluorocromo utilizado, vai ser emitida uma luz de determinada cor (vermelho ou verde), tendo em conta aquilo que for reconhecido. Assim, quando se liga o microscópio, é possível observar um campo escuro com várias zonas coloradas dessas duas cores. | Capítulo 3 – Métodos de estudo das células 27  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 A sua utilização baseia-se na propriedade que certas substâncias têm de absorver a luz a um determinado comprimento de onda e, posteriormente, emitir luz a um comprimento de onda superior. Este mecanismo depende do fluorocromo que está a ser utilizado, dentro do espectro vísivel, no entanto existe apenas um número reduzido de substâncias com capacidades de fluorescência: a clorofila, a riboflavina, a vitamina A ou a porfirina. A base da técnica para observar as células neste tipo de microscópio é exactamente a mesma que é usada no microscópio de campo claro. Porém, enquanto no primeiro os anticorpos têm que estar marcados com fluorocromo para serem vistos no microscópio, no segundo, os anticorpos têm de estar marcados com uma dada enzima para ficarem corados. É por isso que a técnica de fluorescência vai decaindo, ou seja, ao fim de algum tempo de permanência do fluorocromo nas células, o seu efeito desaparece. Desvantagens: Durante a focagem, focam-se vários planos simultaneamente, ou seja, verifica-se uma sobreposição de imagens fluorescentes das moléculas, a profundidades da célula, o que exibe uma imagem com pouca definição. Durante a fixação, pode haver destruição da antegenicidade das proteínas, o que vai dificultar a sua ligação aos anticorpos, portanto a fluorescência emitida perde eficácia. É difícil utilizá-lo para secções de células finas. O próprio meio em que as células estão pode emitir fluorescência, obscurecendo o sinal emitido pelo anticorpo (fenóm eno “declant”). 6.2. Microscópio confocal Tal como o microscópio anteriormente referido, este também emite fluorescência durante o processo de observação. No entanto, difere do microscópio de fluorescência nos seguintes aspectos: Permite visualizar as moléculas num único plano de focagem e forma uma imagem a nível de computador (imagem tridimensional com mais pormenores) e bastante mais definida – deconvolução. Utiliza raios laser. Tanto a fluorescência do declant como a sobreposição de planos desaparecem. Devido ao seu elevado custo, são usados nos laboratórios, os de fluorescência e não confocal. 6.3. Microscópio de contraste de fase / de interferência Este microscópio é bastante utilizado para células vivas, em culturas, ou para observar movimentos celulares. Baseia-se nas diferenças entre os índices de refracção, entre o interior da célula e o exterior da célula e zonas das células. Assim sendo, as diferentes espessuras e os diferentes tipos de refracção irão converter-se em zonas claras e escuras. O que este microscópio tem de especial relativamente aos outros,no que diz respeito à morfologia é uma placa com um anel com orifício e um anel escuro. Isto faz com que os raios que atravessam a 28 Capítulo 3 – Métodos de estudo das células |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 preparação sofra refracção e difracção, atingindo a objectiva ao atravessar o objecto. Os raios de luz não sofrem quaisquer desvios e passam pelo anel escuro ao induzir um atraso à fase da onda, permitindo assim observar as zonas claras e escuras com maior nitidez. A principal desvantagem deste microscópio é o facto de apenas ser possível observar células isoladas ou tecidos ou cortes extremamente finos. 6.4. Microscópio de fundo escuro É muito utilizado na microbiologia e serve para observar estruturas muito pequenas, como as bactérias. Com este microscópio observamos o fundo escuro e estruturas extremamente brilhantes. Quando se liga o microscópio óptimo, é possíver o fundo todo iluminado, o que não acontece com o microscópio de fundo escuro, na medida em que os raios partem da fonte luminosa, atravessam o condensador, mas nem todos atingem a objectiva. Apenas aqueles que atravessam também o objecto é que irão atingir a objectiva, dando origem às estruturas brilhantes que constituem as células que se pretendem observar. 