Dommages de l'ADN, réparation et mutagenèse - Cours PDF

Stabilité / instabilité du génome : Réparation et Tolérance des dommages de l'ADN Vincent Pagès Directeur de Recherche, CNRS Dommages de l'ADN et instabilité du génome  Mutation : modification irréversible de la séquence d'un génome...

Stabilité / instabilité du génome : Réparation et Tolérance des dommages de l'ADN Vincent Pagès Directeur de Recherche, CNRS Dommages de l'ADN et instabilité du génome  Mutation : modification irréversible de la séquence d'un génome GTCCGAGA Base substitution CAGGCTCT GTTCGAGA CAAGCTCT GTTC AGA Deletion / Insertion CAAG TCT Lesion : altération d'une base de l'ADN / Adduit a)P B ( GTTCGAGA GTTCGAGA CAAGCTCT O CH3 CAAGCTCT O HN OH 6 N NH O N 4 N N NH HO N O dR HO H3C O N O HO O P O O OH O- OH T(6-4)T photoproduct B(a)P-N2-dG UV lesion Benzo(a)pyrene  Une lésion peut devenir une mutation : mutagenèse induite O CH3 HN OH 6 GTTCGAGA GTCCGAGA O N 4 HO N Base substitution O H3C O O O P O O N CAAGCTCT CAGGCTCT O- OH T(6-4)T photoproduct a)P O N B ( GTTCGAGA GTTC AGA NH N N NH Deletion / Insertion dR CAAG TCT HO HO OH CAAGCTCT B(a)P-N2-dG Au cours de la réplication de l'ADN Modèles pour étudier la mutagenèse dans la cellule Bactérie Levure Culture cellulaire Escherichia coli Saccharomyces cerevisiæ Lignée cellulaire I. Mutagenèse spontanée : Fidélité de la réplication A. Fidélité de l’ADN Polymérase réplicative (Pol III) Taille du chromosome d' Escherichia coli : ~5.106bp Fidélité de Pol III : -sous-unité α seule : sélection du nucléotide dans le site actif de la polymérase 10-5 - 10-6 5-50 erreurs / chromosome répliqué I. Mutagenèse spontanée : Fidélité de la réplication A. Fidélité de l’ADN Polymérase réplicative (Pol III) Taille du chromosome d' Escherichia coli : ~5.106bp Fidélité de Pol III : -sous-unité α seule : sélection du nucléotide dans le site actif de la polymérase 10-5 - 10-6 5-50 erreurs / chromosome répliqué +exonucléase (ss-unité ε) : activité de correction de lecture (proofreading) 10-8 0,05 erreurs / chromosome répliqué = 1 erreur tous les 20 cycles α 3'OH 3'OH ε I. Fidélité de la réplication B. MMR = Mismatch Repair (réparation des mésappariements) Me Me G C Me Dans la cellule, l’ADN est méthylé Me Me Mismatch G C T Me G Me C -Reconnaissance du brin non-méthylé Me -Excision -Resynthèse Fidélité Polymérase + Proofreading + MMR : 10-10 soit 1 erreur tous les 2000 cycles de réplication ! II. Les lésions et leur réparation A. Les altérations de l'ADN O O CH3 O HN N C CH3 OH HN 6 N O N N N H2N 4 HO N dR O H3C O N O O P O O dG-C8-AAF O- OH T(6-4)T photoproduct O N NH O N N NH H N dR HN HO O N N HO H 2N dR OH 8-oxo-Guanine B(a)P-N2-dG II. Les lésions et leurs réparations A. Les altérations de l’ADN 1. Site Abasique O -O P O OH O O- OH Perte de la base Purines (A-G) moins stable -Spontanée (favorisé par pH acide) -Induite par agents alkylants Cellule de mammifère : ~10.000 sites abasiques par jour et par cellule II. Les lésions et leurs réparations A. Les altérations de l’ADN 2. 