6.5. Microscópios electrónicos Estes microscópios servem, principalmente, para estudar todas as estruturas existentes no interior da célula. Em comparação com os restantes, estes utilizam um feixe de electrões (em vez de fotões), existindo uma grande diferença de potencial entre o cátodo (filamento de tungsténio) e o ânodo que vai permitir a obtenção de uma boa definição da imagem observada. Quanto maior a voltagem, maior a definição da imagem e maior a resolução do microscópio. O poder da resolução aproxima-se dos 0.1 nm, sendo muito pequeno em valor, mais muito grande na visualização das células. Esta diferença de potencial provoca uma aceleração dos electrões, sendo que para evitar as interferências deste excesso de aceleração, todo o sistema está inserido num tubo constituído apenas pelo vazio, a fim de não haver absorção de electrões. Possui lentes electromagnéticas onde se colocam as amostras, no entanto a imagem é visualizada num ecrã. | Capítulo 3 – Métodos de estudo das células 29  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 Modo de funcionamento: 1. Quando o filamento de tungsténio é aquecido no vácuo, produz electrões. 2. Há uma grande diferença de potencial entre o ânodo e o cátodo, que leva à aceleração dos electrões. 3. Os electrões passam no condensador e atingem o objecto a observar – os electrões têm fraco poder de penetração logo os cortes devem ser extremamente finos. 4. Muitos electrões são dispersos pelos constituintes da estrutura celular e contribuem para a formação de uma imagem intermédia dada pela objectiva. Após a passagem dos electrões, as estruturas celulares ficam destruídas. 5. Esta imagem é depois ampliada por outra bobina projectora que equivale à ocular do microscópio óptico. 6. A focagem é feita pela variação da corrente electrónica que passa através das lentes electromagnéticas. Tipos de microscópios electrónicos: Transmissão (difere do segundo devido à diferença de potencial) Transmissão de alta voltagem Esquadrinhamento – SEM Integrado – STEM (transmissão + enquadrinhamento) 6.6. Microscópio de esquadrinhamento Observa-se a superfície da amostra não seccionada. A superfície da célula é fixada, seca e recoberta por um metal pesado (platina), visualizando-se então uma película sore a amostra. Os electrões chocam com a camada metálica e são emitidos formando uma imagem tridimensional. 30 Capítulo 3 – Métodos de estudo das células |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 7. Métodos de introdução de substâncias na célula Microinjecção – utilização de uma seringa sendo que se injectam as substâncias quando estão prestes a ser analisadas no microscópio. De seguida, o sistema a ser utilizado vai induzir alterações ao nível da membrana celular. Electroporação – colocação das substâncias desejadas de inserir na célula em choques eléctricos que alteram a abertura de poros existentes na célula. Se estiverem fechados, impedem que as substâncias que entraram voltem a sair, e é possível que se registem os efeitos dessas substâncias na conformação celular. Lipossomas – ao contactar com a membrana celular, as vesículas têm de ter proteínas reconhecidas como sendo proteínas membranares através de receptores. Depois disto, fundem as 2 membranas, dando-se a libertação do conteúdo da células vesiculares. Introdução de genes – introdução de partículas de DNA na célula sem alterar a conformação da sua membrana plasmática. | Capítulo 3 – Métodos de estudo das células 31  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 Capítulo 4 – Energia celular Fotossíntese ou compostos com elevado potencial energético (Respiração) ENERGIA Movimentos celulares, Criação de um incluindo Síntese de Síntese de outros potencial contracções Transporte de macromoléculas constituintes eléctrico através musculares, moléculas contra celulares (DNA, celulares da membrana Calor arrastamento de o gradiente de RNA, proteínas, (membrana (importante para células e concentração polissacarídeos) fosfolipídica) as funções movimento de nervosas) cromossomas durante a mitose 1. Glicólise A glicólise é a sequência metabólica de várias reacções enzimáticas, em que a glicose é oxidada produzindo duas moléculas de ácido pirúvicoe dois equivalentes reduzidos de NAD +, que ao introduzirem- se na cadeia respiratória, produzirão duas moléculas de ATP. Os organismos primitivos originaram-se num mundo cuja atmosfera carecia de O2 e, por isso, a glicólise é considerada com sendo a via metabólica mais primitiva, estando portanto presente em todas as formas de vida actuais. Este processo, nos seres eucariontes, ocorre no citosol. 