8-oxo-Guanine Guanine 8-oxo-Guanine O O H N N HN HN H O N N H2N N H2N N dR dR Oxydation d’une guanine Attaque par des produits réactifs de l’oxygène II. Les lésions et leurs réparations A. Les altérations de l’ADN 3. CPD : Cyclo-Pyrimidine Dimer O O HN NH O N N O dR1 dR2 Formation d’un cycle entre 2 Thymines Induit par les UV (254nm) II. Les lésions et leurs réparations A. Les altérations de l’ADN 4. T(6-4)T Photoproduit O CH3 HN OH 6 O N 4 HO N O H3C O N O O P O O O- OH Liaison entre C6 et C4 de deux Thymine Induit par les UV (254nm) II. Les lésions et leurs réparations A. Les altérations de l’ADN 5. Benzo(a)Pyrène Adduit = agent chimique se fixant de manière covalente à l’ADN O N NH N N NH dR HO HO OH B(a)P-N2-dG Hydrocarbure polycyclique de la fumée de cigarette Se fixe de manière covalent en N2 des Guanines II. Les lésions et leurs réparations A. Les altérations de l’ADN 6. AF/AAF : Aminofluorène / Acétylaminofluorène dG-C8-AF dG-C8-AAF O O O N N C CH3 HN HN NH N N N N N H2N H2N dR dR Amine / Amide aromatique forme un adduit en C8 d’une Guanine II. Les lésions et leurs réparations A. Les altérations de l’ADN 6. AF/AAF : Aminofluorène / Acétylaminofluorène -> Aspect structural L’AF se place à l’extérieur de l’hélice : ne gène pas l’appariement L’AAF s’insère à l’intérieur de l’hélice G-C provoquant une dénaturation locale  II. Les lésions et leurs réparations A. Les altérations de l’ADN 7. Aflatoxine B1 (AFB1) dG-N7-AFB1 O O O HO O OCH3 N+ HN O O N N H2N dR Métabolite produit par une moisissure consid r e comme l’un des plus puissants canc rog nes g notoxiques naturels forme un adduit en N7 d’une Guanine é é é è é II. Les lésions et leurs réparations B. La réparation 1. Réversion directe : la Photoréactivation O O O O UV (254nm) HN NH HN NH O N N O O N N O dR1 dR2 DNA Photolyase dR1 dR2 P P P + lumière (>300nm) P P P ADN non endommagé CPD (Cyclo-Pyrimidine Dimer) Réversion directe de la lésion grâce à une enzyme : la DNA Photolyase activée par l’absorption de lumière Effet de la photoréactivation sur la survie aux UV survival 80J 25% 20% Survival (%) 15% 10% 5% 0% red light sunlight II. Les lésions et leurs réparations B. La réparation 2. BER : Base Excision repair Mécanisme de remplacement d'un nucléotide dont la base est endommagée 3’ 5’ 5’ 3’  5’ 3’ Catalyse l'hydrolyse de la liaison N-glycosylique entre la DNA glycosylase base endommagée et le sucre -> créé un site ABASIQUE 5’ 3’ Site AP reconnu et coupé en 5’ par une 5’ AP endonucléase endonucléase spécifique -> créé une coupure OH 5’ P 3’ dRpase OH P Excision du déoxyribose-phosphate par la DNA deoxyribophosphodiesterase (dRpase) -> créé une brèche (ou "gap") OH 5’ P 3’ Incorporation d'un nouveau nucléotide par l'ADN DNA pol I + Ligase OH P polymérase I (extrémité 3' OH) Soudure finale par la ligase 5’ 3’  Bilan du BER : 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ -Mécanisme permettant de réparer des lésions de faible encombrement stérique, c'est à dire n'induisant pas une trop grande distorsion dans l'ADN ex : lésions oxydatives (8-oxo-G), alkylantes -Réparation des sites Abasiques  Il existe de nombreuses glycosylases ayant chacune sa spécificité de lésion ->Limites du mécanisme car la cellule ne dispose pas d'une glycosylase pour toutes les lésions possibles II. Les lésions et leurs réparations B. La réparation 2. NER : Nucleotide Excision repair Acteurs : 4 protéines -UvrA -UvrB -UvrC -UvrD Réparation d'adduits encombrants - induisant une distorsion dans l'ADN  UvrA UvrA 3' 5' 5' 3' UvrB UvrA UvrA 3' 5' 5' 3' UvrB UvrC 3' 5' 5' 3' UvrB UvrD UvrC 3' 5' 5' UvrB 3'  UvrD UvrC 3' 5' 5' UvrB 3' UvrB 3' 5' 5' 3' DNA pol I DNA pol I 3' 5' 5' 3' Ligase 3' 5' 5' 3' Importance du système uvrABCD : Simple adduit Cross link ou CPD ou T(6-4)T Simple adduit Cross-link N7 des G Methylnitrosoguanidine En absence du système NER, l'exposition à des agents mutagènes devient très toxique pour la cellule (ex : Xeroderma pigmentosum) Grande diversité des lésions prises en charge par le NER III. Tolérance des dommages / Mutagenèse Lesion Tolerance A. Synthèse Translésionnelle Trans Lesion Synthesis (TLS) M Replication fork encountering the lesion Replication DNA lesion Repair Replication  Trans Lesion Synthesis (TLS) Les deux étapes de la TLS M C G A T C A G G C T A G A T 1. Insertion C G C G A T C A G Glissement C G A T C A G G C T A G T G C T A G T A T 2. Elongation C G C G A T C A G C G A T C A G G C T A G T T G C T A G T C Fidèle ou Substitution de base Frameshift -1 III. Tolérance des dommages / Mutagenèse Lesion Tolerance B. Le contournement des dommages Trans Lesion Synthesis (TLS) M Replication fork encountering the lesion Error Prone Replication Damage avoidance DNA lesion Repair Replication  Damage avoidance III. Tolérance des dommages / Mutagenèse B. Le contournement des dommages RecA/Rad51 III. Tolérance des dommages / Mutagenèse Lesion Tolerance B. Le contournement des dommages Trans Lesion Synthesis (TLS) M Replication fork encountering the lesion Error Prone Replication Damage avoidance DNA lesion Error Free Repair Replication  Trans Lesion Synthesis (TLS) Synthèse Translésionnelle : Les ADN polymérases Translésionnelles M Jusqu'en 1999 : 3 ADN polymérases connues chez E.coli -Pol I excision - digestion amorces d'ARN - (1956) -Pol III réplication du chromosome -Pol II mutagenèse SOS ? 1999 : découverte de 2 nouvelles ADN polymérases chez E. coli -Pol IV (gène dinB) Strasbourg -Pol V (gène umuDC) Californie Propriétés : -Polymérisation de l'ADN -Faible processivité (distributives) -Pas d'activité de proofreading (sauf Pol II) -Faible fidélité  Trans Lesion Synthesis (TLS) Synthèse Translésionnelle : Les ADN polymérases Translésionnelles M 1999 : découverte de 2 nouvelles ADN polymérases chez E. coli -Pol IV (gène dinB) Strasbourg -Pol V (gène umuDC) Californie Par homologie de séquence: -Levure: Pol η, Rev1, Pol ζ -Homme: Pol η, Pol κ, Pol ι, Rev1, Pol ζ, Pol µ, Pol λ,... Nouvelle famille d'ADN polymérases : Famille Y  Pol η (RAD30) * Pol δ Pol η O O HN NH *—GTACTCCAGTGTAGGCATAATACGAA— O N N O dR1 dR2 TT-CPD (Cyclobutane Pyrimidine Dimer) *—GTACTCCAGTGTAGGCAT *—GTAC Johnson et al. Science 1999  Trans Lesion Synthesis (TLS) Les ADN polymérases Translésionnelles : Aspect structural M T7 Pol  Trans Lesion Synthesis (TLS) Les ADN polymérases Translésionnelles : Aspect structural M T7 Pol Pol η Trincao et al. 2001 Molecular Cell  Trans Lesion Synthesis (TLS) Les ADN polymérases Translésionnelles : Aspect structural M T7 Pol O O HN NH O N N O dR1 dR2 P cyclobutane pyrimidine dimer Pol η Trincao et al. 2001 Molecular Cell  Trans Lesion Synthesis (TLS) Les ADN polymérases Translésionnelles : Aspect structural M L'anneau de processivité Procaryotes : Eucaryotes : anneau ß (ß-clamp) PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen)  