32 Capítulo 4 – Energia celular |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 A glicólise divide-se em duas partes principais: Na primeira, a glicose é fosforilada com o gasto energético de uma molécula de ATP para originar a glicose-6-fosfato, que se isomeriza para formar frutose-6-fosfato. A partir desta molécula e com gasto de outra molécula de ATP, forma-se a frutose-1,6-bifosfato. Assim sendo, nesta fase, foram gastas duas moléculas de ATP. Esta é uma reacção irreversível na qual intervém a glicose e o ATP, onde constam cinco reacções bioquímicas. A importância dos intermediários fosforilados é: Grupos fosfato são ionizados a pH 7, dando uma carga negativa aos intermediários que então, não conseguem atravessar a membrana celular; Grupos fosfato são essenciais na conservação da energia metabólica; A ligação dos grupos fosfato ao centro activo da enzima fornece a energia de ligação. Na segunda parte, a frutose-1,6- bifosfato divide-se em duas moléculas: gliceraldeído-3-fosfato e dihidroxiacetona-fosfato, por meio da enzima aldolase. Esta última molécula vai transformar-se também em gliceraldeído-3-fosfato, duplicando a reacção a partir deste momento. O gliceraldeído-3-fosfato sofre cinco reacções bioquímicas até se converter em piruvato. O piruvato pode ser oxidado a acetil-CoA na presença de oxigénio (na matriz mitocondrial) e o NADH formado vai ser oxidado através da oxidação mitocondrial. | Capítulo 4 – Energia celular 33  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 2. Fermentação A fermentação é um processo anaeróbio de transformação de uma substância noutra, produzida a partir de microrganismos, tais como bactérias e fungos, chamados nesses casos de fermentos. Existem vários tipos de fermentação, entre os quais: Fermentação láctica – em que o piruvato origina o ácido láctico. Fermentação alcoólica – em que o piruvato origina etanol e CO2. 3. Ciclo de Krebs O ciclo de Krebs corresponde a uma série de reacções químicas que ocorrem no metabolismo celular. É exectuado nas mitocôndrias dos eucariontes e no citoplasma dos procariontes. Trata-se de uma parte do metabolismo dos organismos aeróbios (utilizando oxigénio da respiração celular) mas também dos organismos anaeróbicos (através da glicólise, por exemplo). 34 Capítulo 4 – Energia celular |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 Este ciclo inicia-se quando o piruvato que é sintetizado na glicólise é transformado em acetil-CoA por acção da enzima piruvato-desidrogenase. Este composto reage com o oxaloacetato que é um produto do ciclo anterior, formando-se citrato. Este vai dar origem a um com posto de cinco carbonos, o α- cetoglutarato com libertação de NADH e de CO2. Por sua vez, o α-cetoglutarato vai dar origem a outros compostos de quatro carbonos com formação de GTP, FADH2, NADH e oxaloacetato. 4. Fosforilação oxidativa O processo de fosforilação oxidativa refere-se à fosforilação do ADP em ATP, utilizando para isso a energia libertada nas reacções de oxidação-redução. As transferências de electrões constituem reacções desse tipo, que se processam com libertação de energia, que pode ser aproveitada biologicamente para a síntese de ATP. A energia do transporte de electrões é primariamente utilizada para bombear protões para o exterior da matriz mitocondrial. Como consequência deste mecanismo, vai haver a formação de um gradiente de protões, ou seja, um conjunto de concentrações de protões diferentes dentro e fora da mitocôndria. Como a membrana interna deste organelo é impermeável a protões, eles só podem voltar à matriz e desfazer o gradiente através de locais específicos da membrana interna. A carga fica mais positiva no espaço intermembranar, devido à maior concentração de protões e o pH fica sucessivamente mais ácido, o que conduz à produção de ATP através da ATP sintase. | Capítulo 4 – Energia celular 35  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 5. Síntese de polímeros Existem monómeros que contêm a energia necessária à sua própria ligação à cadeia em crescimento (Tail polymerization) – ex.: ácidos nucleicos e polissacarídeos. Existem monómeros que transportam a energia necessária para que se ligue o monómero seguinte (Head polymerization) – ex.: proteínas e ácidos gordos. 