Trans Lesion Synthesis (TLS) Les ADN polymérases Translésionnelles : Aspect structural M L'anneau de processivité Polymérase Leading Lésion bloquante Hélicase Oka1 sous-unités τ γ-complexe Polymérase lagging Oka2  Trans Lesion Synthesis (TLS) Les ADN polymérases Translésionnelles : Aspect structural M L'anneau de processivité  Trans Lesion Synthesis (TLS) Les ADN polymérases Translésionnelles : Aspect structural M L'anneau de processivité % TLS Pol II mutagenesis Becherel et al. DNA Repair (2002)  Trans Lesion Synthesis (TLS) Les ADN polymérases Translésionnelles : Aspect structural M L'anneau de processivité % TLS Pol V mutagenesis Becherel et al. DNA Repair (2002)  Trans Lesion Synthesis (TLS) La Synthèse Translésionnelle : "Polymerase switch model" M Replicative Polymerase TLS Polymerases Pagès & Fuchs 2002 Oncogene IV. Régulation de la réponse aux dommages : le système SOS Système propre aux procaryotes Si les lésions sur l'ADN n'ont pas été réparées au moment où la réplication commence : -> la fourche de réplication rencontre des lésions -> Il y a alors activation du système SOS Système INDUCTIBLE Système permettant l'expression d'environ 20 gènes ou opérons (gènes SOS) -gènes impliqués dans la réparation -gènes dont l'expression permet la "tolérance des dommages" IV. Régulation de la réponse aux dommages : le système SOS LexA RecA CTG(N)10CAG SOS gene RecA* LexA CTG(N)10CAG SOS gene Le système SOS Étude de la transcription d'un gène SOS CTG(N)10CAG gène SOS lacZ Activité enzymatique mesurable = gène REPORTER Fusion réalisée in vitro CTG(N)10CAG lacZ Réintroduite dans la cellule Le système SOS Étude de la transcription d'un gène SOS CTG(N)10CAG lacZ Expression en fonction de la dose UV ßgal Assay à 15 min 24/10/00 8000 7000 6000 5000 Miller Units 4000 3000 2000 1000 0 0J 2J 5J 10J Dose UV (Joules) Le système SOS Étude de la transcription d'un gène SOS CTG(N)10CAG lacZ Cinétique après irradiation aux UV ßgal Assay recA 20J 7000 6000 5000 Miller Units 4000 UV- UV+ 3000 2000 1000 0 0 15 30 45 60 75 90 Temps (min)  Trans Lesion Synthesis (TLS) La Synthèse Translésionnelle : "Polymerase switch model" M Replicative Polymerase TLS Polymerases Pagès & Fuchs 2002 Oncogene IV. Régulation de la réponse aux dommages : cellules eucaryotes TLS Error-Prone Rad6 Rad18 PCNA Ubc13 Mms2 Damage Avoidance Rad5 Error-Free Rad6: Ub conjugating Rad18: Ub ligase Ubc13/Mms2: Ub conjugating K63 polyubiquitine chain → DA Rad5: Ub ligase K48 polyubiquitine chain → proteasome V. Étude de la mutagenèse induite par les lésions A. Test de mutagenèse "en avant" Étude de la mutagenèse induite par l'AAF dG-C8-AAF O O N C CH3 HN N N N H2N dR Test de mutagenèse en avant Gène de résistance à la tétracycline tet AF AF AF A A A tet Modifié au hasard par l'AAF Introduit dans un vecteur plasmidique AF A AF F A Transformation des bactéries AA (l'ADN se réplique) tet Sélection des clones Amp® (où le plasmide s'est établi) Recherche des clones sensibles à la tétracycline (mutation dans le gène tet) Ori Amp Séquençage du gène tet  Obtention d'un spectre de mutagenèse Fréquence de mutation -GC -GC -GC -G GGCGCC GGCGCC GGGGG GGCGCC site NarI site NarI site NarI gène tet Le site NarI est un point chaud de mutagenèse (hotspot) Fuchs et al. Nature 