6. Ciclo do azoto O ciclo do azoto pode ocorrer nos nucleótidos ou nas proteínas. No caso dos nucleótidos, é originado nas dietas e na biossíntese, pois o azoto das bases azotadas é proveniente da glutamina, da glicina (aminoácidos também importantes para a síntese de outros compostos) e do ácido aspártico. Por sua vez, as pentoses ribose e desoxirribose são provenientes da glicose. No que diz respeito às proteínas, a origem é semelhante à dos nucleótidos. Na biossíntese de polímeros, podem existir reacções favoráveis quando se produz energia necessária para a síntese de moléculas ou reacções desfavoráveis quando não ocorrem devido à ausência de energia. Relativamente à regulação, é controlada por mecanismos de feedback negativo e de modificações enzimáticas. Isto acontece pois as enzimas só são activas quando estão fosforiladas. 36 Capítulo 4 – Energia celular |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 Capítulo 5 – Mecanismos genéticos 1. Replicação semiconservativa do DNA Na replicação da molécula de DNA, cada cadeia parental serve de modelo para a síntese de uma cadeia filha que lhe é complementar, processo que culmina com a obtenção de duas moléculas filhas idênticas ao duplex inicial. Neste mecanismo de replicação, intervém um conjunto de factores proteicos que constituem a maquinaria de replicação e que vão actuar ao longo de várias fases deste complexo processo.  Enzimas envolvidas no processo DNA polimerase – enzima chave que catalisa a incorporação de desoxirribonucleósidos 5’-trifosfato (dNTP) na cadeia nascente de DNA. Nos procariontes, existem 3 tipos: as polimerases I e III são essenciais ao processo de replicação, enquanto que a actividade da polimerase II está mais ligada ao processo de reparação. Nos eucariontes, existem 5 tipos, mas apenas 2 são mais relevantes para o processo da replicação do D N A. A polim erase α inicia a cadeia continua e sintetiza os fragm entos de O kazaki e a polim erase δ faz o elongam ento da cadeia contínua. Helicase – quebra as pontes de hidrogénio entre bases complementares das 2 cadeias. Proteínas SSB (single stranded binding proteins) – ligam-se à cadeia de modo a que não se restabeleça a dupla hélice, enquanto as outras enzimas não estão ainda a actuar. DNA primase – sintetiza uma pequena molécula de RNA (primer). DNA ligase – liga os nucleótidos de modo a formar-se uma cadeia. Topoisomerases I e II – evitam o super-enrolamento da cadeia, após a actuação da helicase, cortando-a em locais estratégicos. A topoisomerase II necessita de ATP para actuar.  Mecanismo geral de replicação De um modo geral, o processo de replicação inicia-se a partir de uma origem de replicação reconhecida por um complexo de reconhecimento da origem (ORC – Origin Recognition Complex), que após associação com outras proteínas, vai localizar nesse local dois complexos hexaméricos de tipo helicase que se vão mover em direcções opostas na cadeia parental a partir da origem. Estas enzimas desenrolam as duas cadeias que compõem a dupla hélice, quebrando as ligações de hidrogénio estabelecidas entre as bases azotadas complementares de cada cadeia. Às duas cadeias simples assim obtidas, associam-se proteínas multiméricas específicas que se vão manter numa estrutura adequada ao seu reconhecimento pelo complexo de DNA polimerase, permitindo que possam servir de modelo à síntese das duas cadeias filhas que lhes serão complementares. | Capítulo 5 – Mecanismos genéticos 37  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 Este conjunto de proteínas e DNA, localizado na zona da origem de replicação, vai originar a constituição de uma dupla forquilha de replicação, que se estende em direcções opostas para os dois lados da origem no caso mais comum da replicação bidireccional. De modo a iniciar a síntese de cada cadeia filha, e devido à impossibilidade de esta ser efectuada pelas DNA polimerases, um novo complexo enzimático denomiado primase irá sintetizar um fragmento de RNA, o fragmento iniciador ou RNA iniciador,a partir da extrem idade 5’de cada um a das novas cadeias a sintetizar. Este fragmento iniciador tem como função permitir a ligação à cadeia nascente das enzimas que constituem o com plexo da D N A polim erase,para que este contínue a síntese da cadeia filha na direcção 5’ para 3’. No entanto, devido ao antiparalelismo da cadeia de DNA parental, das duas cadeias filhas a sintetizar, só um a poderá ser feita de m odo contínuo na direcção 5’ para 3’ a partir da região da cadeia principal imediatamente adjacente à origem de replicação – esta será a cadeia avançada (cadeia contínua ou leading). A outra cadeia filha não poderá ser sintetizada de forma contínua, pois estará condicionada pelo facto da D N A polim erase ter um a única direcção de síntese (de 5’ para 3’). Assim , esta cadeia atrasada (cadeia descontínua ou lagging) irá ser sintetizada na direcção oposta ao avanço da forquilha de replicação, através da síntese e posterior ligação de múltiplos segmentos de DNA, todos iniciados por um pequeno fragmento de RNA iniciador colocado pela primase – os fragmentos de Okazaki. O processo de junção de dois fragmentos de Okazaki implica a remoção do RNA iniciador existente no fragm eto de O kazaki a partir da sua extrem idade 5’ por um a enzim a do tipo RN Ase com actividade exonucleásica 5’-3’. Ao mesmo tempo, para preencher esse espaço, são adicionados novos nucleótidos na extremidade 3’do fragm ento de D N A que lhe fica adjacente,com a ajuda de um a das D N A polim erases que constitue o complexo de replicação. Os dois fragmentos de DNA são finalmente ligados um ao outro pela DNA ligase, que estabelece a ligação fosfodiester finalentre o grupo 3’-OH do último nucleótido do primeiro fragmento de Okazaki e o alfa-P da exterm idade 5’do fragm ento de O kazakiadjacente que acabou de ser sintetizado. De modo a aliviar a tensão de torsão das cadeias durante o seu desenrolar pela helicase, enzimas de tipo topoisomerases vão igualmente actuar neste processo. Estas enzimas associam-se com a dupla cadeia parental a montante de cada uma das helicases e removem a tensão provocada pela torção da 38 Capítulo 5 – Mecanismos genéticos |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 cadeia dupla através de uma série de cortes pontuais nas ligações fosfodiester, reformadas de seguida pela mesma enzima, que vão ocorrer durante o desenrolamento efectuado pela helicase.  Replicação dos telómeros / Função da telomerase A), B) A telomerase reconhece a cadeia simples deixada na extrem idade 3’ do telómer o após a replicação e adiciona a esta cadeia uma sequência telomérica por transcrição reversa, utilizando como modelo o RNA iniciador interno. C) Por translocação, a telomerase reposiciona-se na nova extrem idade 3’da cadeia e recom eça o processo. D) Após mais uma etapa de transcrição reversa, foi colocado mais um m otivo telom érico TTG G G G na extrem idade 3’. E) Utilizando a recém-sintetizada extrem idade 3’ com o m odelo, a prim ase vai sintetizar um RN A iniciador na direcção 5’ para 3’, ao qual se liga a DNA polimerase para iniciar a síntese de DNA e preencher o fragmento em falta. F) A DNA ligase une o fragmento de DNA sintetizado de novo à extrem idade 5’ da cadeia preexistente. Após a rem oção do RN A iniciador,a extrem idade da cadeia 3’do crom ossoma é complexada com proteínas teloméricas que vão promover a circularização da extremidade do cromossoma, de modo a estabilizá-la (G). | Capítulo 5 – Mecanismos genéticos 39  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007  Mecanismos de reparação de erros do DNA Depurinação – caso em que falta uma base na cadeia, criando-se portanto um local apurínico (caso a base em falta seja uma purina), ou um local apirimidínico (caso a base em falta seja uma pirimidina). Tem de haver quebra das ligações fosfodiester entre nucleótidos, preenchimento do espaço vazio e novamente ligação dos nucleótidos. Para este processo, são então necessárias as seguintes enzimas: - Endonucleases - DNA polimerase - DNA ligase Desaminação – caso em que um uracilo está no lugar de uma citosina; hipoxantina em vez de adenina ou xantina em vez de guanina. Neste processo intervêm as seguintes enzimas: - DNA glicosidases (remove o uracilo) - Endonucleases - DNA polimerase - DNA ligase 2. Transcrição A transcrição constitui o mecanismo universal da expressão dos genes, unidades de DNA que contêm a informação necessária à especificação da síntese de todas as formas funcionais de RNA de cada célula. Trata-se de um processo sequencial que se processa em 3 etapas: Iniciação – consiste no reconhecimento do sítio do DNA genómico que irá ser copiado em RNA, e condensação dos primeiros nucleótidos constituintes das extrem idades 5’P do RN A nascente. Elongação – consiste na polimerização orientada dos nucleótidos, reflectindo a sequência do DNA molde, e obedece à regra da complementaridade estrutural das respectivas bases. Terminação – resulta da interrupção selectiva do processo de transcrição da cadeia molde do DNA, delimitada pelo último nucleótido de cada gene activo, que corresponde portanto à extremidade 3’-OH da cadeia de RNA transcrito. Existem zonas do DNA que são reconhecidas pela RNA polimerase e por proteínas, como sendo o local de início da transcrição – promotor. Este é uma sequência de nucleótidos à qual se ligam proteínas que informam a RNA polimerase que pode iniciar