1981 IV. Étude de la mutagenèse induite par les lésions B. Test de réversion par mutagenèse AF A lacZ GGCGCCNN BLANC CCGCGGNN +2 Mutagenèse lacZ AAF (frameshift -2) Amp pUC 19 lacZ GGCCNN BLEU CCGGNN Ori Étude de la mutagenèse : -transformation du plasmide modifié -analyse des clones blancs/bleus B. Test de réversion par mutagenèse Sans Lésion Avec l'AAF Pas de mutagenèse 10-15% de mutagenèse lacZ GGCGCCNN lacZ GGCCNN CCGCGGNN CCGGNN +2 B. Test de réversion par mutagenèse : Étude génétique TLS au niveau du site NarI modifié par l'AAF Pol III Pol V F F F A A A Pol V A A A 3' 5' 3' 5' 3' 5' -CCGCGG- -CCGCGG- -CCGCGG- -GG 5' -GG 5' C -GG 5' C GCC Insertion Elongation TLS 0 Isomérisation C G Pol II C G A A 3' 5' 3' 5' -C CGG- -C CGG- A A F F -G-GC 5' -G-GCC 5' TLS -2 Diversity of genetic requirements for TLS E. coli A. AF Pol III G Error free TLS B. TT Pol III + Pol V Error free TLS or Mutagenic TLS (3'TC) Pol III Mutagenic TLS (3'GT) a ) P C. B( GGG Pol III + Error free TLS + Pol V or Pol IV Mutagenic TLS (-1 frameshift) F D. AA GGG Pol III + Pol V Error free TLS or Mutagenic TLS (-1 frameshift) Error free TLS Pol V A F AF E. A Pol III or Pol V A CCGCGG CCGCGG GGC Pol II Mutagenic TLS (-2 frameshift) Pagès & Fuchs, Oncogene 2002 Plasmid vs. Chromosome TLS Plasmid: Full unwinding Plasmids are not suitable to study DA Replication fork encountering the lesion Chromosome: TLS Fork block STOP DA Toxicity Un nouveau système pour étudier la Synthèse Translésionnelle (TLS) et les mécanismes de contournement des dommages (DA) in vivo: Introduction d'une lésion unique sur le chromosome Delivering a single lesion on the chromosome 5’-lacZ AttL R6K Amp® OriC 3’-lacZ integrase AttR xis int chromosome pVP135 kan® ori Pagès et al. NAR 2012 Delivering a single lesion on the chromosome LacZ OriC Amp® AttP AttB xis int chromosome pVP135 kan® ori Pagès et al. NAR 2012 Integration of a non-damaged heteroduplex 5' LacZ AttL LacZ+ chromosome OriC LacZ+ (blue phenotype) LacZ- heteroduplex LacZ+/- chromosome LacZ- chromosome (white phenotype) Integration of a damaged heteroduplex 5' LacZ AttL 5' LacZ AttL Replication TLS DA Modulation of TLS by the level of specialized DNA polymerases: O O N C CH3 HN N N N H2N Bypass of a single G-AAF lesion dR N2-Acetylaminofluorene (dG-C8-AAF) 100 Tolerance events (%) DA 80 TLS0 TLS-2 60 40 20 0 T V ) in I-V I-V ef W II- 0m (D lI lI ol po Po /3 xA ∆p T+ c_ le 5J W O V U RecA Damage DA Avoidance A F 3' A 5' CCGCGG Error Free 5' 3' TLS Pathway TLS0 Pol V Pol V A F Pol III 3' A 5' CCGCGG 5' GGC Pol II Mutagenic (-2) frameshift TLS-2 TLS Pathway Modulation of TLS by the level of specialized DNA polymerases: Bypass of a single G-AAF lesion 100 Tolerance events (%) DA 80 TLS0 TLS-2 60 40 20 0 T V ) in I-V I-V ef W II- 0m (D lI lI ol po Po /3 xA ∆p T+ c_ le 5J W O V U -Under physiological conditions, TLS events are rare compared to DA events. -The level of TLS is kept low by a low basal level of TLS polymerases. -An increase in TLS Polymerases leads to increased TLS Naiman et al. PNAS 2014 Delivering a single lesion into the yeast genome 5’-lacZ lox71 LEU2 Cre 3’-lacZ lox66 Maslowska et al. NAR 2019 Delivering a single lesion into the yeast genome Cre LEU2 lacZ loxPWT loxdouble mutant Maslowska et al. NAR 2019 Delivering a single lesion into the yeast genome lacZ lacZ Non-damaged TLS DA TLS at UV Lesion O O TT-CPD lesion HN NH *** ** ** *** ** O N N O *** * ** ** *** dR1 P dR2 100 DA cyclobutane pyrimidine dimer TLS Tolerance events (%) 80 60 40 20 0 al 0 30 0 v3 v1 v3 d3 d3 nt re re re d re ra ra ra v1 pa lζ v3 v1 lη re Po re re Po Parental strain: rad14, msh2, phr1 TLS at UV Lesion *** ** ** *** ** *** * ** ** *** TT-CPD lesion 100 DA TLS Tolerance events (%) 80 O O 60 HN NH 40 O N N O 20 dR1 dR2 P 0 cyclobutane pyrimidine dimer al 0 re d30 0 v3 re e v 1 v3 d3 d3 nt re re re ra r ra ra v1 pa v3 v1 re WT Pol ζ + Pol η + Rev1 ∆Pol ζ ∆Rev1 ∆ Pol η V V V 3'-AATTGA-5' 3'-AATTGA-5' 3'-AATTGA-5' 5'-TTAACT-3' 82% 5'-TTAACT-3' 99.5% 5'-TTAACT-3' 80% 5'-TTAAGT-3' 7% 5'-TTAAGT-3' 7% 5'-TTAAAT-3' 11% 5'-TTAAAT-3' 7% 5'-TTATCT-3' 3% 5'-TTXXXT-3' 3% TLS at different Lesions TT-CPD lesion TT(6-4) lesion G-AAF DA TLS *** ** ** * *** ** *** * ** ** * * 100 100 100 Tolerance events (%) Tolerance events (%) 80 80 Tolerance events (%) 80 60 60 60 40 40 40 20 20 20 0 0 0 al 0 v3 v1 al al 0 0 0 v3 v1 v1 v3 d3 d3 nt d3 nt d3 nt re re re re re re re re ra ra re ra ra pa pa lζ lζ pa v3 lζ lη lη lη Po Po Po re Po Po Po O CH3 HN O O O OH O 6 N C CH3 O N HN N HN NH 4 HO N O N N H3C O H2N dR O N N O N O O P O dR1 dR2 O O- P cyclobutane pyrimidine dimer OH dG-C8-AAF T(6-4)T photoproduct DNA damage tolerance regulation in eukaryotic cells TLS Error-Prone Rad6 PCNA Rad18 K164 K63 Ubc13 Mms2 Damage Avoidance Rad5 Error-Free Rad6: Ub conjugating Rad18: Ub ligase Ubc13/Mms2: Ub conjugating Rad5: Ub ligase DNA damage tolerance regulation in yeast TLS Rad6 Rad18 TT-CPD lesion Ubc13 Mms2 DA Rad5 * * 100 *** *** DA Tolerance events (%) 80 TLS 60 40 20 0 4R al 18 nt po rad 16 re 0K pa l3 DNA damage tolerance regulation in yeast TLS Rad6 Rad18 TT-CPD lesion TT(6-4) lesion G-AAF Ubc13 Mms2 DA * *** *** *** Rad5 * * * * 100 *** *** 100 100 Tolerance events (%) DA Tolerance events (%) 80 Tolerance events (%) 80 80 TLS 60 60 60 40 40 40 20 20 20 0 0 0 l 8 4R a 4R al 18 4R al 18 d1 nt nt nt 16 po rad po rad 16 16 re ra re re K pa 0K 0K pa pa 30 l3 l3 l po PCNA ubiquitination is imperative for TLS Ubiquitination of PCNA occurs locally Is TLS regulated locally or globally? 1) No Genotoxic stress 2) Genotoxic stress (4NQO or UV) Insertion of a single lesion Is TLS regulated locally or globally? 4R 13 - + c 6 4NQO: ub K1 Ub2 Ub1 PCNA-Flag 4NQO treatment leads to signi cant PCNA Ubiquitination fi  Is TLS regulated locally or globally? O O HN NH -4NQO +4NQO O N N O dR1 dR2 TLS CPD P cyclobutane pyrimidine dimer DA 100 Tolerance events (%) 80 60 40 20 0 k k k O O O oc oc oc Q Q Q m m m +N +N +N  Is TLS regulated locally or globally? O O HN NH -4NQO +4NQO O N N O dR1 dR2 TLS CPD TT(6-4) G-AAF P cyclobutane pyrimidine dimer DA 100 Tolerance events (%) O CH3 HN 6 OH 80 O N 4 60 HO N O H3C O N O O P O O 40 O- OH T(6-4)T photoproduct 20 O O 0 k k k N O O O C CH3 oc oc oc HN Q Q Q N m m m +N +N +N N N H2N dR dG-C8-AAF  Is TLS regulated locally or globally? O O HN NH -4NQO +4NQO or UV O N N O dR1 dR2 TLS CPD TT(6-4) G-AAF P cyclobutane pyrimidine dimer DA 100 Tolerance events (%) O CH3 HN 6 OH 80 O N 4 60 HO N O H3C O N O O P O O 40 O- OH T(6-4)T photoproduct 20 O O 0 k k k N O V