a síntese da molécula de RNA. Contém zonas consenso como a TATA box que é altamente conservada e que existe na maior parte dos genes, constituída por nucleótidos de adenina e timina (TATAAT). Existe uma proteína que reconhece o promotor – a TBP. Esta vai ligar-se à TATA box que se encontra 25 a 35 nucleótidos acima do início da cadeia e vão adicionar-se vários factores de transcrição. A RNA polimerase II tem uma sequência de aminoácidos terminal carboxílico que se designa CTD – sinal reconhecido por outras enzimas e que indica que a molécula sintetiza o mRNA. Depois da RNA polimerase II 40 Capítulo 5 – Mecanismos genéticos |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 se ligar, é necessário que todos os factores de transcrição recebam a abertura da cadeia. Para isso é necessário o TFIIH, que actua como uma cinase, fosforilando as proteínas neste caso o terminal CTD.  Tipos de RNA rRNA – antes de passar para o citoplasma, associa-se a proteínas e forma as unidades do ribossoma. mRNA – RNA mensageiro, capaz de reconhecer o código proteico. tRNA – ler a informação contida no mRNA. snRNA – relacionado com o proesso de splicing; reconhece zonas de RNA estranhas e remove-as. snoRNA – envolvido na degradação da molécula de rRNA sintetizado no nucléolo.  Tipos de RNA polimerases RNA polimerase I – responsável pela síntese de cerca de 80% da totalidade do RNA celular, localiza- se no nucléolo, transcrevendo os genes dos RNA ribossomais, que conduzem à produção dos rRNA 18S, 5.8S e 28S. RNA polimerase II – responsável pela síntese de 2% do RNA celular, localiza-se no nucleoplasma, e catalisa a síntese dos produtos primários precursores dos mRNA, que dão origem ao hnRNA nuclear. RNA polimerase III – responsável pela síntese de cerca de 20% do RNA celular, está igualmente localizada no nucleoplasma, e catalisa a síntese dos tRNA, snRNA e snoRNA. 3. Processamento do RNA heterogéneo (hnRNA) | Capítulo 5 – Mecanismos genéticos 41  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 3.1. Capping N os eucariontes, a extrem idade 5’ da m olécula é, im ediatam ente após a sua síntese, bloqueada pela fixação ao nucleótido 5’ term inal da m olécula, de um resíduo guanílico em posição invertida – a metilguanosina. O capping ocorre ainda durante a fase de elongação das cadeias de RNA nascente. Esta estrutura, designada cap, é formada por adição do resíduo G proveniente do dador GTP, formando uma ligação de tipo pouco com um ,5’-5’trifosfato com o nucleósido trifosfato term inalda cadeia transcrita. A presença desta estrutura 5’ cap impede a degradação do mRNA e respectivos precursores intranucleares pelas fosfatases ou pelas exonucleases, ao mesmo tempo que estimula a tradução dos mRNA pelo aparelho de síntese proteica dos eucariotas, ao nível do citoplasma. A estrutura cap não só protege os mRNA eucariotas da degradação pelas nucleases, como também intervém activamente na formação do complexo de iniciação da tradução. Depois de as moléculas de RNA nascente produzidas pela RNA polimerase II atingirem um comprimento de 25 a 30 nucleótidos, a 7-m etilguanosina e os outros com ponentes do 5’ cap que se encontram no m RN A eucariótico, são adicionados à sua extrem idade 5’. Este passo inicial do processamento de RNA é catalisado por um complexo enzimático associado ao CTD fosforilado. 3.2. Splicing Com apenas algumas excepções, a maior parte dos genes que codificam para as proteínas nos eucariotas superiores contém sequências não codificantes, os intrões, intercalados nas sequências codificantes, os exões. O processo de eliminação dos intrões durante a maturação dos mRNA é designado splicing, e consiste na excisão-reparação das cadeias dos respectivos produtos primários da transcrição. O conjunto dos precursores do mRNA nucleares, que incluem as formas que se encontrm nas diferentes fases de maturação, constituem o RNA heterogéneo nuclear (hnRNA). Este não se encontra livre no nucleoplasma, mas sim associado a proteínas, sob forma de partículas ribonucleoproteicas que, no citoplasma, contêm os mRNA maduros, aptos a ser traduzidos pelos ribossomas. 42 Capítulo 5 – Mecanismos genéticos |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 Em unidades pequenas de transcrição, o fenómeno de splicing segue, normalmente, a poliadenilação da extrem idade 3’,enquanto que em m aiores unidades de transcrição,contendo um grande número de exões, o splicing só se inicia quando a transcrição de todo o gene termina.  Splicing dos precursores dos mRNA A eliminação das sequências intrónicas presentes nos produtos primários da transcrição dos genes mRNA dá-se mediante formação de estruturas em ansa no RNA transcrito, através de um mecanismos de transesterificação com form ação de um a ligação 2’-5’fosfodiéster entre o resíduo adenílico do sítio de ligação do pré-mensageiro e o grupo fosfato do resíduo guanílico da extrem idade 5’do intrão. Existem, no núcleo das células, pequenos RNA, os snRNA (small nuclear RNA), que são constituídos por menos de 300 nucleótidos, em cuja composição predominam resíduos urídílicos. Estes encontram-se associados a proteínas, formando partículas chamadas snRNP (small nuclear ribonucleoproteins) às quais cabe um papel no processo de eliminação dos intrões da cadeia de RNA do produto primário da transcrição. Nos eucariontes, a partícula U1-snRNP fixa-se ao sítio da clivagem, delim itado pela extrem idade 5’ do intrão, devido à com plementar estrutural com uma sequência do U1RNA. O complexo U2-snRNP fixa-se ao sítio de ligação e ao nível da sequência de pirimidinas que se encontram a m ontante do sítio de clivagem , na extrem idade 3’ do intrão, enquanto a partícula U5-snRNP reconhece o próprio sítio de clivagem em 3’. A ligação entre as proteínas U1 e U2 leva à aproximação das extrem idades 5’ e 3’ do intrão, facilitando a segunda reacção de transesterificação necessária à ligação entre os dois exões. Actuam em seguida os complexos U4 e U6-snRNP associados numa partícula dotada da capacidade de formar um complexo com o precursor do mRNA, de grandes dimensões, o spliceossoma. 3.3. Poliadenilação Na maior parte dos eucariotas, dá-se a adição de 200 a 300 resíduos adenílics, que formam uma cadeia de poli A na extrem idade 3’ da m olécula. Esta reacção é catalisada pela poli A polim erase que, juntamente com a endonuclease, constitui um complxo que inclui ainda uma partícla ribonucleoproteica contendo um pequeno RNA nuclear de composição rica em uridina, o U1RNA. | Capítulo 5 – Mecanismos genéticos 43  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 Uma poli-A polimerase (PAP) conecta-se a um complexo proteico antes de a clivagem ocorrer. Este facto para a conexão da PAP liga a clivagem e a poliadenilação, para que a extrem idade 3’livre seja rapidam ente poliadenilada. Seguidamente à clivagem, a poliadenilação divide-se em duas fases: em primeiro lugar, dá-se a adição de 12 resíduos adenílicos de forma lenta e seguidamente ocorre a adição dos restantes 200-250. Esta última fase requer uma ligação de várias cópias de PABPII (polyA-binding protein). Esta proteína tem a capacidade de ligar a cauda adenília mais curta inicialmente adicionda pela PAP, estimulando a polimerização de um novo conjunto de fragmentos adenílicos. Para além disso, a PABPII também é responsável por sinalizar à poli-A polimerase que pode finalizar a polimerização quando a cauda poli-A atinge um comprimento de cerca de 250 nucleótidos, ainda que o mecanismo para controlar esse tamanho ainda não seja conhecido. 4. Síntese do rRNA As moléculas de rRNA vão ser sintetizadas no nucléolo com excepção do gene que dá origem à fracção 5S, que existe no nucleoplasma. Existem várias fracções de rRNA que não se associam às proteínas, e que vão dar origem às duas subunidades dos ribossomas. A fracção 45S é sintetizada pela enzima RNA polimerase I e a fracção 5S pela RNA polimerase III. A fracção 45S vai ser degradada por outras porções de RNA não codificadas designadas snoRNA (small nucleolar RNA), originando outras tres fracções de rRNA (5.85S, 18S, 28S). A fracção 18S associa-se a proteínas, e dá origem à subunidade menor do ribossoma, enquanto que as fracções 5.85S e 28S dão origem à subunidade maior do ribossoma. O componente fibrilar são as zonas do nucléolo que contêm os RN A’s transcritos e a com ponente granular é composta pelas zonas que contêm os RNAs associados a proteínas. A lâmina nuclear é constituída por filamentos intermediários que fazem parte do citosqueleto e que são altamente 44 Capítulo 5 – Mecanismos genéticos |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 organizados, existindo cromatina associada à parte interna da membrana nuclear (heterocromatina – proteína em forma condensada, sem genes activos). 5. Tradução  Formação do aminoacil tRNA Esta fase é o primeiro passo da síntese proteica e só ocorre na presença da aminoacil tRNA sintetase, sendo que cada aminoácido tem a sua. Os aminoácidos de grandes dimensões penetram nas bolsas enquanto que os mais pequenos são inicialmente activados pelas AMP (adenina monofosfato). A cada codão do mRNA correspnde um anticodão dum tRNA que transporta um aminoácido. As moléculas de tRNA podem servir de transportadores de aminoácidos, estabelecendo uma ligação covalente entre o grupo hidroxilo da ribose ligada à adenina no extrem idade 3’e o grupo carboxilo do am inoácido a ser transportado. A reacção catalisada pelas enzimas sintetase de aminoacil-tRNA utiliza ATP e permite a esterificação dos grupos O H em posição 3’ou 2’.A reacção ocorre em duas etapas:prim eiro a form ação dum am inoacil- adenilato com libertação de pirofosfato e depois a reacção com o tRNA para a formação do aminoacil- tRNA: | Capítulo 5 – Mecanismos genéticos 45  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007 O aminoácido é activado devido à ligação do AMP ao seu grupo carboxílico formando-se um aminoácido adenilado. Este AMP é proveniente da hidrólise do ATP já referido. O aminoácido adenilado é transferido para uma molécula de tRNA havendo uma ligação do grupo carboxílico do am inoácido e do grupo hidroxilo do açúcar 3’ do tRN A, sendo que com esta ligação éster, fica formado o aminoacil tRNA.  1 - Iniciação A tradução inicia-se quando há um aminoacil tRNA que se liga ao local P da subunidade pequena do ribossoma, em vez de se ligar ao local A. Assim, com esta ligação, este aminoacil tRNA tem um codão complementar de iniciação AUG. A ligação do aminoacil tRNA ao local P, bem como a ligação da subunidade pequena ao mRNA, deve-se à participação de factores proteicos ou factores de iniciação (eIF, eIF1, eIF2 e eIF3). O eIF2 vai, então, ligar-se à molécula de tRNA, fazendo com que esta molécula se possa ligar ao local P do ribossoma. No entanto, esta molécula pode sofrer alterações e deixa de se poder ligar ao tRNA, sendo necessários novos mecanismos de regulação. O eIF2 na forma inactiva tem ligado a si GDP e na forma activa, troca para GTP. Para isso, é necessário que o eIF2 sofra fosforilação através de cinases. 46 Capítulo 5 – Mecanismos genéticos |  Biologia Celular – 1º Ano - FFUP 2006/2007 As duas subunidades do ribossoma estão separadas no citosol. A pequena está ligada ao eIF3 e a grande está ligada ao eIF6, sendo que quando se encontram neste forma, perdem a capacidade de se unir e impedem o decorrer da tradução. Por sua vez, o eIF2 que permanece ligado ao GTP, pode associar-se ao aminoacil tRNA e para se conseguir ligar ao local P do ribossoma, tem de estar aqui associada a subunidade menor, ligando-se ao eIF1A, e formando um complexo de pré-iniciação (tem esta designação porque ainda não começou a síntese). Depois de a molécula ter o eIF4, o complexo de iniciação liga-se, iniciando a síntese da molécula de RNA. No entanto, se o tRNA está ligado a outras moleculas, caso haja um novo aminoacil tRNA não vai ter capacidade de se ligar. Quando se forma o complexo de iniciação, liga-se à m olécula de RN A na extrem idade 5’ e segue até encontrar o codão AUG. Quando o encontra, dá-se o estabelecimento de pontes de hidrogénio entre o codão e o anticodão presente a nível do RNA. Quando há pontes de hidrogénio, a subunidade maior pode então ligar-se, mas inicialmente o GTP hidrolisa-se e o eIF2 deixa de ter capacidade de ligação e todos os factores ligados até ao momento, desligam-se também. A partir deste momento, a subunidade maior do ribossoma já tem a capacidade de se associar à menor. No entanto, como tem ligado a si o eIF6, impede esta conexão, necessitando de um novo factor activo com uma molécula de GTP que permita a ligação do eIF6 à subunidade menor, o IF5. Assim que a ligação ocorre, os factores eIF5 e eIF libertam-se, juntamente com a GTP, permitindo que finalmente se inicie a síntese do peptídeo. | Capítulo 5 – Mecanismos genéticos 47  Biologia Celular - 1º Ano - FFUP 2006/2007  2 - Elongação Factores de Elongação – permitem que a leitura codão-anticodão seja correcta. Esta fase requer factores de elongação que se ligam a uma molécula de ATP e ao aminoacil tRNA, sendo que no caso dos eucariotas, este factor é o EF1, que para ser activo tem de ter uma molécula de GTP. Em primeiro lugar, ocorre o emparelhamento entre o anticodão do tRNA e o respectivo codão do mRNA no local A, através de pontes de hidrogénio, bem como a hidrólise do GTP (em GDP + Pi). Esta hidrólise revela-se fundamental para que a leitura seja correcta existindo, enquanto isso, um tempo de espera. Durante esse tempo de espera, verifica-se